Preparacin de Medios de Cultivo

Fundamento

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los

microorganismos. La composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, porque
las necesidades nutricionales varan considerablemente. Hay microorganismos muy poco
exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes
que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
Los medios de cultivo poseen una serie de componentes:
1.

Indispensables: Entre los primeros se incluye el agua, nutrientes orgnicos (hidratos de

carbono, aminocidos, vitaminas, etc) y nutrientes inorgnicos (P, Fe, N, Mg, S, etc)
2.

Alternativos: sustancias isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar), tampones,

indicador de pH, etc.

Durante las prcticas se van a manejar medios de cultivo de composicin muy variada y de tres
tipos diferentes en cuanto a consistencia: medios slidos, semislidos y lquidos. Este ltimo
aspecto es importante a la hora de la preparacin de los mismos. Aunque los medios artificiales o
sintticos se pueden preparar a partir de sus componentes individuales, se pueden adquirir
comercialmente como medios deshidratados a los que solamente hay que aadir la cantidad de
agua necesaria. El fabricante indica la composicin, la caducidad, y la cantidad que debe pesarse
por cada litro a preparar e incluso como debe esterilizarse.
Objetivos concretos de la prctica
1.

Preparar medios de cultivo como soporte y fuente de nutrientes para el desarrollo de los

microorganismos in vitro.
2.

Manejar los instrumentos de uso rutinario, a la vez que imprescindibles, en el laboratorio de

microbiologa.
3. Hacer un primer acercamiento a la manipulacin de microorganismos. Adquirir la idea de la
importancia del trabajo en condiciones de esterilidad y las tcnicas ms comunes para realizarlo.

Cada mesa de trabajo se encargar de la preparacin de una cantidad suficiente de un

determinado medio de cultivo, para ser utilizado, en su momento, por todos los alumnos del grupo
de prcticas. Las instrucciones a seguir dependern del nmero de mesa y el medio de cultivo
asignado, pero en todos los casos, los pasos son los siguientes:

1. Disolver los componentes del medio en agua destilada. En muchos casos se parte de un
preparado comercial con todos los componentes deshidratados. Siguiendo las instrucciones del
fabricante o del profesor, aadir la cantidad de agua adecuada para conseguir la concentracin
deseada de los mismos. Si el medio contiene un agente solidificante (agar-agar) hay que calentar
el preparado hasta la ebullicin del mismo agitando de vez en cuando, para asegurar una completa
disolucin del agar (medios slidos y semislidos); para medios lquidos no es necesario calentar,
nicamente se agita la mezcla hasta la completa disolucin de la misma.
2. Esterilizar la disolucin.- Una vez disuelto el medio se debe esterilizar para evitar el crecimiento
de contaminantes. Dependiendo de la forma en que vaya a utilizarse el medio, el procedimiento
ser diferente:

a) Medios slidos en placa.- Tapar el matraz con tapn de algodn y cubrir con papel de aluminio.
Llevar a esterilizar alautoclave (1210C) durante 15-20 minutos. Una vez estril repartir en placas
de Petri estriles y dejar en reposo para que solidifique.
b) Medios lquidos.- Una vez disueltos los componentes repartir en tubos a razn de unos 2-4 ml
por tubo, tapar con tapn de aluminio y llevar a esterilizar en autoclave.

OBJETIVOS
El alumno aprender:
1.
2.
3.
Este vdeo

a aislar bacterias por siembra en estras

a caracterizar bacterias por sus colonias
a definir experimentalmente un cultivo puro de bacterias
de la TV de la Universidad de Sevilla resume y explica los contenidos de esta prctica

Introduccin
En la naturaleza, los microorganismos se encuentran formando poblaciones mixtas con otros tipos de
microorganismos. Los cultivos de estas mezclas se llaman por ello cultivos mixtos. Sin embargo, el
conocimiento de los microorganismos se consigue mediante el estudio de cepas aisladas, cultivadas en el
laboratorio en cultivos puros (o axnicos). En ocasiones el estudio molecular conduce a la
caracterizacin de los microorganismos, an en poblaciones mixtas. Sin embargo la identificacin
bacteriana y la caracterizacin completa solo es posible tras el aislamiento de la bacteria y la obtencin de
cultivos puros. Por ello el primer problema al estudiar una bacteria es su aislamiento del resto de los
microorganismos presentes (enn una muestra patolgica, de agua, de suelo, de alimentos, etc.). Una vez
que se ha logrado el aislamiento es posible obtener la bacteria de inters en cultivo puro .

