ARTICULO ORIGINAL

Secuenciacin Exoma en familias con autismo multiplex sugiere una

papel principal para las mutaciones heterocigotos truncando
C Toma
1,2
, B Torrico
1,2
, A Hervs
3
, R Valds-Mas
4
, A-Tristn Noguero
1
, V Padilla
5
, M Maristany
5
, M Salgado
3
, C Arenas
6
, XS Puente
4
,
M Bays
7
y B Cormand
1,2,8
El autismo es un trastorno grave del desarrollo neurolgico, la etiologa de la que
sigue siendo principalmente desconocido. Los estudios familiares y de gemelos
proporcionan
fuerte evidencia de que los factores genticos tienen un papel importante en la
etiologa de esta enfermedad. Recientemente, la secuenciacin del exoma (WES)
los esfuerzos se han centrado principalmente en raras variantes de novo en las
familias nicos. Aunque estos estudios han proporcionado pionera
Insights, de novo variantes probablemente explican slo una pequea proporcin
de la varianza riesgo de autismo. En este estudio, hemos realizado exoma
secuenciacin de las familias multiplex 10 del autismo con el objetivo de
investigar el papel de las variantes raras que se coinherited en el afectado

hermanos. El conjunto de variantes seleccionadas en nuestro estudio se ha

enriquecido con genes implicados en las funciones neuronales o ya se ha
informado en
trastornos psiquitricos, como se muestra por anlisis de ontologa de genes y
navegando por la base de datos de Neurocarta. Nuestros datos sugieren que rara
truncar las variantes heterocigotos tienen un papel preponderante en la etiologa
del autismo. El uso de un modelo de regresin lineal mltiple, se
encontr que la carga de truncar mutaciones se correlaciona con un coeficiente de
inteligencia no verbal inferior (NVIQ). Adems, el nmero de
truncando mutaciones que se han transmitido a los hermanos afectados fue
significativamente mayor (doble) que aquellos que no se transmite.
Anlisis de la interaccin protena-protena realizado con nuestra lista de genes
mutados revel que el YWHAZ postsinptica es el ms
nodo de la red interconectada. Entre los genes que se encuentran interrumpidos
en nuestro estudio, hay evidencia que sugiere que YWHAZ y
tambin la DRP2 ligada al cromosoma X se puede considerar como nuevos genes
candidatos autismo.
Molecular Psychiatry publicacin anticipada en lnea 3 de septiembre de
2013; doi : 10.1038 / mp.2013.106
Palabras clave: trastorno del espectro autista; exoma secuenciacin; mltiplex
de las familias; nuevos genes candidatos; variantes genticas raras;
truncando mutaciones
INTRODUCCIN
Los trastornos del espectro autista (TEA) representan un grupo de
neurodegeneracin
trastornos velopmental caracterizadas por alteraciones en la recproca
la interaccin social, la comunicacin verbal y no verbal y
patrones de comportamiento estereotipado.
1
La prevalencia de los TEA es
estimado en torno al 0,6%, por lo que es uno de los ms prevalentes
trastornos de la infancia.
2
Los estudios familiares y de gemelos han proporcionado
fuerte evidencia de que los factores genticos juegan un papel importante en la
etiologa de los TEA: el riesgo de recurrencia entre hermanos es B20 veces
mayor
que en la poblacin general,
3
y la tasa de concordancia es B80-

90% en comparacin con los gemelos monocigticos B10-30% en gemelos

dicigticos.
4
Aunque en los ltimos aos varios de alto rendimiento gentica
Los estudios han identificado nuevos genes de ASD en el autismo idioptico,
la gran mayora de los factores genticos subyacentes siguen siendo todava
desconocido. En este sentido, ninguna mutacin o variante copia nmero
(CNV) encontrado para ser asociado con las cuentas de autismo para ms de
1% de los casos, lo que hace la estimacin del nmero de
riesgo independiente loci extremadamente alta.
5
Hoy en da, toda exoma
secuenciacin (WES) representa una tecnologa poderosa para
la identificacin de variantes raras de un solo nucletido (SNVS) que pueden
ayudar
para representar la compleja arquitectura gentica del autismo y desenredan
algunos de la heredabilidad faltante. Recientemente, varios estudios
WES realizado en tros padre-hijo, centrndose en novo
variantes.
6-10
Estos estudios muestran que las mutaciones de novo tienen una
aumento de la tasa de mutacin en el autismo y correlacionar con el aumento de
la edad paterna.
7,9
Sin embargo, incluso la alta tasa de mutacin observada
(una variante aproximadamente de novo de un solo nucletido en el
exoma por nio autista) no puede explicar completamente la etiologa de la
desorden, en el que los efectos acumulativos de varias mutaciones genticas son
se espera bajo un modelo de herencia Multigolpe.
11,12
el exoma
Los estudios realizados hasta la fecha se han centrado principalmente en la de
novo
variantes. Aunque este enfoque es til, no es suficiente para
descubrir la piscina completa de variantes etiolgicos, la mayora de
que se espera que sea en la fraccin heredado. Varios
estudios en familias multiplex Singleton y sugieren un diferencial
paisaje gentico, con las familias con varios individuos afectados
siendo ms propensos a tener eventos heredados que de novo
variantes.
13-15

