INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y HOMEOPATA

SECCIN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIN
PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BIOMEDICINA MOLECULAR

PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN BIOQUMICA

Y FUNCIONAL DE LA PROTENA DE UNIN A
LA CAJA TATA DE Entamoeba histolytica

TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE:
DOCTORA EN CIENCIAS EN
BIOMEDICINA MOLECULAR
P R E S E N T A

La M. en C. MA. GUADALUPE DE DIOS BRAVO

MXICO, D. F.

ABRIL DE 2006

COMIT TUTORIAL
DIRECTORA
Dra. Esther Orozco Orozco
Investigadora Titular del Departamento de
Patologa Experimental
CINVESTAV-IPN

CO-DIRECTOR
Dr. Juan Pedro Luna Arias
Investigador Titular del Departamento
de Biologa Celular
CINVESTAV- IPN

ASESORES

Dr. Guillermo Prez Ishiwara

Dra. Mara del Consuelo Gmez Garca

Profesor Titular

Profesor Titular

Posgrado en Biomedicina Molecular

Posgrado en Biomedicina Molecular

ESMyH-IPN

ESMyH-IPN

Dra. Laurence Marchat Marchau

Profesor Titular
Posgrado en Biomedicina Molecular
ESMyH-IPN

Este proyecto ha sido apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologa

(CONACyT), Mxico; la Coordinacin General de Posgrado e Investigacin del Instituto
Politcnico Nacional (CGPI-IPN), Mxico; el Instituto Mdico Howard Hughes (USA) y la
Comunidad Econmica Europea. Durante la realizacin de este trabajo, recib los apoyos de
beca institucional otorgada por la CGPI-IPN y Telmex. El trabajo experimental fue
realizado en el laboratorio 2 de la Dra. Esther Orozco del Departamento de Patologa
Experimental del CINVESTAV-IPN.

AGRADECIMIENTOS:
EN ESPECIAL
Dra. Esther Orozco
Por su gran temple para guiarnos por el camino cientfico,
sus sabios consejos y por permitirme formar parte de su grupo.
Dr. Juan Pedro Luna Arias
Por su apoyo, sus sabios consejos y por su amistad.
Dra. Consuelo Gmez y Dr. Guillermo Prez Ishiwara
Por compartir sus conocimientos.
Dra. Laurence Marchat
Por formar parte del comit, por sus observaciones
y adems por su amistad.
Dra. Ana Mara Rivern
Por sus valiosas observaciones, su apoyo
y sobre todo por su amistad.
A MIS COMPAEROS DE LABORATORIO:
Con quienes compart momentos importantes de mi vida:
M. en C. Cecilia Bauelos, M. en C. Eduardo Flores, Dra. Guillermina Garca, Dra.
Elisa Azuara, Dr. Jos Olivares, M. en C. Esther Herrera, M. en C. Ricardo
Orozco, Qum. Matilde Garca, Dr. Mario Rodrguez, Q.B.P. Toms Snchez, Dr.
Csar Lpez, Bil. Israel Lpez, M. en C. Carolina Martnez, Dr. Ramn Ocdiz,
Dra. Xchil Madriz, M. en C. Mnica Romero, Bil. Eduardo Carrillo, M. en C.
Roco Tapia, M. en C. Mayra Melndez, Dra. Abigail Betanzos, M. en C. Mavil
Lpez, Dra. Karina Picazarri, M. en C. Rosa Ma. Garca, Dr. Andrs Salas, Dr.
Job Garca, Dra. Marzella Baez-Camargo, Dra. Ma. Eugenia Hidalgo, Dra. Rima
Gharaibeh, Dra. Lucia Menezes, Dra. Luz Mara Garca, Dra. Dulce Delgadillo,
Dr. Guillermo Prez-Ishiwara, Dra. Consuelo Gmez, Qum. Francisco Paz, Dr.
Leobardo Mendoza, Dra. Laurence Marchat, Dra. Margarita Guaderrama, Sra.
Claudia Montiel, Secretaria Roco Guerrero, Tc. Alejandrina Reyes, Tc.
Alberto.

Quiero dar las gracias tambin de manera especial:

M. en C. Cecilia Bauelos Barrn, simplemente por su amistad, por su apoyo

incondicional y por la convivencia que seguimos manteniendo.
Dr. Jos de Jess Olivares, por su apoyo y sus valiosas aportaciones a este
trabajo.
Tcnica Alejandrina Reyes porque sin su trabajo nada de esto hubiese sido
posible, por su apoyo en la preparacin del material, sus sabios consejos y por
su amistad.
Sr. Alfredo Padilla Barberi por todo el apoyo en la elaboracin de las figuras
pero sobre todo por el entusiasmo con el que trabaja y por su amistad.
M. en C. Rosa Ma. Garca por su apoyo y disposicin como auxiliar de
investigacin.
Secretaria Claudia Montiel por su apoyo secretarial.
Secretaria Roco Guerrero Garca por su gran apoyo secretarial y su
disposicin en el trabajo.
Algunas personas que incondicionalmente me apoyaron:
Dra. Rosa Ma. Del ngel Nez, Dra. Ana Lorena Gutirrez, Dr. Efran Garrido,
Dra. Rosaura Hernndez, Dr. Miguel ngel Vargas, Dr. Jos Tapia Ramrez,
Q.B.P. Pedro Chvez.

DEDICATORIA:
Con todo mi corazn a los dos seres maravillosos que me han tocado
como padres:
Q. F. Ignacio De Dios Cupido y Q. F. Ma. del Carmen Bravo vila
Por su ejemplo, su incansable apoyo y sobre todo por su inagotable amor.

Agradezco y dedico esta TESIS al amor de mi vida

Dr. Martn Iglesias Arteaga
Por su gran sabidura, por guiarme con su ejemplo
y por permitirme formar parte de su vida.

A mi abuelita:
Guadalupe vila
Por ser el pilar de la familia y por sus sabios consejos.

A mi ta:
M. en C. Martha Elena Bravo vila
Por su ejemplo y su gran apoyo.

A mis hermanos y cuados:

Dra. Ma. del Carmen De Dios Bravo y Javier Bahena Martnez,
Lic. Ignacio Jess De Dios Bravo y Flor de Mara Garca vila,
Dra. Anglica Margarita De Dios Bravo
Por su apoyo, por los aos compartidos y porque sigamos siendo unidos.

A los nuevos integrantes de la familia:

Javier Bahena De Dios y Karen Bahena De Dios
Por llenar mi vida de momentos felices con su inocencia.

NDICE

Pgina

ABREVIATURAS.............................................................................................................. i
NDICE DE FIGURAS..................................................................................................... iii
NDICE DE TABLAS....................................................................................................... v
ABSTRACT....................................................................................................................... vi
RESUMEN......................................................................................................................... vii
I. INTRODUCCIN......................................................................................................... 1
1.1 Amibiasis.......................................................................................................... 1
1.2 Clasificacin taxonmica................................................................................. 1
1.3 Ciclo de vida de E. histolytica.......................................................................... 1
1.4 Epidemiologa................................................................................................... 2
1.5 Tratamiento...................................................................................................... 4
2.Transcripcin en eucariontes........................................................................................ 7
2.1 Generalidades................................................................................................... 7
2.2 Estructura general de genes............................................................................ 7
2.2.1 Promotores........................................................................................ 8
2.2.2 Otras regiones reguladoras.............................................................. 9
2.3 Factores de transcripcin................................................................................ 9
2.4 RNA Polimerasas............................................................................................. 11
2.5 Etapas de la transcripcin............................................................................... 12
2.6 Transcripcin por RNA Pol II........................................................................ 14
2.6.1 Promotores clase II........................................................................... 18
2.6.2 Maquinaria basal de Transcripcin............................................... 24
Factor de transcripcin TFIID........................................................ 24
Protena de unin a la caja TATA.................................................. 24
Diversidad de los miembros de la familia de TBP........................ 29
Factores asociados a TBP................................................................ 30
3. Antecedentes sobre la transcripcin en E. histolytica............................................... 38
3.1 Promotores en E. histolytica............................................................................. 38
Ncleo del promotor en E. histolytica ............................................................ 39
Caja TATA en E. histolytica............................................................................ 40
Elemento Inr en E. histolytica ......................................................................... 40

Elemento GAAC en E. histolytica ................................................................... 41

Otras regiones reguladoras en genes de E. histolytica .................................. 41
3.2 Regulacin de la expresin de genes en E. histolytica ............................. 43
3.3 Factores de transcripcin en E. histolytica ............................................... 44
Protena de unin a la caja TATA.......................................................... 44
Otros factores de transcripcin en E. histolytica .................................

45

II. JUSTIFICACIN......................................................................................................... 47
III. OBJETIVOS................................................................................................................ 49
Objetivo General................................................................................................................ 49
Objetivos Particulares....................................................................................................... 49
IV. MATERIAL Y MTODOS........................................................................................ 50
Anlisis de la secuencia del gen Ehtbp............................................................................. 50
Microorganismos empleados ............................................................................................ 50
Cultivos de E. histolytica .................................................................................................. 50
Obtencin de Extractos Nucleares.................................................................................... 50
PCR in situ.......................................................................................................................... 52
Anlisis in silico del plegamiento y estructura terciaria de la EhTBPr........................ 52
Preparacin de clulas competentes BL21(DE3)pLys S y DH5 y transformacin ... 52
Extraccin de DNA plasmdico por lisis alcalina............................................................ 53
Restriccin enzimtica....................................................................................................... 54
Electroforesis en geles de agarosa..................................................................................... 55
Expresin de EhTBP recombinante................................................................................. 55
Anlisis electrofortico de EhTBPr en geles de poliacrilamida..................................... 56
Purificacin de EhTBPr bajo condiciones desnaturalizantes........................................ 57
Purificacin de EhTBPr bajo condiciones nativas......................................................... 58
Elucin de protenas a partir de geles de poliacrilamida............................................... 58
Obtencin de anticuerpos de conejo anti-TBP de E. histolytica................................... 59
Purificacin de anticuerpos por inmunoadsorcin......................................................... 59
Inmunofluorescencia indirecta......................................................................................... 60
Ensayos de Western blot................................................................................................... 60
Marcaje de oligonucletidos con [- 32P]ATP.................................................................. 61
Ensayos de retardamiento ................................................................................................ 62

Ensayos de entrecruzamiento DNA-proteina (UV-Cross-linking)................................ 63

Cromatografa de filtracin en gel y de intercambio inico............................................63
Cuantifiacin de los complejos DNA-protena................................................................ 64
Determinacin de las constantes de disociacin de los complejos
DNA protena...................................................................................................................... 64
Determinacin de la relacin molar EhTBP/TATA cuando F =1................................. 66
Intervalos de confianza (IC) de las predicciones de la funcin polinmica................. 66
Determinacin de las constantes de disociacin (KD)..................................................... 67
V. RESULTADOS ............................................................................................................ 68
5.1. Localizacin del gen Ehtbp y de la protena EhTBP en trofozotos de
E. histolytica y prediccin de la estructura terciaria de la protena...................... 68
5.1.1. Localizacin intracelular del gen Ehtbp................................................. 68
5.1.2. Localizacin intracelular de la protena EhTBP................................... 69
5.1.3. Prediccin de la estructura tridimensional de la EhTBPr.................... 69
5.2. Caracterizacin de EhTBP en extractos nucleares................................................ 74
5.2.1. Identificacin de EhTBP en los complejos DNA-protena...................... 74
5.2.2. Formacin de los complejos de EN con diferentes cajas TATA............ 77
5.2.3. Enasyos de competencia............................................................................. 80
5.2.4. Cuantificacin de la afinidad de EN por las diferentes cajas TATA..... 82
5.2.5. Constantes de disociacin de EN para las diferentes cajas TATA.......... 88
5.3. Caracterizacin de EhTBPr...................................................................................... 89
5.3.1. EhTBP recombinante se une al oligonucletido TATTTAAA [1]........... 89
5.3.2. Formacin de complejos de EhTBPr con diferentes cajas TATA........... 91
5.3.3. Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por las diferentes
cajas TATA................................................................................................ 95
5.3.4. Constantes de disociacin de EhTBPr para las diferentes
cajas TATA..................................................................................................... 100
5.3.5. Formacin de complejos de la EhTBPr con el oligonucletido GAAC..103
5.3.6. Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por el elemento GAAC....... 104
5.3.7. Constante de disociacin de EhTBPr para la secuencia GAAC............ 106
5.4. Purificacin parcial del factor TFIID..................................................................... 108
5.4.1. Cromatografa de filtracin en gel y de intercambio inico .................. 108

5.4.2. Ensayo de retardamiento y competencia con las

fracciones purificadas............................................................................ 112
5.4.3. Formacin de complejos de la fraccin de EN eluda con KCl 0.4 M
con diferentes cajas TATA...................................................................... 114
VI. DISCUSIN............................................................................................................... 117
VII. CONCLUSIONES.................................................................................................... 127
VIII. PERSPECTIVAS.................................................................................................... 129
IX. REFERENCIAS......................................................................................................... 130
X. APNDICE.................................................................................................................. 150

i
LISTA DE ABREVIATURAS
E histolytica

Entamoeba histolytica

DNA

cido desoxirribonuclico

EhTBPr

Protena de unin a la caja TATA recombinante de Entamoeba

histolytica

EN

Extracto nucleares

TFIID

Factor de transcripcin TFIID

TATA

Secuencia de la regin promotora de un gen rica en Adeninas y

Timinas a las que se une TBP

RNA Pol

RNA Polimerasa

PIC

Complejo de preinicio de la transcripcin

CTD

Dominio carboxilo terminal

DPE

Elemento del promotor ro abajo

TFIIB

Factor de transcripcin TFIIB

BRE

Elemento de reconocimiento del factor TFIIB

TAFs

Factores asociados a TBP

URE

Elemento de reconocimiento ro arriba del promotor

Cpm

Cuentas por minuto

PCR

Reaccin en cadena de la polimerasa

EMSA

Ensayo de retardamiento (del Ingls Electrophoretic Mobility Shift

Assay)