Aislamiento

Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos que

le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio de cultivo slido adecuado
dispuesto
en
una
placa
de
petri.
Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se reparte sobre la superficie
del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la
incubacin en condiciones adecuadas, cada clula viableorigina una colonia visible resultado de
sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas determinadas en cuanto
a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia, etc.. Los tipos de bacterias presentes en la muestra
original es visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es
posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la muestra original.
El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la superficie sobre la que
se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el mayor nmero de estras posible. En las
primeras estras aparecern colonias confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras
finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un reducido inculo de
partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de
cultivo) al recorrer el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden
suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.
Criterios para la diferenciacin de colonias El aspecto de las colonias, su coloracin, tamao, etc.
permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son propiedades generales muy influenciadas por las
condiciones de cultivo, por lo que a continuacin se realiza una descripcin muy general. Las colonias
pueden ser opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes cuando se
iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o
poseen anillos concntricos. En ocasiones el olor es tambin caracterstico.

Obtencin de cultivos puros

Se trata de obtener el cultivo de un solo tipo microbiano en un medio de cultivo, por ejemplo en un tubo
inclinado de agar nutritivo. Para ello, se obtiene una pequea cantidad de masa bacteriana de una colonia
separada en el aislamiento. Con ella se inocula un nuevo medio de cultivo haciendo estras muy juntas. La
incubacin en condiciones adecuadas proporcionar un cultivo puro. Puede repetirse el proceso con cada
tipo de colonia. Se obtendr una coleccin de cultivos puros, separados, de los microorganismos que
coexistan en la muestra original.
Es aconsejable hacer un segundo aislamiento antes de proceder a la obtencin del cultivo puro. Si todas
las colonias de la segunda placa resultan idnticas, puede usarse una de ellas para establecer el cultivo
puro. Obtenido el cultivo puro es conveniente comprobar su pureza mediante una tincin de Gram. Los
cultivos puros de microorganismos son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase de un medio
de cultivo a otro) sucesivas. Una de las copias puede ser liofilizada para su conservacin.

PRCTICA No. 2
Mtodos de cultivo y aislamiento de bacterias

Objetivos. Que el alumno conozca las diferentes tcnicas de aislamiento en

medios de cultivo slido para la obtencin de cultivos puros de bacterias. Que el
estudiante prepare medios de cultivo de uso general, diferenciales y selectivos
para el cultivo de diferentes especies bacterianas.

Introduccin
Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
para caracterizar su crecimiento, hacer su identificacin y determinar sus
actividades metablicas. Un medio de cultivo es una solucin acuosa de diferentes
compuestos que contiene todos los elementos indispensables que requieren los
microorganismos para crecer.

Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios

lquidos (caldos) o solidificados con agar para su propagacin y/o conservacin,
as como para estudiar sus caractersticas de crecimiento. Es importante recordar
que la inoculacin de los microorganismos en los medios de cultivo, siempre
debern realizarse en zona asptica (cerca del mechero o en campana de flujo
laminar), condiciones que limitan la presencia de microorganismos indeseables o
contaminantes.

Las tcnicas de aislamiento, permiten la obtencin de microorganismos a

partir de muestras complejas (suelo, agua, alimentos, etc.) en las que hay una
gran diversidad microbiana, as como para comprobar la pureza de los cultivos
obtenidos. Los cultivos puros estn formados por un solo tipo de microorganismo;
y son indispensables para conocer las caractersticas morfolgicas, propiedades
de tincin, actividad bioqumica, patogenicidad, sensibilidad a antibiticos e
identificacin de las especies microbianas.