De acuerdo con el modelo Multigolpe, esperaramos

mutaciones en varios genes a estar en la base de la enfermedad.
Los datos actuales muestran que la mayora de las variantes seran etiolgicos
heterocigoto, mientras que homocigotas o heterocigotas compuestas
mutaciones seran mucho menos frecuentes.
16-18
El objetivo de este estudio era descubrir nuevos genes candidatos ASD
mediante el anlisis de la piscina de variantes raras heredadas en multiplex
familias. Se realiz WES en 10 familias, teniendo en cuenta los
variantes raras que no estn presentes en pblico o en el local de que las bases de
datos
se prev que sea perjudicial y coinherited en el afectado
hermanos.
1
Departamento de Gentica de la Universidad de Barcelona, Barcelona, Espaa;
2
Centro de Investigacin Biomdica en Red de Enfermedades Raras (CIBERER),
Barcelona, Espaa;
3
Nios y Adolescentes
Unidad de Salud Mental, Hospital Universitari Mtua de Terrassa, Barcelona,
Espaa;
4
Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular de la Universidad de OviedoIUOPA, Barcelona, Espaa;
5
Unidad de Trastornos Generalizados del Desarrollo (UETD), el Hospital Sant
Joan de Du, en Esplugues de Llobregat, Barcelona, Espaa;
6
Departamento de Estadstica, Universidad de Barcelona, Barcelona, Espaa;
7
Centro Nacional de Anlisis Genmico (CNAG), Barcelona, Espaa y
8
Instituto de Biomedicina de la Universidad de Barcelona, Barcelona,
Espaa. Correspondencia: Profesor B Cormand,
Departament de Gene`tica, Facultad de Biologa, Universidad de Barcelona,
Avenida Diagonal 643, Edifici Prevosti, 3
un
planta, 08028 Barcelona, Espaa.
E-mail : bcormand@ub.edu

Recibido el 13 de febrero de 2013; revisado 23 de mayo de 2013; aceptado 22 de

de julio de 2013
Molecular Psychiatry (2013), 1-7
Y 2013 Macmillan Publishers Limited Todos los derechos reservados 1359 hasta
4184/13
www.nature.com/mp
Pgina 2

MATERIALES Y MTODOS
Pacientes con TEA y evaluacin fenotipo
En nuestro estudio, hemos considerado 10 familias multiplex con TEA: nueve
con dos
probandos afectados y una con tres probandos afectados. Los datos clnicos son
resumen en la T abla 1, y ms detalles se proporcionan en el Suplemento
Informacin mentaria.
El anlisis CNV con CytoScan HD matriz
Anlisis del nmero de copias de ADN de todo el genoma se realiz en todos los
TEA
de los pacientes en nuestro estudio (21 individuos), utilizando la matriz de
CytoScan HD
(Affymetrix, Santa Clara, CA, EE.UU.). Este estudio se llev a cabo para
descartar
familias con anomalas cromosmicas se inform anteriormente en el autismo.
Los detalles de este estudio se resumen en la informacin complementaria.
La captura y la secuenciacin del exoma
Un total de 41 personas, incluidos 21 probandos y sus padres eran
procesado por enriquecimiento exoma con 3 mg de ADN genmico de
sangre. los
ADN TruSeq kit de preparacin de la muestra (Illumina, San Diego, CA,
EE.UU.) y la
Kit v.1.0 NimbleGen SeqCap EZ Biblioteca Exoma Humano (Roche, Basilea,
Suiza), que se dirige a unos 20 000 genes correspondientes a
34 Mb, se utilizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. los
bibliotecas exoma resultantes se aplicaron a una celda de flujo para Illumina
clster
generacin. Secuenciacin de extremo emparejado se realiz en un HiSeq2000
instrumento (Illumina) usando 76-base lee.
Anlisis de datos exoma
Las lecturas fueron alineados al genoma de referencia (GRCh37) usando
BurrowsWheeler anlisis con la misma opcin,
19

y un archivo de BAM se ha generado utilizando

SAMtools.
20
Duplicados de reaccin en cadena de la polimerasa se retiraron usando
SAMtools y scripts personalizados, y polimorfismos de un solo nucletido
iniciales
de llamada se ha realizado mediante una combinacin de SAMtools y Sidrn
como descricama con anterioridad.
21
Estadsticas para la exigibilidad (porcentaje del exoma revesti- mientos
rojo por al menos 10 lee con la calidad de mapeo X30 y X20 calidad de base) de
cada muestra se muestran en la Tabla 1. complementaria En promedio, los
individuos
tena 83,5% de la meta cubierto. Variantes comunes, definidas como aquellas
presente en dbSNP135 con una menor frecuencia de los alelos X1%, se separaron
por filtracin.
Variantes de seleccin y validacin
Despus de que los polimorfismos de un solo nucletido comunes se separaron
por filtracin, se
seleccionado todas las variantes de transmisin de padres a ambos individuos
afectados presentaron,
con la excepcin de SJD_50 familia, en la que se seleccionaron variantes
transmitidos a dos de cada tres o los tres probandos afectados. Todas
variantes no transmitidos o variantes de transmisin a un solo sib afectados
fueron excluidos del estudio. Dentro de la casa y las bases de datos WES falsos
positivos
Tambin se utiliza para filtrar el conjunto de variantes.
22
Nuestra seleccin incluye todos
truncando mutaciones sin sentido (indeles y que producen un cambio de marco),
de empalme
sitios y variantes de cambio de sentido. Missense variantes fueron incluidos en
nuestra
Slo si la seleccin se predijo que se patgenos por SIFT (Clasificacin
De intolerantes Tolerante) o PolyPhen (polimorfismo Fenotipificacin).
23,24
Esas variantes que han superado todas las etapas de filtrado se validaron
mediante la realizacin de
reacciones en cadena de la polimerasa estndar y secuenciacin de Sanger. De
media,

