EL CIDO DOCOSAHEXAENOICO DHA Y CIDO ARAQUIDNICO ARA SON

SUPLEMENTOS FUNDAMENTALES PARA LA INDUCCIN DE LA DIFERENCIACIN

NEURONAL
La terapia de reemplazo celular abstracta est siendo investigado para el
tratamiento de trastornos neurodegenerativos. Adulto clulas madre
mesenquimales derivadas de mdula sea autlogo (MSCs) han sido inducidas
a diferenciarse en neuronas como clulas que albergan una variedad de
marcadores neuronales y la transcripcin factores. Tejido neural contiene
caractersticamente alta proporciones de cido docosahexaenoico (DHA) y
araquidnico cido (AA). En este estudio, la evaluacin del cido graso el perfil
de las clulas similares a neuronas diferenciadas revel una muy bajo nivel de
DHA, similar a la de MSCs pero diferentes de las neuronas tpicas. La
suplementacin del medio con Solo DHA dio como resultado mayores niveles
de DHA, pero concomitante bajos niveles de AA. Sin embargo, la
suplementacin con DHA y AA produjeron un perfil de cidos grasos parecido la
del tejido neural. Tambin dio lugar a una mayor extensin de procesos
similares a neuritas, seas de identidad de la diferenciacin neuronal.
Estos hallazgos demuestran la esencialidad de DHA y AA suplementacin en el
proceso de inducido
la diferenciacin neuronal y tienen implicaciones importantes para el desarrollo
de estrategias de reemplazo celular de neural repair.-Kan, I., E. Melamed, D.
Offen, y P. Verde. El cido docosahexaenoico y cido araquidnico son
fundamentales suplementos para la induccin de la diferenciacin neuronal. J.
Lipid Res. 2007. 48: 513 a 517.
Clave clulas madre mesenquimales palabras complementarias y el
crecimiento de neuritas y
La terapia de reemplazo de clulas y cidos grasos poliinsaturados
Muchos trastornos neurodegenerativos se atribuyen a la
degeneracin de poblaciones neuronales especficas, con la consiguiente
prdida funcional. Aunque varios tratamientos tienen
ha demostrado que modificar el curso de la enfermedad, ninguno con xito
detenido la degeneracin. Debido a estos factores,
la terapia de reemplazo celular para reemplazar el neural degenerado
las clulas pueden servir como una alternativa valiosa para lograr significativa
mejora clnica.
Mesenquimales derivadas de la mdula sea autloga para adultos
clulas madre (MSCs) han sido ampliamente estudiados como candidatos para
la terapia de reemplazo celular de las enfermedades neurodegenerativas.
Varios laboratorios, incluyendo el nuestro, han demostrado que las MSC son
capaces de diferenciar ms all de tejidos de origen mesodrmico en clulas
similares a neuronas que albergan una variedad de marcadores neuronales y
factores de transcripcin) (1-7. Sin embargo, ninguno de estos estudios se
dirigi a la composicin de cidos grasos nica de las membranas neuronales,
a saber, la alta proporcin de cido PUFAs docosahexaenoico (DHA; 22: 6 n-3) y
cido araquidnico (AA; 20: 4 n-6) (8). DHA y AA son productos de
alargamiento de desaturacin de los cidos grasos de los padres, el cido alinolnico de los cidos grasos omega 3 (n-3) familia (18: 3n-3) y cido linoleico
de los omega 6 (n-6), la familia (18 : 2n-6), respectivamente. cido a-linolnico
y cido linoleico han sido identificados como cidos grasos esenciales, ya que
no son sintetizados de novo por los animales pero obtienen de plantas por la

