PROCEDIMIENTOS BIOQUMICOS Y

FISIOLGICOS EN LAS ALTERACIONES DE LA

SALUD

CUADERNO DE PRCTICAS
CURSO ACADMICO 2006-2007

Alumno/a____________________________________________

Practicas de Procedimientos Bioqumicos y

Fisiolgicos en las alteraciones de la salud

INTRODUCCIN
Un laboratorio clnico es el lugar en el que se efectan trabajos
experimentales y se realizan anlisis y exmenes bioqumicos, serolgicos,
histolgicos citolgicos, bacteriolgicos...

En la actualidad, la mayora de los diagnsticos pueden verse completados,

confirmados o sujetos a revisin gracias a las tcnicas de laboratorio y, por ello,
buena parte de la responsabilidad del mantenimiento de la salud recae sobre
ellos. En definitiva, las tcnicas analticas cumplen bsicamente tres objetivos:

Aportan informacin para que el mdico diagnostique adecuadamente

Permiten seguir la evolucin de una enfermedad durante el tratamiento

Pueden ser utilizadas como medida preventiva para conocer el estado de

salud de los individuos y detectar precozmente alguna alteracin.

Cuatro son las condiciones de un buen profesional de laboratorio:

Ciencia: es imprescindible una compresin adecuada

Paciencia: meticulosidad y capacidad crtica

Conciencia: de la responsabilidad del trabajo realizado

Instrumentacin: conocimiento bsico de los aparatos e instrumentos

utilizados.

OBJETIVO
El objetivo de estas prcticas es familiarizar al alumno con las distintas tcnicas
experimentales empleadas en el laboratorio de anlisis clnicos, trasladando al
mismo los conocimientos adquiridos durante la docencia terica.

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INSTRUCCIONES GENERALES
Material necesario
Cada alumno deber venir provisto del siguiente material:

Bata de laboratorio
Cuaderno
Rotulador de vidrio (si es posible)
Bolgrafo, papel milimetrado, regla y calculadora

Laboratorio
Sigue cuidadosamente las normas de seguridad. Trata el material con cuidado
y rotula adecuadamente todos los tubos y cualquier otro recipiente que utilices.
Limpieza
Al finalizar la prctica, todo el material de cada grupo, as como el material de
uso general deber quedar perfectamente limpio y sin rtulos, el ltimo
enjuague debe realizarse con agua destilada.
Asistencia
Es obligatorio asistir a todas las sesiones prcticas
Evaluacin
Se evaluar de forma continuada en el laboratorio durante el desarrollo de las
sesiones prcticas tanto las aptitudes como las actitudes mostradas por el
alumno.
Tras la finalizacin del periodo de prcticas se entregar, de forma voluntaria,
un cuaderno en el que se incluirn: las respuestas a las cuestiones planteadas,
los clculos realizados as como los resultados obtenidos en cada
determinacin, un comentario personal con la descripcin de las tcnicas
empleadas, el material utilizado, las normas de manipulacin de la muestra, los
posibles problemas acaecidos, etc. Si los resultados obtenidos fueran errneos,
el alumno deber indicar las posibles causas que han originado el error as
como la forma de subsanarlas.

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SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Es necesario, antes de comenzar cualquier prueba, saber la finalidad y
procedimiento experimental exacto con el objeto de tener preparado todo el
material y los reactivos necesarios. Aquellos materiales o reactivos que se
utilicen con ms frecuencia se tendrn guardados en lugares fcilmente
accesibles. Es esencial la limpieza, tanto durante el trabajo como al final del
mismo.

En todo laboratorio existen riesgos potenciales que requieren una atencin

especial. Como normas generales para prevenir los accidentes se pueden
considerar las siguientes:

1. Debe utilizarse bata mientras se permanece en el laboratorio

2. No se debe comer o beber dentro del laboratorio, ni utilizar recipientes para
beber o conservar alimentos
3. Antes de utilizar los reactivos, leer los rtulos
4. No dejar destapados los envases
5. Guardar las medidas de asepsia cuando ello sea necesario. En el
laboratorio clnico se debe trabajar con guantes en todo momento.
6. Mantener limpio el lugar de trabajo y lavar el material utilizado al finalizar el
anlisis
7. No fumar
8. No succionar con la boca una pipeta. Utilizar peras de goma.
9. No abandonar una prueba que no est acabada, a no ser que se
especifique claramente que se puede hacer
10. El material de vidrio roto se debe proteger antes de tirarlo para evitar cortes

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PRCTICA 1
DETERMINACIN DE GLUCOSA EN SUERO.
MTODO GOD-POD
Con esta prctica se pretende determinar la concentracin de glucosa en una
muestra de suero, utilizando un kit comercial basado en el mtodo GOD-POD.
La glucosa es el glcido principal del cuerpo y todos los otros glcidos se
convierten en glucosa despus de su digestin y absorcin.
Los niveles de glucosa en sangre se mantienen entre unos lmites muy
estrechos y constantes gracias, fundamentalmente, a la accin de dos
hormonas: insulina y glucagon. En general, dichos valores nunca deben
sobrepasar los 200 mg/dl, por grande que sea la ingestin de hidratos de
carbono, ni descender por debajo de 50 mg/dl en condiciones fisiolgicas.

Interpretacin de los datos de laboratorio

-Hiperglucemia: entre las alteraciones que cursan con hiperglucemia podemos
citar:
- Diabetes mellitus: sndrome caracterizado por un aumento en los
niveles fisiolgicos de la glucosa y que cursa de manera caracterstica con
polifagia, poliuria y polidipsia. Durante las clases tericas se explicar
detalladamente las pruebas de laboratorio que llevan a su diagnstico.
- Disminucin de la tolerancia a la glucosa: glucemia basal inferior
a 140 mg/dl y, a las dos horas de sobrecarga oral de glucosa, valores
intermedios entre los fisiolgicos y los tpicos de la diabetes.