90,1% de las variantes seleccionadas fueron validados con xito. el flujo de

trabajo
seguido en este estudio se resume en la Figura 1 complementario.
Los anlisis estadsticos y bioinformticos
Se realiz el anlisis de ontologa de genes de enriquecimiento del conjunto de
seleccionados
variantes usando el software FatiGO disponible en la suite Babelomics (h ttp: //
babelomics.bioinfo.cipf.es) .
25
La base de datos Neurocarta ( http: // gemmadoc.chibi.ubc.ca/neurocar se utiliz ta /) para identificar el potencial de generelaciones fenotipo en nuestra lista de genes. La base de datos SFARI (h TTP: //
gene.sfari.org/autdb/Welcome.do) se utiliz para obtener una lista comentada de
genes implicados en el autismo: genes de predisposicin al autismo en el
contexto de
trastorno sindrmica (categora S), fuertes genes candidatos TEA (categora 2)
y los genes con ASD evidencia sugestiva (categora 3).
La piscina de genes seleccionados en este estudio se investig para redes
y las relaciones de funcin gnica utilizando Ingenuity Pathway Analysis (IPA)
software (www.ingenuity.co m). IPA calcula una puntuacin basada en el
probabilidad de encontrar una piscina dado de genes en una red de la
Base de datos de conocimiento de Ingenuity por casualidad (puntuacin de de
un registro (exacta de Fisher
probabilidad de prueba)). IPA tambin se utiliz para evaluar la enfermedad y el
trastorno '
asociaciones que salen de nuestro grupo de genes utilizando el 'Top Bio
Categora de funciones.
Un modelo de regresin lineal mltiple se consider para evaluar la relacin
entre el cociente no verbal inteligencia (NVIQ) y los diferentes
categoras de variantes genticas (truncando, no es sinnimo de perjudicial,
no sinnimo benigna, sinnimo). Los supuestos bsicos de regresin
(errores se distribuyen normalmente y de forma independiente variables
aleatorias) eran
comprobado para asegurar que el modelo era apropiado. Siguiendo un
enfoque conservador, para detectar las variables independientes (la variante
diferente
categoras) relacionaron significativamente con la respuesta NVIQ, el
Bonferronise consider procedimiento ajustado. Para todas las variables regresores, la
muestra
Coeficiente de correlacin de Pearson con la variable de respuesta y su

significacin se calcula. Por otra parte, un estudio de simulacin era persona

formado. Por boostrap remuestreo, 50 nuevos anlisis simulados con una muestra
tamao de cada 100 individuos fueron computados y la correspondiente
se comprob modelo de regresin lineal mltiple.
Un modelo de regresin logstica mltiple se utiliz para establecer la relacin
entre las variantes de estado (las variantes no sinnimas transmiten a ambos
hermanos afectados en una familia (TR) y las variantes no transmiten desde
los padres (NT)) y filtrar, puntuaciones PolyPhen.
Para obtener detalles sobre la regresin lineal mltiple, modelo de suficiencia,
Correccin de Bonferroni, estudio de simulacin y la regresin logstica mltiple
ver
Informacin suplementaria.
Por otra parte, el [0,1] a [0,1] determinado por el cuadrado de seleccionar y
Puntajes PolyPhen de variantes TR y NT fue dividido en cuatro cuadrantes
de acuerdo con los umbrales de patogenicidad de 0,05 y 0,5 utilizados para
seleccionar y
PolyPhen, respectivamente. Se compar la proporcin de variantes TR y NT
entre los benignos (valores de 0,05 a 1 para seleccionar y 0 a 0,5 para
PolyPhen) y patgenos (valores de 0 a 0,05 para SIFT y de 0,5 a 1 para
PolyPhen) cuadrante utilizando la prueba exacta binomial y la prueba exacta de
Fisher.
Los anlisis se realizaron con el paquete R (ht tp: // CRAN.
R-project.org) .
RESULTADOS
En este estudio, hemos secuenciado los exomas de mltiplex 10 del autismo
familias y validadas 220 variantes raras de transmisin de cada
padre a al menos dos hermanos afectados. Todas las variantes seleccionadas
fueron
filtrada para las variantes comunes y el uso de bases de datos internas y
Tabla 1.
Descripcin de las familias multiplex ASD incluido en nuestro estudio
Identificacin de la familia (sib par ID)
Sexo (aos)
fenotipo
NVIQ
retraso en el lenguaje
MT_69 (sib.3-sib.4)
M (17) / M (20)
Aut / aut
50/56
S S

