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Facult de Mdecine Pierre et Marie Curie

PACES 2013-2014
UE1

Fonctions des protines, bases molculaires


Pr Franois COURAUD

Introduction.
Chapitre 1. Stratgies pour l!tude des protines
Chapitre 2. Structure des protines: de lacide amin la macromolcule
Chapitre 3. L!exemple du transport de loxygne : myoglobine et hmoglobine
Chapitre 4. L!exemple des protines motrices : actine, myosine et les autres...
Chapitre 5. Lexemple dune protine membranaire, le rcepteur de lactylcholine

Introduction.
Les protines : premires actrices du monde vivant
! !protine! vient de !"#$%&#' (proteion) = qui occupe le premier rang.
! Il n!existe pratiquement pas de processus biologique non rgi par une/des protine(s).
! Comprendre le fonctionnement d!une protine, cest donc comprendre in fine
!la logique du vivant!
Les protines assurent l'ensemble des fonctions du vivant
Crer et maintenir une structure
Les protines du cytosquelette

Transformer
Les enzymes catalysent
lessentiel des
ractions chimiques du vivant

Les protines des tissus


de soutien

Bouger-se dplacer
Les protines fonction motrice
Les protines des mouvements
intracellulaires

Reconnatre et se dfendre
Les immunoglobulines
Transporter
Les transporteurs de petites
molcules dont loxygne

Informer-signaler

Les transporteurs
trans-membranaires

Les rcepteurs et leurs ligands


3
Les !interrupteurs molculaires!

1. Stratgies pour l!tude des protines

1.1. Isoler la/les protine(s) responsable(s) d!une fonction


1.2. Analyser la composition chimique de la protine
1.3. Dcouvrir la structure spatiale de la protine
1.4. Corrler la structure la fonction de la protine

1.1. Isoler la/les protine(s) responsable(s) d!une fonction

Exemple : on sintresse la chymotrypsine,


enzyme pancratique scrte dans le tube digestif,
responsable d!une tape de digestion des protines
alimentaires.
On dispose dune mthode de mesure de lactivit de
lenzyme qui va permettre de suivre l!ensemble
du processus

Les tapes suivre seront :


. isoler le tissu pancratique ou collecter les scrtions
isoler lorganite (RER) par centrifugations diffrentielles
extraire les protines totales
sparer les protines par chromatographie et lectrophorse
isoler et purifier lenzyme par affinit
dcouper la protine en petites units (peptides)
analyser la composition chimique des peptides (acides amins)
dterminer la squence de la protine entire
tudier la structure 3D de la protine
dduire son mcanisme daction

! isoler le tissu pancratique ou collecter les scrtions


! isoler lorganite (RER; Reticulum Endoplasmique) par centrifugation diffrentielle
Centrifugation
basse vitesse
(1000xg, 10 min)

Homognat
cellulaire

Centrifugation
moyenne vitesse
(20 000xg, 20 min)

Le culot contient
cellules entires
noyau
cytosquelette

Centrifugation
haute vitesse
(80 000xg, 1h)

Le culot contient
mitochondries
lysosomes
peroxysomes

Centrifugation
trs haute vitesse
(150 000xg, 3h)

Le culot contient
microsomes
petites vsicules
RER

Le culot contient
ribosomes
virus
macromolcules
de grande taille
Le surnageant
contient le cytosol

Extraire les protines totales partir de la fraction subcellulaire


purifie

Lextraction des protines totales repose sur leur proprits


dinsolubilit dans des solutions salines

Sparer les protines par chromatographie grce leur migration


diffrentielle travers un systme compos de deux phases, une
phase fixe et une phase mobile.
On peut ainsi sparer les protines en utilisant leurs diffrences
de taille,
de charge
dadsorption spcifique

Charge globale dune protine et point isolectrique

! Une protine porte des charges positives et ngatives au niveau des


chanes latrales des rsidus dacides amins (voir chap. 2). Ces
charges dpendent du pH de la solution et leur somme algbrique
dfinit la charge globale de la protine.

! Il existe toujours un pH pour lequel le nombre de charges positives


portes par une protine est gale au nombre de charges ngatives: la
charge globale est alors nulle. Ce pH sappelle le point isolectrique de
la protine (pI). Cest la base de la sparation des protines par
lectrofocalisation (voir lectrophorse bi-dimensionnelle)

Les trois grands types de chromatographie


utiliss pour purifier les protines

Tampon dlution
(phase mobile)
chantillon
Billes fonctionnalises
(Phase fixe)

Colonne de chromatographie

Sparation selon la charge

Sparation selon la taille

Sparation par adsorption


spcifique

Chromatographie changeuse d!ions


Tampon dlution
(phase mobile)
chantillon
Billes fonctionnalises
(Phase fixe)

Chromatographie de filtration sur gel

6 5 4 3 2 1

Chromatographie d!affinit

Quantit de protine dans les fractions


Profil du gradient
Activit enzymatique spcifique

10

lectrophorse (SDS-PAGE)
lectrophorse mono-dimensionnelle
Protine avec 2
Protine simple (C)
sous-units (A et B)