Pb

Pares de bases

ii

RNAm

cido ribonucleico mensajero

EDTA

cido etilendiaminotetraactico

DTT

Dithiothreitol

kDa

kiloDaltons

kb

Kilobases

LB

Medio de cultivo para bacterias Luria-Bertani

rpm

Revoluciones por minuto

PAGE

Electroforesis en gel de poliacrilamida (del Ingls Polyacrylamide gel

Electrophoresis)

EhKO

Organelo cinetoplasto de Entamoeba histolytica

PFO

Piruvato ferredoxinaxidorreductasa

KD

Constante de disociacin

ln

Logaritmo natural

iii
NDICE DE FIGURAS

Pgina

Figura 1. Ciclo de vida de Entamoeba histolytica............................................................. 3

Figura 2. Estructura de promotores eucariticos............................................................... 10
Figura 3. Modelo de la estructura de la cromatina. .......................................................... 15
Figura 4. Modelo de transcripcin mediada por RNA Pol II. ........................................... 17
Figura 5. Modelo de factores de transcripcin formados por TBP y los TAFs................. 25
Figura 6. Estructura cristalina de TBP de humano........................................................... 28
Figura 7. Modelo terico de TAF250 y su papel en la desestabilizacin del nucleosoma. 33
Figura 8. Modelo de la visin contempornea de la expresin de genes.......................... 37
Figura 9. Microscopa confocal de PCR in situ del gen Ehtbp.......................................... 70
Figura 10. Inmunofluorescencia de trofozotos incubados con el anticuerpo anti-EhTBP..72
Figura 11. Modelo hipottico de la estructura tridimensional de EhTBPr.......................... 73
Figura 12. Identificacin de EhTBP en extractos nucleares................................................ 75
Figura 13. Complejos formados con extractos nucleares y diferentes cajas TATA.......... 79
Figura 14. Ensayos de competencia de extractos nucleares incubados con diferentes
cajas TATA......................................................................................................................... 81
Figura 15. Cuantificacin de la afinidad de Extractos nucleares por diferentes
cajas TATA. ....................................................................................................................... 83
Figura 16. Representacin grfica de los datos obtenidos en la cuantificacin de
complejos formados con EN y las diferentes cajas TATA ................................................. 84
Figura 17. Relacin entre ln F y la relacin molar EN/ TAT_ _ AAg [7] y entre
1/F y 1/P............................................................................................................................. 88

iv
Figura 18. Inmunodeteccin de EhTBPr y ensayo de retardamiento con el oligonucletido
TATTTAAA [1]................................................................................................................. 90
Figura 19. Formacin de complejos de EhTBPr con diferentes cajas
TATA y competencias....................................................................................................... 92
Figura 20. Ensayo control de unin de EhTBPr a secuencias ricas en A-T...................... 94
Figura 21. Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por diferentes cajas TATA.............. 96
Figura 22. Representacin grfica de los datos obtenidos en la cuantificacin de
complejos formados con EhTBPr y las diferentes cajas TATA...................... 97
Figura 23. Relacin entre ln F y la relacin molar EhTBPr/TAT_ _AAg y entre
1/F y 1/P.......................................................................................................... 101
Figura 24. Ensayo de retardamiento con la EhTBPr y el elemento GAAC..................... 105
Figura 25. Relacin entre ln F y la relacin molar EhTBPr/GAAC............................... 107
Figura 26. Esquema de purificacin de los factores generales de transcripcin............. 109
Figura 27. Patrn electrofortico de las fracciones parcialmente purificadas de EN de
E. histolytica .................................................................................................. 110
Figura 28. Ensayo de retardamiento y competencia con extractos nucleares crudos
y la fraccin parcialmente purificada de TFIID............................................ 113
Figura 29. Ensayo de retardamiento con la fraccin de TFIID eluda con KCl 0.4 M
y las diferentes cajas TATA........................................................................... 115
Figura 30. Prediccin de los residuos de aminocidos involucrados en la unin de
EhTBP al DNA............................................................................................. 124

NDICE DE TABLAS

Pgina

Tabla I. Posiciones de la secuencia TATTTAAA (1) y posibles variantes en

promotores de genes de E. histolytica................................................................ 77

Tabla II. Relacin Matemtica entre ln Sx vs x y ln F vs relacin molar EN/TATA...... 84

Tabla III. Relacin matemtica entre ln Sx vs x y ln F vs relacin molar

EhTBPr/TATA ................................................................................................. 97

Tabla IV. Constantes de disociacin de EhTBP por variantes de caja TATA................ 101

RESUMEN

vi

Abstract
Entamoeba histolytica is the protozoan responsible for human amoebiasis. The
variability in virulence exhibited by E. histolytica might be controlled in part by gene
transcription. The capacity of E. histolytica TATA Box Binding Protein (EhTBP) to
interact with different TATA boxes in gene promoters may be one of the key factors to
perform an efficient transcription in this human parasite.
In this study we investigated the cellular location of Ehtbp gene by in situ PCR. In
100% of the cells the gene was detected in nucleus. In contrast, 95% of trophozoites, also
presented small fluorescent spots in EhkO organelle. In agreement with these experiments,
confocal microscopy and immunofluorescence analysis revealed that EhTBP is located in
both the nucleus and EhkO.
Based on its amino acid sequence we predicted the tertiary structure of EhTBP, as a
molecular saddle basically identical to those of their archaebacterial and eukaryotic
counterparts, suggesting its biological function.
On the other hand, we used several TATA variants to study the in vitro EhTBP
DNA-binding activity and to determine its dissociation constants. The presence of EhTBP
in complexes formed by nuclear extracts (NE) and TATTTAAA oligonucleotide, which
corresponds to the canonical TATA box for E. histolytica, was demonstrated by gel-shift,
supershift, UV-crosslinking and Western blot assays. In these experiments a single NETATTTAAA oligonucleotide complex was detected. Recombinant EhTBP (rEhTBP)
formed specific complexes with TATA variants found in E. histolytica gene promoters and
other TATA variants generated by mutation of TATTTAAA sequence. The dissociation
constants of EhTBP for TATA variants in NE, ranged between (1.75 1.86) x 10-12 and
(3.25 0.87) x 10-11 M. rEhTBP presented a specific DNA-binding activity 10-fold lower

RESUMEN

vii

than EhTBP in NE with dissociation constants ranging between (6.60 3.15) x 10-12 and
(1.60 0.37) x 10-10 M. EhTBP in NE presented the lowest KD values for TATgTAAA
oligonucleotide and rEhTBP presented the lowest KD for gAgTTAAA. Intriguinly, the
recombinant EhTBP affinity for TATA variants is stronger than other TBPs reported.
We have begun to analize the RNA polymerase II machinery by biochemical
fractionation of NE derived from E. histolytica trophozoites. A partially purified fraction
showed functional binding to TATA variants and to GAACT containing oligonucleotide,
which has been reported as a possible binding element for TFIID.
Interestingly, rEhTBP presented a KD value for this GAACT element, similar to the
KD values showed for TATTTAAA and TATA variants, suggesting that the GAACT
element is a potential binding motif for EhTBP and that EhTBP is more promiscuous than
human and yeast TBPs, probably due to modifications in amino acids involved in TBPDNA binding activity.

RESUMEN

viii

Resumen
Entamoeba histolytica es uno de los agentes infecciosos de mayor distribucin
mundial y es responsable de uno de los problemas de salud ms serios en pases en vas de
desarrollo. Este parsito, usualmente comensal del humano, bajo ciertas condiciones es
capaz de invadir la mucosa intestinal y dar lugar a la forma ms comn de amibiasis
sintomtica, la disentera.
La variabilidad en la virulencia presentada por diferentes cepas de E. histolytica,
puede estar controlada, al menos en parte, por la transcripcin de genes involucrados en su
patogenicidad, tales como lectinas, molculas de adherencia, proteasas y amebaporos entre
otros.
La transcripcin se inicia por la unin al DNA de la protena de unin a la caja
TATA (TBP), que es el primer factor que se une al DNA para formar un complejo
multiproteico, entre los cuales se encuentra la RNA polimerasa. La habilidad de TBP en E.
histolytica (EhTBP) para interactuar con diferentes cajas TATA en los promotores de
ciertos genes, puede ser uno de los factores importantes para llevar a cabo una transcripcin
eficiente en este parsito.
En este trabajo investigamos en primer lugar, la localizacin intracelular en
trofozotos de E. histolytica, del gen Ehtbp y de la protena EhTBP. En el 100% de las
clulas se observ la presencia del gen Ehtbp en el ncleo y en un 95% se localiz en el
organelo reportado como EhkO. Por ensayos de inmunofluorescencia, la protena EhTBP se
localiz tambin en el ncleo y en el organelo EhkO.
Con base en la secuencia de aminocidos se predijo la estructura terciaria de la
protena EhTBP como una silla de montar molecular, cuyo plegamiento es bsicamente

RESUMEN

ix

idntico a la estructura cristalina de TBP de humano, sugiriendo su funcin biolgica de

unin al DNA y de regulacin de la transcripcin.
Por otro lado, estudiamos la capacidad, tanto de EhTBP en extractos nucleares (EN)
como de la EhTBP recombinante (EhTBPr) purificada, de unirse a diferentes cajas TATA
por ensayos de retardamiento y determinamos sus constantes de afinidad. La presencia de
EhTBP en los complejos formados por EN y la secuencia TATTTAAA, considerada como
caja TATA consenso para los promotores de genes de E. histolytica, se demostr por
ensayos de retardamiento, superretardamiento, entrecruzamiento DNA-protena con UV
(UV-crosslinking) y Western blot empleando el anticuerpo anti-EhTBPr.
Los EN y la EhTBPr formaron complejos especficos con las variantes de caja
TATA encontradas en promotores de genes de amiba y con otras, generadas por mutacin
de la secuencia TATTTAAA. Las constantes de disociacin de EhTBP en EN variaron
entre (1.75 1.86) x 10-12 y (3.25 0.87) x 10-11 M, mientras que los valores de EhTBPr
fueron de (6.60 3.15) x 10-12 a (1.60 0.37) x 10-10 M. Estos resultados muestran que: i)
la afinidad de la protena recombinante es 10 veces menor que la afinidad mostrada por la
EhTBP en EN. ii) la afinidad de esta TBP por diferentes cajas TATA es mayor que la
reportada para las TBP de humano y de levadura y iii) una mutacin en la posicin 5
reduce la afinidad de EhTBP. Por lo tanto, EhTBP presenta una especificidad de unin al
DNA ms relajada que la presentada en otros sistemas y esta capacidad le puede haber
conferido a E. histolytica ventajas evolutivas, ya que ciertas mutaciones en la secuencia
TATA pueden no afectar la expresin de sus genes.
Paralelamente a estos estudios, iniciamos el anlisis de la maquinaria basal de
transcripcin mediada por RNA polimerasa II (RNA Pol II) mediante el fraccionamiento
bioqumico de extractos nucleares de trofozotos de E. histolytica. Una fraccin

RESUMEN

parcialmente purificada mostr unin a la secuencia TATTTAAA y a las variantes de stas,

as como a la secuencia GAACT, que se ha descrito como un posible sitio de unin para el
factor TFIID. Interesantemente, EhTBPr present una afinidad a esta secuencia similar a la
obtenida para las variantes de caja TATA, lo que sugiere que este elemento es un potencial
sitio de unin para EhTBP y adems, que esta protena es ms promiscua que las TBPs de
humano y levadura, probablemente debido a modificaciones en residuos de aminocidos
involucrados en la unin al DNA.

INTRODUCCIN 1

I. INTRODUCCIN
1.1 Amibiasis
Entamoeba histolytica es el protozoario parsito entrico que causa la amibiasis
intestinal humana. Este parsito, usualmente comensal del humano, se aloja en el lumen del
intestino grueso sin producir signos o sntomas (amibiasis luminal). Sin embargo, bajo
ciertas condiciones es capaz de invadir la mucosa y submucosa intestinal y dar lugar a la
forma ms comn de amibiasis sintomtica, la disentera. Una vez invadido el epitelio
intestinal el parsito puede diseminarse a otros tejidos a travs de la sangre, originando
lesiones extraintestinales, principalmente en hgado y con menos frecuencia en pulmn,
cerebro, piel, rganos genitales, bazo y rin (Jackson, 2000).

1.2 Clasificacin Taxonmica

E. histolytica pertenece al reino Protista, formado por microorganismos
provenientes de eucariontes primitivos (Margulis y col., 1990). Se ubica en el subreino
Protozoa, que incluye cerca de 65,000 especies, de las cuales ms de la mitad son fsiles y
aproximadamente 10,000 son parsitos (Levine y col., 1980). Varios autores coinciden en
que E. histolytica pertenece al grupo de los Rhizopodos, pues presenta pseudpodos por lo
menos en un estadio de su ciclo de vida (Corliss, 1987; Bauelos-Barrn, 2002).

1.3 Ciclo de vida de E. histolytica

Durante su ciclo de vida, el parsito presenta dos formas principales: el quiste, que
es la forma infectiva y el trofozoto, que es la forma invasiva (Fig. 1).
La infeccin con E. histolytica se inicia cuando el ser humano ingiere quistes
maduros, los cuales tienen un dimetro de 8 a 20 m, presentan cuatro ncleos y una pared

INTRODUCCIN 2

celular de 125 a 150 nm de espesor y son muy resistentes a cambios ambientales drsticos.
stos atraviesan el estmago, en donde son capaces de tolerar los jugos gstricos llegando
hasta el leon, en donde ocurre el desenquistamiento. De cada quiste emergen 8 trofozotos
uninucleados que se dividen por fisin binaria, se adhieren a la mucosa intestinal y pueden
vivir como comensales. Mediante mecanismos moleculares an no bien caracterizados, los
trofozotos pueden atravesar la mucosa intestinal invadiendo los vasos sanguneos de los
tejidos ms prximos y son capaces de diseminarse hacia diferentes rganos causando
abscesos, principalmente en hgado (Martnez Palomo, 1989; Jackson, 2000). Bajo
condiciones desfavorables, los trofozotos se desprenden de la mucosa iniciando el
enquistamiento en la luz del intestino grueso. Durante este proceso, las clulas pierden
movilidad, adquieren una forma esfrica, se deshidratan y excretan parte de las reservas
alimenticias presentes en las vacuolas digestivas, formando el prequiste. En seguida,
forman una pared de quitina y pilas de ribosomas que constituyen los cuerpos cromidiales,
transformndose en quistes uninucleados inmaduros. Los quistes inmaduros presentan
divisiones nucleares sucesivas y dan origen al quiste maduro tetranucleado que se elimina
con las heces. Estos ltimos pueden ser ingeridos por otro individuo completando as el
ciclo biolgico y de transmisin de E. histolytica. (Despommier y Karapelou, 1987) (Fig.
1).