-Hipoglucemia: hablamos de hipoglucemia cuando los niveles de glucosa en

sangre se sitan entre 40 y 45 mg/dl. La hipoglucemia puede presentarse en
ayunas, o bien ser reactiva a la ingestin de alimentos o a la toma de
medicamentos
CUESTIONES
1. Cul es la finalidad del blanco? Cmo se ajusta el espectrofotmetro con
el blanco? Ha realizado un blanco de reactivos o de suero? por qu?
2. Calcule la concentracin de glucosa en el suero indicando los clculos
realizados.
3. Si la concentracin de glucosa hubiera sido superior a 500 mg/dL. Cmo
habra actuado?
4. Para la determinacin ha utilizado un mtodo enzimtico. Se trata de un
mtodo cintico? Justifique su respuesta
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PRCTICA 2
DETERMINACIN DE COLESTEROL TOTAL
El objetivo de esta prctica es realizar la determinacin del colesterol total
presente en una muestra de suero, siguiendo para ello las instrucciones de un
kit comercial.
El colesterol es un alcohol esteroide insaturado muy soluble en grasas pero
poco hidrosoluble. El colesterol presente en el organismo tiene un doble origen:

El que procede de la dieta -exgeno- se encuentra en su mayor parte en

forma libre no esterificado-. El colesterol esterificado es hidrolizado por la
colesterol esterasa pancretica dando colesterol libre y cidos grasos.

El colesterol endgeno aunque puede ser potencialmente sintetizado por

todas las clulas- se forma fundamentalmente a nivel heptico e intestinal y
es eliminado por el hgado con la bilis- o utilizado para la sntesis de cidos
biliares.

El colesterol circula en sangre unido a las lipoprotenas:

Las LDL transportan el 70% del colesterol

Las HDL del 15 al 20%
El resto, circula unido a las VLDL y a los quiliomicrones.

El aumento de la concentracin plasmtica de colesterol, se asocia a un

incremento del riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares, por lo que su
regulacin tiene un alto inters epidemiolgico.

Interpretacin de los datos de laboratorio

Niveles elevados de colesterol en sangre se van a encontrar en casos de:
1. Dietas ricas en colesterol y grasas saturadas; estas ltimas pueden elevar
hasta en un 15-20% la cifra de colesterol sanguneo.
2. Hipotiroidismo, como consecuencia de la disminucin del metabolismo
lipdico
3. Diabetes mellitus: debido al incremento notable del metabolismo lipdico
4. En enfermedades de retencin renal: en estos casos se eleva tanto el
colesterol sanguneo como los triglicridos y los fosfolpidos. Se cree que es
debido a la inhibicin de la lipoprotein lipasa, de manera que se elevan
considerablemente las grasas sanguneas.
5. En casos de ictericia obstructiva
Niveles bajos de colesterol en sangre suelen ser indicativos de hepatitis grave y
cirrosis.

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Fisiolgicos en las alteraciones de la salud

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CUESTIONES
1. Si tuviera que preparar un blanco de suero cmo lo hara? Razone su
respuesta.
2. Por qu se incuban los tubos durante 5 min. a 37C o 10 min. a T
ambiente? Por qu vara el tiempo en funcin de la temperatura?
3. Si la muestra tuviera un valor de 700 mg/dl podra aplicar el mtodo
directamente?
4. Determine el valor de colesterol en la muestra problema, especificando
los valores experimentales de D.O. obtenido y el clculo realizado.
5. Si el paciente cuyo suero ha analizado tuviera una concentracin de
triglicridos de 200 mg/dl y un nivel de colesterol HDL de 60 mg/dl Cul
sera su concentracin de colesterol LDL?

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PRACTICA 3
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE PROTENAS
PLASMTICAS
En esta prctica se realizar la cuantificacin de las protenas presentes en una
muestra de suero.
Las protenas presentes en el plasma forman parte de un sistema
metablicamente "dinmico" con caractersticas y funciones muy diversas.
La suma de las concentraciones de todas y cada una de las protenas
presentes en el plasma, se conoce como protenas totales y en condiciones
normales oscila entre 66 y 83 g/L.
Fundamento
Existen diferentes mtodos para determinar la concentracin de protenas de
una muestra. El mtodo de Bradford se basa en el cambio de color que se
produce cuando el Azul Brillante de Coomasie se une a las protenas

MATERIAL
-Reacti vo de Bradford
-Albmina srica bovina (BSA) (1 mg/ml).
-Muestras: Como es un mtodo espectrofotomtrico (Ley de Lambert-Beer), las
muestras deben estar convenientemente diluidas para que sus absorbancias se
encuentren dentro de los valores de la recta de calibracin. As, la muestra
problema inicial (S1 ), se diluir a la mitad 1/2 para obtener otra a la que
denominaremos S2.
PROCEDIMIENTO
1. Prepare 8 tubos, 6 para la recta patrn (B, 1 2, 3, 4 y 5) y 2 para cada una de
las muestras problema que haremos directamente en el tubo de anlisis (S1,
S2) segn el protocolo esquematizado en la tabla siguiente:

Tras aadir estos reactivos habr exactamente 0.1 mI en cada tubo de anlisis.
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2. Aada 5 mI de reactivo Bradford a cada uno de los tubos. Agite sin que se
forme espuma
3. Incube la mezcla durante 5 minutos.
4. Mida la absorbancia a 595 nm. Primero se mide el tubo blanco (B) que sirve
para ajustar el espectrofotmetro (autocero) y a continuacin, el resto de los
tubos.
Con los 6 primeros valores obtenidos (tubos B, 1 2, 3, 4, 5) podremos construir,
en un papel milimetrado, la recta patrn apareando los valores de absorbancia
(eje Y) con los de concentracin de glucosa (eje X). Esta recta representa la
relacin que existe entre absorbancia y la concentracin de protenas, y por
tanto nos permitir calcular la concentracin de protenas de las muestras
problemas leyendo en dicha recta los valores de absorbancia obtenidos para
cada muestra problema (si entran dentro del intervalo de concentraciones
comprendido por la recta patrn). As se calcula la concentracin de protena
para cada uno de los tubos de anlisis.
La concentracin de protenas en cada uno de los tubos de la recta patrn se
calcula a partir de la concentracin de la solucin de albmina (1 mg/ml)
mediante la frmula CV = CV donde C = concentracin de albmina
estndar (1 mg/ml); V = volumen de albmina estndar aadido a cada tubo; C'
= concentracin de albmina en ese tubo; V = volumen total en el tubo (0,1 ml
en todos los tubos). El ajuste de la recta a los puntos se puede hacer
grficamente o por mnimos cuadrados (opcional).
En el primer tubo problema (S1) la muestra no est diludida (dilucin 1 :1 ) por
lo que la concentracin de protenas ser la calculada directamente por
interpolacin en la recta patrn sin necesidad de multiplicar por ningn factor
de dilucin (el factor sera 1 ). En el segundo tubo problema (S2) la muestra
est diluida dos veces (1/2; factor de dilucin 2) por lo que la concentracin de
protenas en el suero original ser 2 veces mayor, as multiplicamos el
resultado de concentracin obtenido por 2.
Para calcular la concentracin de protenas en el suero original (sin diluir),
como hemos realizado dos medidas a diferentes diluciones, una vez
normalizadas (es decir, multiplicadas por 1 o por 2, segn el caso) podremos
calcular la media aritmtica entre ellas, y esta ser el resultado del anlisis (s
los resultados obtenidos entre ambas diluciones son coherentes ).

Interpretacin de los datos de laboratorio

El aumento en la cifra de protenas plasmticas totales, suele deberse a una
disminucin relativa del volumen de lquido plasmtico debido a hipovolemia o
a una deshidratacin (en realidad lo que vara no es la cantidad total de
protenas sino la proporcin entre stas y el nivel hdrico del organismo).

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La disminucin en la cantidad de protenas totales, puede tener causas tan
variadas como:
El aumento del volumen plasmtico, como consecuencia de una retencin de
lquidos.
La disminucin en la sntesis de albmina debido a alteracin heptica o
desnutricin graves .
El descenso en la produccin (hipogammaglobulinemia) o aumento de las
prdidas (quemaduras intensas, sndrome nefrtico) de la fraccin de las
globulinas.
CUESTIONES
1. Qu es y para que sirve una recta patrn? Calcule la concentracin de
albmina de los distintos puntos de la recta patrn.
2. Qu interferencias est eliminando el blanco utilizado? Razone la
respuesta.
3. Dibuje la recta de calibracin enfrentando los valores de absorbancia (eje Y)
obtenidos para cada concentracin de albmina (eje X). Calcule la ecuacin
de la recta por el mtodo de los mnimos cuadrados (opcional).
4. Calcule la concentracin de protenas de S2.
5. Calcule la concentracin de la muestra S1 utilizando el resultado de la
concentracin de protenas obtenida para S2 y el valor obtenido en el tubo
S1.
6. Si suponemos que el suero del enfermo se diluy 200 veces (1/200) para
obtener S1 Cul ser la concentracin de protenas del suero del
enfermo?

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PRACTICA 4
ELECTROFORESIS DE PROTENAS PLASMTICAS
El objetivo de esta prctica es separar mediante electroforesis las protenas
del plasma sanguneo identificando tras tincin las distintas fracciones
obtenidas.
Fundamento
Las protenas poseen carga elctrica en funcin de sus grupos
ionizables y del pH y, por tanto, son capaces de migrar al ser sometidas a un
campo elctrico (Electroforesis). Normalmente se utiliza un tampn a pH > 8.0.
A estos valores de pH, la mayora de las protenas estn cargadas
negativamente, por lo que se desplazan hacia el polo positivo (nodo). La
velocidad de desplazamiento de cada protena estar determinada por su carga
y su tamao (relacin carga/masa). La electroforesis de las protenas
plasmticas nos permite separar 5 fracciones con cargas negativas
decrecientes, que son: Albmina (la ms negativa); 1-globulinas; 2-globulinas; -globulinas; (fibringeno en el caso de utilizar plasma), y -globulinas (las
menos negativas).
Material
-

Cubeta de electroforesis
Alimentador para electroforesis
Aplicador semi-micro
Tiras de acetato de celulosa
Tampn veronal sdico 0,04 M: Dietilbarbiturato sdico 8,24 g/l (preparado
comercial, pH >9)
Colorante: Negro amido, 0,5 g; Metanol, 45 ml; Ac. actico 10 ml; Agua
destilada 45 ml
Decolorante: Metanol 47,5 ml; Ac. Actico 5 ml; Agua destilada 47,5 ml
Plasma o suero sanguneo humano

Procedimiento experimental
-

Sumerja previamente las tiras de acetato de celulosa en el tampn durante

15 min. como mnimo, y absorber el exceso de tampn de las tiras entre dos
hojas de papel de filtro.
Monte las tiras sobre el puente de la cubeta de electrofo resis, previamente
llena de tampn, con la cara absorbente hacia arriba.
Con el aplicador, tome el plasma sanguneo problema y pngalo sobre la
tira a un centmetro del borde del ctodo (polo negativo) de color negro. A
los valores de pH determinados por el tampn, las protenas plasmticas
muestran carga negativa, por lo que migrarn hacia el nodo (polo positivo)

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de color rojo. Por tanto es muy importante la colocacin correcta de las tiras
en la cubeta de electroforesis.
Conecte la fuente de alimentacin y deje correr la electroforesis durante 35
min. a 200 v. Terminada la migracin desconecte el alimenta dor y la cubeta.
Coloree las tiras durante 5 minutos con el colorante negro amido.
Decolore las tiras realizando 3 4 baos en la solucin decolorante hasta
que se visualicen bien las bandas y los lquidos de lavado estn limpios. La
solucin decolorante una vez utilizada se filtra con carbn activo para su
reutilizacin.