Coupure des ponts


traitement par le SDS
disulfure covalents
(sodium dodcyl sulfate)
((-mercapto-thanol)
A
C
B
11

lectrophorse mono-dimensionnelle
Cathode

100 kDa

1 : homognat cellulaire
40 kDa

2 : aprs ultracentrifugation
3 : aprs chromatographie changeuse dions
4 : aprs chromatographie par filtration sur gel
5 : aprs chromatographie d!affinit

Anode

15 kDa
1

NB : le Dalton (Da) est lunit de masse. La masse


dun Dalton correspond la masse dun atome
dhydrogne.
12

1.2. Analyser la composition chimique dune protine: composition en acides amins et


squence
La mthode la plus utilise pour analyser la composition chimique dune protine est
aujourdhui la spectromtrie de masse.
Cette mthode permet de dterminer avec une trs grande prcision la masse dune
molcule et cela partir de quantits extrmement faibles de lordre de 10-12 mole
(picomole) 10-15 mole (fentomole)
Dans le cas des protines, la spectromtrie de masse permet:
1. de dterminer la composition en acides amins des protines
2. de dterminer la squence des peptides et des protines, cest--dire lordre
dans lequel sont enchans les acides amins.
3. De caractriser des mutations y compris des mutations ponctuelles

14

1.3. Dcouvrir la structure spatiale dune protine

Protine
purifie

Cristal de
protine

Diffraction des rayons X

Reconstruction
informatique
des donnes

Production
du modle

) =1,54 A
Source
rayons X
Profil de
diffraction

Rsolution 5A

Cartes de
densit lectronique

Rsolution 1,5A

15

1.4. Corrler la structure la fonction dune protine


Arriv ce stade, nous savons :
Que la plupart des fonctions biologiques sont ralises par des protines
Quil est possible disoler la/les protine(s) responsable(s) dune fonction
Que cette protine est un enchanement (polypeptide) dunits de base (acides amins)
Que les acides amins se succdent selon une squence spcifique
Que cette squence spcifique constitue la structure primaire de la protine
Que la protine adopte une structure spatiale, accessible par diffraction X

16

2. Structure des protines: de lacide amin la macromolcule


2.1. Les forces impliques dans la structure des protines
2.2. Les lments de bases des protines : les acides amins
2.3. La liaison peptidique
2.4. Les structures secondaires
2.5. La notion de motif et de domaine
2.6. Structures primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire
2.7. Structure et pathologie le mystre de la vache folle !

17

2.1. Les forces impliques dans la structure des protines


Dans les molcules biologiques existent des interactions molculaires non covalentes
facilement rversibles. Ces liaisons sont considrablement affectes par la prsence de
leau dans les milieux biologiques
! Les liaisons de van der Waals dpendent de la distance inter-atomique
! Les liaisons lectrostatiques (= ioniques, salines) se forment entre molcules charges
! Les liaisons hydrogne se forment entre molcules polaires (charges ou non)
-O-H
donneur

Naccepteur

2,88 A

-N-H
donneur

Oaccepteur

3,04 A

2 types dans
les protines

! Les liaisons hydrophobes sont principalement dues la forte affinit de leau pour
elle-mme
Les molcules apolaires interagissent entre elles pour laisser le plus de liaisons
hydrogne possible entre les molcules deau (penser deux gouttes dhuile dans de
leau). Dans un environnement biologique, les protines exposent leurs rsidus
hydrophiles lextrieur et les rsidus hydrophobes lintrieur.
Cette rgle est pratiquement gnrale, lexception notable des protines
transmembranaires, et constitue lune des bases principales pour la mise en place de la
structure tri-dimensionnelle des protines
18

Dfinition du pH et du pK
Equilibre acide-base
On dfinit le pH = -log [H+] = log1/[H+]
Dans les milieux biologiques, il n!y a pas d!acide fort ou de base forte
mais des acides et des bases faibles, c!est dire qu!ils ne sont que partiellement ioniss
dans la gamme des pH biologiques
Un acide est un donneur de proton, une base est un accepteur de proton
HA
acide

H+ + A proton Base
conjugue

avec la constante dquilibre Ka

Ka=

(H+)(A-)
HA

On dfinit le pK = -logKa = log1/Ka


On peut tirer des quations prcdentes une relation entre le pH et le pK

quation de Henderson-Hasselbalch

pH = pKa + log

[A-]
[HA]
19

2.2. Les lments de bases des protines : les acides amins


2.2.1. Caractristiques gnrales
La structure
commune de
(presque) tous les
acides amins peut
scrire :

Carbone *+

COOH COOH = fonction acide carboxylique


H - C - NH2
R

NH2 = fonction amine primaire

R = chane latrale variable

Le carbone * est asymtrique. Il existe donc deux stroisomres.+

COOH
NH2- C - H
R

COOH
H - C - NH2
R

Les protines ne contiennent que des L acides amins.