1.4 Epidemiologa
E. histolytica infecta 500 millones de personas, provoca 50 millones de casos de
disentera o abscesos hepticos y produce alrededor de 100 mil decesos anualmente a nivel
mundial (WHO, 1998). La prevalencia de la amibiasis se asocia directamente con la falta de

INTRODUCCIN 3

Figura 1. Ciclo de vida de E. histolytica. (1) La infeccin se inicia al ingerir quistes

maduros presentes en alimentos, agua y manos contaminados con heces. (2) En el intestino delgado
ocurre el desenquistamiento y (3) se liberan trofozotos que migran al intestino grueso. (4) Los
trofozotos pueden atravesar la mucosa intestinal y diseminarse a diferentes rganos. Cada
trofozoto se multiplica por fisin binaria produciendo quistes que viajan por el intestino grueso y
son liberados en las heces y son los responsables de la transmisin de la enfermedad. Los
trofozotos tambin pueden ser liberados de esta forma; sin embargo, no soportan las condiciones
ambientales (Tomado del sitio web URL: http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Amebiasis/).

INTRODUCCIN 4

hbitos de higiene y sanidad deficiente, que son caractersticas de las condiciones

socioeconmicas precarias, en donde adems predominan el hacinamiento y el manejo
inadecuado de las aguas y de las excretas (Bauelos-Barrn, 2002).
En Mxico, la amibiasis es una enfermedad endmica considerada como un serio
problema de salud pblica ya que constituye una de las primeras diez causas de muerte. En
el ao 2001 se reportaron 1,225,800 casos nuevos de amibiasis intestinal (Fuente: SSA,
http://www.salud.gob.mx), estimndose que el 20% de la poblacin total mexicana (16
millones de personas) son portadoras del parsito, el 2% (1.3 millones) presenta la
enfermedad y entre el 0.1 y el 0.2% (de 10 a 30 mil enfermos) muere por infeccin
amibiana (Conde-Bonfil y de la Mora, 1992; Barreda, 1999).

1.5 Tratamiento
El mejor mecanismo de control contra la amibiasis lo constituye el tratamiento
farmacolgico con metronidazol y emetina. Debido a la similitud entre el metabolismo del
husped y los parsitos, los tratamientos farmacolgicos no son selectivos para la
maquinaria metablica de los patgenos eucariticos, lo cual ha hecho difcil el desarrollo
de agentes quimioterapeticos especficos.
Los frmacos amebicidas empleados actualmente se han clasificado en dos grupos
de acuerdo a su sitio de accin: a) Tisulares o extraintestinales, como los derivados
emetnicos

(emetina,

deshidroemetina),

las

aminoquinolinas

(cloroquina)

los

nitroimidazoles (metronidazol, tinidazol, ornidazol, secnidazol). b) Luminales, como el

sulfato de paramomicina, las hidroxiquinolinas halogenadas (iodoquinol, cloroquinol) y las
dicloroacetamidas (furoato de diloxanida, teclozn, etofamida, clefamida y quinfamida)
(Norris y Ravdin, 1990).

INTRODUCCIN 5

El metronidazol es el frmaco ms utilizado en los casos de amibiasis debido a su

alta eficacia en la eliminacin del parsito. El mecanismo de accin implicado en su efecto
antiamibiano es el de causar alteraciones en las macromolculas del parsito en especial en
su material gentico. Este frmaco se activa en el interior de las clulas por la reduccin de
su grupo nitro en radicales libres reactivos y compuestos nitrosos que interactan con el
DNA del parsito desestabilizando su estructura helicoidal y generando su ruptura, lo que
conduce a muerte celular por inhibicin de la sntesis de cidos nucleicos (LaRusso y col.
1977; Knight, 1978). Los electrones responsables de la activacin del metronidazol en los
protozoarios son producidos principalmente por la piruvato ferredoxina xido reductasa
(PFO) (Hrdy y Muller, 1995; Rodrguez y col., 1996) y son transferidos al frmaco por la
ferredoxina. nicamente los organismos anaerobios son capaces de activar al frmaco en
forma eficiente bajo condiciones de baja tensin de oxgeno.
El metronidazol produce efectos secundarios en el paciente, como nuseas, diarrea,
dolor abdominal, anorexia, distensin epigstrica, dolor de cabeza, fatiga y salpullido.
Existen datos que sugieren que este frmaco podra causar cncer en el ser humano, ya que
rompe cromosomas en clulas humanas tanto in vitro como in vivo, y produce tumores
malignos en roedores (Bendesky, 2002). Recientemente ha sido posible la sntesis de
diversos derivados de los nitroimidazoles en busca de una mayor eficacia en los
tratamientos contra las parasitosis causadas por protozoarios.
El tratamiento farmacolgico usualmente es suficiente para controlar tanto la
disentera amibiana, como el absceso heptico. Sin embargo, existen factores del husped,
del medio ambiente y del parsito, que pueden ocasionar el fracaso teraputico frente a la
enfermedad (Barreda, 1999). Uno de los factores ms importantes presentados por el
parsito es la resistencia a frmacos, a travs de la expresin del fenotipo de resistencia a

INTRODUCCIN 6

mltiples frmacos (mdr), que se define como la capacidad celular para sobrevivir en
presencia de frmacos o drogas. Este fenotipo, ha sido bien estudiado en clulas de
mamferos y se debe principalmente a la sobreexpresin de los genes mdr.
La modulacin de la expresin de estos genes en E. histolytica ocurre a nivel de la
transcripcin (Gmez y col., 1998; Prez y col., 1998), de la estabilidad del RNA
mensajero (RNAm) y de su procesamiento (Lpez-Camarillo y col., 2003) y a nivel de la
estabilidad de la protena y su tasa de incorporacin en la membrana.
Uno de los primeros y ms importantes puntos de control en la regulacin de la
expresin de genes, es el inicio la transcripcin. Otros fenmenos como la variabilidad en
virulencia mostrada por E. histolytica pueden estar controlados en parte por la elevada tasa
de transcripcin de genes que codifican protenas relacionadas con su patogenicidad. Para
entender los mecanismos moleculares que regulan la expresin selectiva de genes, nos
enfocamos a estudiar la maquinaria involucrada en el proceso de transcripcin de genes que
codifican protenas en este microorganismo.
El conocimiento de cmo funcionan los factores de transcripcin durante la
expresin diferencial de genes, puede ser aplicado a aspectos fundamentales en el campo de
la biologa y la medicina. A continuacin se describen los conocimientos generales sobre
transcripcin en organismos eucariontes superiores y despus se contrastan con los
conocimientos en E. histolytica.

INTRODUCCIN 7

2. Transcripcin en eucariontes

2.1 Generalidades
La transcripcin es el proceso celular mediante el cual el cido ribonucleico (RNA)
es sintetizado a partir de una cadena de DNA dplex (gen) que sirve como templado
(molde). La cadena de RNA se genera en direccin 5 a 3 mediante la incorporacin de los
nucletidos, catalizada por tres RNA polimerasas (RNA Pol) distintas para cada clase de
gen. En eucariontes superiores, el RNA ribosomal (RNAr) es transcrito por la RNA Pol I, el
RNA mensajero (RNAm) y algunos RNAs nucleares pequeos (RNAsn) por la RNA Pol II
y el RNA de transferencia (RNAt), el RNA 5S y algunas especies de RNAsn, son
sintetizados por la RNA Pol III.
A pesar de su complejidad estructural, estas enzimas requieren de protenas
auxiliares conocidas como factores basales o generales de inicio de la transcripcin (GTFs)
para reconocer y posicionarse en la regin promotora (secuencia de DNA que no se
transcribe) que se encuentra localizada ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin de
cada clase de gen (Burley y Roeder, 1996).

2.2 Estructura general de genes

Los genes poseen tpicamente una regin ro arriba del sitio de inicio de la
transcripcin que se conoce como promotor, a la cual se unen protenas conocidas como
factores de transcripcin y la enzima RNA polimerasa, un sitio de inicio de la transcripcin,
una regin codificante y una seal de paro conocida como terminador. Los componentes
bsicos requeridos para que se lleve a cabo una precisa, eficiente y regulable transcripcin
eucaritica son: 1) elementos del DNA conocidos como promotores y secuencias

INTRODUCCIN 8

reguladoras, 2) protenas nucleares conocidas como factores basales o generales de

transcripcin y protenas reguladoras (activadoras o represoras) y 3) la RNA Pol que
sintetiza el RNA (Goodrich y col., 1996).

2.2.1 Promotores
Los promotores son secuencias de DNA de tamao variable que se encuentran
localizadas ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin y controlan la tasa a la cual la
RNA polimerasa transcribe la regin codificante del gen. Se distinguen dos regiones de los
promotores:
1. El promotor mnimo o ncleo del promotor, que se encuentra inmediatamente
adyacente, ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin y se extiende entre
40 (ro arriba) hasta +50 (dentro de la regin que se transcribe) pb
aproximadamente del sitio de inicio de la transcripcin. Es la secuencia de DNA
mnima requerida para llevar a cabo la transcripcin en ausencia de un
activador, generalmente contiene el elemento conocido como caja TATA, el
iniciador (Inr) o ambos y el sitio de inicio de la transcripcin (Smale y
Kadonaga, 2003).
2. La regin reguladora del ncleo del promotor, se encuentra inmediatamente ro
arriba del ncleo del promotor y se extiende hasta 1,000 pb aproximadamente
del sitio de inicio de la transcripcin. En esta regin se encuentran secuencias
consenso para diferentes factores nucleares que funcionan como activadores o
represores de la transcripcin (Fig. 2) (Goodrich y col., 1996). Cada promotor
tiene una combinacin particular de elementos reguladores o secuencias
consenso positivas y negativas (denominadas elementos en cis, debido a que

INTRODUCCIN 9

actan sobre su propio promotor mnimo) con un determinado arreglo espacial

(Smale y Kadonaga, 2003).

2.2.2 Otras regiones reguladoras

Los potenciadores son secuencias de DNA que contribuyen a la actividad del ncleo
de promotor y pueden estar localizados a posiciones variables relativas al sitio de inicio de
la transcripcin. Se pueden localizar tanto ro arriba, como ro abajo del sitio de inicio de la
transcripcin y funcionan independientemente de la orientacin. Estn constituidos por
secuencias cortas, a las cuales se unen diferentes factores de transcripcin e interactan con
la maquinaria basal de transcripcin (Smale y Kadonaga, 2003).
Elementos de respuesta: Son secuencias de DNA que reversiblemente activan o
reprimen la transcripcin en respuesta a seales moleculares. Entre estos elementos se
encuentran los de respuesta a metales, a choque trmico, a glucocorticoides y a la
concentracin de suero, entre otros. Los genes regulados por elementos de respuesta son
reconocidos por protenas especficas, sintetizadas o activadas en tiempos y tejidos
especficos (Triezenberg, 1995).

2.3 Factores de transcripcin

Los factores de transcripcin son protenas que reconocen secuencias consenso del
promotor. Son los responsables de la transcripcin de genes en tiempo y espacio,
especifican el inicio de la transcripcin y regulan la transcripcin basal. Se han dividido
de acuerdo a su funcin en dos grupos: Los factores basales o generales que, junto con la
RNA Pol son suficientes para iniciar la transcripcin, y los factores especficos o
reguladores (activadores o represores) que estn formados por dos dominios funcionales:

INTRODUCCIN 10

Caja TATA

Promotor

Regin Codificante

-1500

-30

MRE

Sp-1

GRE

-10

+1

+10

AP-1

OCT

+600

Inr

TATA

Caja TATA

(1)
5
-100

3
-30

+1

Caja TATA

(2)
5

3
Activador

-100

-30

+1

Caja TATA

(3)
5

3
Activador Represor

Activador

-100

-30

+1

Figura 2. Elementos requeridos para la expresin de los genes eucariticos. A) Componentes

bsicos de un promotor eucaritico, la caja TATA (verde) se localiza entre 25 y 30 pb del sitio de
inicio de la transcripcin (flecha) y es un elemento esencial del ncleo del promotor.
Inmediatamente ro arriba del ncleo del promotor se encuentra la regin reguladora del promotor y
ms arriba de las 500 pb, extendindose hasta 10,000 pb del sitio de inicio de la transcripcin se
encuentran las regiones potenciadoras (representadas por las cajas de colores que esquematizan
secuencias de unin para diversos factores de transcripcin). A ambas regiones se unen protenas
que se conocen como activadores, que pueden encender o activar la transcripcin de un gen. B)
Esquema de un promotor regulado por varias secuencias ro arriba. (1) ncleo del promotor que
carece de elementos reguladores y slo presenta una expresin basal. (2) La unin de una protena
activadora a su secuencia consenso provoca un aumento en la expresin del gen. (3) La mayora de
los promotores eucariticos presentan una combinacin de diferentes activadores y represores
unidos a sus respectivas secuencias consenso (Goodrich y col., 1996).

INTRODUCCIN 11

uno de unin al DNA y uno de activacin.

El dominio de unin al DNA es el responsable de dirigir al factor de transcripcin a
la cercana del promotor y le confiere especificidad por una secuencia a travs de la unin
DNA-protena o por interacciones protena-protena con otros factores de transcripcin. La
unin al DNA se lleva a cabo por puentes de hidrgeno e interacciones de Van der Waals.
El dominio de activacin facilita el ensamble de los complejos de preiniciacin por
interacciones directas o indirectas. Las interacciones indirectas se dan va una o ms
protenas mediadoras llamadas adaptadores, coactivadores o protenas accesorias. Estas
interactan con componentes del complejo de preiniciacin, a travs de un puente de unin
entre el activador y la maquinaria basal de transcripcin. Por la composicin de
aminocidos del dominio de activacin, los factores de transcripcin han sido agrupados en
varias clases: acdicos, ricos en glutamina, ricos en prolina o serina y ricos en treonina. La
presencia de estos dominios en los factores activadores les permite tener un intercambio
dinmico y complejo de interacciones con diferentes protenas, que en conjunto son
capaces de llevar a cabo la activacin transcripcional (Triezenberg, 1995).