MT_76 (sib.3-sib.4)
M (22) / M (29)
PDD-NOS / Asp
81/85
No / no
MT_109 (sib.3-sib.4)
M (13) / M (25)
Aut / aut
64/35
S S
MT_160 (sib.3-sib.4)
M (14) / M (11)
PDD-NOS / PDD-NOS
68/105
No / no
MT_28 (sib.3-sib.4)
M (16) / M (14)
PDD-NOS / Asp
105/107
No / no
MT_151 (sib.3-sib.4)
M (20) / M (11)
Asp / asp
98/92
No / no
SJD_49 (sib.3-sib.4)
M (6) / M (4)
Asp / PDD-NOS
129/112
No / no
SJD_10 (sib.3-sib.4)
M (13) / M (10)
PDD-NOS / PDD-NOS
105/95
No / no
SJD_34 (sib.3-sib.4)
M (13) / M (9)
Asp / asp
107/139
No / no
SJD_50 (sib.3-sib.4-sib.5)

M (16) / F (15) / M (8)

Asp / asp / PDD-NOS
97/98/95
No / no / no
Abreviaturas: Asp, sndrome de Asperger; Aut, autismo; F, hembra; M, de sexo
masculino; NVIQ, no verbal cociente de inteligencia; PDD-NOS, trastorno
generalizado del desarrollo
de otro modo no est especificado.
Para cada familia, se proporcionan datos para los dos o tres hermanos afectados.
Secuenciacin del exoma en familias con autismo multiplex
C Toma et al
2
Molecular Psychiatry (2013), de 1 - 7
Y 2013 Macmillan Publishers Limited
Pgina 3

se prev que ser patgena. La piscina de variantes es validados

enumerados en la Tabla 2. La mayor parte complementaria (83%) son de sentido
errneo
cambios, mientras que las variantes predijeron para causar el truncamiento de
protenas
(mutaciones sin sentido y indeles marco de lectura) representaron el 16% de
el total. Variantes alterar cannico sitios de empalme o codones de inicio
fueron menos representado, en el 0,5% cada uno (Figura 2). Todas
estas variantes fueron heterocigotos, ninguno de ellos se homocigotos
o heterocigotos compuestos, y ningn gen mutado se encontr en
ms de una familia. Truncando mutaciones representan notable
eventos en el exoma y puede identificar posibles genes candidatos
para una enfermedad. Curiosamente, en nuestro estudio, este tipo de mutacin
representado una proporcin sustancial de toda la piscina de variantes,
con 20 y 16 indeles mutaciones sin sentido (T capaces 2) .
Reordenamientos cromosmicos y anteriormente descrito completamente
supresiones penetrantes fueron descartadas en los probandos afectados, por
cariotipo ya travs de un estudio de la CNV. Este anlisis, seguido de
validacin experimental, revel seis hereditaria presente en las VNC
cinco pares de hermanos que identifican los siguientes genes: los genes
COL4A3 - MFP, FHIT,
MRPL36 - NDUFS6, CTNND2, GRM1 y ASAH1 ( Tabla 3) . Estructural
variantes que abarca los genes FHIT y CTNND2 anteriormente haban
ha descrito en el autismo.
14,26
Para establecer si la piscina de variantes seleccionados en nuestro exoma

estudio se enriquece en los posibles genes de susceptibilidad ASD, nos

llevado a cabo un estudio de ontologa de genes. El anlisis de componentes
celulares
mostr 'cruce de telfono' sea una categora enriquecido significativamente
despus
aplicando mltiples correcciones de pruebas (p = 0,043) (suplementarios
Tabla 3). Varios genes en esta categora, como CYFIP1, SCN1A,
DNM2, FLNB, GABRA4, P2RX4, PJA2 y SV2B han sido descritos
en el autismo o estn involucrados en las funciones neuronales. varios GO
los procesos biolgicos se sobre-representados en nuestro estudio y algunos
de ellos pueden ser relevantes para el autismo, tales como "tubo neuronal
desarrollo "(p = 0,044) y 'Reglamento del potencial de accin'
(P = 0,044) (Tabla 4). Adems, se utiliz para IPA
analizar la categora 'Funcin de inicio Bio' de '' Enfermedades y trastornos
y encontr que "Los trastornos del desarrollo 'y' Neurolgica
enfermedades ', entre otros, fueron los grupos ms significativos relacionados
de los genes en nuestro estudio (Tabla 5). el Neurocarta
la base de datos se utiliz para construir un mapa de fenotipos psiquitricos
previamente vinculado a estos genes ( Figura 1 ). La mayora de los genes
estaban asociados con el autismo, sino tambin con la epilepsia, dislexia,
discapacidad intelectual, trastorno de hiperactividad por dficit de atencin y
esquizofrenia.
Tambin se investig la posible correlacin entre la
gravedad de las mutaciones y la discapacidad intelectual, mediante el uso de la
NVIQ. NVIQ se evalu en nuestra muestra de 21 hermanos afectados,
con puntajes entre 35 y 139 y una media de 91
(Figura 3). Un modelo de regresin lineal mltiple
se aplic con NVIQ como variable de respuesta y truncar, no
sinnimo cambios (dainos o benignos de acuerdo a Tamizar
y PolyPhen) y variantes sinnimas como variables predictoras.
Los resultados mostraron que las variantes solamente truncar contribuyen
de manera significativa a NVIQ (P 0,007). Por otra parte, las variantes que
truncan
Tabla 2.
Variantes raras de genes que alteran compartidos por los hermanos afectados en
cada familia mltiplex
Family_ID
Cromosoma
la posicin de nucletido
un
Gene

la posicin AA
segundo
Efecto
MT_109
5
180 477 255
BTNL9
208/535
fs (del-C)
MT_109
6
28 962 882-886
ZNF311
632/666
fs (del-TTCTT)
MT_109
11
133 712 408
SPATA19
137/167
Disparates
MT_109
19
11 943 225
do
ZNF440
412/595
Disparates
MT_151
1
152 883 252
IVL
327/585
fs (del-G)
MT_151
3
113 652 385
do
GRAMD1C
413/662
Disparates