20

2.2.2. Classification des acides amins


Il existe 20 acides amins naturels entrant dans la composition des protines
On peut rpartir les acides amins selon la nature de leur chane latrale en 3 classes :
chane aliphatique : glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine,
mthionine, proline

acides amins apolaires

chane aromatique : phnylalanine, tryptophane


fonction alcool : srine, thronine, tyrosine

acides amins polaires


neutres

fonction soufre : cystine


fonction amide : glutamine, asparagine
fonction acide : acide glutamique, acide aspartique

acides amins polaires


ionisables

fonction basique : histidine, lysine, arginine


Acide amin essentiel = non synthtis par lhomme

Il existe des codes trois ou une lettre extrmement utiliss pour les squences protiques
glycine,

Gly,

mthionine,

Met, M

Cystine,

Cys, C

phnylalanine, Phe, F

alanine,

Ala,

Proline

Pro, P

glutamine,

Gln Q

Tryptophane, Trp, W

valine,

Val,

srine,

Ser, S

Asparagine,

Asn, N

histidine,

His, H

leucine,

Leu,

thronine,

Thr, T

acide glutamique, Glu, E

lysine,

Lys, K

Tyrosine,

Tyr, Y

acide aspartique, Asp, D

Arginine,

isoleucine, Ileu, I

2.2.3. Proprits spcifiques

Etat dionisation pH 7,0

acides amins apolaires chane aliphatique

glycine

alanine

valine

Arg, R
21

leucine

isoleucine

mthionine

Pas de
carbone
asymtrique

proline

Chane latrale lie


la fois au carbone *
et lazote

22

acides amins apolaires chane aromatique

phenylalanine

tryptophane

acides amins polaires neutres fonction alcool

srine

thronine

tyrosine

acide amin polaire neutre fonction soufre


Etat dionisation pH 7,0

cystine

23

Trois acides amins chanes latrales aromatiques

Les cycles aromatiques


contiennent des lectrons !
dlocaliss qui absorbent
fortement dans lultraviolet ce
qui permet le dosage des
protines en solution.

phenylalanine
tyrosine
Cycle phnyl

tryptophane

Etat dionisation pH 7,0

Groupe indol

24

Trois acides amins


fonction alcool

srine

thronine

tyrosine

Chacune de ces trois fonctions


alcool peut fixer un groupement
phosphate.
Cest le principe de la
phosphorylation des protines
qui constitue lun des modes les
plus frquents de la rgulation
de la fonction dune protine
25

Cystines et pont disulfure

Rduction: (-mercaptothanol

Pont disulfure

oxydation

cystine
26

acides amins polaires neutres


fonction amide

acides amins polaires ionisables


fonction acide

OSE

asparagine

glutamine

acide aspartique

acide glutamique

pKa (R) = 3,9


Dans les glycoprotines, les oses se fixent
sur latome dazote de la fonction amide de
la chane latrale de lasparagine:
N-glycosylation

pKa (R) = 4,1

Etat dionisation pH 7,0

27

acides amins polaires ionisables fonction basique

Etat dionisation pH 7,0

+
H
pH 5,0

Fonction guanidinium

histidine
pKa (R) = 6,0

lysine

pKa (R) = 10,5

arginine
pKa (R) = 12,5

Remarque: lhistidine prsente un certain caractre aromatique


28

2.3. La liaison peptidique


2.3.1. La liaison peptidique est le ciment de base de toutes les structures protiques

La liaison peptidique est une liaison covalente qui se forme par condensation du groupe
*-carboxyle (acide) dun acide amin avec le groupe *-amin dun autre acide amin
et limination d!eau

H *-carboxyle H
NH2 - C - COOH

NH2 - C - C

N - C - COOH
H

R1

N- C - COOH
H

R1

R2

*-amine

H2 O

R2

liaison peptidique
(liaison amide particulire)

29

La liaison peptidique est une liaison amide particulire


Elle est un !hybride de rsonance! entre deux formes extrmes

Premire forme extrme


La liaison C O est une double liaison
La liaison C N est une simple liaison
Lazote de lamide possde
une paire dlectrons non partags

Seconde forme extrme


La liaison C O est une simple liaison
La liaison C N est une double liaison
Loxygne de lacide possde
une paire dlectrons non partags

Forme hybride
Les lectrons sont partags
entre les atomes O, C et N
et sont distribus sur une
orbitale molculaire !
qui recouvre les 3 atomes

En consquence, la liaison peptidique possde trois proprits fondamentales


Elle est plane

Elle est rigide

Elle est polaire

30

La liaison peptidique prsente des dimensions pratiquement fixes

1,0 A

C*+

C*+

1,33 A
1,52 A

119,5

-+

,+

1,45 A

C*+

118,2

115,6

121,1

1,23 A

.+
121,9

C*+

123,2

carbone

oxygne

azote

hydrogne

Chane latrale

Il existe cependant 3 angles qui peuvent prendre des valeurs variables : ,+ -+ .+

31

2.3.2. La liaison peptidique et la nature des rsidus amino-acides imposent des structures
spatiales trs particulires aux chanes polypeptidiques
On dfinit ,, angle de torsion autour de la liaison C-N. Cet angle ne peut prendre que 2 valeurs

Vers le
C-terminal
Vers le
N-terminal

Vers le
N-terminal

Vers le
C-terminal

, = 0

CIS

, = 180

TRANS

La liaison peptidique prend presque toujours une configuration trans, plus stable
32

Dans une chane polypeptidique, il n!existe


que deux types de libert de rotation
qui permettent de modifier la conformation
spatiale

C*+
La libert de rotation de l!angle . (phi) autour de la liaison entre le C* et l!azote amidique
33

La libert de rotation de l!angle - (psi) autour de la liaison entre le C* et le groupe carbonyle

