BIOSINTESIS DE PENICILINA POR Penicillium chrysogenum.

REGULACION POR LA FUENTE DE CARBONO.

Emilio Alvarez y Leonila Liz

Introduccin
La ruta de biosntesis de la penicilina por P. chrysogenum es un proceso
que consta de tres etapas elaramente diferenciadas. La primera de ellas
consiste en la unin secuencial de los aminocidos L-a-aminoadpico,
L-cistena y L-valina para formar el tripptido lineal &-(L-a-aminoadipil)L-cisteinil-D-valina (ACV). La biosntesis "in vitro" del tripptido ACV se
lleva a cabo mediante la activacin de cada aminocido con el concurso de
ATP e iones magnesio. La reaccin est catalizada por la enzima ACV
sLlltetasa, una protena de alto peso molecular cuyas caractersticas
enzimticas an no estn completamente establecidas.

El siguiente paso de la ruta biosinttica de la penicilina consiste en la

delacin del tripptido ACV, proceso que origina la molcula de la
isopenicilina N. La isopenicilina N es el primer compuesto de esta ruta
biosinttica que tiene actividad antibitica. La cielacin del ACV es una
reaccin oxidativa durante la cual se produce la prdida de cuatro tomos de
hidrgeno por cada molcula de tripptido. Como consecuencia de esta
reaccin se forman dos anillos caractersticos de las penicilinas: un anillo
B-lactmico y un anino tiazolidnico.
El proceso de cielacin del ACV est catalizado por la enzima
isopenicilina N sintasa \) cielasa. Las caractersticas de esta eI1..zima, a
diferencia ue lo que ocurre con la mencionada anteriormente, se conocen con
bastante detalle. Hasta la fecha se han estudiado las ciclasas de bastantes
especies de microorganismos productores de antibiticos B-lactmicos
(Penicillium, Cephalusporium, Streptomyces) y se han clonado los genes que
codifican para dichas protenas (2).

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La ltima de las etapas de la ruta de biosntesis de la penicilina consiste en

el intercambio de la cadena lateral de la isopenicilina N (cido
a-aminoadpico) por el cido fenilactico, molcula que se aade al medio de
cultivo en calidad de precursor de la penicilina. La reaccin enzimtica se
lleva a' cabo "in vitro" en presencia de isopenicilina N y de fenilacetilcoenzhna A (una forma activada del cido fenilactico). Esta reaccin est
catalizada por la enzima acir-coenzima A:isopenicilina N aciltransferasa (1).
La penicilina puede ser sintetizada asimismo por acilacin directa del cido
6-aminopenicilnico (6-APA) mediante el concurso de la enzima
aciltransferasa y del fenilacetil-coenzima A La enzima aciltransferasa es
capaz de hidrolizar la isopenicilina N, en ausencia de fenilacetil-coenzima A,
y tambin muestra actividad hidroltica frente a diversas penicilinas,
liberando la cadena lateral y el ncleo de la penicilina (6-APA).

Desde hace bastante tiempo se conoce el efecto que ejerce la fuente de

carbono presente en el medio de cultivo sobre la produccin de distintos
metabolitos secundarios, y concretamente de los antibiticos. Este efecto,
conocido como regulacin catablica, est presente de una forma patente en
el caso de la biosntesis de la penicilina. La fuente de carbono utilizada
habitualmente en los cultivos encaminados a la produccin de penicilina es la
lactosa, azcar que no presenta el efecto antes descrito. Cuando se utiliza
glucosa como fuente de carbono se produce una drstica disminucin de la
biosntesis de penicilina.
El mecanismo molecular de la regulacin catablica an no est
completamente dilucidado. Se ha observado que la presencia de glucosa en el
medio de cultivo reprime la sntesis del tripptido ACV y de la isopenicilina
N sintasa, pero no de la enzima aciltransferasa (3).
Objetivo

El objetivo de esta prctica es el estudio del efecto de regulacin

catablica de la produccin de penicilina. Dicho efecto se hace patente
mediante la comparacin de la produccin de penicilina que se obtiene en un
medio de cultivo apropiado y en un medio de cultivo que contiene glucosa
como fuente de carbono. Asimismo se pretende. estudiar el efecto de la
adicin al medio de cultivo de un precursor de la cadena lateral de la
penicilina (cido fenilactico) sobre la produccin de dicho antibitico.

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Protocolo
Da 1
Inculo de matraces que contienen medio complejo de produccin de
penicilina (MCPP), normal o con diversas modificaciones en su composicin:
medio con lactosa, medio con glucosa y medio con lactosa y sin cido
fenilactico. Toma de muestras a Ohoras de cultivo. Incubacin a 25C.
Da 2
Toma de muestras a las 24 horas de cultivo.
Da 3
Toma de muestras a las 48 horas de cultivo.
Da 4
Toma de muestras a las 72 horas de cultivo.
La concentracin de penicilina en las muestras recogidas durante las
primeras 72 horas de cultivo se determina mediante bioensayo de las mismas,
utilizando Bacillus subtilis como microorganismo de referencia. El bioensayo
se lleva a cabo depositando 60 ,J de cada muestra en pocillos realizados en
placas de medio slido (TSA al 1 %) inoculadas con el microorganismo
sensible.
Da 5
Anlisis de los resultados obtenidos en el bioensayo del da precedente.

Apndice
Medio de cultivo MCPP
Pharmamedia, 20 g; Carbonato clcico, 5 g; Sulfato amnico, 4 g; Lactosa,
50 g; Acido fenilactico, 4 g.

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Preparacin de las placas de bioensayo

100 ml de TSA al 1 % se funden y se dejan enfriar hasta una temperatura
de 45~C. A continuacin se inoculan con 100 J de una suspensin de esporas
de B. subtilis. El medio se reparte en placas de Petri con 15 ,ml por placa y se
deja solidificar. Una vez solidificado el agar se procede a la realizacin de los
pocillos mediante un sacabocados.

Bibliograa
1. Alvarez E, Cantoral JM, Barredo JL, Dez B, Martn JF. Purification to
homogeneity and characterization of acyl coenzyme A:6-arninopenicillanic acid acyItransferase of Penicillium chrysogenum. Antimicrob
Agents Chemother 31, 1675-1682. 1987.
2. Ramos FR, Lpez-Nieto JM, Martn JF. Isopenicillin N synthetase of
Penicillium
chrysogenum,
an
enzyme
that
converts
&-(L-a-arninoadipyl)-L-cysteinyI-D-valine to isopenicillin N. Antimicrob
Agents Chemother 27, 380-387. 1985.
3. Revilla G, Ramos FR, Lpez-Nieto JM, Alvarez E, Martn JF. Glucose
represses formation of &-(L-a-aminoadipyl)-L-cysteinyI-D-valine and
isopenicillin N synthase but not penicillin acyltransferase in Penicillium
chrysogenum. J Bacterio1168, 947-952. 1986.

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