El aislamiento de cultivos microbianos puede realizarse por mtodos de

dilucin, en medios slidos por estra en placa o en medios lquidos. En el primer
caso se considera que cada clula bacteriana que se separa dar origen a una
poblacin que formar una colonia caracterstica, visible a simple vista.

La limitacin principal de estas tcnicas de dilucin, es que no es

prctica para el aislamiento a partir de mezclas donde el microorganismo de
inters se encuentra en pequeas cantidades, donde solamente se obtendrn las
bacterias dominantes.

Para favorecer el aislamiento de cultivos de baja intensidad, se aplican

mtodos de cultivo especiales, en los que se utilizan medios que contienen
nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones de sales y/o condiciones
de pH, luz o temperatura para favorecer el crecimiento de microorganismo de
inters y se conocen como selectivos o de enriquecimiento.
En ocasiones se pueden agregar a los medios de cultivo otros
componentes como: sangre, colorantes, indicadores, etc. Para distinguir especies
bacterianas diferentes por la forma en que metabolizan los sustratos que se
manifiesta por cambios en la apariencia o modificacin del pH del medio de
cultivo. Estos medios se conocen como medos diferenciales y son de gran utilidad
para la caracterizacin e identificacin de especies bacterianas.

Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo
3 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
3 cajas de Petri con Agar papa-dextrosa
1 Mechero
1 Asa de siembra
1 Parrilla de agitacin
1 Autoclave

Procedimiento

El alumno recolectara muestras para ver el tipo de microorganismos que

estan presentes en estas muestras.

Tcnica de estra cruzada

a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro

cuadrantes. Tomar una muestra con el asa previamente flameada y

fra, inocular la muestra haciendo 4-5 estras simples muy juntas de
lado a lado borde el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja
(Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja de Petri un cuarto
de vuelta. Abrir nuevamente la caja y enfriar el asa de siembra
tocando la superficie del medio lejos de la zona de estras recin
hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estras
y hacer un segundo grupo de estras en el segundo cuadrante como
en el caso anterior.
d) Repetir el procedimiento 4 y 5 en el tercer cuadrante y al efectuar la
siembra en el ltimo cuadrante, no se deber flamear el asa de
siembra y se har una estra ms abierta (simple).
Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos

1. Hacer grupos de 3 cajas, primer grupo medio nutritivo, segundo grupo y

tercer grupo agar papa-dextrosa. Sembrar en las cajas por estra

2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos,
sembrara por estra cruzada la muestra problema.

Condiciones de incubacin
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35C durante 24 horas
Resultados
A. Recopilar la informacin de la caracterizacin colonial de cada cepa
en los cuadros 4 y 5
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes
en la muestra problema.

El nitrgeno es un elemento qumico, de nmero atmico 7, smbolo N y que en condiciones normales forma
un gas diatmico (nitrgeno diatmico o molecular) que constituye del orden del 78% del aire atmosfrico.1 En
ocasiones es llamado zoe antiguamente se us tambin Az como smbolo del nitrgeno.
PRINCIPIO DEL METODO KJELDAHL
El Mtodo desarrollado por Kjeldahl consta de tres etapas:
1.
Digestin: conversin del Nitrgeno (proveniente de las protenas, por ejemplo) en ion amonio.
2.
Destilacin: separacin por arrastre con vapor del amonaco y posterior solubilizacin en una solucin cida de
concentracin conocida.
3.
Valoracin: medicin de la cantidad de cido neutralizado por el amonaco disuelto, lo que indica la cantidad de Nitrgeno
presente en la muestra inicial.
De acuerdo al origen de la muestra, a travs de un factor se relaciona la cantidad de Nitrgeno encontrado con el
porcentaje de protenas que lo originaron.