2.3.3. Les chanes polypeptidiques sont constitues dun nombre variable de rsidus
amino-acides et possdent une structure spatiale spcifique

N-terminal

C-terminal

Par dfinition une chane polypeptidique commence par l!acide amin qui a sa fonction amine
libre (extrmit N-terminale, que l!on place gauche) et se termine par l!acide amin
qui a sa fonction acide carboxylique libre (extrmit C-terminale, que l!on place droite.)
NB : Par dfinition on appelle un oligopeptide un enchanement de quelques acides amins
(de 2 une dizaine).
!Polypeptide! et !protine! sont pratiquement quivalents. Cependant on rserve
gnralement le terme polypeptide des structures de moins de 10 kDa.
34

2.3.4. Groupements chargs dans une chane polypeptidique

lys

asp
NH

CH

CO

NH

CH

NH

CO

CH

CO

NH

CH

CH2

CH2

CH2

CH2

COOH

CH2

COO-

CH2
CH2

CH2

pH 1

CO

CH2

CH2

pH 7

+NH3

Ce sont les charges portes par les


chanes latrales des rsidus dacides
amins qui sont responsables de la
charge globale dune protine.
Elles sont dpendantes du pH

NH

CH

+NH3

CO

NH

CH

CH2

CH2

COO-

CH2

CO

CH2

pH 12

CH2
NH2

35

2.3.5. Les chanes polypeptidiques peuvent tre clives de faon spcifique


Clivage enzymatique
La trypsine coupe la liaison peptidique aprs (ct carboxylique) un rsidu lysine
ou arginine
La chymotrypsine coupe la liaison peptidique aprs un rsidu phnylalanine,
tyrosine, tryptophane, leucine ou mthionine

chymotrypsine
NH2-ala-ser-phe-pro-lys-gly-gly-arg-trp-asp-glu-lys-cys-COOH

trypsine
Clivage chimique

Le bromure de cyanogne coupe aprs un rsidu de mthionine


36

2.4. Les structures secondaires

Lhlice alpha droite est la structure


secondaire la plus frquente

2.4.1 Lhlice alpha et les autres hlices

- =-47
. =-57

C-O pointent
vers le haut

C-term.

hlice hlice
gauche droite

C-term.

N-H pointent
vers le bas
Liaison
hydrogne
1 tour =
3,6 rsidus
5,41 A

Liaison R4
Hydrogne
R1!R5

N-term.

R1
R2

N-term.

2.4.2 Feuillets bta:

- =+135

13 atomes (1-13) forment


une boucle ferme par
une liaison H

Vue de
dessus

37

2 types de feuillet bta: anti-parallle (plus stable) et


parallle (moins stable).

. =-139

3,4 A

feuillet bta anti-parallle


vu de dessus

feuillet bta anti-parallle


vu de ct

- =+113

. =-119

C"N
(brin 1)

C"N
(brin 1)

N!C
(brin 2)

C"N
(brin 2)

C"N
(brin 3)

C"N
(brin 3)
feuillet bta parallle
vu de dessus

feuillet bta parallle


vu de ct

38

2.4.3 Boucles et coudes


Les boucles et les coudes sont des structures non rgulires, non rptitives permettant
des connections entre les structures secondaires.
Les coudes ou tours ne possdent que quelques rsidus
Une boucle peut atteindre une vingtaine de rsidus.
Contrairement aux structures secondaires
rgulires, les boucles ont tendance se
situer vers lextrieur des protines et
engager des liaisons hydrognes avec
leau environnante

Exemple de coude ( (type I)

39

2.4.4. Prdiction de structure et bioinformatique


Ces proprits spcifiques font que chaque acide amin prfre un environnement
conformationnel donn. Les nouveaux outils bioinformatiques permettent de faire des prdictions
structure primaire
1 -GHRFTKENVRILESWFAKNI!
21-ENPYLDTKGLENLMKNTSLS!
41-RIQIKNWVSNRRRKEKTI!
Hlice 2

Prdiction de structure 3D
1 - //*((**/(****/****/*+
21-*///*//*/**/***/(/*/+
41-*****/(*//******(*+

COOH

Hlice 3

Hlice 1
NH2

Proposition dun modle


ventuellement associ
une fonction
Comparaison dans les
banques de donnes
40

2.5 La notion de motif et de domaine


On trouve dans les protines des combinaisons de structures secondaires. Ces combinaisons
sappellent des !motifs! et des !domaines!.
Ils peuvent se retrouver dans des protines diffrentes: ils apportent ces protines une
fonction commune.

Exemple: le motif compos dune hlice a


spare dune autre hlice a par un coude
est appel motif ! hlice-coude-hlice! .
Il est prsent dans beaucoup de protines
se fixant lADN

Exemple: Motif ou domaine


immunoglobulinique qui est llment
constitutif des immunoglobulines
(anticorps)
Structure globulaire compacte
constitues de feuillets bta

2.6. Structures primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire


La squence des acides amins (structure primaire) dtermine la structure tridimensionnelle
Une structure primaire donne conduit une structure tridimensionnelle donne
La squence des acides amins (structure primaire) est dtermine par le gne

structure primaire

structure tridimensionnelle
Liaisons
hydrognes

Rsidus
hydrophobe
s
Rsidus
hydrophiles

Cur
hydrophobe

extrieur
hydrophile

Dnaturation = perte de lactivit


Agents dnaturants: Ure 8M, Chlorure de guanidine
rupture des liaisons non covalentes

42

On appelle
Structure secondaire

Structure tertiaire

Structure quaternaire ...