2.4 RNA polimerasas

Las RNA Pol son enzimas complejas formadas por 12 o ms subunidades, 5 de las
cuales, son productos de genes compartidos por los tres tipos de RNA polimerasas
(ABC10, ABC10, ABC14.5, ABC23 y ABC27 en Saccharomyces cerevisiae) (Marvin y
White, 2000). Las RNA Pol I y RNA Pol III comparten adems, dos subunidades que no se
encuentran en la RNA Pol II (AC19 y AC40 en S. cerevisiae), aunque las subunidades
B12.5 y B44 de la RNA Pol II, son funcionalmente equivalentes a estas subunidades

INTRODUCCIN 12

(Marvin y White, 2000). La presencia de subunidades comunes les confiere una regulacin
coordinada.
La RNA Pol I se encuentra en el nucleolo, mientras que las RNA Pol II y III estn
localizadas en el nucleoplasma. Presentan diferente sensibilidad a -amanitina, un
importante inhibidor de la sntesis de RNAm en eucariontes, de tal manera que la RNA Pol
I es totalmente resistente a -amanitina, la RNA Pol III tiene una sensibilidad intermedia
(usualmente inhibida en el rango de 10 500 mg/ml) y la RNA Pol II es altamente sensible
a la droga (inhibida por 0.1 mg/ml). Este patrn es mantenido en todos los eucariontes,
aunque en los eucariontes inferiores hay respuestas ms variables a la -amanitina,
presentando generalmente menos sensibilidad (Sauer y Tjian, 1997).
El dominio carboxilo terminal (CTD) de la RNA Pol II de mamferos consiste de
aproximadamente 52 repetidos de un heptapptido consenso YSPTSPS (Tyr-Ser-Pro-TreSer-Pro-Ser), que proporciona un punto de anclaje para una amplia variedad de protenas
involucradas en la sntesis y el procesamiento del RNAm. La secuencia consenso y la
estructura repetitiva del CTD es altamente conservada en la escala evolutiva, lo que implica
que sus funciones son las mismas en diferentes organismos. Sin embargo, en algunos
grupos de eucariontes, este dominio se encuentra degenerado, sugiriendo la prdida de
interaccin con protenas esenciales para algunas de sus funciones (Guo y Stiller, 2005).

2.5 Etapas de la transcripcin

La sntesis de los RNAs por las RNA Pol es un proceso complejo que consta de
cuatro etapas bsicamente:
1. Preiniciacin: Comienza con el reconocimiento del templado y la unin de los
factores basales de transcripcin al promotor, los cuales permiten la interaccin

INTRODUCCIN 13

de la RNA Pol con el DNA de doble cadena. Se crea la burbuja de transcripcin

por un desenrrollamiento local de las cadenas de DNA, que comienza en el sitio
de unin de la RNA Pol y permiten el reconocimiento de una de las cadenas
como templado para la sntesis del RNA (Sauer y Tjian, 1997).
2. Iniciacin: Comienza con la incorporacin del primer ribonucletido, la enzima se
posiciona en el promotor e incorpora los primeros 9 nucletidos, que se van
uniendo por medio de enlaces fosfodister. La fase de iniciacin termina cuando
la enzima avanza para extender la cadena de RNA. El primer nucletido unido
al complejo DNA-RNA Pol es casi siempre una purina. La sntesis de la cadena
de RNA se da en direccin 5 a 3, tomando como molde la cadena
complementaria, por lo que la secuencia de bases de la hebra de RNA recin
sintetizada es idntica a la cadena codificante (Sauer y Tjian, 1997).
3. Elongacin: Es la fase durante la cual la burbuja de transcripcin que contiene la
RNA Pol se mueve a lo largo del DNA y se extiende la cadena de RNA.
Conforme la enzima se va moviendo, los nucletidos son agregados y unidos
covalentemente al extremo 3 de la cadena de RNA y el DNA se va
desenrollando para exponer un nuevo segmento del DNA templado. La cadena
de DNA templado se aparea transitoriamente con el RNA naciente en el punto
de crecimiento, formando un hbrido RNA-DNA. La tasa de elongacin vara
considerablemente dependiendo de la naturaleza del templado que est siendo
transcrito; sin embargo, los valores mximos son de 30 a 60 nucletidos
polimerizados por segundo. La cadena de RNA crece gradualmente por la
incorporacin de 5-10 nucletidos provocando un cambio conformacional en la

INTRODUCCIN 14

enzima, que le permite moverse hacia delante para continuar la sntesis del RNA
(Sauer y Tjian, 1997).
4. Terminacin: Involucra el reconocimiento de una secuencia, la cual genera la seal
para que ya no sean agregadas ms bases a la cadena de RNA, la formacin de
enlaces fosfodister se detiene, la burbuja de transcripcin se colapsa y el
hbrido de RNA-DNA se separa. El DNA recupera su estructura de doble
cadena y la RNA Pol y el RNA recin transcrito son liberados. La secuencia de
DNA que se requiere para que la reaccin termine se denomina terminador
(Shilatifard y col., 1997).

2.6 Transcripcin por RNA Pol II

La transcripcin por RNA Pol II es el punto final de la va de transduccin de
seales que contnuamente modifica a la clula en respuesta a sus necesidades metablicas
y a estmulos ambientales, por esta razn es la ms estudiada y mejor caracterizada.
La transcripcin de genes que codifican protenas es precedida por mltiples
eventos que incluyen la descondensacin del sitio que se va a transcribir, el
remodelamiento del nucleosoma mediante modificaciones de las histonas, la unin de
activadores transcripcionales y coactivadores a regiones potenciadoras y regiones
promotoras respectivamente y el reclutamiento de la maquinaria basal de transcripcin en el
ncleo del promotor para formar el complejo de preinicio de la transcripcin (Fig. 3).
El ensamble del complejo de preinicio de la transcripcin (PIC), que consta de ms
de 60 polipptidos, es un proceso de asociacin estequiomtrica ordenado temporalmente
que inicia con la unin al ncleo del promotor, de los factores TFIID y TFIIA, seguido del

INTRODUCCIN 15

Figura 3. Descondensacin del sitio de transcripcin. En eucariontes el DNA se encuentra

condensado en la cromatina, la cual est formada por protenas llamadas histonas con las cuales el
DNA se une formando los nucleosomas, que corresponden a las unidades estructurales de la
cromatina. Este grado de compactacin del DNA mantiene a los genes en estado inactivo, ya que
inhiben la unin de factores de transcripcin al DNA. Mediante modificaciones como fosforilacin,
acetilacin de histonas, entre otras, se desestabiliza el nucleosoma exponiendo las cadenas del DNA
que posteriormente sern separadas para iniciar la transcripcin.

INTRODUCCIN 16

complejo llamado holoenzima RNA Pol II. El cual a su vez es un complejo preensamblado
conformado por el ncleo de RNA Pol II, los factores generales de transcripcin TFIIB
(algunos complejos no contienen TFIIB), TFIIF, TFIIE y TFIIH, el complejo mediador/Srb,
el complejo Srb10CDK, el complejo Swi/Snf y el complejo SAGA (PCAF en humano)
(Greenblatt, 1997; Myer y Young, 1998; Berk, 1999). Al formarse el PIC se inicia la
transcripcin cuando se fosforila el dominio carboxilo terminal (CTD) de la subunidad
mayor de RNA Pol II por el factor TFIIH. En el ncleo del promotor se quedan unidos los
complejos TFIID y TFIIA y el resto del PIC se mueve conforme sintetiza el RNAm (Fig.
4). El factor TFIIA potencia la transcripcin y produce una transcripcin basal de los genes.
Para aumentar la velocidad de la transcripcin, se presentan interacciones protena-protena
entre factores de transcripcin que se unen a secuencias proximales y/o distales al ncleo
del promotor, y el PIC directamente, o a travs de coactivadores, que actan como un
intermediario de la comunicacin entre los primeros y el PIC. Sin embargo, la complejidad
de la transcripcin es tal, que recientemente se ha establecido la existencia de varios PICs
especializados y diversos mdulos de selectividad en los promotores, que dirigen
coordinadamente la regulacin de redes de genes relacionados funcionalmente. Esto se
debe a que es necesario controlar patrones de expresin de manera espacial y temporal
durante los procesos de diferenciacin y desarrollo (Levine y Tjian, 2003). Para encender
estas redes de genes, debe haber una interaccin molecular entre complejos modificadores
de las histonas (complejos de acetilacin-desacetilacin) y del DNA (metilasasdesmetilasas), complejos remodeladores de la cromatina, correguladores y los PICs. Los
elementos ms importantes del ncleo del promotor y las protenas que interactan con
estos elementos se describen a continuacin.

INTRODUCCIN 17

Inr

TATA

II
B Pol
Inr
3

Pol II
H

EE

PP

PP
P P
P
PP

Terminacin

II
B Pol
Inr

EE

Inr

Pol II

PP

ATP

P
P

PP

RNA
6
P

P
PP

Pol II

PP

P
P P
P

PP

D
5

NTPs

Pol II
Inr

P
P
P P

EE

P
PP

PP

Figura 4. Ensamble del complejo de preiniciacin (PIC). Comienza con el reconocimiento

de la caja TATA por el factor TFIID seguido de una unin coordinada de TFIIA, TFIIB, la forma
no fosforilada de RNA Pol II y TFIIF (RAP30/RAP74), TFIIE y TFIIH. Antes de la elongacin la
RNA Pol II es fosforilada por TFIIH. Despus de la terminacin una fosfatasa recicla la RNA Pol II
a su forma no fosforilada, permitiendo que la enzima reinicie la transcripcin (Burley y Roeder,
1996). Es importante sealar que la holoenzima RNA Pol II lleva consigo molculas involucradas
en el procesamiento del RNA (no se muestra en esta figura).

INTRODUCCIN 18

2.6.1 Promotores de clase II

Estn formados por varios elementos que actan en cis: 1) ncleo del promotor, 2)
elementos del promotor proximales, 3) elementos activadores o "enhancers" distales del
promotor, 4) silenciadores y 5) elementos insulators (Blackwood y Kadonaga, 1998;
Bulger y Groudine, 1999; West y col., 2002). Estos elementos poseen secuencias que
permiten la unin de una variedad de factores de transcripcin que regulan la actividad del
promotor.

Ncleo del promotor

Originalmente se pensaba que los ncleos de los promotores para la RNA Pol II
eran invariables, pero se ha encontrado recientemente que poseen una diversidad estructural
y funcional considerable (Smale, 1994; Butler y Kadonaga, 2002), lo cual contribuye a
variaciones en la regulacin de la expresin gnica (Smale, 1994; Smale, 2001). Los
elementos que conforman el ncleo del promotor son: a) la secuencia de nucletidos que
constituye el elemento iniciador (Inr) en las posiciones 2 a +4 pb, b) la caja TATA
localizada entre 31 y 25 pb, c) el elemento de reconocimiento por el factor TFIIB o BRE
ubicado en las posiciones 37 a 32 pb y d) el elemento del ncleo del promotor localizado
ro abajo del sitio de inicio de la transcripcin o DPE (de sus siglas en ingls Downstream
Promoter Element), en las posiciones +28 a +32 pb (Butler y Kadonaga, 2002; Smale y
Kadonaga, 2003).

Elemento Iniciador (Inr).

Esta secuencia fue definida como un elemento discreto del ncleo del promotor
funcionalmente similar a la caja TATA y puede funcionar independientemente de sta.

INTRODUCCIN 19

Aunque lleva a cabo las funciones de una caja TATA, como dirigir la formacin del PIC,
determinar la localizacin del sitio de inicio de la transcripcin y mediar la accin de
protenas activadoras, se encuentra localizada en el sitio de inicio de la transcripcin.
Generalmente se encuentra una adenosina en el sitio de inicio de la transcripcin (+1), una
citosina en la posicin 1 y unas pirimidinas (Py) a ambos lados de estos nucletidos. La
secuencia consenso definida mediante estudios de transcripcin in vitro e in vivo en lneas
celulares humanas es Py Py A(+1) N T/A Py Py (Smale y Kadonaga, 2003). El Inr parece
ser reconocido por dos protenas independientes: el TAFII250 estabilizado por el TAFII150
y la RNA Pol II (Kaufmann y col., 1998). El factor TFIID reconoce el Inr de promotores
sin caja TATA, posiblemente con la ayuda del factor TFIIA y cofactores denominados
TICs (TAFII y cofactores dependientes del Inr). En algunos promotores este evento de
reconocimiento dirige a la TBP (subunidad del factor TFIID) a unirse a la regin 30 pb del
promotor en una manera independiente de la secuencia TATA, aunque en ciertos
promotores la unin de TBP parece ser innecesaria. Estudios del espaciamiento entre la caja
TATA y el Inr han demostrado que los dos elementos actan de manera sinrgica cuando se
encuentran separados por 25-30 pb, pero actan independientemente cuando estn
separados por ms de 30 pb (OShea-Greenfield y Smale, 1992).