Valores normales en el adulto:

Rango %
- Albmina
54-62 %
- 1-globulinas
2-5 %
- 2-globulinas
7-10 %
- -globulinas
8-13 %
- -globulinas
14-19 %

Rango de g/100 ml
3,4 - 5,4
0,2 - 0,4
0,5 - 0,9
0,6 - 1,1
0,7 - 1,7

Cuestiones
1. Por qu se utiliza un tampn de electroforesis de pH tan alto (pH=9)?
Qu ocurrira si utilizara un tampn de pH inferior ej. pH=6?
2. Qu finalidad se persigue sumergiendo las tiras de acetato de celulosa en
el tampn 15min antes de la electroforesis?
3. Cerca de qu polo se aplican las protenas? Por qu?
4. Para que se utiliza el colorante negro amido?
5. Qu diferencia se observa al hacer el proteinograma en una muestra de
plasma en lugar de suero? Cmo cuantificaras las fracciones proteicas?
6. Cmo realizara un lipidograma?
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PRACTICA 5
ANLISIS DE ORINA MEDIANTE EL EMPLEO DE TIRAS
REACTIVAS
La finalidad de esta prctica es realizar el anlisis de anormales en una
muestra de orina.
La tira reactiva diagnstica de inmersin es una tira de plstico a la que se fija
una o ms almohadillas de celulosa que est qumicamente impregnada de
tampn y varios indicadores qumicos. Cuando se humedece en orina, cada
almohadilla se convierte en un medio qumico en miniatura que responde a la
presencia de compuestos qumicos especficos presentes en la muestra.
Para obtener resultados semicuantitativos, es importante observar los tiempos
que se especifican para la realizacin de cada lectura.
Las zonas reactivas, una vez impregnadas de orina se comparan con las
escalas colorimtricas del envase.
Se debe considerar la tira reactiva como un dispositivo de seleccin primaria
que junto con el examen visual, permite separar las muestras anormales de las
normales. Las anomalas deben dilucidarse usando pruebas de seguimiento y
confirmacin.
Las tiras reactivas disponibles en el mercado tienen tests para: glucosa,
bilirrubina, cuerpos cetnicos, densidad, sangre, pH, protenas, urobilingeno,
nitritos y leucocitos.
Composicin de las almohadillas
Glucosa: 16,3% p/p glucosa oxidasa (1,3UI); 0,6% p/p peroxidasa (3300UI); 7% p/p Yoduro
potsico; 60,7% p/p tampn; 15,4% p/p ingredientes no reactivos.
Bilirrubina: 0,4% p/p sal de diazonio de 2,4-dicloroanilina; 37,3% p/p tampn; 62,3% p/p
ingredientes no reactivos.
Cetonas: 7,1% p/p nitroprusiato sdico; 92,9% p/p tampn.

Densidad: 2,8% p/p azul bromotimol; 97,2% p/p. Poli(metil vinil ter cido
maleico sal sdica).
Sangre: 6,8% p/p diisopropilbenceno dihidroperxido; 4% p/p 3,3,5,5tetrametilbencidina; 48%
p/p tampn; 41,2% p/p ingredientes no reactivos.

pH: 0,2% p/p rojo metilo; 2,8% p/p azul de bromotimol; 97% p/p ingredientes no
reactivos.
Protenas: 0,3% p/p azul de tetrabromofenol; 97,3% p/p tampn; 2,4% p/p.
Ingredientes no reactivos.
Urobilingeno: 0,2% p/p p-dietilaminobenzaldehido; 99,8% p/p ingredientes no
reactivos.
Nitritos: 1,4% p/p p-cido arsanlico; 1,3% p/p 1,2,3,4-tetrahidrobenzoquinolin3-ol; 10,8% p/p tampn; 86,5% p/p ingredientes no reactivos.
Leucocitos: 0,4% p/p ster de pirrol aminoacdico derivatizado; 0,2% p/p sal de diazonio; 40,9%
p/p tampn; 58,5% p/p ingredientes no reactivos.

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Recogida y preparacin de muestras

No deben utilizarse conservantes de orina porque pueden interferir en los
resultados de las cetonas, bilirrubina o urobilingeno. El crecimiento bacteriano
tambin puede afectar a los resultados de glucosa, pH y sangre. Manejar
siempre las muestras bajo condiciones sanitarias estrictas.
Tcnica
Las instrucciones deben ser seguidas cuidadosamente para obtener resultados
fiables.
1. Utilizar orina fresca recogida en un recipiente limpio y seco
2. Sacar una sola tira del frasco y utilizarla inmediatamente. Sumergir
brevemente la tira en la muestra y sacarla con rapidez
3. Escurrir el exceso de orina con el borde del frasco. Mantenerla en
posicin horizontal
4. Si estamos leyendo visualmente comparar los colores con la carta de
colores del frasco mantener la tira cerca de la tabla de colores y
escoger cuidadosamente-. La mayor precisin se obtendr ajustndola a
los tiempos de lectura correctos. Algunos colores toman mayor
intensidad con el tiempo y despus decrecen, por lo cual colores que
aparezcan transcurridos 2 minutos carecen de significado. Si el color de
una zona reactiva no es uniforme debemos fijarnos en la zona ms
oscura. Todas las zonas, excepto los leucocitos, se pueden leer entre 1
y 2 minutos como screening de positivo o negativo. Leer los test de
leucocitos a los 2 minutos.
5. Si se lee instrumentalmente, seguir las instrucciones de manejo del
aparato.
6. Como todos los tests de laboratorio, el diagnstico definitivo o la
decisin teraputica no debe basarse en un solo resultado o test.
Instrucciones de almacenaje y cuidado
Almacenar las tiras en su propio frasco. No extraer el desecante. No sacar la
tira hasta el momento de su uso. No tocar las reas reactivas de la tira.
Almacenar a temperaturas inferiores a 30C, pero no en refrigerador. No
almacenar bajo luz directa.
Informacin sobre las reas reactivas
Glucosa. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Este test es especfico de glucosa; no hay otra
sustancia que se conozca presente en orina que d resultados positivos. En orinas diluidas o
con glucosa en pequea cantidad, concentraciones de cido ascrbico superiores a 2,2 mmol/l
pueden dar falsos positivos. Sensibilidad del test: 4-7 mmol/l.
Bilirrubina. Tiempo de lectura visual: 30 seg. Normalmente la bilirrubina no es detectable en
orina incluso por los mtodos ms sensibles. Incluso resultados traza de bilirrubina son
suficientes para iniciar una investigacin. Colores atpicos (no comparables al bloque positivo o
negativo) indican que se deben continuar la investigaciones en esta muestra. Metabolitos de