Hlice alpha

coude
Feuillet bta

les motifs structuraux


lorganisation interne
de base :
d!une protine monomrique
hlice alpha, feuillet bta,
(ou d!une sous-unit)
tours et coudes

lorganisation complexe
dune protine multimrique
(au moins dimrique) :

43

2.7. Structure et pathologie le mystre de la vache folle !


La modification de la structure dune protine particulire, le prion, peut lui confrer
un rle pathologique

Conversion
Auto-propageable

Protine prion normale


PrPc

Protine prion infectieuse


!scrapie! PrPsc

44

3. L!exemple du transport de loxygne : myoglobine et hmoglobine


3.1. Introduction : place du transport de l!oxygne dans les processus biologiques
3.2. Myoglobine
3.2.1. La myoglobine a une structure compacte et riche en hlice alpha
3.2.2. Loxygne est fix sur la myoglobine grce lhme, un groupement prosthtique
3.2.3. La liaison de lhme la myoglobine dpend principalement de deux rsidus histidine
3.2.4. La liaison de loxygne la myoglobine suit une courbe hyperbolique
3.3. Hmoglobine
3.3.1. Lhmoglobine est compose de 4 sous-units de structure proche de celle de la
myoglobine
3.3.2. Lhmoglobine adulte contient 2 chanes alpha et deux chanes bta. Cette structure
confre la molcule des caractristiques de protine allostrique
3.3.3. Lhmoglobine est parfaitement adapte pour la captation, le transport et la
libration de loxygne dans les tissus : modulations de laffinit pour O2
3.3.4. Lanalyse tridimensionnelle de lhmoglobine permet de dfinir le mcanisme
molculaire de son fonctionnement
3.3.5. Lhmoglobine sert de modle pour les protines allostriques
3.3.6. Lhmoglobine sert de modle pour l!tude des pathologies molculaires

45

3. L!exemple du transport de loxygne : myoglobine et hmoglobine


3.1. Introduction : place du transport de l!oxygne dans les processus biologiques
La cration dnergie disponible pour les processus biologiques est le premier impratif
du vivant.
On!extrait 18 fois plus dnergie partir du glucose en prsence qu!en absence doxygne
Chez les vertbrs deux protines sont capables de fixer loxygne :
La myoglobine est une protine simple et fixe l!oxygne avec une forte affinit
L hmoglobine est une protine complexe et fixe loxygne avec une affinit modulable
Le contexte biologique du transport de loxygne chez l!homme

46

3.2. La myoglobine
3.2.1. La myoglobine a une structure compacte et riche en hlice alpha

Schma simplifi

Modle haute rsolution

Modle en cylindre

Structure 3D de la myoglobine de cachalot par diffraction X


Protine de 153 rsidus, de forme globulaire (!sphrique!) de 45x35x25 A.

47

3.2.2. Loxygne est fix sur la myoglobine grce lhme, un groupement prosthtique

Unit de base
groupement prosthtique =
molcule non peptidique
ncessaire la fonction
apoprotine = protine
dpourvue de groupement
prosthtique

C
C

HEME = protoporphirine IX +fer


48
Cette molcule est plane et polaire

Le fer joue un rle majeur dans cette fixation


Le fer est sous forme ferreuse Fe2+ (ferromyoglobine) et dispose de 6 liaisons de coordination
Loxydation du fer en forme ferrique Fe3+ (ferrimyoglobine) rend la molcule inactive
Dans le cas de l!hmoglobine ces formes sappellent respectivement ferrohmoglobine (Fe2+)
et ferrihmoglobine ou methmoglobine (Fe3+)

La fixation doxygne dplace latome de fer par


rapport au plan de lhme
49

3.2.3. La liaison de l!hme la myoglobine dpend principalement de deux rsidus histidine

O2

Modle haute rsolution

Le monoxyde de carbone CO se lie au


fer de faon comptitive avec lO2
avec une affinit beaucoup plus forte
forte.
Il bloque le transport de lO2, do
son effet toxique

50

Saturation (Y)

3.2.4. La liaison de l!oxygne la myoglobine suit une courbe hyperbolique


Elle traduit la trs haute affinit de la myoglobine pour loxygne
tissus
poumons
1,0

P50 = 3-5

la myoglobine nest pas


adapte pour le transport
et la libration de
loxygne dans les tissus

0,5

0,0
0

20
40
60
80
100
Pression partielle en oxygne, pO2 (en torr)
1 torr = 1mm Hg 1 torr = 0,13 kPa

51

3.3. Hmoglobine
3.3.1. Lhmoglobine est compose de 4 sous-units de structure proche de celle de la
myoglobine

52

3.3.2. Lhmoglobine adulte contient 2 chanes alpha et deux chanes bta, identiques deux
deux. Cette structure confre la molcule des caractristiques de protine allostrique
protine allostrique = protine,
comportant gnralement plusieurs
sous-units, possdant plusieurs sites
de liaisons pour un/des ligands et telle
que la liaison dun ligand sur un site
modifie la liaison des autres ligands

Molcule d!hmoglobine avec 2 chanes alpha


et deux chanes bta maintenues par des
interactions non covalentes. Chaque chane
possde un hme et un site de liaison de lO2

L!volution de la myoglobine vers lhmoglobine


confre cette dernire des proprits
remarquables :
- cooprativit de la liaison de O2
- possibilit de modulation physiologique de la
fixation de loxygne : pH, CO2, BPG...

