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Laboratorio n 5

Extraccin de ARN a partir de bacterias (kit ARN)


Snchez Karen 1610906, Bustos Cindy 1610911, Villamizar Sindy 1610933
Universidad Francisco de Paula Santander
Facultad de ciencias agrarias y del ambiente
Ingeniera biotecnolgica
RESUMEN
Durante la extraccin de ARN bacteriano es de vital importancia conocer el protocolo a
seguir y diferenciar cada una de sus etapas y el tiempo de cada una. La metodologa que se
va a utilizar en esta prctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa, igualmente el
ADN y las protenas pueden ser recuperados de la fase orgnica por precipitacin
secuencia, as con etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitacin
adicional pueden recuperarse las protenas de la fase orgnica. Esta tcnica permite obtener
ARN a partir de pequeas cantidades de tejido y clulas en cultivo o suspensin de origen
humano, vegetal, animal o bacteriano. As mismo el ARN obtenido si se realiza el
procedimiento con precaucin est libre de contaminacin con ADN y protenas y
finalmente puede ser utilizado en diferentes procedimientos. (Pabn, 2014)
Palabras claves: Fase orgnica, ARN, precipitacin.
ABSTRACT
During bacterial RNA extraction it is vital to know the protocol to follow and differentiate
each of its stages and time of each. The methodology to be used in practice, retrieve the
RNA from the aqueous phase, also DNA and proteins can be recovered from the organic
phase by precipitation sequence and ethanol is achieved precipitate the DNA of the
interface and further precipitation can recover proteins from the organic phase. This
technique allows obtaining RNA from small amounts of tissue and cells in culture or
suspension of human, plant, animal or bacterial origin. Also the RNA obtained if the
procedure is performed with caution is free from contamination with proteins and DNA and
can eventually be used in different procedures.
Keywords: organic phase, RNA, precipitation

INTRODUCCIN

1. Homogeneizacin de la muestra

En los organismos celulares el ARN es la


molcula encargada de dirigir la sntesis
de protenas, pues aunque el ADN es el
que contiene la informacin que
determina la estructura de estas, no puede
actuar solo y se vale del ARN para
traducir esta informacin y producir las
protenas necesarias para el desarrollo y
actividades de la clula. La mayor
dificultad en la extraccin del ARN es
evitar la contaminacin con RNAsas,
enzimas muy estables que no requieren
cofactores para su funcin. (Martinez,
203).El RNA es el cido nucleico ms
abundante en la clula, y puede
purificarse fcilmente. Una clula tpica
contiene 10 veces ms RNA que DNA. El
azcar presente en el RNA es la ribosa,
que posee un grupo hidroxilo (OH) libre
en la posicin 2'. Este grupo participa en
la formacin de un intermediario en el
mecanismo de hidrlisis y determina que
el RNA sea qumicamente inestable, y se
hidrolice fcilmente en una solucin
acuosa alcalina. En la mayor parte de los
casos, el RNA es un polmero
monocatenario (ssRNA), pero las
secuencias
nucleotdicas
de estas
molculas poseen, en mayor o menor
medida, regiones complementarias que
determinan tramos de apareamientos
intracatenarios (estructura secundaria en
forma de dsRNA). Las RNAsas utilizan el
mismo mecanismo que se observa en la
catlisis alcalina, pero la mayora de estas
enzimas
atacan
exclusivao
preferentemente la ssRNA. (Fonseca,
2014). Existen tres pasos fundamentales
en la extraccin de un cido nucleico
(DNA o RNA):

Permite la disgregacin de la estructura


tisular y celular para facilitar la salida de
los cidos nucleicos. Dentro de los
mtodos para la homogenizacin
podemos mencionar los fsicos como la
sonicacin,
hervido,
congelacindescongelacin, choque osmtico, etc.;
los qumicos como la utilizacin de
detergentes (SDS) y tambin los
enzimticos como la lisozima, la
proteinasa K, etc. El agregado de
quelantes de magnesio, como el EDTA, a
las soluciones de extraccin contribuye
tambin a la reduccin de la integridad
de las membranas.
2.

Separacin y Purificacin

Permite la eliminacin progresiva de


protenas y otros contaminantes celulares
y la obtencin de un material gentico
cada vez ms limpio. En el caso del
fenol-cloroformo, el primero se utiliza
para la desnaturalizacin y solubilizaran
de las protenas y componentes celulares
y el cloroformo permite la separacin de
las fases durante la centrifugacin,
adems de tambin ser desnaturalizante.
3. Precipitacin
Permite la obtencin del cido nucleico
listo para ser almacenado o diluido a la
concentracin
deseada
para
su
utilizacin. Este paso se realiza mediante
el agregado de 1 volumen de isopropanol
o 2 a 3 volmenes de etanol.