Caja TATA
La caja TATA, tambin llamada caja Goldberg-Hogness, fue el primer elemento del
ncleo del promotor identificado en genes eucariticos que codifican protenas (Smale y
Kadonaga, 2003). El descubrimiento de la caja TATA, en 1979, se llev a cabo mediante la
comparacin de promotores de genes de Drosophila, mamfero y virus (Breathnach, 1981).
La secuencia 5-TATAAAAG-3 (considerada como la caja TATA consenso para

INTRODUCCIN 20

eucariontes) se localiza generalmente en las posiciones 25 a 40 pb ro arriba del sitio de

inicio de la transcripcin, aunque en S. cerevisiae se localiza en las posiciones -40 a -120
pb (Smale y Kadonaga, 2003). El desarrollo de ensayos de transfeccin y transcripcin in
vitro hizo posible demostrar que una mutacin puntual, como un cambio de T por G o por
A en la tercera posicin de la caja TATA, reducen o abaten la actividad de promotores
celulares y virales (Wasylyk y col., 1980; Wasylyk y Chambon, 1981). En un principio se
pensaba que la caja TATA podra estar muy conservada desde levadura hasta el humano,
pero en estudios recientes con Drosophila se encontr que esta secuencia o una que
contena un cambio con respecto de la consenso estaban presentes slo en el 33% de 1941
ncleos de promotores estudiados (Olher y col., 2002); adems, el 32% de 1301 ncleos de
promotores potenciales humanos contienen esta secuencia TATA (Suzuki y col., 2001). La
secuencia 5-TATATAAG-3 se report como la ptima secuencia de reconocimiento para
la TBP (Wong y Bateman, 1994). Sin embargo, estudios recientes han mostrado que existe
una gran diversidad de secuencias ricas en A/T que pueden funcionar como cajas TATA
(Hanhn y col., 1989; Singer y col., 1990; Wobbe y Struhl, 1990; Zenzie y col., 1993;
Patikoglou y col., 1999). Diez secuencias variantes de la caja TATA (5-TATAAAAG-3)
del promotor AdMLP de adenovirus, que se encuentran naturalmente, permiten la unin de
TBP al DNA, induciendo en todos los casos cambios conformacionales del DNA similares
(determinados por los patrones de difraccin de rayos X), con la excepcin de los cambios
a C:G o G:C en las posiciones 2, 4 y 5, y del cambio de la T de la tercera posicin por una
A. De tal manera que la nueva definicin de la caja TATA resultante de estos estudios
estructurales es:
Posicin:

4 /

5- T>>c>a=g /A>>t / T>>a=c / A>>t / T>>a / A>>g>c=t / A=T>g>c / G=A>c=t -3,

INTRODUCCIN 21

donde el nmero representa la posicin de la caja TATA. Sin embargo, esta definicin slo
predice qu tan bien puede ser tolerado cada nucletido en cada una de las posiciones, pero
no si la TBP puede unir una secuencia nucleotdica en particular (Smale y Kadonaga,
2003). Aunque la mayora de los estudios de cajas TATA se han realizado en levadura,
Drosophila y humano, se han encontrado elementos anlogos en eucariontes ms
primitivos, as como en Archaea. En promotores de varias especies de Archaea, una
secuencia de 8 pb rica en AT est localizada a 24 pb del sitio de inicio de la transcripcin.
Esta secuencia, originalmente denominada caja A, es el sitio de unin para la protena de
Archaea homloga a la TBP (Smale y Kadonaga, 2003). Cajas TATA o secuencias ricas en
AT localizadas a una distancia fija ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin han sido
identificadas esencialmente en todos los promotores de genes de animales, plantas y hongos
estudiados (Smale y Kadonaga, 2003).

Elemento del Promotor Ro Abajo (DPE).

El ncleo de la secuencia DPE se localiza en la posicin +28 a +32 relativa a la
A(+1) del Inr. Fue identificado como un elemento del ncleo del promotor requerido para
la unin del factor TFIID purificado, a una clase de promotores sin caja TATA. El DPE
est conservado desde Drosophila hasta el humano y se le encuentra tpicamente, pero no
exclusivamente en promotores sin caja TATA. La secuencia consenso es A/G+28 G A/T
C/T G/A/C, aunque existe una preferencia menor por G+24 (Kutach y Kadonaga, 2000).
El DPE acta en conjuncin con el Inr y una mutacin en cualquiera de estos dos elementos
ocasiona una drstica reduccin de la transcripcin (Burke y Kadonaga, 1996; Butler y
Kadonaga, 2003). Por lo tanto, el DPE y el Inr funcionan juntos como una unidad del

INTRODUCCIN 22

ncleo del promotor. Estudios de crosslinking y unin al DNA sugieren que el DPE es
reconocido por los TAFII60 y TAFII40 (Burke y Kadonaga, 1996)

Elemento de Reconocimiento para el factor TFIIB (BRE).

ste es el nico elemento bien caracterizado en el ncleo de los promotores de
genes de tipo II que es reconocido por otros factores transcripcionales diferentes al TFIID o
a los complejos de TRF1 y TRF2 (formados por factores relacionados a la TBP y factores
asociados distintos a los encontrados en el complejo TFIID). La evidencia inicial de que
exista un elemento ro arriba y adyacente a la caja TATA se obtuvo con el anlisis de
mutaciones en promotores de Archaea (Reiter y col., 1990; Palmer y Daniels, 1995).
Posteriormente se descubri mediante el anlisis de cristalografa de rayos X del complejo
TBP-TFIIB-TATA, que el factor TFIIB interacciona con el surco mayor del DNA ro arriba
de la caja TATA y con el surco menor ro abajo de esta misma secuencia (Nikolov y col.,
1995).

Finalmente,

se

ha

confirmado

esta

interaccin

mediante

estudios

de

entrecruzamiento DNA-protena. La secuencia consenso del BRE es G/C G/C G/A C

G C C, donde la C del extremo 3 es seguida por la primera T de la caja TATA.
Experimentos realizados in vitro con el TFIIB purificado han mostrado que BRE facilita la
incorporacin del TFIIB en PICs productivos (Lagrange y col., 1998). Por otra parte, otros
estudios han mostrado que el BRE tiene un efecto negativo en la transcripcin con extractos
nucleares crudos y en ensayos in vivo mediante transfecciones transitorias (Evans y col.,
2001). Archaea tambin tiene el elemento BRE, al que se une el homlogo de TFIIB, el
factor TFB (Qureshi y Jackson, 1998).

INTRODUCCIN 23

Otros Elementos del ncleo del Promotor.

Adems de los elementos descritos anteriormente, se han encontrado un gran
nmero de secuencias del ncleo del promotor que contribuyen a la actividad
transcripcional. Algunos ejemplos de estas secuencias son: i) un elemento ro abajo (DCE)
del ncleo del promotor de la -globina humana, localizado de +10 a +45. Mutaciones en
este elemento reducen la unin del TFIID y la eficiencia de la transcripcin. ii) El promotor
de la protena acdica fibrilar de la gla humana presenta un elemento localizado de +11 a
+50 que es necesario para la unin de TFIID y para la actividad transcripcional (Butler y
Kadonaga, 2002). El anlisis de promotores sin caja TATA con mltiples sitios de inicio de
la transcripcin permiti la identificacin del elemento de inicio mltiple ro abajo MED-1
(Butler y Kadonaga, 2002), el cual contribuye a la actividad transcripcional de dos
promotores de los tres estudiados en donde se identific este elemento.

Elementos Proximales y Distales del Promotor.

Los elementos proximales pueden localizarse en cualquier sitio entre -250 y +250
nucletidos. En esta regin se pueden unir factores activadores o represores de la
transcripcin. Por ltimo, los elementos activadores o enhancers que se pueden localizar
muy lejos del sitio de inicio de la transcripcin, en cualquier direccin y orientacin,
constituyen otro grupo de elementos a los que se unen factores de transcripcin que
modulan la actividad de RNAP II. Esta modulacin se hace a travs de interacciones
protena-protena y/o protena-DNA.

INTRODUCCIN 24

2.6.2 Maquinaria Basal de Transcripcin.

Factor de Transcripcin TFIID.
La primera etapa del proceso de transcripcin es el reconocimiento del promotor por
el factor TFIID a travs de interacciones con la caja TATA, el Inr y el DPE. El factor de
transcripcin TFIID, que tiene un peso molecular aproximado de 700 kDa, est formado
por la protena de unin a la caja TATA (TBP) y alrededor de 14 factores altamente
conservados que se asocian a TBP. En el humano se han caracterizado 13, en Drosophila
11 y en Saccharomyces 14 (Burley y Roeder, 1996; Lee y Young, 1998). Se denominan
TAFIIs por sus siglas en ingls (TBP associated factors), y el peso molecular en kDa, o
usando la nueva nomenclatura: TAF y el no. arbigo correspondiente (Tora, 2002). Los
TAFs se describieron originalmente como coactivadores, pero ahora se involucran en la
selectividad del promotor. As, los TAFs se requieren para la transcripcin de promotores
TATA- in vitro (Lee y Young, 2000).

Protena de unin a la caja TATA (TBP)

La TBP fue inicialmente identificada como un componente del factor de
transcripcin TFIID, participa en la transcripcin llevada a cabo por las tres RNA Pol. Por
lo tanto se le considera un factor central en la transcripcin ya que es capaz de formar
complejos multiproteicos como el SL1, el TFIID y el TFIIIB al asociarse con diferentes
TAFs, para posicionar a la RNA Pol I, II y III respectivamente, en el promotor adecuado
(Fig. 5) (Hernandez, 1993).
En 1989, varios grupos reportaron la purificacin y clonacin de una TBP de
levadura (Cavallini y col., 1989; Eisenmann y col., 1989; Hahn y col., 1989; Horikoshi y
col., 1989), y la clonacin de los genes homlogos de Drosophila y humano se report al

INTRODUCCIN 25

TAF 110
I
TAF 48 TBP TAF 63
I
I

SL1

RNA POL I

TBP

RNA POL II

RNA POL III

TAF 80
II
TAF 60
II
TAF 110
II
TAF 40
TAF 250
II
II
TAF 150
TBP
II
TAF 30
II

TFIID
TAF 170
TAF 70
III
III
TBP

TFIIIB

Figura 5. TBP como factor central de la transcripcin. La TBP es capaz de asociarse a

diferentes protenas denominadas TAFs (por sus siglas en ingls TBP associated factors) formando
los complejos multiproteicos SL1, que participa en la transcripcin mediada por RNA Pol I; TFIID
para la RNA Pol II y TFIIIB para posicionar a la RNA Pol III (Hernandez, 1993).

INTRODUCCIN 26

ao siguiente (Hoey y col., 1990; Hoffman y col., 1990; Kao y col., 1990; Muhich y col.,
1990). En la mayora de los organismos existe un solo gen que codifica para la TBP, sin
embargo, en algunos incluyendo Arabidopsis thaliana y Zea mayz, existen dos genes de
TBP que codifican protenas altamente similares (Hernandez, 1993). Aparentemente TBP
sola puede participar en el ensamble del PIC, pero es incapaz de responder a seales
regulatorias, como lo hace el factor TFIID.
TBP es una protena altamente conservada, desde Archaea hasta eucariontes
superiores (Struhl, 1994; Burley y Roeder, 1996). Presenta dos dominios: el extremo
amino, de longitud variable (18 173 residuos) y poco conservado, y el extremo carboxilo,
altamente conservado, que comprende los ltimos 180 aa. Con excepcin de la TBP de
Plasmodium falciparum, la cual es idntica solo en un 38% con la TBP de humano
(Hernndez, 1993), los dominios carboxilo de las TBPs caracterizadas, presentan alrededor
de 75% de identidad con la de humano. Este dominio es el dominio funcional de la
protena, el cual est formado por los dominios estructurales y , de 89 y 90 aa,
respectivamente, que constituyen un dmero intramolecular separado por un dominio
bsico, y con estructura tridimensional en forma de silla de montar (Fig. 6) (Nikolov y
Burley, 1994).
El dominio funcional de la TBP interacta con la curvatura menor del DNA a travs
del dominio cncavo (Burley y Roeder, 1996). La regin convexa, formada por cuatro
hlices , el dominio bsico, parte de las cadenas plegadas S1 y S1 y por el extremo
amino, presenta mltiples interacciones con diferentes factores de transcripcin, desde
basales como los TAFs, hasta activadores como p53 (Nikolov y Burley, 1994). TBP por s
sola produce una distorsin en el DNA, creando un doblez de casi 120 y separando las dos

INTRODUCCIN 27

H2
H2
S1

S1

S5
S4
S2

S3

S5
S4

S3

H1
S2

H1

Figura 6. Representacin de listones de la estructura tridimensional del extremo carboxilo

terminal de TBP de humano, determinada por cristalografa de rayos X. TBP se une a la curvatura
menor de la secuencia TATA e induce un doblamiento en el DNA. Las hlices se indican con H y
las lminas -plegadas con S. El segundo repetido directo se denota con '(Nikolov y col., 1996).

INTRODUCCIN 28

cadenas de DNA en la secuencia TATA, lo cual facilita la transcripcin. Esta protena por
s sola es suficiente para permitir la transcripcin basal.
La TBP se dimeriza a travs de interacciones hidrofbicas de su dominio Cterminal, bloqueando el sitio de unin al DNA, por lo que la dimerizacin y la unin al
DNA son eventos mutuamente excluyentes (Campbell y col., 2000). Se ha propuesto un
mecanismo de regulacin de unin al DNA en dos etapas, el cual conduce finalmente a la
formacin de un complejo DNA-protena estable.
La primera etapa involucra la formacin de un complejo inestable TBP-DNA sin
distorsin, el cual slo se observa con la protena completa. Esto implica que el extremo
amino no inhibe la interaccin entre TBP y el DNA per se, pero puede ayudar a pasar a la
segunda etapa, la distorsin en el DNA. As se identific una superficie expuesta al
solvente
en el ncleo de TBP, que sera la superficie inhibitoria de la unin al DNA (IDB) y, por lo
tanto, no habra el doblez en el DNA.
Es probable entonces que el extremo amino haga contacto con esta superficie o que
bloquee alostricamente la segunda etapa. Otras evidencias sugieren que el extremo amino
se une a la superficie expuesta (Perez-Howard, 1995; Lee y Struhl, 2002). Esto ha sido
confirmado con el descubrimiento de que el TFIIA promueve la disociacin del dmero de
TBP y acelera la cintica de unin al DNA. El factor TFIIA tambin tiene el mismo efecto
sobre el factor TFIID (Reese, 2003).
A pesar del papel central de TBP en la transcripcin, cambios en la concentracin
celular de esta protena producen cambios especficos en la expresin de genes que
contribuyen a la transformacin celular (Johnson y col., 2003).