NB : on note lhmoglobine adulte HbA *2(2. Il existe de nombreuses autres chanes


53
possibles pour lhmoglobine, comme par exemple lhmoglobine ftale HbF *202

3.3.3. Lhmoglobine est parfaitement adapte pour la captation, le transport et la


libration de l!oxygne dans les tissus : leffet coopratif
tissus

Saturation (Y)

1,0

poumons

Laffinit de Hb pour 02 est


plus faible que celle de Mb
et modulable

P50 = 3-5

0,5
La courbe sigmode traduit
un effet coopratif.

P50 = 26

0,0
0

20

40

60

80

100

Pression partielle en oxygne, pO2 (en torr)


1 torr = 1mm Hg 1 torr = 0,13 kPa
54

1. laffinit de Hb pour O2 est diminue par la diminution du pH (augmentation de [H+])


2. laffinit de Hb pour O2 est diminue par laugmentation de CO2

Poumons, pH 7,4, pO2 100 torrs


Muscles, pH 7,4, pO2 20 torrs:
Muscles, pH 7,2, pO2 20 torrs:
Muscles, pH 7,2, pO2 20 torrs, pCO2 40 torrs

Effet BOHR

100%
66% capacit libre
77% capacit libre
90% capacit libre
55

Laffinit de Hb pour O2 est diminue par le 2,3 diphospho-glycrate (DPG)


Hb purifie
sans DPG

avec DPG

Le DPG est un intermdiaire de la glycolyse, libr


dans les tissus priphriques et prsent dans les
hmaties la mme concentration que lHb (2 mM)
En absence de DPG, lhmoglobine perd ses
proprits de cooprativit.

Hb dans les hmaties

P50=20

Laffinit de Hb ftale (HbF=*202) pour O2 est


suprieure celle de lhmoglobine maternelle
(HbA =*2(2).
Cette diffrence daffinit HbF>HbA est lie la
plus faible affinit de la chane 0 de HbF pour le
DPG compare la chane ( de HbA

P50=26

56

3.3.4. Lanalyse tridimensionnelle de lhmoglobine permet de dfinir le mcanisme


molculaire de son fonctionnement
Lors de loxygnation, latome de fer se dplace vers le plan de lhme

Ce mouvement est transmis lhistidine


proximale et lensemble de la chane
polypeptidique par dplacement de proche
en proche

En l!absence d!O2
Aprs fixation de O2

57

Les dplacements gnrs sur une sous-unit sont transmis une sous-unit associe

*1+
*2+

Les interactions entre


chanes adjacentes sont
principalement ralises
par des ponts salins entre
rsidus chargs.

Contact *1 (1+

(2+
Contact *2 (1+

(1+

Modle basse rsolution indiquant les zones de contact *-(

58

Les dplacements gnrs sur une sous-unit sont transmis une sous-unit associe
La rsultante globale est un mouvement du dimre *1(1 par rapport *2(2

59

La comparaison des structures de loxyHb et de la desoxyHb indiquent l!existence de


deux tats molculaires distincts.
Oxy

Desoxy

2,3 DPG

Etat relach R a une forte affinit


pour O2

Etat tendu T a une faible affinit


pour O2

Le 2,3 DPG bloque lhmoglobine en position T en se fixant dans l!espace libre60


entre les 4 sous-units. C!est pourquoi il interfre avec la cooprativit.

3.3.5. l!hmoglobine sert de modle pour les protines allostriques


Il existe deux modles pour la !transition! allostrique de lhmoglobine!
Considrons pour simplifier deux tats de lhmoglobine

Etat tendu T

Etat relach R

la !transition! allostrique peut suivre deux voies :


Modle du tout ou rien ou modle symtrique

T T

R R

T T

R R

O2 R

O2 O2

O2 O2

O2 O2

O2 O2

O2 O2
O2 O2

R R

R R

O2 R

O2 O2
O2 O2

Modle squentiel

T T
T T

T O2
T T

T T

O2 T

61

O2 O2
O2 O2
O2 O2
O2 O2

sans DPG

avec DPG
O2 O2
T T

R R

T T

R R

T T

62

3.3.6. l!hmoglobine sert de modle pour l!tude des pathologies molculaires


L!exemple de la drpanocytose
(+
(+

Hmoglobine S:
Mutation dun acide amin
sur la sous-unit (

*+
Passage dans la microcirculation.
Oxy HbS libre son oxygne et se
transforme en desoxyHbS. Cette
transformation est associe un
changement conformationnel qui
favorise la formation dune poche
hydrophobe

Oxy HbS
O2

Hmatie normale

desoxy HbS

Deux exemples de situations


pathologiques:
CO : blocage du site actif de lHb
Drpanocytose: Pas datteinte du
site actif