dieta. Pueden, sin embargo, se someten a una serie de pasos de elongacindesaturacin en el organismo de mamfero para formar los derivados de
cadena ms larga (9). En el tejido neural, PUFAs son importantes para varios
aspectos del desarrollo y la funcin neuronal, incluyendo el crecimiento de
neuritas (10-14), transduccin de seales, y fluidez de la membrana (15-17).
Aunque DHA se encuentra en abundancia en el tejido neuronal, que no puede
ser sintetizado por las neuronas y tiene que ser suministrado por el endotelio
cerebrovascular y los astrocitos (18). En este estudio, hemos examinado la
diferenciacin inducida de las MSC en ausencia y presencia de suplementos
AGPI.
MATERIALES Y MTODOS
Aislamiento y cultivo de MSC humanas Este estudio fue aprobado por el Comit
de Helsinki del Ministerio de Salud de Israel y la Universidad de Tel Aviv. Se
aislaron las MSC como se ha descrito previamente (7) y se cultivaron en medio
de crecimiento que consiste en DMEM (Biological Industries, Beit-Haemek,
Israel) complementado con suero 15% de ternera fetal (Biological Industries), 2
mM L-glutamina (Biological Industries), y 100 mg / ml de estreptomicina, 100 U
/ ml de penicilina, y 12,5 U / ml de nistatina (SPN; Biolgica
Industrias). El medio se reemplaz dos veces por semana.
la diferenciacin neuronal
La diferenciacin neuronal fue inducida por un protocolo previamente descrito
(7). Brevemente, se reemplaz el medio de cultivo con medio de diferenciacin
I, que consiste en DMEM suplementado con 10% de suero de ternera fetal,
glutamina 2 mM, SPN, 10 ng / factor de crecimiento de fibroblastos bsico ml
(R & D Systems, Minneapolis, MN), 10 ng / epidrmica ml factor de crecimiento
(R & D Systems), y suplemento N2 (5 mg / ml de insulina, 20 nM de
progesterona, 100 mM de putrescina, 30 nM de selenio, y 100 mg / ml de
transferrina). Cuarenta y ocho horas ms tarde, el medio se reemplaz con
medio de diferenciacin II, que contiene DMEM suplementado con SPN, 2 mM Lglutamina, suplemento N2, 200 mM hidroxianisol butilado (Sigma, St. Louis,
MO), 1 mM de dibutiril AMP cclico (Sigma ), 3-isobutil-1-metil-xantina (Sigma),
y 1 mM de cido todo-trans-retinoico (Sigma), durante 48 h.
Suplementos de cidos grasos y el anlisis
Varias concentraciones y combinaciones de DHA y AA, junto con 1% de suero
de caballo y diluidas en DMEM y a-tocoferol (40 mM), disuelto en etanol, se
aadieron a la diferenciacin medio I.
Despus de la aspiracin del medio, los cultivos se lavaron con PBS y los lpidos
se extrajeron con hexano (BioLab, Jerusaln, Israel) -isopropanol (Sigma) (3: 2,
v / v) que contiene 5 mg / 100 ml hidroxitolueno butilado (Sigma) como un
antioxidante y 0,5 mg / 100 ml de cido heneicosanoico (21: 0; Sigma) como