MT_151
4
17 606 229-232
LAP3
400/519
fs (del-TGGG)
MT_151
7
99 489 859
TRIM4
477/500
Disparates
MT_151
8
144 642 836
GSDMD
158/484
Disparates
MT_151
incgnita
100 503 119
DRP2
432/957
Disparates
MT_160
8
10 557 940-941
C8orf74
282/294
fs (INS-C)
MT_160
8
101 936 203-204
YWHAZ
220/245
fs (INS-T)
MT_160
12
75 892 479
GLIPR1
209/266

Disparates
MT_28
2
114 392 641
do
RABL2A
78/238
fs (del-G)
MT_28
10
91 162 622-623
IFIT1
197/478
fs (INS-A)
MT_69
3
49 274 079
CCDC36
52/594
Disparates
MT_69
8
67 813 550
C8orf45
579/681
fs (del-G)
MT_69
11
2 339 146-147
TSPAN32
319/320
fs (del-TC)
MT_69
11
114 577 559
do
FAM55B
529/559
Disparates
MT_69
15

42 154 996
SPTBN5
2419/3674
Disparates
MT_69
22
26 890 166-169
TFIP11
700/837
fs (del-AGAT)
MT_76
5
38 412 639-642
EGFLAM
462/1017
fs (del-AAGT)
MT_76
5
74 882 867
POLK
415/870
fs (del-A)
MT_76
10
88 703 106
MMRN2
479/949
Disparates
MT_76
19
7 965 639-640
LRRC8E
745/796
fs (del-CA)
SJD_10
8
131 921 998
ADCY8
532/1251
Disparates
SJD_10

11
34 167 721-722
NAT10
949/953
fs (INS-A)
SJD_10
12
54 756 741
GPR84
299/396
fs (del-G)
SJD_10
22
18 609 783
TUBA8
346/449
Disparates
SJD_34
1
160 143 953
atp1a4
682/1029
Disparates
SJD_34
11
121 028 796
TECTA
1518/2155
Disparates
SJD_34
19
53 644 208-209
ZNF347
626/840
fs (del-AA)
SJD_49
13
20 796 930-931
GJB6
231/261
fs (INS-T)

SJD_49
19
10 610 629-633
KEAP1
27/624
fs (del-TGCCC)
SJD_50
15
76 225 440-443
FBXO22
402/403
fs (del-ATAA)
SJD_50
re
17
71 205 688
FAM104A
202/207
Disparates
Abreviaturas: AA, aminocidos; o del ins, delecin o insercin seguido de los
nucletidos implicados; fs, cambio de marco.
un
Las posiciones se indican segn el montaje / hg19 GRCh37 de la UCSC Genome
Browser (genome.ucsc.edu).
segundo
La posicin del aminocido alterado por la
mutacin / polipptido completo codificado por la transcripcin.
do
Variantes raras ya descritas en dbSNP 137.
re
Familia Multiplex con tres probandos: variante encontrada en
dos de cada tres afectados.
Secuenciacin del exoma en familias con autismo multiplex
C Toma et al
3
Y 2013 Macmillan Publishers Limited
Molecular Psychiatry (2013), de 1 - 7
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se correlacionaron con las puntuaciones ms bajas NVIQ (coeficiente de

correlacin
r -0,517, p = 0,016; Figura 2) y explica el 26% de NVIQ

varianza en nuestra muestra ASD (r

2
0,267). Un estudio de simulacin
incluyendo 50 nuevos anlisis simulados de 100 individuos cada uno
obtenido los mismos resultados que en la muestra original (para ms
detalles, vase la informacin complementaria, que complementa el cuadro 7
y complementario Figura 8).
Posteriormente, se investig si las mutaciones que truncan
podra tener un papel importante en la etiologa del autismo mediante la
comparacin de la
nmero de los que fueron cotransmitted (T abla 1) con los que se
No fueron transmitidas (Tabla 6). Encontramos una
diferencia significativa, teniendo en cuenta el nmero total de especies raras
variantes, entre las mutaciones de alteracin que se transmitieron a
probandos afectados (16 variantes sin sentido y 20 indeles marco de lectura)
y los que no transmite (9 variantes sin sentido y 9 del marco de lectura
indeles) (prueba exacta de Fisher, p = 0,015; complementa la figura 4).
Posteriormente, se determin la contribucin potencial de
ASD de variantes no sinnimas raras prev que sea patgena,
comparando el grupo de transmisin (TR) de un solo nucletido
variantes con las que no se ha transmitido (NT). Un mltiplo
El anlisis de regresin logstica (ajustado por el modelo logit) se realiz para
investigar si las puntuaciones otorgadas por SIFT y PolyPhen
fueron capaces de discriminar las variantes de un solo nucletido en relacin
a su TR o el estado NT, pero los resultados no fueron significativos
(SIFT p = 0,122; p = 0,811 PolyPhen). A fin de probar la posible
relacin de las variantes no sinnimas con la enfermedad,
que trazan todos los cambios de sentido errneo en contra de las puntuaciones de
PolyPhen
(Eje X) y filtrar puntuaciones (eje Y) (Figura 5) a
determinar si haba alguna diferencia en la proporcin de
variantes prev que sea patgena (PolyPhen scores40.5 y
SIFT scoreo0.05) entre los grupos TR y NT. No significativo
No se detectaron diferencias (a dos caras prueba exacta binomial,
P = 0,47).
La lista de 220 genes que albergan raras predijo patgena
mutaciones (Tabla 2) y los genes que se encuentran en la CNV
estudio ( Tabla 2 ) fueron considerados juntos y se analiz por IPA para
identificar las redes cannicos que pueden sugerir las interacciones de
posibles genes candidatos TEA. La mejor puntuacin fue de red
obtenido despus de considerar slo las interacciones directas (score 89)