OBEJTIVOS
Identificar las etapas y fundamentos
indispensables para la extraccin de
ARN bacteriano.
Adquirir conocimiento bsico para el
manejo y cuidado de ARN extrado.
Realizar un procedimiento comercial
y accesible para la obtencin de ARN.
MATERIALES

Reactivos
Fenol
Etanol
Procedimiento
Isopropanol

Equipos
Vortex
Microcentrifuga

Se tomaron 2ml de
cultivo de bacterias
(E.
coli),agregandose a
un microtubo 2ml,
se
llevo
a
centrifugar 14.000
rpm 30" a 4C.
Luego se desecho
el sobrenandante,
aadiendose 2ml de
sln de lavado y se
centrifugo.
luego se desecho
nuevamene
el
sobrenadnte y se
resuspendio en 200
l de H2O sin
ARNasas.

se paso la suspension a
un tubo nuevo de 2ml
(contiene perlas circonosilica) y se aadieron 500
l sln detergente, 500 l
fenol acido y 100 l
cloroformo:Isoammilico
se llevo al vortex,
posteriormente
incubandos en hielo 10';
luego se centrifugo a
10.000 rpm 10' a 4C.
se paso la fase acuosa a
un microtubo de 1.5 ml y
se aadio un volumen
(1:1)
de
cloroformo
isomilico. Se mezcl por
inversin,
centrifugandose a 14000
rpm 5' a 4C.

se paso la fase
acuosa
a
un
microtubo de 1.5
ml, aadiendole 500
l
de
sln
isopropanol
e
incubar a -20 C
por
30',
luego
centrifugamos
a
14000 rpm 15' a 4
C.
se
desecho
el
sobrenandante,
aadiendose 400l
de
etanol
75%
mezclar
por
inversion,
centrifugando
a
14000 rpm 5' a
4C , luego deseche
el sobrenadante.
se
dejo
secar,
resuspendiendose
en TE.

RESULTADOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Poz
o

RN
A

Fuente:
Laboratorio
de
biologa
molecular. En la extraccin de ARN a
partir de bacterias (E. coli)
En esta imagen se puede observar, el
resultado obtenido, luego de realizar el
protocolo para la extraccin de ARN a
partir de bacterias (kit ARN), en esta
prctica trabajamos con cepas de E.coli,
las cuales son las ms comnmente
utilizadas para realizar este tipo de
procedimientos.
El pozo correspondiente a nuestro grupo,
es el nmero 11, en el cual se puede
observar mediante la electroforesis, la
presencia de ARN, esto quiere decir que
se realiz el protocolo de manera
correcta, por lo tanto, se pudo obtener el
resultado esperado. Al igual que los pozos
1, 4, 5, 6, 7; en los cuales es ms notable
la presencia de ARN. En los pozos, 9, 10,
12 y 13; la presencia de ARN fue mnima;
y, en los pozos, 2, 3, y 8 no se observ la
presencia de ARN.

DISCUSIONES
En la prueba de electroforesis se pudo
evidenciar un resultado exitoso debido a
que hubo un correcto desarrollo del
protocolo expuesto por la docente.
Es muy importante conocer los materiales
y reactivos que se utilizaron durante este
protocolo, ya que cualquier error a la hora
de pipetear o aadir reactivos se vern
afectados en los resultados que se desean
obtener.

El procedimiento se basa en la lisis


mecnica de las clulas bacterianas
embebidas con una solucin detergente
seguido de extraccin orgnica sucesiva
con
fenol
cido,
cloroformo
y
precipitacin con isopropanol.

Cada vez que se vaya a retirar el


sobrenadante es muy importante tener un
estricto cuidado de no tomar la muestra
de la parte inferior del microtubo.

CUESTIONARIO

a. cul es
la
funcin del
dietlpirocarbonato
(DEPC)
durante la extraccin del RNA?
(Salamanca, 2015)
Es una sustancia qumica que elimina
Ribonucleasas, enzimas capaces de
degradar el RNA. Se prepara adicionando
el compuesto DEPC, 0.01 ml por cada
100 ml de agua. Con el agua DEPC
puedes disolver RNA aislado de cualquier
tejido, pues esta agua ya no tendr
ribonucleasas que degraden el RNA.

b. qu otras tcnicas comerciales


existen para extraer ARN?
Mtodo
comercial
basado
en
Tioisocianato de guanidina (Trizol,
Invitrogen) (Chomczynski, 1993); el
mtodo basado en CTAB (Chang et al.,
1993; Lpez et al., 2006), y el mtodo
fenol/cloroformo (Schneiderbauer et al.
GIPS: (Valera, 2014) El mtodo utilizado
con ms frecuencia es el de GIPS (por sus