estndar interno. Los cidos grasos se convirtieron en steres metlicos de

cidos grasos calentando con 14% de trifluoruro de boro en metanol (Sigma) y
se separaron en columnas capilares en un HP 5890 serie II cromatgrafo de
gases equipado con un detector de ionizacin de llama. reas de los picos se
integraron y se representan con la ayuda del paquete de equipo Varian estrella
Integrator. steres metlicos de cidos grasos individuales se identificaron
mediante la comparacin de los tiempos de retencin con los de patrones
autnticos. Se document La cantidad de cido graso individuo como el
porcentaje en peso del total de 25 cidos grasos identificados (media 6 SEM).
marido.
La inmunocitoqumica
Las clulas fueron fijadas con paraformaldehdo al 4% y se permeabilizaron con
0,5% Triton X-100 (Sigma). Doble etiquetado de inmunofluorescencia se realiz
usando protena asociada a microtbulos anti-ratn 2 (1: 250; Zymed, San
Francisco, CA) y de cabra anti-ratn AffiniPure Cy2-conjugado (01:50; Jackson,
West Grove, PA). Los ncleos se contratieron con dihidrocloruro de 4,6diamino-2-fenilindol (Sigma).
mediciones de neuritas
Las clulas se tieron con anticuerpo anti-protena asociada a microtbulos 2,
para revelar el compartimento somatodendrtico, y 4,6- diamino-2-fenilindol
tincin nuclear dihidrocloruro y se fotografiaron con un microscopio de
fluorescencia Olympus IX70-S8F2. La longitud total de neuritas por neurona se
determin midiendo las longitudes neuritas individuales con Image-Pro: Plus
software (medios de comunicacin ciberntica, Silver Spring, MD) y sumarlos
por neurona. Se analizaron al menos 20 clulas similares a neuronas no
agrupados para cada grupo de tratamiento.
Estadstica
La significacin estadstica de las diferencias en la longitud de las neuritas
media entre los grupos de tratamiento se determin mediante muestras
independientes t-test.
RESULTADOS
La diferenciacin neuronal inducida no afecta a las concentraciones celulares
de DHA y AA Las concentraciones de DHA y AA en las clulas similares a
neuronas diferenciadas fueron 3,82 6 0,17% y 7,17 6 0,30%, respectivamente
(Fig. 1). Estos valores no difirieron significativamente de los de MSCs no
diferenciadas (3,00 6 0,13% y 8,69 6 0,63%, respectivamente) (Fig. 1). La
suplementacin de DHA aumenta en gran medida la concentracin de DHA en
clulas similares a neuronas, pero a expensas de la disminucin de AA La

suplementacin de DHA en concentraciones de 30, 40, 50, y 60 mM dio lugar a

una, continua dependiente de la dosis
aumento en los niveles de DHA celulares. Sin embargo, se observ una
considerable disminucin concomitante en la concentracin de AA (Fig. 2).
Combinadas de DHA y AA suplementacin da como resultado una composicin
de cidos grasos celulares similares a neuronas Para evitar que la mayor
disminucin de AA en clulas similares a neuronas que se activan por la
suplementacin de DHA, que complementan el medio de diferenciacin tanto
con AA y DHA. Despus de la adicin de 30, 40, y 50 mM DHA y
concentraciones iguales, respectivamente, de AA, los niveles de DHA
aumentaron de una manera dependiente de la dosis, mientras que la
concentracin de AA se mantuvo estable (Fig. 3). La combinacin de 40 mM
DHA y AA 40 mM dio lugar a una proporcin final de 8,93 6 0,24% de DHA y
7,93 6 0,24% AA en clulas similares a neuronas. Estos valores, as como su
proporcin de la fig. 1.

El cido docosahexaenoico (DHA) y concentraciones en las clulas madre

mesenquimales (MSCs) antes y despus de la diferenciacin neuronal inducida
por el cido araquidnico (AA). La composicin de cidos grasos de las clulas
se determin por cromatografa de gases de los steres metlicos de cidos
grasos, como se describe en Materiales y Mtodos. MSC indica MSC
diferenciacin neuronal antes inducida (n 5 18); Dif. indica MSCs despus de la
induccin de la diferenciacin (n 5 33).
Los valores se expresan como porcentaje en peso de cidos grasos totales
identificados (6 significa SEM).

Fig. 2. DHA y AA concentraciones despus de la suplementacin con

DHEA. La diferenciacin neuronal fue inducida ya sea sin DHA (0 mM) o con la
administracin de suplementos de concentraciones crecientes de DHA (30, 40,
50, y 60 mM), tal como se describe en Materiales y Mtodos. La composicin de
DHA y AA, de las clulas se determin por cromatografa de gases de los
steres metlicos de cidos grasos, como se describe en Materiales y Mtodos.
Los valores se expresan como porcentajes en peso de cidos grasos totales
identificados (6 significa SEM; n 5 6). 1,13 6 0,05, se consideraron para
asemejarse mejor las concentraciones de estos cidos grasos en el tejido
neural. Por lo tanto, la combinacin de 40 mM DHA y AA 40 mM fue elegida
para experimentos adicionales.
Combinadas de DHA y AA suplementacin resultados mejorados en
culturas desarrollo de neuritas
suplementadas con DHA y AA durante la diferenciacin neuronal inducida
mostraron un aumento en la poblacin de neuronas con neuritas ms largas
longitudes totales (de 50-200 mm y superior) y una disminucin en el nmero
de neuronas con longitudes totales de neuritas ms cortas (de 0-50 mm) (Fig.
4). En particular, 33% de las clulas similares a neuronas que se diferencian sin
suplementacin PUFA tenido longitud total de las neuritas de al 0-50 mm, y
67% tienen longitud total de las neuritas de 50-200 mm de alto. Clulas
similares a neuronas que se diferencian con los suplementos de cidos grasos
poliinsaturados tenido una distribucin de frecuencias diferentes: 9% tenan
una longitud total de neuritas