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drogas que dan color a pH bajo pueden causar falsos positivos. Sensibilidad del test: 7-14
mol/l.
Cetonas. Tiempo de lectura visual: 40 seg. El test reacciona con el cido acetoactico en orina.
No reacciona con acetona ni con cido betahidroxibutrico. Ciertas orinas de pH bajo y/o
densidad alta pueden dar falsos positivos. Las muestras de orina no patolgicas suelen dar
negativo con este reactivo. Niveles detectables de acetona puden aparecer en caso de dieta,
embarazo o ejercicio extremo frecuente. En cetoacidosis o ayuno prolongado junto con otras
alteraciones del metabolismo lipdico o de carbohidratos, las cetonas pueden aparecer en
grandes cantidades en la orina antes de que se manifiesten en el suero. Sensibilidad del test:
0,5-1 mmol/l.
Densidad. Tiempo de lectura visual: 45 seg. Este test permite la determinacin de densidades
entre 1-1,03. No se afecta por constituyentes no inicos como la glucosa o colorantes. Orinas
alcalinas altamente tamponadas pueden causar lecturas relativamente bajas en comparacin
con otros mtodos. Pueden salir resultados falsamente altos en presencia de concentraciones
moderadas de protenas (1-7,5 g).
Sangre. Tiempo de lectura visual: 60 seg. La interpretacin del resultado trazas puede variar
ampliamente entre distintos pacientes y se requiere valorar cada paciente individualmente. El
desarrollo de unos puntos verdes (eritrocitos intactos) o de color verde difuminado
(hemoglobina/mioglobina libre) en el rea reactiva de la tira indican la necesidad de una
investigacin ms profunda. La sangre se suele encontrar en los periodos menstruales de la
mujer. Este test es muy sensible a la hemoglobina libre y algo menos a los eritrocitos intactos y
as se complementa con la investigacin microscpica. La sensibilidad de este test puede
disminuir algo en las orinas de alta densidad. Este test es igualmente sensible a hemoglobina
como a mioglobina. Alta densidad o proteinuria pueden disminuir la sensibilidad del test. Falsos
positivos pueden aparecer por ciertos contaminantes oxidantes o por la peroxidasa microbiana
asociada a una infeccin. Sensibilidad del test: 150-620 g/l (equivale aproximadamente a 5-20
clulas intactas por microlitro).
pH. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El rea de pH mide de una en una unidad en el rango de
5 a 8,5 en lectura visual y de 5 a 9 en lectura instrumental. Si no sigue el procedimiento
correcto y permanece un exceso de orina en la tira, se puede producir un fenmeno conocido
como runover, en el cual el tampn del reactivo de protena contamina la prueba de pH dando
un resultado anormalmente bajo.
Protenas. Tiempo de lectura visual: 60 seg. (o inmediatamente, o hasta 2 minutos despus de
la inmersin de la tira). El rea reactiva de la tira es ms sensible a las albminas que a las
globulinas, hemoglobinas, protenas de Vence-Jones y mucoprotenas. Un resultado negativo
no puede descartar por lo tanto la presencia de estas ltimas. Generalmente no se suele
detectar protenas por este mtodo en orina a pesar de que normalmente se excreta una
pequea cantidad. Cualquier color por encima de trazas es indicador de proteinuria. Para
orinas de alta densidad suele aparecer el resultado de trazas en orinas normales. Se precisa
una evaluacin clnica para valorar el resultado de trazas. Se pueden encontrar falsos positivos
en orinas alcalinas o altamente tamponadas y por contaminacin con compuestos cuaternarios
amoniacales y detergentes. Sensibilidad del test: 0,15-0,30 g/l.
Urobilingeno. Tiempo de lectura visual: 60 seg. El rea reactiva puede detectar
concentraciones tan bajas como 3 mol/l (aproximadamente 0,2 unidades Ehrlich). El rango
normal es de 3-16mol/l. Un resultado de 33mol/l significa el trnsito entre normal y anormal,
y el paciente o la orina deben ser examinados con ms cuidado. El rea reactiva puede tener
interferencias con sustancias que interfieran con la reaccin de Ehrlich. Reacciones de color
atpicas se pueden presentar en caso de presencia de cido p-aminobenzoico o formalinas.
Sustancias altamente coloreadas como riboflavinas pueden enmascarar el desarrollo del color.
Con este test no se puede determinar la ausencia de urobilingeno.