Polymre de
desoxy HbS

Hmatie falciforme

63

4. L!exemple des protines motrices : actine, myosine et les autres...


4.1. Corrler les structures anatomique et histologique la composition biochimique
4.1.1 La structure dun sarcomre en microscopie lectronique montre lexistence
de filaments fins et pais
4.1.2 Les filaments fins sont principalement composs d!actine. Les filaments pais
sont principalement composs de myosine
4.1.3 Un modle simple permet de corrler les donnes anatomique et biochimique
4.2. Comprendre le mcanisme de transformation dnergie chimique en nergie mcanique
4.2.1
4.2.2
4.2.3
4.2.4

Les filaments d!actine (microfilaments) sont composs de polymres dactine globulaire


La myosine est une protine complexe de trs grande taille
La !tte! de la myosine (S1) est responsable de lactivit motrice
Linteraction de la myosine (S1) avec lactine est rversible et dpend de la
fixation de l!ATP et de l!activit ATPase

4.3. Etudier un exemple de rgulation de lactivit des protines par leur environnement

64

Corrler la structure anatomique la composition biochimique


Comprendre le mcanisme de transformation d!nergie chimique en nergie mcanique
Etudier un exemple de rgulation de l!activit des protines par leur environnement

65

4.1. Corrler les structures anatomique et histologique la composition biochimique


4.1.1 La structure d!un sarcomre en microscopie lectronique montre l!existence
de filaments fins et pais
Myofibrille au repos
Bande I

Bande A

Ligne Z

Zone H

Bande I
Ligne Z

1m

fins

fins + pais

pais

fins + pais

fins

Myofibrille contracte

66

4.1.2. Les filaments fins sont principalement composs dactine.


Les filaments pais sont principalement composs de myosine

Un filament dactine est un polymre


constitu de sous units (monomre)

Les molcules de myosine sont regroupes en


faisceaux desquels mergent des !ponts!

67

4.1.3 Un modle simple permet de corrler les donnes anatomique et biochimique

Les filaments fins dactine


!coulissent! sur les filaments pais
de myosine

Dans le muscle, de trs nombreuses


units (sarcomres) sont juxtaposes

68

4.2. Comprendre le mcanisme de transformation d!nergie chimique en nergie mcanique


4.2.1. Les filaments d!actine (microfilaments) sont composs de polymres d!actine globulaire
Le monomre dactine, actine G (43 kDa)
prsente une polarit qui permet la
formation du polymre
Le monomre d!actine est compos de
deux domaines.
Chaque domaine prsente plusieurs types
de structures secondaires
hlices alpha
feuillets bta

coudes et boucles
Chaque monomre contient une
molcule d!ATP et un ion Ca2+.
69

4.2.2. La myosine musculaire est une protine complexe de trs grande taille
La myosine (520 kDa) est une protine
polymrique compose de deux chanes
lourdes (220 kDa) et de deux paires
de chanes lgres (20 kDa chacune)
2 hlices * +
Super-enroules

N-terminal

chanes
lgres

Fragment S1

tte

C-terminal
queue

La digestion enzymatique de la
myosine gnre des fragments qui
permettent ltude de sa structure
et de ses fonctions
70

4.2.3. La !tte! de la myosine (S1) est responsable de l!activit motrice

La myosine est une ATPase qui catalyse la


raction qui produit de l!nergie :
ATP + H2O

ADP + Pi + H+

ATP

ADP
Pi
L!hydrolyse de l!ATP entrane un
changement conformationnel
(bras de levier)

10 nm
Chanes
lgres

71

4.2.4. L!interaction de la myosine (S1) avec l!actine est rversible et dpend de la


fixation de l!ATP et de l!activit ATPase
Le mouvement de bras de levier de la tte de la myosine peut tre transmis
au filament d!actine

tte de la myosine

filament d!actine

72

4.2.5. La coordination de l!hydrolyse de l!ATP, du changement conformationnel et de la


fixation l!actine permet le mouvement : le cycle actine-myosine est une superbe mcanique
1

ADP

ATP
2

Hydrolyse
de l!ATP

Pi

73

4.3. Etudier un exemple de rgulation de lactivit des protines par leur environnement
Comment contrler la contraction musculaire ?
Il existe un complexe de protines rgulatrices : la troponine et la tropomyosine
fix sur les filaments d!actine : notion d'difice macromolculaire
la troponine est une protine sensible aux ions Ca2+ . Elle change de conformation en prsence
de Ca2+. Cela induit le dplacement de la tropomyosine, ce qui dmasque le site de fixation de
la myosine sur lactine.
Troponine
C

Actine

Tropomyosine

C = calcium binding T = tropomyosin binding

I = inhibitory
74

La contraction musculaire est donc sous le contrle direct de la concentration en ions Ca


++. Laugmentation de la concentration en ions Ca++ dans le cytoplasme du myocyte est
dclenche par larrive de linflux nerveux dans la terminaison nerveuse
Influx
nerveux