( Figura 3 ). Es de destacar que esta red incluye genes

previamente implicados en el autismo u otros trastornos psiquitricos tales como
SCN1A, PAX3, KDM5C, TSC1, NF1, CYFIP1, KCNQ3 y LAMA5. los
Gen YWHAZ era el nodo ms interconectada de esta red.
Adems, cuando el anlisis de la interaccin protena-protena era
realizado con un adicional de 43 genes de ASD del gen SFARI
Categoras de bases de datos (S, 2 y 3), la puntuacin de esta red mejorada
(score 106). YWHAZ fue de nuevo el nodo principal y interactu
directamente con TSC1 y CYFIP1, dos genes de ASD se encuentra mutado
en nuestro estudio, y tambin con otros genes ASD de la lista SFARI tales
como UBE3A, DISC1, MET y TSC2 (Figura 6).
DISCUSIN
Varios informes de secuenciacin del exoma de tros autismo han sido
publicado en los ltimos aos. Estos estudios han permitido a la
identificacin de nuevos genes candidatos para ASD, centrndose en de
novo variantes. A pesar de estos resultados alentadores, de novo variantes
representan probablemente O5% de la varianza riesgo de autismo,
8
y por lo tanto
variantes raras hereditarias pueden ser responsables de una proporcin
considerable
de la heredabilidad faltante en el autismo. Aqu presentamos los resultados de
la secuenciacin del exoma de 10 familias multiplex, en el que slo la
variantes raras hereditarias compartidos por los hermanos afectados en una
familia
y pronosticado a ser patgenos fueron considerados. La lista resultante
de alrededor de 220 variantes genticas identificadas se evalu para GO
anlisis de enriquecimiento y de las redes de interaccin de genes (IPA).
Estos enfoques identificaron categoras de inters relacionados con
trastornos del desarrollo o la participacin de las funciones neuronales, y
puesto de manifiesto las interacciones posibles con TEA ya se ha informado
genes. En nuestro estudio, hemos identificado un nmero considerable de genes
ya asociado con el autismo o con otros psiquitrica
condiciones, lo que sugiere que hay una comn gentica
fondo para los trastornos psiquitricos.
27,28
El ms interesante
conclusin que emerge de nuestro estudio sugiere un papel importante para
truncando las mutaciones en el autismo. Se encontr que los probandos
con un mayor nmero de mutaciones heterocigotos son alteradoras
aquellos con puntuaciones ms bajas NVIQ. Adems, encontramos ms

truncando mutaciones que fueron transmitidos y compartidos entre

los hermanos afectados (36 mutaciones) que los que no eran
de transmisin (18 mutaciones). Curiosamente, Iossifov et al.
9
analizado
exoma de datos y describen una tasa dos veces mayor de perturbar de
mutaciones de novo en los probandos afectados en comparacin con los no
afectados
hermanos. Adems, un estudio reciente de WES en hered homocigotos
o compuestos mutaciones heterocigotas prdida de funcin encontraron una
doble enriquecimiento en el autismo en comparacin con un grupo control.
18
Estos datos sugieren un modelo gentico para el autismo en base a la
contribucin acumulada de truncar alelos y otros raros
Tabla 3.
Validado CNV compartida por los hermanos afectados en cada familia mltiplex
En s
Cromosoma
min
un
Max
un
cytoband
Tipo
Tamao (kb)
Los genes
SJD_34.3-34.4
2
228 149 569
228 193 389
q36.3
Ganancia
43.82
COL4A3, MFP
MT_109.3-109.4
3
60 478 959
60 572 752
p14.2
Prdida
93.793

FHIT
MT_76.3-76.4
5
1 742 845
1 849 924
p15.33
Ganancia
107.079
MRPL36, NDUFS6
SJD_34.3-34.4
5
11 619 568
12 183 983
p15.2
Ganancia
564.415
CTNND2
SJD_49.3-49.4
6
146 309 359
146 373 644
q24.3
Prdida
64.285
GRM1
SJD_50.3-50.4
8
17 908 916
17 946 695
p22
Prdida
37.779
ASAH1
Abreviatura: CNV, copia variante nmero.
un
Las posiciones se indican segn el montaje / hg19 GRCh37 de la UCSC Genome
Browser (www.genome.ucsc.edu).
Figura 1. Los genes identificados en nuestro estudio que ya han sido
asociado con el autismo o con otras condiciones psiquitricas
conforme
a