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Nitritos. Tiempo de lectura visual: 60 seg. Este test depende de la conversin de los nitratos en
nitritos a travs de las bacterias presentes en la orina, generalmente Gram negativas. Este test
es especfico para nitritos y no reacciona con otras sustancias presentes en la orina. Puntos o
bordes rosados no deben confundirse con un resultado positivo. Cualquier desarrollo de color
rosa suave uniforme debe interpretarse como un resultado positivo e indicador de al menos 10
microrganismos/ml, pero el desarrollo del color no es proporcional al nmero de
microorganismos presentes. Un resultado negativo no puede probar la ausencia de
microorganismos. Pueden aparecer falsos negativos debido a la presencia de microorganismos
que no contengan la reductasa para el paso de nitratos a nitritos o cuando la orina no ha
pasado tiempo suficiente en la vejiga (4 horas o ms) para el proceso de reduccin o cuando
no haya habido ingesta de nitratos en la dieta. La sensibilidad est reducida en las orinas de
alta densidad. Sensibilidad del test: 13-22 mol/l.
Leucocitos. Tiempo de lectura visual: 2 min. Las muestras de orina normales deberan dar en
general resultados negativos. Resultados positivos tienen significado clnico. Los resultados de
traza deben ser interpretados cuidadosamente aunque, si son repetitivos, se deben considerar
positivos. Falsos positivos pueden deberse a descargas vaginales o a drogas. Concentraciones
de glucosa elevadas (160mmol/l), alta densidad o la tetraciclina pueden disminuir la
sensibilidad. Cualquier sustancia que de color a la orina puede enmascarar la interpretacin del
test. Sensibilidad del test: 5-15 clulas/c.a.p.

Cuestiones
1. Qu es el anlisis de anormales?
2. Describa el procedimiento utilizado para su realizacin. Ha tenido alguna
precaucin con la posicin de la tira?
3. Por qu deben mantenerse las tiras dentro del frasco evitando al mximo
mantenerlo abierto?
4. Describa el resultado obtenido en su muestra de orina. Se trata de un
anlisis cuantitativo? Justifique su respuesta

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PRCTICA 6
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD CATALTICA DEL ENZIMA
FOSFATASA ALCALINA EN SUERO
La actividad enzimtica puede determinarse mediante mtodos cinticos o
mtodos a punto final. Con esta prctica se pretende determinar de la
actividad de la enzima fosfatasa alcalina, utilizando para ello un kit comercial
basado en un mtodo cintico.
Las fosfatasas son enzimas que catalizan la descomposicin de los steres de
fosfato con poca especicidad para un substrato determinado.
Existen dos tipos de fosfatasas: la fosfatasa alcalina, que tienen un pH de
actividad ptima de 9 y la fosfatasa cida, que tienen un pH de actividad
ptima de 5. Pueden separarse, alterando el pH al cual se realiza la prueba,
siendo los mtodos de determinacin en esencia similares para ambas.

Interpretacin de los datos de laboratorio

La determinacin de fosfatasa alcalina se utiliza principalmente para el
diagnstico de las ictericias obstructivas post-hepticas. Cuando la obstruccin
es completa los valores aumentan de 3 a 8 veces sobre los valores normales
en suero. Se ha observado que, cuando la enfermedad est producida por un
carcinoma pancretico, los niveles de fosfatasa son ms elevados que en
procesos benignos. Igualmente, se encuentran aumentados en casos de
hepatitis vrica, ictericia hepatocelular txica, ictericia hepatocanalicular, etc.
Se producen elevaciones de esta enzima en procesos hepticos no ictricos,
como en la enfermedad hepatobiliar, carcinoma heptico y abcesos hepticos.
Otras enfermedades con aumento de los niveles de fosfatasa alcalina son las
enfermedades seas, caracterizadas por un aumento de la actividad
osteoblstica, como la enfermedad de Paget, raquitismo, fracturas, tumores
seos, hiperparatiroidismo... Cifras fisiolgicamente elevadas pueden
producirse en mujeres embarazadas y en nios en crecimiento.
La determinacin de fosfatasa cida se utiliza para el diagnstico de los
pacientes con carcinoma prosttico, observndose niveles elevados.
CUESTIONES
1. En la derminacin de la actividad enzimtica de la fosfatasa alcalina se ha
utilizado un mtodo cintico. Comente sus ventajas
2. Ha preparado algn tubo blanco? Por qu?
3. Dibuje una grfica en la que enfrente la D.O. obtenida en cada minuto?
Calcule el E/min medio.
4. Determine la actividad enzimtica explicando el significado del factor 3300
empleado en el clculo.
5. Si la actividad obtenida fuera demasiado alta Cmo afectara a la forma de
la grfica? Cmo actuara para obtener un resultado fiable?
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PRCTICA 7
TINCIN DIFERENCIAL DE EXTENSIONES HEMATOLGICAS
El objetivo de esta prctica es la realizacin de una extensin y tincin
sangunea, as como la posterior identificacin al microscopio cada una de las
clulas observadas.
Los mtodos que se pueden seguir utilizar para hacer un anlisis de la
morfologa de las clulas de la sangre son varios. Se puede hacer un examen
en fresco sin coloracin, una coloracin vital u observar las clulas fijadas y
teidas.
El examen de la sangre teida es lo ms habitual. Para ello se hace una
extensin de sangre en un porta, se fija y se tie observando por ltimo al
microscopio. La extensin de sangre tambin se denomina frotis.
Principalmente se utiliza para hacer recuento de los distintos tipos de
leucocitos.
Puede obtenerse mucha informacin del estudio de una extensin de sangre.
Nos puede servir tanto para realizar un diagnstico como para seguir el curso
de una enfermedad o indicarnos los efectos nocivos de algn tratamiento.
Para que los resultados sean fiables es fundamental que la extensin est bien
hecha.
Preparacin de la extensin
Son varios los mtodos a seguir:
a) Mtodo del cubreobjetos

Tomar un cubre y depositar en su centro una gota pequea de sangre

Colocarlo con la gota de sangre mirando hacia abajo
Aproximar desde abajo otro cubre de manera que las esquinas de los
mismos queden alternadas. La sangre entonces se extiende entre los dos
cubres de forma rpida y uniforme.
Una vez extendida la sangre se separan los dos cubreobjetos mediante
deslizamiento de uno sobre otro. El movimiento ha de ser firme y rpido, no
levantndolos ni apretando uno sobre otro.
Colocarlos sobre papel de filtro y dejar secar al aire. La parte donde no est
la sangre ser la que est en contacto con el papel.

b) Mtodo del portaobjetos

Es el mtodo ms utilizado en la prctica, ya que es mucho ms cmodo de
realizar.