Fig. 3. DHA y AA concentraciones despus de la suplementacin con DHA y AA.

La diferenciacin se indujo ya sea sin PUFAs (Dif.) O con la administracin de
suplementos de diferentes concentraciones (diff.1 bocanada) de DHA y AA,
como se describe en Materiales y Mtodos. Dif. indica MSCs despus de la
diferenciacin neuronal inducida. Los valores se expresan como porcentajes en
peso de cidos grasos totales identificados (6 significa SEM; n 5 5).

Fig. 4. Efecto de la suplementacin de DHA y AA de la longitud de las neuritas

de clulas diferenciadas. La longitud de las neuritas de las clulas
diferenciadas se determin en ausencia (Dif.) Y la presencia de 40 mM y 40 mM
AA (diff.1 PUFA), como se describe en Materiales y Mtodos. Dif. indica MSCs
despus de la diferenciacin neuronal inducida.
de 0 a 50 mm, y el 91% tena una longitud total de neuritas de 50- 200 mm y
superiores. Por otra parte, despus de la suplementacin PUFA, la suma del
total de longitudes de neuritas en 21 clulas similares a neuronas aument de
1,432 a 2,514 mm. La diferencia observada en la longitud de neuritas por
neurona total de entre las clulas similares a neuronas tratadas con DHA y las
clulas de control fue estadsticamente significativa (P 5 0.025, por muestras
independientes t-test).
DISCUSIN

Este estudio mostr que el perfil de cidos grasos de las clulas neuronlike
derivados de MSCs despus de la diferenciacin inducida era notablemente
diferente del perfil de cidos grasos del tejido neural (19) y se pareca el perfil
de cidos grasos de la MSCs. Al complementar el medio de diferenciacin con
DHA y AA, tuvimos xito en la consecucin de un perfil de cidos grasos celular
del tejido neural. Por otra parte, estas clulas neuronlike exhibieron mejoran el
crecimiento de neuritas. Por la presente informamos que a pesar de las MSC
derivadas de mdula sea diferenciada alcanzan las caractersticas de las
clulas neuronales (7), carecen de su perfil tpico de cidos grasos (19), la
principal diferencia es un menor nivel de DHEA. La importancia de la
suplementacin adecuada de DHA en el cerebro se ha demostrado
ampliamente (20). Sin embargo, las neuronas no pueden realizar el paso final
en la biosntesis de DHA y depender de su suministro continuo. En este
estudio, el medio de induccin neuronal contena cantidades muy pequeas de
AA y casi nada de DHA (datos no mostrados). La suplementacin de DHA
aument la concentracin de DHA celular sino que tambin condujo a una
disminucin en la concentracin de AA. Este efecto de la suplementacin de
DHA se ha observado previamente (21). Debido a que ambos PUFAs son crticos
para la funcin neuronal, hemos decidido aadir DHA y AA para el medio de
diferenciacin en un intento de conseguir la composicin tpica de cidos
grasos neuronal. Despus de los ensayos con varias combinaciones de dosis,
se encontr que la suplementacin de la differentiationmedium con 40
mMDHAand 40 MMAA dio lugar a valores de perfil de cidos grasos celulares
parecidas a las de las clulas neuronales de la regin del cuerpo estriado (19).
Adems, la diferenciacin enriquecido produjo el DHA relacin A / AA invertida
(DHA / AA. 1) que caracteriza a las neuronas tpicas.
Los cultivos de clulas de origen neuronal se han complementado con
anterioridad con DHA, principalmente en experimentos que exploran el papel
del DHA en las neuronas (13, 22). A pesar de que se han logrado aumento de
las concentraciones de DHA, las proporciones bsicas de DHA y AA no
cambiaron. Esta es la primera vez, sin embargo, que las clulas no neuronales
de origen de mdula sea (MSC), inducidas a diferenciarse en neuronas,
alcanzan el perfil de cidos grasos celular que caracteriza a las neuronas
tpicas. Cabe mencionar que, en ausencia de la induccin neuronal, MSCs no
alcanz un perfil de cidos grasos neuronal despus de PUFA enriquecimiento
del medio de crecimiento (datos no mostrados). Por lo tanto, tanto la induccin
neuronal y la suplementacin con PUFA, especialmente DHA, son necesarios
para MSCs para alcanzar caractersticas neuronales. Uno de los pasos crticos
en la diferenciacin neuronal es el resultado de los procesos neuronales
(dendritas) y axones, que establecen la polaridad estructural y funcional de la
neurona (23, 24). Se ha demostrado anteriormente que en el curso de
induccin neuronal, MSC humanas se desarrollan caractersticas celulares de
neuritognesis y la sinaptognesis similares a las observadas en neuronas
inmaduras (25). En este estudio, la adicin de 40 mM DHA y AA 40 mM al