Neurocarta
(http://gemma-doc.chibi.ubc.ca/
neurocarta /). Trastorno de hiperactividad TDAH, por dficit de atencin; TEA,
desorden del espectro autista; EP, la epilepsia; SCZ, la esquizofrenia; DYS,
dislexia; Identificacin, discapacidad intelectual.
Secuenciacin del exoma en familias con autismo multiplex
C Toma et al
4
Molecular Psychiatry (2013), de 1 - 7
Y 2013 Macmillan Publishers Limited
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Figura 2. Distribucin del nmero promedio de variantes raras por caso ndice
para cada intervalo de coeficiente de inteligencia no verbal (NVIQ) en cuatro
categoras variantes: (1) truncar mutaciones, que incluyen sin sentido y
mutaciones de cambio; (2) no syn perjudicial, no sinnimos
mutaciones predichos a ser perjudicial por SIFT o PolyPhen; (3) no syn
mutaciones benignas, no es sinnimo prev que sea benigna y por SIFT
PolyPhen; y (4) Syn, variantes sinnimo raras. La piscina de variantes raras
analizados son los que heredan dos o tres hermanos afectados en una
familia. El anlisis de regresin lineal mltiple de estos datos mostraron que el
nmero de variantes truncar contribuye significativamente a NVIQ
(P 0,007). En contraste, la contribucin de los otros tipos de mutaciones no fue
significativa (P40.385). Los coeficientes de correlacin entre NVIQ
y tambin se presentan cada tipo de mutacin con sus significados.
Figura 3. Anlisis de la interaccin protena-protena (Ingenuity Pathway
Analysis, IPA), que incluye todos los genes que se encuentran mutados en
nuestro estudio. Solamente
se consideraron interacciones directas entre las protenas. Las protenas en gris o
de color representan los genes identificados en nuestro estudio, con lo que indica
una roja
anterior asociacin con el autismo, la epilepsia y verde con azul con la
esquizofrenia. Las protenas representadas en blanco son los que no estn
presentes en nuestra
estudiar. Efectos Upregulatory estn representados por flechas apuntando hacia
afuera, los efectos downregulatory estn representados por garrapatas hacia el
exterior, y
flechas circulares indican interacciones homotipica.
Secuenciacin del exoma en familias con autismo multiplex
C Toma et al
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Y 2013 Macmillan Publishers Limited

Molecular Psychiatry (2013), de 1 - 7

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variantes patgenas, junto con variantes estructurales raras, en los cuales

el impacto de las variantes comunes puede ser menos importante que
se pensaba anteriormente.
29
La mayora de los genes con mutaciones que truncan
encontrado en nuestro estudio tiene una funcin desconocida y ninguno tiene
anteriormente se ha descrito en el autismo. Entre estos, y YWHAZ
DRP2 puede ser considerado como fuerte nuevos genes candidatos ASD.
La secuenciacin del Proyecto NHLBI Exoma (ESP) de base de datos (ht tp: //
evs.gs.washington.edu/EVS/ ) se utiliz para verificar la frecuencia de
interrumpir las mutaciones en estos genes en aproximadamente 6500
individuos. No
truncando mutaciones fueron listadas en cualquiera YWHAZ o DRP2.
El gen YWHAZ, que codifica una protena postsinptica, es el ms
candidato intrigante en nuestro estudio. La protena interacciona fsicamente
con numerosos productos de gen asd como TSC1, TSC2, DISC1,
UBE3A y CYFIP1 (Figura 6). YWHAZ pertenece a
la familia de protenas 14-3-3 altamente conservada que comprende siete
isoformas (b, g, e, Z, Z, s, y) que participan en la transduccin de seales por
vinculante motivos especficos pSer / pThr. Estas protenas estn implicadas en
una
amplia gama de procesos que incluyen el ciclo celular, la transcripcin,
el desarrollo neuronal, la migracin y el crecimiento de las neuritas.
Aunque expresado de forma ubicua, los niveles de expresin son ms altas
en el cerebro.
30,31
Los miembros de esta familia han sido asociados
con varios trastornos del desarrollo neurolgico, sndromes o
enfermedades psiquitricas. Las supresiones de los estados contiguos y ywhae
PAFAH1B1 genes son responsables de dos mendeliana distinta
trastornos, dependiendo del tamao de la delecin: aislados
lisencefalia y el sndrome de Miller-Dieker.
32
duplicaciones
abarca slo el gen ywhae estn asociados con una
fenotipo distinto que implica el autismo y otros conductual
sntomas.
33,34
Este gen tambin ha sido fuertemente asociada con