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Se utilizan dos portas, en uno de ellos se pone la gota de sangre y con el otro
se realiza la extensin.
Los pasos a seguir son:

Colocar una gota de sangre pequea aproximadamente a 1 cm del borde

del portaobjetos. Este puede estar sujeto con la mano izquierda por el
extremo opuesto a donde est la gota, o bien puede estar colocado sobre
una mesa. Es preferible lo segundo, ya que as tiene un lugar de apoyo.
Coger con la mano derecha (con los dedos ndice y pulgar) el otro
portaobjetos y apoyarlo sobre el que tiene la gota de sangre por delante de
ella. El ngulo que forman ambos portaobjetos ha de ser de 30 a 40.
Hacer retroceder el portaobjetos hacia el extremo donde no estaba la gota
de manera rpida y uniforme hasta que la sangre quede totalmente
extendida.

Observaciones
En una extensin de sangre realizada correctamente se observar una parte
ms gruesa en donde estaba la gota de sangre, despus una uniforme y al final
una zona de menor espesor deshilachada. Cada una de esas partes
corresponde a lo que se denomina cabeza, cuerpo y cola de la extensin.
La extensin de sangre no ha de llegar a los bordes del portaobjetos ni tener
estras o vacuolas.
El espesor de la extensin depende del ngulo entre los dos portaobjetos,
tamao de la gota, rapidez y presin con que se realiza la extensin. A mayor
rapidez se consigue un mayor espesor. A mayor ngulo tambin el espesor es
mayor.
Si el espesor es muy grueso las clulas aparecen sobrepuestas, con lo que los
leucocitos no se identifican con facilidad. Si es demasiado fino las clulas estn
muy separadas y hay que recorrer muchos campos para hacer el recuento.

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Una buena preparacin para contar leucocitos es aquella en la que los glbulos
rojos aparecen algo amontonados, ya que as los leucocitos se encuentran
tambin ms juntos (pero no superpuestos) y su recuento se hace ms rpido.
A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuenta
que la distribucin de las clulas no es uniforme. Las clulas grandes
(monocitos y neutrfilos) se sitan en los bordes, mientras que las clulas
pequeas (linfocitos) se sitan en el centro de la extensin. Por esta razn no
se cuenta slo en el centro o en los bordes, sino que se siguen unas
trayectorias a modo de grecas.

CUESTIONES
1. Cul es la finalidad del fijador?
2. Comente los colorantes utilizados
3. Haga un dibujo de las clulas observadas.

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Clu las sang uneas

Plaquetas, Linfocito
Linfocito

Neutrfil
o

Monocit
o

Eosinfil
o

Basfil
o
Neutrfilos: 3.500-7.000/mm 3, 60-70%
Eosinfilos: 150-400/ mm 3, 2-4%
Basfilos: 50-100/ mm 3, < 1%
Linfocitos: 1.500-2.500/ mm 3, 20-25%
Monocitos: 200-800/ mm 3, 3-8%
Eritrocitos: 4,5-5 millones/ mm 3
Plaquetas: 200.000-300.000/ mm 3

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APENDICE
1. PREPARACIN DE DILUCIONES
En el laboratorio, en muchas ocasiones es necesario diluir las muestras o los
reactivos para obtener concentraciones adecuadas a las tcnicas. La perfecta
preparacin de estas diluciones es imprescindible para la obtencin de unos
resultados correctos.
La dilucin realizada se expresa generalmente como una unidad de la solucin
inicial por unidades de la solucin final. Por ejemplo, una dilucin al 1/10
requiere que una unidad de la solucin inicial sea o haya sido diluida hasta un
volumen final de 10 unidades (un volumen de 1 solucin inicial ms 9
volmenes de disolvente).
Aquellas concentraciones en las cuales se expresa la concentracin como
cantidad de soluto en un volumen fijo de disolucin, como es el caso de la
Normalidad, Molaridad o % p/v, se denominan escalas volumtricas de
concentracin.
Cuando la concentracin se expresa sobre una de estas escalas volumtricas,
la cantidad de soluto contenido en un volumen dado de solucin es igual al
producto del volumen por la concentracin:
Cantidad de soluto = volumenconcentracin
Si diluimos una solucin, el volumen de la misma aumentar a la par que
disminuye su concentracin, mientras que la cantidad de soluto presente
permanecer constante. Por ello, dos soluciones con distintas concentraciones,
pero que contienen las mismas cantidades de soluto, estn relacionadas de la
siguiente forma:
V1 C 1 =V 2 C 2
Aplicaciones de esta frmula:

a) Si se conocen tres de los trminos de esta ecuacin, se puede calcular el

cuarto. Las cantidades a los dos lados de la ecuacin deben expresarse en las
mismas unidades.
Ejemplo 1
Preparar 50 mI de HNO3 0,1 M a partir de una solucin concentrada de HNO3
1 M.
Aplicando la frmula V 1 C 1 =V 2 C 2 donde:
C1 = 1 mol/l
C2 = 0, 1 mol/l
V2 = 50 m I
V1 = desconocido
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Sustituyendo:
V 1 1 mol/l = 50 ml 0, 1 mol/l