INTRODUCCIN 29

La expresin de TBP se encuentra elevada en carcinomas de colon en humano, con

respecto al epitelio normal, lo que sugiere que TBP puede ser un componente crtico en la
sealizacin desregulada que ocurre ro abajo de lesiones genticas que causan tumores
(Johnson y col., 2003).

Diversidad en los miembros de la familia de TBP

En metazoarios existen dos nuevas familias de genes que codifican factores
relacionados a TBP. El factor TBP-like (parecido a TBP) con una similitud
significativamente alta a TBP pero con races filogenticas separadas (Dantonel y col.,
1999). Este factor es tambin llamado factor 2 relacionado a TBP (TBP-related factor 2 o
TRF2) (Rabenstein y col., 1999) y protena TBP-like (TLP) (Ohbayashi y col., 1999). El
genoma de Caenorhabditis elegans contiene solo dos factores tipo TBP (TBP y TLF) con
un 60% de similitud entre sus dominios bien conservados (Dantonel y col. 1999) y con
dominios no conservados con mucho menor similitud, cuando se comparan con diferentes
dominios conservados de TBPs (con un 80% de identidad).
Esto sugiere que las funciones de TLFs y TBPs han estado sujetas a diferentes
presiones evolutivas. Mientras que las funciones de TBP parecen ser idnticas desde
levaduras hasta el humano, los TLFs pueden tener funciones que toleran ms diversidad.
Una segunda clase de genes parlogos de TBP se han identificado recientemente en
organismos vertebrados (Veenstra y Wolffe., 2001). Estos genes codifican factores cuyos
dominios conservados (C-terminal) presentan una identidad del 92% con los dominios de
las TBP hasta ahora reportadas, pero difieren significativamente de estas en sus dominios
amino-terminal. En Drosophila existen cuatro factores relacionados a TBP (TRF1-TRF4)
adems de TBP (Levine y Tjian., 2003). TRF1 se une pobremente a la secuencia TATA,

INTRODUCCIN 30

reconoce secuencias ricas en TC que no son reconocidas por TBP, e inicia la transcripcin
de un pequeo grupo de promotores de tipo II sin caja TATA. Participa en la transcripcin
mediada por RNA Pol III, ya que si se inhibe su expresin, se inhibe tambin la
transcripcin por esta enzima (Takada y col. 2000). Este factor relacionado a TBP se
conoce slo en insectos, mientras que genes ortlogos de TRF2 se han identificado en C.
elegans, ranas, ratones y humanos (Levine y Tjian, 2003). TRF2 puede ser esencial en la
espermatognesis de mamferos (Levine y Tjian, 2003), pero presenta una influencia ms
amplia en la expresin de genes durante el desarrollo embrionario temprano de C. elegans,
Drosophila y Xenopus (Levine y Tjian, 2003). dTRF2 no se une a la caja TATA pero se
une a los promotores mediante la interaccin con DREF que activa selectivamente genes
que codifican protenas. En levaduras no se han identificado esta clase de genes homlogos
de TBP (Levine y Tjian, 2003). TRF1, TRF2 y TBP se unen a los factores basales TFIIA y
TFIIB. Adicionalmente, se ha identificado un nuevo complejo multiproteico que est
formado por TAFIIs y hGCN5 (una acetilasa de histonas), pero que no contiene TBP,
denominado TFTC, que puede formar un complejo de inicio de transcripcin para RNA Pol
II, as como mediar activacin transcripcional. Se postula que su funcin sera su
reclutamiento en la cromatina para acetilar las histonas y as potenciar tanto el inicio como
la activacin de la transcripcin (Brand y col., 1999).

Factores asociados a TBP (TAFs)

Los TAFIIs que conforman el TFIID de humano son hsTAF1 (hTAFII250), hsTAF2
(hTAFII150), hsTAF3 (hTAFII140), hsTAF4 (hTAFII130/135), hsTAF4b (hTAFII105),
hsTAF5 (hTAFII100), hsTAF6 (hTAFII80), hsTAF7 (hTAFII55), hsTAF9 (hTAFII32/31),
hsTAF10

(hTAFII30),

hsTAF11

(hTAFII28),

hsTAF12

(hTAFII20/15),

hsTAF13

INTRODUCCIN 31

(hTAFII18) y hsTAF15 (hTAFII68). El primer factor en asociarse a TBP es el TAFII250. Sin

este factor, el complejo TFIID no se forma (Takada y col., 1992; Weinzierl y col., 1993;
Ruppert y col., 1993; Kokubo y col., 1993; Reese y col., 1994).
Estas protenas son el blanco de activadores o represores de la transcripcin, as
como de otros factores basales de la transcripcin, entre los que se encuentran Rb, que
interacta con hTAFII250, Sp1 con el hTAFII135, y p53 y VP16 con hTAFII31 (Weinzierl y
col., 1993). Estudios recientes han revelado la estructura de algunos TAFIIs: hTAFII80 y sus
homlogos yTAF60 y dTAF69/62, tienen homologa estructural con la histona H4;
hTAFII31, yTAF17 y dTAF40/42 tienen homologa con H3 y, finalmente, hTAFII20,
yTAF68/61 y dTAF30a la tienen con la histona H2B (Burley y Roeder, 1996; Hahn, 1998).
Adems, los TAFs de Drosophila parecidos a las histonas H3 y H4 tienen una
estructura tetramrica (H3-H4)2 muy similar a la observada en los nucleosomas, lo cual,
aunado a otros datos bioqumicos y estructurales, ha permitido establecer que el factor
TFIID tiene una estructura octamrica parecida al nucleosoma (Burley y Roeder, 1996;
Hoffmann y col., 1996; Hahn, 1998).
Los TAFIIs no slo forman parte del factor TFIID, algunos de ellos forman parte de
un complejo denominado SAGA en levaduras, que acetila histonas (Hahn, 1998), lo cual
ampla la funcionalidad de estos factores asociados a TBP.
La estructura de los nucleosomas se altera cuando ocurre la acetilacin de los
residuos de lisina en las histonas por complejos como p300/CBP o como GCN5 (Mizzen y
col., 1996; Brownel, y Allis, 1996). De igual manera, se propone que la acetilacin mediada
por TFIID (especficamente del TAFII250) permite el acceso, la orientacin y estabilizacin
de la maquinaria de transcripcin en un promotor determinado (Struhl, 1998; Albright y

INTRODUCCIN 32

Tjian, 2000). Se ha propuesto que los TAFIIs son esenciales para la estimulacin de
activadores transcripcionales in vitro (Burley y Roeder, 1996; Verrijzer y Tjian, 1996).
Adems, se ha determinado que son necesarios para la transcripcin in vitro de
promotores que carecen de caja TATA, presumiblemente a travs de interacciones con
otros elementos del promotor como las secuencias Inr y de otros elementos del promotor
localizados ro abajo y que sirven para posicionar al factor TFIID, o con factores como
YY1
que reconoce secuencias Inr (Verrijzer y Tjian, 1996; Chalkley y Verrijzer, 1999; Chian y
Roeder, 1995).
El hsTAF1 (hTAFII250) tambin conocido como CCG1 es una subunidad
importante del factor TFIID, que adems de regular la progresin de la fase G1 del ciclo
celular, integra interacciones entre factores de transcripcin y varios TAFs permitiendo su
comunicacin con TBP. Esta protena de alto peso molecular posee: i) dos bromodominios
(BD), ii) dos dominios con actividad de cinasa, uno en el extremo amino y otro en el
carboxilo, los cuales actan sobre RAP74, una subunidad del factor TFIIF (Dickstein y col.,
1996), iii) un dominio con una actividad de acetilasa de histonas y iv) un dominio con
actividad de ubiquitinacin.
El TAFII250 marca con ubiquitina la histona H1 tanto in vitro como in vivo, lo cual
sugiere un nuevo papel de la ubiquitinacin en la regulacin transcripcional mediante el
remodelamiento de la estructura de la cromatina (Mizzen y Allis, 2000). La actividad de
acetilasa de histonas presentada por esta subunidad, ha permitido sugerir que el factor
TFIID promueve la descondensacin de los nucleosomas facilitando as la formacin del
PIC (Fig. 7) (Mizzen y col., 1996). Por otro lado, los residuos acetilados de las histonas se
unen especficamente a los bromodominios, un dominio estructural presente en un gran

INTRODUCCIN 33

ubc

2068

Cinasa

Cinasa

BD BD

HAT

TFIID
TAFII250
Ac
Ac

Bromodominios
Acetil lisina

Ub

DNA
H1
Nucleosoma H1
?
P

H1

N
U
b

C
U
b

Figura 7. Diversas modificaciones de las histonas desestabilizan el nucleosoma. El TAF1

(TAFII250) modifica las protenas asociadas a la cromatina en varias maneras. Este TAF en
Drosophila presenta dos bromodominios (BD), dos dominios con actividad de cinasa (cinasa), de
acetiltransferasa de histonas (HAT), y de conjugacin de ubiquitina (ubc). El TAF1 se une al
extremo acetilado del nucleosoma a travs de sus bromodominios. Esta interaccin puede permitir
al TAF1 ubiquitinar la histona H1, dando como resultado la alteracin de la estructura de la
cromatina, facilitando la transcripcin (Mizzen y Allis, 2000).

INTRODUCCIN 34

nmero de reguladores transcripcionales incluyendo acetilasas de histonas como TAFII250

y p300/CBP. Esto sugiere que existe un cdigo en las modificaciones de las histonas que
dirige cuando y dnde se pueden unir a la cromatina ciertos reguladores de la transcripcin
(Mizzen y Allis, 2000). La interaccin del extremo amino del hTAFII250 con TBP
interfiere con la unin de TBP a la caja TATA y esto puede tener alguna significancia
regulatoria (Kokubo y col., 1993; Burley y Roeder, 1996). El complejo de este TAF y el
hsTAF2 (TAFII150), se une directamente a la secuencia Inr y pueden determinar la
respuesta de un promotor a un activador como Sp1, pero no lo pueden hacer por s solos
(Chalkley y Verrijzer, 1999).
El primer TAF sobre el cual se analizaron mutaciones in vivo fue el hsTAF1
(hTAFII250). Las lneas celulares ts13 y tsBN462 derivadas de clulas BHK-21 (baby
hamster kidney), presentan una mutacin puntual, que resulta en la sustitucin del cido
asprtico (690) por una glicina en el dominio con actividad de acetil transferasa. Esta
mutacin termosensible en el gen CCG1/TAFII250, conlleva al arresto celular en la fase G1
y a defectos en la transcripcin de genes especficos a temperatura no permisiva (39.5o C)
(Wang y col., 1997; Sekiguchi y col., 1999). Estudios sobre la expresin de los genes de
levadura a lo largo del ciclo celular, (medidos con un biochip o microarreglo de DNA), en
los que se emple una mutacin termosensible en el gen que codifica al yTAFII145
(homlogo del hTAFII250), revel que slo el 16% de los genes requieren de este factor
para expresarse. Un juego de estos genes est involucrado en la progresin a travs del
ciclo celular (como el gen CTR9 que controla la expresin de los genes de ciclinas de G1,
CLN1 y CLN2) y otro, en la reparacin y sntesis del DNA (Holstege y col., 1998). Estos
resultados fueron parcialmente comprobados por Sekiguchi y col., (1999) quienes
encontraron que la sobreexpresin de ciclinas tipo D rescataban el fenotipo de las clulas

INTRODUCCIN 35

tsBN462, al igual que la sobreexpresin de E2F-1 (cuya funcin es reprimida por la forma
hipofosforilada de Rb), del antgeno T grande de SV40 y de E7 de HPV16 (estas dos
ltimas, protenas que se unen a Rb y la inactivan), concluyendo que el TAFII250 es
necesario para la expresin de las ciclinas tipo D.
Mediante el uso de cepas mutantes termosensibles en otros TAFs se demostr que a
temperatura restrictiva, la transcripcin de varios genes, tanto constitutivos como
inducibles, no se afectaba, pero s cuando se usaban mutantes termosensibles en TBP y en
la subunidad mayor de la RNA Pol II (Moqtaderi y col., 1996; Walker y col., 1996), lo cual
cuestion seriamente el papel de los TAFIIs como coactivadores. Sin embargo, mutaciones
termosensibles en TAFII68/61, TAFII60 y TAFII17 de levaduras, los cuales tienen
homologa con varias histonas, permitieron determinar el papel fundamental de estos
TAFIIs en la viabilidad celular (Holstege y col., 1998; Moqtaderi y col., 1998; Apone y col.,
1998). Una mutacin termosensible en el TAFII17 de levadura redujo la expresin del 67%
del total de genes. Este efecto se debe probablemente a que forma parte de TFIID y de
SAGA (Moqtaderi y col., 1998; Holstege y col., 1998). De igual manera, yTAFII25, que no
tiene estructura de histonas pero que forma parte de ambos complejos, es esencial para la
transcripcin del mRNA in vivo, incluyendo numerosas subunidades de TFIID y SAGA
(Sanders y col., 1999). Mutaciones en el yTAFII40 que es especfico del TFIID, conducen a
un arresto general de la transcripcin, an en presencia de un exceso de TBP (Komarnitsky
y col., 1999).
Actualmente se sabe que los metazoarios han desarrollado mltiples complejos
relacionados con TFIID que pueden funcionar en distintos promotores a travs de TAFs
que son tejido especficos y con protenas relacionadas a TBP o TRFs (Levine y Tjian,
2003). El TAFII105 relacionado al TAFII130, opera en el TFIID de clulas foliculares de