Terminaison nerveuse

Scrtion dactylcholine
Membrane plasmique

Tubule T

+
+
+
+
+
+
+
+

+++++

+++++

---Z
-

-----

REL

Na+

Rcepteur de lactylcholine
Na+
Z
actine
myosine
Protines
rgulatrices

Ca++

Ca++

Myocyte

75

5. Un exemple de protine membranaire, le rcepteur nicotinique de


lactylcholine
5.1. Cest une protine intgrale de la membrane plasmique
5.2. Cest un canal cationique rgul
5.3 Cest une protine pentamrique
5.4 Cest la structure du pore qui dtermine la slectivit ionique
5.5. Ce canal ionique est aussi un rcepteur: il lie spcifiquement un
neuromdiateur, lactylcholine
5.6. La fixation de deux molcules dactylcholine induit louverture du pore
5.7. Une pathologie humaine touchant le rcepteur nicotinique, la myasthnie

76

5.1. Cest une protine intgrale de la membrane plasmique

Extracellulaire

cest--dire une protine immerge


dans la bicouche lipidique et entrant
largement en interaction
avec les
chanes hydrocarbones et hydrophobes
des lipides.

Cest une protine transmembranaire


comprenant 3 domaines
1 domaine extracellulaire,
1 domaine intramembranaire
1 domaine cytoplasmique (intracellulaire).

Double
couche
de lipides

Intracellulaire

La protine

77

5.2. Cest un canal cationique rgul

Pore

Site de liaison
de lactylcholine

Cest une protine contenant un pore


ralisant un pont aqueux entre les faces
intra- et extra-cellulaires de la
membrane plasmique.
Cest une protine-canal ou plus
simplement un canal.
Le pore laisse passer les molcules
deau et certains ions. On parle de
canal ionique.
Le rcepteur de lactylcholine est
slectif pour les cations,
Na+, Ca++ et K+.
Cest un canal cationique.

Structure tridimensionnelle du rcepteur nicotinique

Le pore peut exister dans au moins


deux conformations,
une conformation ferme
une conformation ouverte
Le passage dune conformation
lautre est sous le contrle de la
fixation dun ligand, lactylcholine,
sur un site spcifique
78

5.3 Cest une protine pentamrique


Le rcepteur nicotinique est constitu de 5 sous-units
(monomres) dont deux sont identiques (sous-units *)
2*, 1(, 10, 11

Les cinq sous-units prsentent une organisation gnrale


commune;
Chaque sous-unit contient 4 hlices (ou segments)
transmembranaires.
Le rcepteur nicotinique contient donc au total 20 hlices
transmembranaires.
Les 20 hlices constituent la rgion transmembranaire qui
forme le pore travers la double couche de lipides:
! Les rgions des hlices qui sont en contact avec les
chanes lipidiques sont riches en rsidus hydrophobes.
! Les rgions des hlices qui constituent la paroi
du pore sont hydrophiles.
79

5.4 Cest la structure du pore qui dtermine la slectivit ionique

Deux paramtres contrlent la slectivit pour


les cations:

! Le diamtre du pore dans sa partie la


p l u s t r o i t e a p p e l e ! f i l t r e d e
slectivit! : 9-10 Angstrms
! Les 5 hlices M2 qui forment la paroi
interne du pore contiennent des acides
amins dont les chanes latrales portent
des charges ngatives: ces charges
repoussent les anions et permettent au
contraire le passage des cations. Il y a
trois anneaux de charges ngatives.

80

5.5. Ce canal ionique est aussi un rcepteur: il lie


spcifiquement un neuromdiateur, lactylcholine
1. Chaque rcepteur porte deux sites
de liaison, un sur chaque sous-unit *+
2. Chaque site est
situ sur la face
interne de lentre du
pore et constitue une
sorte de poche o vient
se fixer la molcule
dactylcholine

3. Somme de liaisons
de faible nergie:
interaction rversible

SITE RECEPTEUR

5.6. La fixation de deux molcules dactylcholine induit louverture du pore

La fixation de 2 molcules
dactylcholine sur les 2 sites de
liaison induit un changement
conformationnel de la protine qui se
traduit par une ouverture du pore
la fois au niveau de la rgion
transmembranaire et au niveau du
domaine cytoplasmique (sortie du
pore).

Louverture du pore dans le domaine


intra-membranaire est le rsultat
dune rotation des hlices M2 qui
forment la paroi interne du pore.
Chaque hlice a la forme dun
coude.

82

Le rcepteur nicotinique de lactylcholine assure 3 fonctions:


1. La rception dun signal spcifique port par la molcule dactylcholine
2. Le transport passif et slectif de cations travers la membrane de la
cellule
3. La rgulation de ce transport par lactylcholine travers un changement
conformationnel

Chacune de ces fonctions est contrle par des rgions prcises et limites au sein du
rcepteur-canal.
Les mcanismes lmentaires responsables de ces trois fonctions se retrouvent dans de
trs nombreuses autres protines membranaires.

83

5.7. Une pathologie humaine touchant le rcepteur nicotinique, la myasthnie

Une maladie neuromusculaire


- Se traduit sur le plan clinique
par une fatigabilit musculaire
-Production dauto-anticorps
anti-rcepteur nicotinique
(maladie auto-immune)
-Blocage et internalisation des
rcepteurs
- Diminution de la transmission
neuromusculaire

Blocage du rcepteur par des auto-anticorps


motoneurone

actylcholine

Rcepteurs
nicotiniques

motoneurone

Auto-anticorps
cellule musculaire

Rcepteurs nicotiniques
internaliss et dgrads

84