Despejando V1= 5 ml

Para preparar 50 m I de HNO3 0, 1 M, mediremos 5 m I de HNO3 1 M y

completaremos hasta 50 m I con agua destilada.
b) Despejando C 2 de la ecuacin [1] obtenemos:
C2 = (V 1 C 1) / V 2 = C 1 V 1 / V 2
El cociente de volmenes se denomina cociente de dilucin y se representa
1/d. Por tanto:
C2 = C 1 1/d
Es decir, para calcular la concentracin de la nueva solucin diluida, hay que
multiplicar la concentracin inicial por el cociente de dilucin.
Ejemplo
Calcular la concentracin de una disolucin obtenida a partir de una inicial al 10
por 100 que se ha diluido al 1/10.
C 2 = C 1 1/d
C2 = 10 .1/10 = 1 por 100
c) Si se realizan sucesivas diluciones, para conocer la concentracin de la
dilucin final, basta multiplicar la concentracin inicial por todos los cocientes
de dilucin.
C2 = C 1 .1/d [1] .1/d [2]...
Ejemplo:
Se ha partido de una solucin al 10 por 100 p/v; sta se ha diluido inicialmente
al 1/10, y la solucin obtenida al 1/2. Calcular la concentracin de la solucin
final.
C2 = C 1 .1/d (1) .1/d (2) ...
C2 = 10 .1/10 .1/2 = 0,5 por 100
d) Forma prctica de realizar una dilucin.
1 /d significa 1 unidad de la solucin inicial + (d -1) unidades de disolvente.
Ejemplo:
Diluir una solucin al 1/5.
Para hacer esta dilucin, por cada unidad que tomemos de la solucin inicial
tomaremos 5 -1 = 4 unidades de disolvente. Ej. 1 ml de solucin inicial y 4 ml
de disolvente.
Ejemplo:
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Diluir con agua destilada 10 mI de una solucin al 1/10.
Para hacer esta dilucin, por cada unidad que tomemos de la solucin inicial
tomaremos 10 -1 = 9 unidades de disolvente.
Como tenemos 10 unidades de solucin inicial, tendremos que tomar 9 x 10 =
90 unidades de agua destilada. En resumen, para hacer esta dilucin
cogeremos los 10 mI de solucin inicial y los completaremos con 90 mI de
agua.
e) En el laboratorio de Anlisis Clnicos, principalmente en Inmunologa, es
frecuente la utilizacin de diluciones seriadas, que se llaman as porque
despus de la primera son todas iguales.
Ejemplo : Diluir un suero al 1/2 (1:2) por adicin de 1 mililitro de suero a 1
mililitro de solucin salina. Tubo (1).
A partir del tubo (1) preparamos cuatro tubos (tubos 2, 3, 4, 5) que contienen
cada uno 1 mililitro de solucin salina como diluyente. Realizamos la dilucin
seriada por transferencia de 1 mililitro del tubo (1) al tubo (2), mezclamos y
transferimos 1 mililitro del tubo (2) al tubo (3), y as sucesivamente hasta el
tubo (5).
La concentracin del suero decrece segn un factor 2 en cada dilucin: tubo (1)
1/2; tubo (2) 1/4; tubo (3) 1/8; tubo (4) 1/16; tubo (5) 1/32.

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2. CROMATOGRAFA
La cromatografa agrupa un importante grupo de tcnicas que permiten separar
componentes de mezclas complejas.
En todas las separaciones cromatogrficas la muestra que se desea separar se
disuelve en la "fase mvil" que normalmente est formada por un gas o un
lquido. La fase mvil se hace pasar a travs de una "una fase estacionaria", la
cual se mantiene fija en una columna o en una superficie slida que acta
como soporte.
NOTA:
Fase mvil: en la cual estn los solutos que se van a separar
Fase estacionaria: lecho a travs del que fluye la fase mvil
Los componentes fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven
lentamente con el flujo de la fase mvil. Los componentes con baja afinidad por
la fase estacionaria se desplazan con ms rapidez al ser arrastrados por la fase
mvil.
Una vez que todos los componentes han atravesado la fase estacionaria, salen
separados unos de otros lo que permite utilizar las fracciones en procesos de
identificacin o cuantificacin .
FASES DEL PROCESO CROMATOGRFICO
1. Preparacin de la fase estacionaria
2. Introduccin de la muestra vehiculada por una fase mvil
3. Paso a travs de una fase estacionaria donde se producen las interacciones
que ms tarde llevarn a su separacin
4. Elucin (segn en que tcnica)
5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma
MECANISMOS IMPLICADOS
1. Adsorcin
2. Reparto
3. Intercambio inico
4. Exclusin molecular
5. Afinidad
Cromatografa de adsorcin: poco usada en clnica
Cromatografia de reparto: basada en las diferencias de solubilidad de las
distintos analitos en dos fases inmiscibles Ejemplo: cromatografa en capa fina
(ver figura 1):

sobre un cristal u otra superficie se deposita una suspensin uniforme de

partculas (ej gel de slice) que ms tarde se seca y activa. En dicha
placa se aplica la muestra y se deja secar.
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Se introduce la placa en una cmara en cuyo fondo hay un disolvente

que va subiendo por capilaridad y arrastrar a los componentes de la
mezcla en funcin de la solubilidad de los mismos en la fase mvil.
Se deja hasta que el frente llegue al final
Los resultados se visualizan por ejemplo por tincin con colorantes.
Aparecern unas manchas que se pueden identificar mediante el uso de
patrones o cuantificar mediante densitometra o raspado de las
manchas, disolucin y determinacin espectrofotomtrica.

Cromatografia de intercambio inico: basada en un mecanismo electrosttico

por atraccin entre iones de distinta carga. En el laboratorio clnico se utiliza en
analizadores de aminocidos, separacin de Hb, isoenzimas y esteroides (Ver
figura 2)
Cromatografia de exclusin molecular: basadas en la diferencia de tamao de
las distintas sustancias a separar. En clnica se utiliza para purificaciones ej de
hormonas (Ver figura 2)
Cromatografia de afinidad: basada en mecanismos que implican interacciones
especficas entre dos molculas como uniones enzima-sustrato, hormonareceptor, antgeno-anticuerpo... (Ver figura 2)
NOTA: HPLC cromatografa lquida de alta presin (resolucin): es un
sistema de cromatografa en columna (la fase estacionaria se deposita en una
columna) con un sistema inyector de la muestra y un impulsor de la fase mvil
que acelera el proceso
Figura 1

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Figura 2

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