1. DIGESTIN

La muestra a analizar ,cuyo contenido de protenas es desconocido, es atacada por una mezcla de Acido Sulfrico al que
se le aade una mezcla de una sal ( Sulfato de Potasio o de Sodio ) conteniendo una pequea proporcin de un
catalizador. En la actualidad, el ms ampliamente usado es Sulfato de Cobre, por no ser txico y resultar inocuo para el
medio ambiente.

El agregado de la sal mezclada con el catalizador provoca que la temperatura durante la digestin se eleve e incremente la
velocidad de ruptura de los enlaces moleculares, facilitando la completa conversin del Nitrgeno proteico en ion Amonio.

La tcnica consiste entonces en colocar la muestra en el tubo de reaccin , aadir el cido junto con la mezcla de la sal y
el catalizador. Se procede entonces a incrementar la temperatura mediante la calefaccin directa del tubo que contiene a
toda la mezcla, hasta alcanzar los 370*C; una vez alcanzada esa temperatura se la mantiene hasta lograr la completa
digestin de la muestra.

Entre los modelos existentes en el mercado, la firma BUCHI de Suiza provee digestores identificados como modelos K-424
y K435 que permiten la operacin simultnea de 6 o 12 tubos, mediante calefaccin por radiacin infrarroja logrando un
calentamiento rpido hasta alcanzar la temperatura mxima de operacin.

En el caso de ser necesaria la digestin simultnea de ms muestras, se podr optar por el modelo K-370, que
calefacciona mediante block de Aluminio hasta 20 tubos.
Este modelo permite adems la programacin del proceso de calefaccin a contraturno, lo que permitira contar con las
muestras ya digeridas en el momento de comenzar la jornada laboral.

Es importante destacar que en esta etapa se hace necesario eliminar los gases sulfurosos provenientes de la digestin de
cada uno de los tubos.
Para ello se crea una leve corriente de aspiracin mediante vaco, colectando y solubilizando los gases en una solucin
alcalina, que evita la contaminacin de la atmsfera en el mbito laboral. Tambin aqu podemos recurrir a BUCHI, que
nos ofrece una solucin prctica, mediante el disolutor de gases modelo B-414, que elimina toda posible contaminacin.

El uso de los tubos de digestin BUCHI tiene como ventajas: su gruesa pared de vidrio resistente al trabajo con cido y
lcalis concentrados y calientes, posee una junta hermtica en la boca que evitar la prdida de gases y el angostamiento
que tienen evita salpicaduras con la consiguiente prdida de muestra y reactivos; su dimetro de 48 mm evita que se
formen altas columnas de espuma , siendo su volumen de 300 ml adecuado para la operacin con muestras de baja
densidad y gran volumen.

Para una muestra de 1 gramo, es necesario aadir 20 ml de cido Sulfrico, 9,500 gramos de Sulfato de Potasio y 0,500
gramos de Sulfato de Cobre.

Para esta proporcin la operacin se prolonga durante 90 minutos o hasta 30 minutos luego de que la mezcla digerida
haya tomado una coloracin verde azulada.

El control de la temperatura es muy importante, ya que una temperatura inferior a la citada provoca una digestin
incompleta mientras que una temperatura mayor provocar prdida de compuestos nitrogenados en la corriente de gases
que salen de los tubos; en ambos casos, los resultados finales darn un porcentaje de protenas inferior al real.

2. DESTILACION.

Durante esta etapa se procede a efectuar una reaccin de desplazamiento formando Amonaco libre y posteriormente se
provoca una arrastre con vapor para poder recogerlo mediante una solubilizacin en un medio cido y valorarlo en la etapa
siguiente.

Luego del enfriamiento del tubo salido de la digestin, se diluye con agua deionizada y se aade una solucin de Hidrxido
de Sodio con el propsito de liberar el ion Amonio presente, convirtindolo en Amonaco, el que deber recogerse por
burbujeo del vapor de arrastre en una solucin cida de concentracin conocida.

Existen dos posibilidades de medio cido receptor : solucin de cido Brico al 2% (o al 4%) o una solucin valorada de
cido fuerte mineral ( Clorhdrico o Sulfrico).
En la mayora de los casos se opta por el Brico, ya que es menos riesgoso el manejo del mismo, tampoco hay riesgo de
prdidas de Amonaco y corresponde a la mayora de los mtodos oficiales de anlisis.