medio de diferenciacin de induccin mejorado el crecimiento de neuritas de

las clulas similares a neuronas. Varios estudios han demostrado tanto un
aumento en la poblacin de neuronas con neuritas ms largas y un mayor
nmero de ramas despus de la administracin de suplementos de DHA y AA,
lo que indica un posible papel de estos PUFAs en la promocin de la
diferenciacin neuronal (10 14). En estos experimentos, AA y DHA en
concentraciones de 1,5 a 60 mM aumentado significativamente el crecimiento
de neuritas en varios tipos de clulas de origen neuronal. La novedad de
nuestro estudio radica en el hecho de que el mismo efecto se observ con las
clulas de origen mesenquimal diseado para convertirse en neuronas. Los
mecanismos moleculares que subyacen a la contribucin de DHA y AA para el
crecimiento de axones no se conocen, y varias posibilidades se han planteado.
Estos incluyen la estimulacin de la sntesis de fosfolpidos requerida para el
alargamiento de las neuritas y la expansin de la membrana y la modulacin
de las vas de transduccin de seales implicadas en el crecimiento de
neuritas. Claramente, se necesitan ms estudios para establecer el mecanismo
exacto (s) de PUFA crecimiento de neuritas inducida en las MSC de someterse a
la diferenciacin neuronal inducida in vitro. En conclusin, hemos demostrado
la necesidad de DHA y los suplementos de AA a las MSC en el proceso de
diferenciacin neuronal inducida. La composicin de la membrana de las
clulas diferenciadas es una caracterstica importante que influye en su
integracin, la formacin sinptica, y la funcin. Por lo tanto, la consecucin de
un perfil de cidos grasos neuronal durante la diferenciacin neuronal inducida
es un paso esencial en la induccin de las clulas madre en neuronas
funcionales Este trabajo se realiz en cumplimiento parcial de los requisitos
para un Ph.D. grado de I.K. Los autores agradecen a Aviva Kluska, Dr. Yossef
Levy, el Dr. Shlomo Bulvik, y el Consejo Editorial Beilinson por su ayuda. Esta
obra fue financiada en parte por el Comit Pblico para la designacin de los
fondos inmobiliarios, el Ministerio de Justicia, Israel (PG, DO), por la Fundacin
Nacional de la Enfermedad de Parkinson, EE.UU. (DO, EM), y por la Norma y
Alan Aufzein Ctedra de Investigacin de la Enfermedad de Parkinson (EM).