siglas en ingls; acido tiosanato de


guanidina, fenol, sarcosyl) desarrollado
por Chomczynski y Sacchi (1987). Cada
uno de estos componente juega un papel
especfico: el cido tiosanato de
guanidina es sumamente fuerte y tiene un
alto poder denaturalizante; el fenol, al
estar acidificado, provoca que el ADN se
acumule en la interfase entre la fase
acuosa y la del fenol, dejando al ARN en
la fase acuosa; el sarcosyl, por su parte, es
un detergente muy potente que ayuda a la
lisis celular, pero no reemplaza la ruptura
fsica de las clulas que generalmente se
logra con micro esferas de vidrio agitadas
con la ayuda de un vrtex o de un
homogenizador celular (como BeadBeater). Sin embargo, es importante tratar
las muestras con ADNasas libres de
ARNasas.
BOOM: El mtodo BOOM, desarrollado
por Boom et al. (1990) lleva a cabo la
extraccin con el cido tiosanato de
guanidina, separando los cidos nucleicos
con base en su alta afinidad para
enlazarse en matrices de slica, en vez de
utilizar fenol. Dado que este mtodo aisla
tanto ADN como ARN, resulta esencial
utilizar las nucleasas especficas para
ADN que lo eliminen de la muestra.
Algunas compaas han creado paquetes
de extraccin basados en este principio,
que utilizan matrices de slica diseadas
para favorecer el enlace de ARN (como
RNeasy de QIAGEN). Las molculas
grandes de ARN, incluyendo ARNr y
ARNm, son insolubles en soluciones con
altas concentraciones de sal, por lo que
durante su precipitacin es comn utilizar
cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas) e
incubar.

c. qu inhibidores de nucleasas
existen y en que procedimientos
deben utilizarse? (Cultek, 2016)
Tampn Tris-EDTA (TE): es un
inhibidor de nucleasas y un buen tampn
para la conservacin del ADN. El EDTA
inhibe la PCR a concentraciones
superiores a 1mM.
Fenol: desnaturaliza las protenas
contaminantes de la muestra. Se usa para
eliminar
la
protenas
(proteasas,
nucleasas...); disminuye el rendimiento de
la PCR a concentraciones del 0,2% y al
0,5% la inhibe completamente.
Cloroformo: permite la separacin
de 2 fases; el ADN queda en la fase
acuosa y en la fase orgnica quedan las
protenas y otros contaminantes.
Etanol e isopropanol: precipitan
los cidos nucleicos. Tienen efectos
inhibitorios a concentraciones superiores
al 1%
- Isotiocianato de guanidinio: es un
agente caotrpico (favorece la disolucin
en agua de compuestos insolubles) que
inhibe las RNasas y conserva el ARN
-El SDS es un detergente inico que
desnaturaliza las protenas pero tambin
inhibe la PCR a concentraciones
mnimas.
-Otras sustancias que presentan efectos
inhibitorios sobre la PCR son el cloruro
sdico, la hemoglobina, la heparina o la
urea.
d. A partir de que otras muestras
puede realizarse la extraccin de
ARN y con qu objetivo se

realizan estas
extraccin?

muestras

de

Se pueden utilizar diferentes muestras,


cada una de ellas con diversos objetivos
como por ejemplo:
Comparacin de mtodos de extraccin
de RNA para la deteccin por RT-PCR del
Potato yellow vein virus (PYVV) en
diferentes rganos de Solanum tuberosum
Grupo Phureja (Katherine*, 2013).

CONCLUSIONES
Mediante la realizacin de este
protocolo se pudo identificar las
etapas y fundamentos indispensables
para la extraccin de ARN bacteriano.
Se pudo comprobar que una de las
metodologas ms sencillas es la que
se utiliz en este trabajo prctico y
consiste en la utilizacin de un
detergente suave como es el SDS
para el lisado de las clulas que se
combina con la muestra de manera de
favorecer la solubilizaran del
material.
Para obtener una excelente extraccin
de ARN bacteriano es importante
seguir paso a paso el protocolo con la
ayuda del docente.
BIBLIOGRAFIA
Cultek. (04 de abril de 2016).
Obtenido de

http://www.cultek.com/aplicac
iones.asp?
p=Aplicacion_AN_Purificacion
&opc=tecnicas&idap=34
Fonseca, M. L. (12 de septiembre de
2014). ARN. Obtenido de
https://www.biol.unlp.edu.ar/b
ioquimica3/TP4-09.pdf
Katherine*, H. G. (01 de julio de
2013). Obtenido de
http://www.scielo.org.co/pdf/b
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Martinez, L. (14 de Octubre de 203).
Enzimas de ARN. Obtenido de
https://biologiamolecularinter
activa.
Pabn, L. M. (15 de Octubre de
2014). Extraccin de ARN.
Obtenido de
https://biologiamolecularinter
activa.files.wordpress.com/20
13/01/laboratorio-no-4extraccion-de-arn.pdf
Salamanca. (2015). Protocolo de
Extraccin de ADN por Buffer
G.T. (Guanidil Tiosulfato) .
Obtenido de
http://tesis.uson.mx/digital/te
sis/docs/22543/Anexo.pdf
Valera, L. I. (2014). Captulo 16.
extraccin de cidos
nucleicos. Obtenido de
http://www2.inecc.gob.mx/pu
blicaciones/libros/530/cap16.
pdf

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