BUCHI ofrece distintos modelos de destiladores: semiautomticos, como los modelos K-350 y K-355, en que el aadido del
agua y cido puede hacerse de manera manual o mediante bomba de diafragma, o como el modelo B-324, en donde la
dosificacin se hace exclusivamente mediante bombas de diafragma, evitando la incertidumbre provocada por el operado
en la medicin de volmenes de lquidos.

Una vez iniciada la destilacin, luego de 3 a 5 minutos se completa el arrastre y disolucin del Amonaco , debiendo
procederse a la valoracin mediante una titulacin.

3. VALORACIN.

En esta etapa se cuantifica la cantidad de Amonio formado, lo que permite medir la cantidad de Nitrgeno presente en la
muestra original y que a su vez, conociendo el origen de la muestra y a travs de un factor promedio, establecer el
porcentaje de protenas del que se parti.

La reaccin de la valoracin, responde a:

(Ver 3ra Frmula)

Para efectuar la titulacin, an cuando existe la posibilidad de la valoracin visual mediante el uso de indicadores
cido/base y la normativa no establece la obligacin de su uso, es muy recomendable la valoracin potenciomtrica
utilizando un titulador automtico, que detectar el punto final de acuerdo al pH final alcanzado.
Entre las ventajas de la valoracin potenciomtrica, la deteccin del punto final es muy precisa, permitiendo

independizarse de la estimacin visual del operador, disminuyendo la dispersin de los resultados y la incertidumbre que
provocaran distintos operadores que debieran fijar el punto final mediante el uso de indicadores cido/base.

Al tener en el inicio de la valoracin slo una disolucin de cido brico en agua, su pH es 4,65. Una vez finalizada la
etapa de la Destilacin, el Amonaco solubilizado provoca que el pH sea mayor, por lo que se deber valorar dosificando
un cido de concentracin conocida , por ejemplo Acido Sulfrico 0.5 N, hasta alcanzar nuevamente el valor inicial de pH
4,65.

BUCHI ofrece la posibilidad de operar con el modelo B-370, que es un DESTILADOR con un TITULADOR AUTOMATICO
incorporado, por lo que se unifican las etapas de Destilacin y Valoracin, programndolo para que efecte ambas
operaciones de manera combinada y consecutiva, brindando de manera automtica el resultado final.

En caso de ser necesario un muestreador debido a la presencia de gran cantidad de muestras, se le puede adosar un
portamuestras identificado por BUCHI como B-371, que permitir automatizar completamente las etapas de destilacin y
valoracin hasta 20 muestras.

Otra posibilidad sencilla se presenta para aquellos que quieran optar por una valoracin mediante un titulador automtico,
es el uso del nuevo modelo DL 15 presentado por METTLER poco tiempo atrs; robusto, fcil de manejar y preparado
para valoraciones potenciomtricas a punto final, permitir obtener resultados precisos que ahorrarn tiempo y errores en
los resultados finales de protenas a informar, con el consiguiente ahorro de dinero.

CALCULOS
%P = ( V -- VB ). 1,4007 . N . 100/m

donde:
%P: porcentaje de protenas en la muestra,
V: volumen de cido consumido durante la valoracin de la muestra, (mililitros)
VB: volumen de cido consumido durante la valoracin del blanco, (mililitros)
N: Normalidad del cido titulante
M: masa de la muestra (gramos)

F: Factor de protena, acorde al origen de la muestra gelatina (5,55) leche, (6,30),

Carne bovina (6,25), pescado (6,25), aceite vegetal (5,40), maz (6,25)

Por la consistencia de los resultados obtenidos durante los 120 aos transcurridos desde su desarrollo inicial por Kjeldahl,
es que se la considera altamente recomendable, atrevindonos a augurar su uso por mucho tiempo ms en la industria
naciona

l.