INTRODUCCIN 36

ovario, lo cual permite la activacin selectiva de un pequeo juego de genes (Freiman y

col., 2002). De igual forma, el homlogo del TAFII80 especfico de testculos, se requiere
en la espermatognesis en Drosophila, y puede formar parte de un complejo TFIID
especfico de espermatozoides (Hiller y col., 2001).
Tambin existen coactivadores, que son complejos activadores con mltiples
subunidades y al parecer facilitan la unin y/o la funcin del dominio de unin al DNA de
RNA Pol II en el ncleo del promotor (Levine y Tjian, 2003).
Las levaduras tienen tan slo un complejo, pero los metazoarios tienen varios
complejos relacionados con TRAP, CRSP, ARC/DRIP, SMCC y hMed. Estos complejos
son reclutados en el DNA por medio de una serie de activadores transcripcionales de
secuencia especfica, que incluyen receptores nucleares como el de la vitamina D y el
receptor de la hormona tiroidea (Levine y Tjian, 2003).
Tambin algunos de estos complejos pueden funcionar como represores, como por
ejemplo complejos ms pequeos de CRSP aumentan la transcripcin in vitro, mientras que
un complejo ms grande de ARC puede reprimir (Levine y Tjian, 2003).
La complejidad de cada una de las etapas en la transferencia de informacin
gentica desde un gen hasta la protena, ha requerido que sean estudiadas en forma aislada,
sin embargo, un creciente nmero de estudios genticos ha revelado interacciones
funcionales entre factores que llevan a cabo diferentes pasos en la expresin de genes.
Estos estudios sugieren que cada etapa es una subdivisin de un proceso continuo, en el que
permanecen fsica y funcionalmente ligadas unas a las otras. Un ejemplo de esta
comunicacin son los resultados de experimentos en los que se ha estudiado la
transcripcin en ncleos intactos, que sugieren que el aparato transcripcional juega un papel

INTRODUCCIN 37

Dimerizacin y activacin
del receptor transmembranal

CITOPLASMA

3
200
AAA

Activacin de
factor de
transcripcin

Plegamiento de protena

Protena

X
p 5
pp
5

pp
p

Traduccin

Localizacin
nuclear

Poro
nuclear

Transporte de RNAm

NCLEO

*
Descompactacin
de cromatina
Cromatina

IMF
TBP

RNAPII

X
p 5
pp

AAA
AAU

G p
5 p
p5 X

Acoplamiento de
transcripcin y
procesamiento de RNAm

RNAPII

Empaquetamiento
RNAm

G/
U

RNAPII

Corte y
poliadenilacin 3

RNAPII

RNAPII

G5

TATA

ppp5
G5

Iniciacin y
cap 5? acopladas

Fig. 8 Visin contempornea de la expresin de genes. Recientes hallazgos sugieren que

cada paso en la regulacin de la expresin de genes (de la transcripcin a la traduccin) es una
subdivisin de un proceso continuo. En esta visin contempornea cada etapa est fsica y
funcionalmente contectada a la siguiente, asegurando que haya una transferencia eficiente entre
manipulaciones y que ningn paso individual sea omitido (Orphanides y Reinberg, 2002).

INTRODUCCIN 38

activo en reclutar la maquinaria que adiciona el CAP y procesa el RNA naciente (Shatkin y
Manley, 2000) (Fig 8). Esta organizacin de eventos puede tambin introducir una serie de
mecanismos de control de calidad para asegurar que ningn paso individual sea omitido
(Orphanides y Reinberg, 2002).

3. Antecedentes sobre la transcripcin en E. histolytica

A diferencia de lo que se conoce en otros eucariontes, en E. histolytica se sabe muy
poco sobre la regulacin de la expresin de genes a nivel de la maquinaria de
transcripcin.La organizacin genmica y los posibles elementos de los promotores de este
protozoario parsito parecen ser distintos de los encontrados en otros protozoarios mejor
caracterizados y en organismos metazoarios (Purdy, 1996).
Estudios filogenticos han revelado que E. histolytica tiene un genoma
relativamente pequeo para un eucarionte (3.2 x 107 pb) y extremadamente rico en A+T
(67% en regiones codificantes y 78% en regiones no codificantes) (Tannich y Horstmann,
1992; Snchez y col., 1994). Adems posee un uso de codones inusual, con un 85% de
A+U en la tercera posicin del codn (Bruchhaus y col., 1993). Hasta hace poco se
consideraba que el genoma amibiano no contena intrones, sin embargo, ahora se sabe que
un 15 % posee este tipo de secuencias.

3.1 Promotores en E. histolytica

Los estudios sobre la estructura y funcin de promotores en E. histolytica, se
iniciaron con el anlisis de las secuencias ro arriba de varios genes (Bruchhaus y col.,
1993). Las secuencias AAAAATTCA y AAAAATCA se identificaron alrededor del sitio
de inicio de la transcripcin y la secuencia TATTTAAA se localiz aproximadamente 30

INTRODUCCIN 39

pb ro arriba este sitio (Bruchhaus y col., 1993; Petri y col., 2002). La caracterizacin del
promotor del gen hgl2 el cual codifica una subunidad pesada de la lectina de 170 kDa,
inhibible por galactosa (Bub y col., 1995; Pudry y col., 1996; Singh Singh y col., 1997;
Rogers, 1998), demostr que ste queda restringido a 550 pb ro arriba del sitio de inicio de
la transcripcin. El promotor mejor caracterizado en E. histolytica es el del gen de otra
subunidad pesada de la lectina, ligeramente diferente a la del gen hgl2. En ambos
promotores las secuencias TATA, CCAAT (hgl2) y GAAC (hgl5) se identificaron como
elementos reguladores para la actividad mxima del promotor in vivo.
En un gran nmero de genes de E. histolytica se han descrito promotores de 272 pb
ro arriba del sitio de la transcripcin (Purdy y col., 1996).

Ncleo del promotor en E. histolytica

Purdy y col. (1996) analizaron la regin del ncleo de promotores de 37 genes de E.
histolytica y encontraron tres secuencias conservadas: i) la secuencia GTATTTAAA,
posible caja TATA localizada a 30 pb del sitio de inicio de la transcripcin, ii) la
secuencia GAACT, denominada elemento GAAC con una ubicacin variable en el ncleo
del promotor y iii) El posible elemento Inr, AAAAATTCA en el sitio de inicio de la
transcripcin. Estudios funcionales de la caracterizacin del promotor del gen hgl5 han
demostrado que existen estas tres regiones conservadas en el ncleo del promotor y son las
que regulan el sitio de inicio de la transcripcin (Singh y col., 1997). El Inr y la posible caja
TATA presentan poca homologa en secuencia con la de otros eucariontes, aunque
funcionalmente son equivalentes. Sin embargo, el elemento GAAC no haba sido reportado
como posible elemento que controla el inicio de la transcripcin.

INTRODUCCIN 40

Otras secuencias que se han descrito como sitios de inicio de la transcripcin son:
ACGC para el gen Ehtbp (Luna-Arias y col., 1999), CAATT para el gen EhPAK y TTAA
para el gen EhMCM3 (Gangopadhyay y col., 1997).

Caja TATA en E. histolytica

Aunque la secuencia TATAAAA es considerada como la consenso para eucariontes,
se ha demostrado que la mayora de secuencias ricas en AT de aproximadamente 6 o ms
pb, pueden funcionar como caja TATA, mientras se encuentren en la proximidad de otros
elementos de control (Kollmar y Farnham, 1993; Smale, 1994). Por lo tanto, es de esperarse
que en un organismo con un alto porcentaje de secuencias ricas en A+T en su genoma
como E. histolytica, mutaciones en la secuencia TATA de tipo silvestre, puede revelar la
existencia de cajas TATA crpticas (Singh, 1997).
Diferentes grupos han localizado posibles cajas TATA con secuencias TATTAAA,
TATAAA (Snchez y col., 1994) y TATTTAAA (Bruchhaus y col., 1993; Li y col., 1992;
Singh y col., 1997), situadas entre -27 y -50 pb del ATG. Sin embargo, debido a que la
secuencia TATTTAAA es la que se ha encontrado en varios promotores de genes de E.
histolytica, sta es la que se considera como sitio consenso para la unin de la TBP de este
protozoario.

Elemento Inr en E. histolytica

El elemento Inr (AAAAATTCA) encontrado en promotor del gen hgl5 parece tener
un papel menos relevante en el control del sitio de inicio de la transcripcin, ya que solo
cuando se mutan la caja TATA y el elemento GAAC se observa un control en este sitio.
Los elementos Inr en E. histolytica se pueden agrupar en cinco subpoblaciones: CE1-a,

INTRODUCCIN 41

CE1-b, CE1-c, CE1-d y CE1-e (Purdy y col., 1996). En el gen hgl5 el Inr pertenece a la
subpoblacin CE1-e, cuya secuencia consenso es ATAGACAA. Aunque se ha descrito una
relativa divergencia entre las regiones Inr de eucariontes superiores y la existencia de
mltiples familias de Inr, estos elementos de los promotores de genes que codifican
protenas en E. histolytica, presentan divergencia an en los nucletidos altamente
conservados 1(C), +1(A) y +3(T) (Bucher, 1990; Smale y col., 1998), encontrados en
regiones Inr de ms de 500 genes eucarinticos y en eucariontes primitivos tales como
Trichomonas vaginalis (Quon, 1994).

Elemento GAAC en E. histolytica

El elemento GAAC est presente en 31 de 37 promotores analizados y se localiza en
una posicin variable entre la caja TATA y el Inr (Petri y col., 2002). El posible papel de
este elemento incluye la estabilizacin del PIC por interacciones con TFIID, TFIIB y la
RNA Pol II.
Este elemento es suficiente para dirigir la transcripcin del promotor de hgl5
mutado tanto en la caja TATA como en la secuencia Inr, de tal manera que este elemento
acta de manera independiente (Singh y Rogers, 1998). El hecho de que el elemento GAAC
se haya localizado en diferentes posiciones en diferentes promotores, ha demostrado que su
funcin tambin es independiente de la posicin.

Otras regiones reguladoras en genes de E. histolytica

Adems de los elementos que componen el promotor en algunos genes de E.
histolytica, se han descrito otras regiones importantes que participan en la regulacin de la
expresin de ciertos genes. Estos elementos son los denominados URE1 al URE5, (de sus

INTRODUCCIN 42

siglas en Ingls Upstream Regulatory Elements) los cuales fueron mapeados por estudios
de mutagnesis por delecin (Purdy y col., 1996).
El elemento URE3, cuya secuencia es TATTCTATT se encuentra ubicado en la
posicin 89 a 80 del sitio de inicio de la transcripcin del promotor del gen hgl5 y es un
regulador negativo de la expresin de este gen. En el promotor del gen fdx de la
ferredoxina, este elemento se ha localizado en la posicin 60 a 50 del sitio de inicio de la
transcripcin y contrario a lo que sucede en el gen hgl5, funciona como un elemento
regulador positivo de la actividad del promotor (Singh y col., 2002). El hecho de que la
mutacin de URE3 haya tenido efectos opuestos, puede parecer inusual, sin embargo,
existen reportes de la dualidad de algunos elementos a los cuales se unen protenas que
afectan la actividad de su promotor positiva o negativamente dependiendo de la presencia
de otros factores de transcripcin. Este elemento se encuentra presente por lo menos en
otros 7 genes de E. histolytica (Gilchrist y col., 1998; Gilchrist y col., 2001).
Las secuencias URE parecen ser especficas de los promotores de E. histolytica y
unen protenas que no son conocidas en otros eucariontes.
En el promotor del gen EhPgp1, uno de los responsables del fenotipo de resistencia
a mltiples drogas, se han localizado dos elementos que actan en cis localizados en las
posiciones 54 a 43 y 198 a 186 pb y corresponden a sitios CCAAT/enhancer binding
protein (C/EBP). Estos elementos son esenciales para la regulacin transcripcional de este
gen, ya que el que se encuentra en la posicin 54, puede estar involucrado en la
estabilizacin del PIC y el de la posicin 198, provoca el doblamiento en el DNA y
promueve la transcripcin del gen (Marchat, 2002).

INTRODUCCIN 43

3.2 Regulacin de la expresin de genes en E. histolytica

Otros promotores que se han estudiado en E. histolytica son los correspondientes a
los genes EhPgp1 y EhPgp5, que codifican P-glicoprotenas, las cuales confieren el
fenotipo de multirresistencia a drogas o MDR (Prez y col., 1998; Gmez y col., 1998). En
estudios relacionados con MDR en E. histolytica, este fenotipo parece ser consecuencia de
un incremento en la actividad de P-glicoprotenas, regulada a nivel transcripcional, pero
tambin a la heterogeneidad de los transcritos de EhPgp5 y a un aumento en su vida media
debida a un alargamiento en el cola de poli(A) (Lpez-Camarillo y col., 2003). Se ha
observado que en trofozotos de la clona C2 (resistente a emetina), 3 de los 4 genes EhPgp
se transcriben diferencialmente (Orozco y col., 1995). Mientras que el gen EhPgp1 se
transcribe

constitutivamente,

el

gen

EhPgp5

es

inducible,

transcribindose

preferencialmente a altas concentraciones de la droga (Prez y col., 1998). El anlisis de la

secuencia del promotor del gen EhPgp5 ha revelado la presencia de secuencias consenso
para la unin de diversos factores de transcripcin, entre los que se encuentra una secuencia
AP-1 dentro de la regin activadora en las primeras 235 pb. Adems, estudios de
competencia con esta regin promotora han evidenciado la posible participacin de un
factor de transcripcin tipo AP-1 y su probable asociacin con factores de la familia HOX
(Prez y col., 1998). Existen reportes de otros organismos que apoyan la participacin de
AP-1 en genes de resistencia a drogas. Por otro lado, en estudios relacionados con la
induccin de la secrecin de colagenasa en E. histolytica, la cual es necesaria para la
invasin por la amiba, se ha reportado que la interaccin del colgeno tipo 1 induce una
cascada de sealizacin en la que participan protenas homlogas a pp125FAK y p42MAPK
(Prez y col., 1996), las cuales intervienen en vas de sealizacin que pueden conducir a la
expresin de los genes que codifican AP-1. Sin embargo, en el banco de genes del TIGR y

INTRODUCCIN 44

de SANGER, no se encontraron (secuenciacin terminada) genes relacionados con AP-1, lo

cual sugiere que las protenas que se unen a los elementos AP-1 son muy divergentes.
Basados en el anlisis de algunas secuencias genmicas y en las caracterizaciones
de varios genes, se sabe que la mayora de las unidades de transcripcin en E. histolytica,
estn ligadas y localizadas unidireccionalmente a travs del genoma (Bruchhaus y col.,
1993). Sin embargo, se report que el gen EhRab B est codificado en la cadena
complementaria, 332 pb ro arriba del gen Eh112 (Rodrguez y col., 2000), el cual a su vez
se encuentra ligado al gen Ehadh112 separados entres s por 188 pb, lo que sugiere
estructuras diferentes de regulacin gentica. Por otra parte, mediante transfecciones
transitorias en ensayos de run on, se determin que la transcripcin en E. histolytica es
monocistrnica y no policistrnica (Nickel y Tannich, 1994).
Un hecho interesante es que la RNA Pol II de E. histolytica es resistente in vitro a
altas concentraciones de -amanitina (hasta 1 mg/ml), contrario a lo que sucede con la
mayora de los organismos eucarinticos, lo cual sugiere que esta RNA Pol II difiere de la
de los dems organismos (Lioutas y Tannich, 1995).