esquizofrenia y consider downregulated juntos

con otros 14-3-3 isoformas en la corteza prefrontal de
pacientes esquizofrnicos.
35,36
Otros 14-3-3 miembros tienen tambin
ha asociado con fenotipos psiquitricos: micro heterocigticos
supresiones que abarca YWHAG y se asociaron con HIP1
epilepsia, dificultades y discapacidad intelectual aprendizaje,
37
mientras
YWHAH se asoci con el trastorno bipolar.
38,39
Recientemente, Cheah
et al.
40
informaron que los ratones knockout muestran YWHAZ neurobehadeficiencias cognitivas y vioural, y el desarrollo aberrante de
el hipocampo con defectos migratorias de las clulas piramidales y
neuronas granulares. Adems, los estudios mostraron neuroproteomic
disminucin de la expresin de YWHAZ en el cerebro de esquizofrnicos
pacientes.
41
YWHAZ
formas
un
molecular
complejo
con
DISC1 (Interrumpido en la esquizofrenia 1), Ndel1 y LIS1 para controlar
el desarrollo del hipocampo mediante la coordinacin
la migracin neuronal, la bsqueda de caminos axonal y la formacin de sinapsis.
40
En nuestro estudio, la insercin de 1 pb que se encuentra en YWHAZ causa una
desplazamiento del marco que lleva a un codn de parada prematuro despus de
18 aminocidos
cidos (Figura 7). Si ARNm sin sentido mediada
decaimiento no impide la degradacin de esta transcripcin, es
es posible que esta protena anormal puede actuar en un papel dominante,
de manera negativa la alteracin de las interacciones normales de protenas
o la prevencin de homo y heterodimerizacin de la protena con
14-3-3 miembros.

El relacionadas con la distrofina-2 protena del gen ligado al cromosoma

X (DRP2),
expresado principalmente en el cerebro y la mdula espinal, tambin es una
buena
Candidato TEA. DRP2 forma un complejo con periaxin y
distroglucano, la regulacin de la mielinizacin de las clulas de
Schwann. Sherman
hombre y col.
42
mostr que la prdida de DRP2 afecta a la organizacin de
el citoplasma de clulas de Schwann en las bandas de Cajal, aunque otra
miembros de la familia de la distrofina pueden suministrar parcialmente el
ausencia de DRP2. No enfermedad humana ha sido asociado con la
Gen DRP2, DRP2 aunque deleciones que abarca se describe en
las personas con agammaglobulinemia ligada al cromosoma X y Mohr
El sndrome Tranebjaerg causada por mutaciones BTK y TIMM8A,
respectivamente. Los cuatro pacientes descritos con la microdelecin
que abarca BTK, TIMM8A, TAF7L y DRP2 presenta la tpica
Agammaglobulinemia ligada al cromosoma X y la sincronizacin de MohrTranebjaerg
drome fenotipos, sino tambin el autismo y el retraso en el lenguaje.
43-45
Curiosamente, un estudio reciente de WES inform la misma mutacin
(E432 *) que encontramos en DRP2 en una familia autista, que era
ausente de una gran cohorte de controles.
18
Este trabajo representa uno de los primeros estudios exhaustivos de
mltiplex de las familias con TEA por secuenciacin del exoma. Similar a otros
estudios que utilizan tecnologas de agua y saneamiento ambiental, las
limitaciones deben ser conocidos
considerado. En primer lugar, la cobertura de la fraccin no era exoma
completa (83,5% de la secuencia diana cubierta de media); Por lo tanto,
Es posible que nos perdimos mutaciones causantes de enfermedad. Segundo,
hemos utilizado criterios estrictos para filtrar falsos positivos, y como
consecuencia que puede haber perdido verdaderas variantes que etiolgicos
no fueron considerados como patgenos. En tercer lugar, hemos considerado
solamente variantes compartida por los probandos afectados, aunque etiolgico
variantes de transmisin de un solo hijo tambin es probable que contribuya
a la enfermedad. En cuarto lugar, elementos repetitivos o variantes situado en
secuencias no codificantes no fueron explorados en nuestro estudio. Por ltimo,
la

muestra en estudio cuenta con solo 10 familias.

En conclusin, nuestros datos sugieren que hered interrumpir
mutaciones en familias multiplex pueden tener un papel importante en la
etiologa de los TEA. Destacamos nuevo candidato potencial TEA
genes como YWHAZ y DRP2 . Estudios adicionales de agua y saneamiento
ambiental heredada
variantes raras en las muestras de ASD amplios para corroborar
estos resultados y para obtener mayor conocimiento en la heredabilidad faltante
de TEA.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no tener ningn conflicto de intereses.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Estamos muy agradecidos a todas las familias por su participacin en nuestro
estudio. Agradecemos a Patricia
Romaris (Hospital Universitari Mtua de Terrassa) para contribuir a la clnica
delimitacin de los pacientes y Lara Nonell y Eula`lia Puigdecanet (Servei
d'Ana`lisi de
Micorarrays, IMIM-Hospital del Mar, Parc de Recerca Biome`dica de Barcelona)
por su
contribucin a los estudios de la CNV. servicios de secuenciacin del exoma
fueron proporcionados por el
Centro Nacional de Anlisis Genmico (CNAG). CT fue apoyado por la
Comisin Europea
Unin (Marie Curie, PIEF-GA-2.009 a 254.930) y BT por AGAUR (beca
FI). Financiero
se recibi apoyo de la "Fundacin La Marat de TV3 '(092010),' Fundacin
Alicia
Koplowitz ', AGAUR (2009SGR00971) y' Ministerio de Economa y
Competitividad,
Espaa '(SAF2012-33484, SAF2010-21165).
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