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25 Avril.

2016
Nom : Mokhtari
Prnom : Amazigh
Groupe : B4

[ TP N4 DE BIOCHIMIE
METABLOIQUE]
[EFFET DE LA TEMPRATURE SUR LA DNATURATION
DES PROTINES CHEZ BACILLUS SP.]

But du TP :
Dans ce TP il est question de dterminer leffet que peut
avoir la temprature sur la structure des protines , ceci en
comparant deux chantillons dextrait protique de bactrie
cultiv 25C et lautre 37C en utilisant la mthode de
Bradford.

Introduction :

La mthode traditionnelle pour le calcul de la concentration en protines d'un chantillon inconnu est
d'utiliser une courbe standard qui est gnre partir des protines talons connus.
L'estimation des protines la plus fiable est ralise en utilisant une rfrence ou un type de protine
qui possde des proprits similaires la protine estime. Souvent, il est difficile de trouver un type
de protine avec des proprits similaires l'chantillon en cours d'analyse. En consquence, il est
devenu acceptable d'utiliser des protines facilement disponibles telles que l'albumine de srum bovin
(BSA) et gammaglobuline comme normes. En utilisant soit la BSA ou bovine -globuline (IgG) en tant
que protines de rfrence ( dans notre TP la protine rfrence sagit dovalbumine ), lanalyse
Bradford de protines font apparatre une variation importante de protines protine; Par
consquent, le rsultat calcul est une estimation de la concentration en protines.

Principe :
Afin de pouvoir tablir leffet de la temprature sur la dnaturation des protines , nous allons
comparer deux extraits protiques issus de deux cultures bactriennes distinctes une incube 25C
et lautre 37C , afin dtablir leurs concentration nous utiliserons la mthode Bradford qui consiste
dterminer la concentration protique dune solution grce son absorbance en la comparant
labsorbance de protine talon (ovalbumine) dont les concentration sont dj connus, le test de
Bradford est bas sur l'observation que l'absorbance maximum pour une solution dacide de bleu de
Coomassie G-250 change subitement de 465 nm 595 nm lors de sa liaison une protine. Les deux
interactions hydrophobes et ioniques stabilisent la forme anionique du colorant, ce qui provoque un
changement de couleur visible

Matriels et mthodes

Prparation de ltalonnage : afin dtablir notre standard de comparaison nous


prparerons des dilutions en cascade de notre protine standard : lovalbumine,
ces concentration connus nous permettrons par la suite dtablir une droite
rfrence de comparaison :
Dans un tube essai effectuer une dilution au 1/10 de la solution dovalbumine
5.2mg/ml ceci en y mettant 100 ml dovalbumine avec 900 ml deau distille en
utilisant la micropipette. Prparez au pralable 3 tubes contenant 500 ul de NaCl
mettre dans le premier tube 500 uL de la solution mre puis en extraire de ce
dernier 500 uL transvaser dans le deuxime tube puis faire de meme pour le

troisime partir du deuxime , extraire aussi 500 uL de la solution mre quon


dispose dans 500 ul de NaCl , ensuite rajouter aux quatre tube 1500 uL du ractif
de Baradford .
Prparation du blanc : afin dtalonner le spectrophotomtre nous aurons besoins
dun blanc qui se compose de 30 uL de NaCl ( 100mM ) avec 1500 uL du ractif de
Bradford ( celui-ci nous servira de point zro )
Prparation des chantillons tester : effectuez une dilution au 1/100 des deux
extrait dans deux tube ceci en y versant 10uL de chaque extrait avec 990 uL deau
distille grce la micropipette , en extraire 30 uL de chaque solution quon verse
dans deux tube contenant 1500 uL du ractif de Bradford laisser incuber et passer
les extrait lanalyse spectrophotomtrie.

Rsultats et discutions :
Extraits
1
2
3
4
25C
37C

Absorbance
0.3
0.866
0.265
0.348
-0.301
-0.143

En liminant les rsultats improbables nous obtenons cette courbe rfrence :

Abs
700
600
500
400
300
200
100
0

50

100

150

200

250

300

350

Rsultats attendus : si les mesure et le conditionnement des extrait tait optimal nous aurions
du obtenir une absorbance de lextrait 37C suprieur celle de 25 C dmontrant ainsi une
concentration plus faible due linfluence de la chaleur en dnaturant les liaisons protique et
en diminuant ainsi leurs production.
- Explication des rsultats obtenus : un mauvais condionnement des extrait protique qui
aurait du etre conserv 6C aurait pus engendrer une dnaturation des extrait ce qui
aurait conduit fauss les rsultats.
Conclusion : le test de Bradford a permis de prouver linfluence de la temprature sur les
protines en les dnaturant et en changeant leur conformation