3.3 Factores de transcripcin en E. histolytica

Protena de unin a la caja TATA

El nico factor de transcripcin de la maquinaria basal que se ha clonado en E.
histolytica es el de TBP. Este gen fue clonado mediante la amplificacin por la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR) de un fragmento de 309 pb (Hernndez y col., 1997),
usando oligonucletidos diseados a partir de secuencias conservadas de la TBP de
Acanthamoeba castellanii (Wong y Bateman, 1992). Este fragmento se utiliz para aislar

INTRODUCCIN 45

clonas de cDNA y DNA genmico, las cuales fueron idnticas y contenan un marco de
lectura abierto (ORF) de 702 pb, sin intrones, que codifica una protena de 234 aa, con un
peso molecular de 26 kDa y un pI de 9.27 (Luna-Arias y col., 1999). La protena codificada
por este gen tiene un extremo amino de 47 aa, muy divergente en secuencia con respecto a
otras TBPs, pero un extremo carboxilo de 182 aa (el dominio funcional de TBP) con una
identidad del 55% y 54%, con TBP de humano y Acanthamoeba, respectivamente, y slo
del 37% con la de Plasmodium falciparum (Luna-Arias y col., 1999). El anlisis de
Southern blot revel que este gen es unicopia, aunque la hibridacin de cromosomas
separados por TAFE detect seal en las bandas de 0.8 y 1.5 Mb, lo que podra significar
diploida para este gen o hibridacin cruzada con otras secuencias del genoma.
Experimentos de Northern blot detectaron un transcrito de 1.2 kb, de casi el doble del
tamao del ORF, al igual como sucede con otros genes de TBP (Luna-Arias y col., 1999).
Anlisis de primer extension permitieron establecer que el transcrito tiene una regin 5' no
traducida (5'UTR) de 420 nt, que constituye la regin ms larga de transcrito conocido a la
fecha en este parsito (Luna-Arias y col., 1999). Tambin se localiz una posible caja
TATA (5-ATTAATT ) en el promotor, a -28 pb del sitio de inicio de la transcripcin.

Otros factores de transcripcin en E. histolytica

Dos factores generales de transcripcin se han identificado en este protozoario. La
protena C/EBP que es un activador transcripcional y ejerce su funcin al unirse al
elemento enhancer CCAAT presente en el promotor del gen EhPgp1 (Marchat y col.,
2003). Este factor de transcripcin se aisl y caracteriz como una protena parecida a las
pertenecientes a la familia C/EBP y se le denomin EhC/EBP (Orozco, 2003). El gen que
codifica para un homlogo de p53, fue aislado y caracterizado por Mendoza y col., (2003).

INTRODUCCIN 46

p53 es un conocido antioncogn que se encarga de cuidar la integridad del DNA. Si existe
dao al material gentico, p53 se induce y promueve una serie de eventos que conducen a
la reparacin del DNA. Si el dao es muy extenso, induce apoptosis (Mendoza y col.,
2003).
Por otro lado, se ha identificado una protena que se une especficamente al
elemento URE3 (URE3-BP) del gen hgl5. La clonacin del gen de esta protena por
monohbrido en levaduras mostr que tiene dos motivos EF-hand que unen calcio y le
permiten unirse a URE3, aunque no presenta dominios cannicos de unin al DNA
(Gilchrist y col., 2003). Esta protena se localiza tanto en el ncleo como en el citoplasma.
Debido a que la regin URE3 puede regular le expresin gentica tanto positiva como
negativamente, se ha sugerido que la protena que se une a este elemento podra tener ms
de una forma de interactuar con la maquinaria basal de la transcripcin (Gilchrist y col.,
2001). Tambin se han identificado dos protenas (EhEBP1 y EhEBP2) que se unen al
elemento enhancer URE4 in vivo. Estas dos protenas contienen el motivo RRM de unin a
RNA (Schaenman y col., 2001), anlogo a los dominios presentes en protenas que
participan en el corte y empalme del RNA durante el procesamiento de los transcritos y
durante la exportacin de los pre-RNA mensajeros (Kenan y col., 1991; Birney y col.,
1993). Estas protenas, por lo tanto, parecen jugar un papel importante en la regulacin de
la expresin de genes en E. histolytica.

JUSTIFICACIN

47

II. JUSTIFICACIN.

La infeccin causada por Entamoeba histolytica, representa una de las principales causas de
morbilidad y mortalidad en pases en vas de desarrollo como el nuestro. A pesar de la importancia
mdica de este parsito, la amibiasis contina siendo un problema de salud pblica.
En ciertas ocasiones, la amibiasis es asintomtica, pero en otras, produce los sntomas
tpicos de la infeccin. E. histolytica, es capaz de invadir el hgado y otros rganos como pulmn y
cerebro, lo que sugiere que este protozoario modifica la expresin de genes en respuesta al ambiente
en el que se encuentra. A nivel de laboratorio, se han observado diferencias entre cepas, en sus
propiedades de virulencia (Orozco, 1985; De Menezes, 1997; Padilla-Vaca, 1999), lo que concuerda
con lo anterior, es decir, el ambiente regula la expresin de los genes relacionados con estas
propiedades.
Por otra parte, los mecanismos moleculares que conducen a la diferenciacin celular de los
trofozotos a quiste y viceversa son desconocidos. Estos mecanismos tambin deben estar regulados
a nivel transcripcional.
Entender los mecanismos de la regulacin de la expresin de genes en el protozoario E.
histolytica puede proporcionar una idea de la habilidad de este organismo para sobrevivir a cambios
drsticos en su ambiente, as como de la transformacin de trofozoto a quiste.
E. histolytica ha sido comparada con clulas transformadas, ya que presenta el fenotipo de
resistencia a mltiples drogas y algunos aspectos de este tipo celular. Tambin se considera un
organismo eucarintico primitivo y atpico por no poseer organelos celulares bien definidos. Estas
caractersticas hacen de este parsito un interesante modelo experimental para tratar de dilucidar los
mecanismos moleculares que regulan la expresin de sus genes.
La protena de unin a la caja TATA, altamente conservada en la escala evolutiva, es
considerada un factor de transcripcin central en el inico de la transcripcin de genes, ya que es la
primera que se posiciona sobre el DNA para reclutar a los dems factores de transcripcin, por tal

JUSTIFICACIN

48

motivo, la caracterizacin de esta protena en Entamoeba histolytica, es un primer paso en el

entendimiento de la expresin de genes, ya que permitir, adems de conocer los mecanismos
moleculares de inicio en la regulacin transcripcional en este protozoario, introducirnos en el campo
de la Biologa Molecular de este parsito e iniciar los estudios relacionados con la expresin de
genes.
Por ltimo, los estudios a nivel molecular, permitirn entender las diferencias en virulencia
presentadas por ste parsito y as disear nuevas estrategias en la elaboracin de frmacos para
controlar y erradicar la amibiasis.

OBJETIVOS 49

III. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL:

Purificar y caracterizar bioqumica y funcionalmente la protena de unin a la caja TATA de

Entamoeba histolytica.

OBJETIVOS PARTICULARES:

1.- Localizar intracelularmente el gen Ehtbp y la protena

2.- Predecir la estructura terciaria de la EhTBP
3.- Demostrar la presencia de la EhTBP en extractos nucleares
4.- Evaluar la afinidad de EhTBP endgena por diferentes cajas TATA
5.- Caracterizar funcionalmente la EhTBP recombinante
6.- Evaluar la afinidad de la protena recombinante con diferentes cajas TATA.
7.- Purificar el factor TFIID a partir de extractor nucleares y determinar la afinidad por
diferentes cajas TATA.
8.- Caracterizar parcialmente la funcionalidad del factor TFIID

MATERIAL Y MTODOS 50

IV. MATERIAL Y MTODOS

Secuencia del gen Ehtbp

La secuencia del gen Ehtbp se obtuvo del plsmido previamente aislado de una
genoteca de E. histolytica construida en ZapII (plsmido G-32). La secuencia deducida de
aminocidos de la EhTBPr (EhTBP recombinante) se compar con secuencias de otras
TBPs empleando el algoritmo de Altschul y col., (1990) depositados en el GeneBank.

Microorganismos empleados
Clulas competentes de Escherichia coli de las cepas BL21(DE3)pLysS y
DH5 (Invitrogen). Trofozotos de la clona A de E. histolytica.

Cultivos de E. histolytica
Trofozotos de la clona A, obtenidos de la cepa HM1:IMSS (Orozco, 1985), se
cultivaron axnicamente en cajas de cultivo (Falcon) a 370 C en medio de Diamond TYI-S33 (Diamond y col., 1978) suplementado con 3% de mezcla de vitaminas Diamond (Special
Diamond Vitamin Mixture, North American Biologicals, EUA), 0.25 Ul/ml de penicilina,
35 g/ml de estreptomicina (Lakeside, Mxico) y suero fetal bovino al 20%. Una vez que
alcanzaron la fase logartmica de crecimiento se cosecharon 100 x 106 trofozotos para
obtener extractos nucleares.

Obtencin de extractos nucleares

Se emple el protocolo de la tcnica corta para obtencin de extractos nucleares
(EN) descrita por Schreiber y col., (1989) y Dignam y col., (1983), modificada y adaptada

MATERIAL Y MTODOS 51

para trofozotos de E. histolytica por Gmez y col., (1998) y Prez y col., (1998). Los
trofozotos se centrifugaron a 360 X g (1,500 rpm) en una centrfuga Beckman TJ-6 a 40 C
durante 12 min en tubos Falcon (Nalgene) de 50 ml. El sobrenadante se elimin y el
paquete celular se lav con solucin salina amortiguadora de fosfatos estril fra (NaCl 137
mM, KCl, 2.7 mM, Na2 HPO4.7H2O 4.3 mM, KH2 PO4 1.4 mM pH 7.2) y se repiti la
centrifugacin. El paquete celular, se resuspendi en 8 volmenes de solucin A fra
(Hepes 10 mM, pH 7.9, MgCl2 1.5 mM, KCl 10 mM, DTT 0.5 mM y PMSF 0.5 mM) y se
transfiri a tubos crex de 30 ml. Se dejaron reposar por 30 min en hielo y se observaron
las clulas al microscopio para evaluar la lisis celular. Se centrifug a 6,000 X g (8,600 rpm
en centrfuga Beckman J2-21 usando un rotor JA-20) durante 10 min a 40 C. Se retir el
sobrenadante cuidadosamente y el paquete celular se resuspendi en solucin A con un
cocktail de inhibidores de proteasas (PMSF 0.5 mM, Benzamidina 2 mM, Aprotinina 5
g/ml, Pepstatina A 5 g/ml, Leupeptina 5 g/ml y E-64 5 g/ml) y se incub a 4C
durante 20 min. Esta mezcla se transfiri a un homogenizador estril, mazo de alta presin
y se dieron aproximadamente 15 a 20 golpes en hielo monitoreando en el microscopio la
eficiencia de lisis celular y la integridad de los ncleos. El lisado se transfiri a un tubo
crex de 15 ml y se centrifug nuevamente a 6,000 X g por 10 min a 4C. Se elimin
cuidadosamente el sobrenadante y la pastilla se resuspendi en 80 a 100 l de solucin C
fra (Hepes 20 mM, pH 7.9, NaCl 0.42 M, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 0.5 mM) con
cocktail de inhibidores de proteasas. La mezcla se incub 40 min a 4C con agitacin
rotatoria, se centrifug a 6,000 X g 10 min y se recuper el sobrenadante (correspondiente
al extracto nuclear), se distribuy en alcuotas, que fueron congeladas a -70C o en
nitrgeno lquido hasta su uso. La concentracin de protenas se determin por el mtodo
de Bradford (Bradford, 1976) (reactivo de Bradford, Bio-Rad).

MATERIAL Y MTODOS 52

PCR in situ
Se emple para localizar intracelularmente el gen Ehtbp utilizando el sistema de
PCR in situ GeneAmp 1,000 (Perkin Elmer), siguiendo las instrucciones del fabricante.
Como

primers

utilizamos

los

CGGGGATCCATGTCAACACCTGGAGA

oligonucletidos
3')

TBP1
TBP2

(5'
(5'

CCGGAATTCTTATTGATTTGATATATCTTC 3') y las condiciones de reaccin descritas

en Luna-Arias y col., 1999.

Anlisis in silico del plegamiento y la estructura terciaria de la protena EhTBP

Se realizaron empleando el algoritmo SWISS-MODEL versin 3.5. Este programa
funciona como un sistema de modelaje automatizado que consiste en la extrapolacin de la
estructura para una nueva secuencia (blanco) a partir de la estructura tridimensional
conocida de protenas relacionadas (templado). La comparacin se llev a cabo por la
superposicin de los correspondientes pares de tomos de carbono alfa seleccionados
automticamente del alineamiento de las secuencias blanco y templado.

Preparacin de clulas competentes BL21(DE3)pLysS y DH5 y mtodo de

transformacin de stas clulas
Las clulas competentes se prepararon de acuerdo al mtodo descrito por Hanahan
(1983). Una colonia de las cepas BL21(DE3)pLysS y DH5 de E. coli se cultiv por
separado en 5 ml de medio SOB (bactotriptona 2%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 2.5
mM, MgCl2 10 mM MgSO4 10 mM) a 370C con agitacin moderada (225 rpm) por 16 18
h hasta que alcanz una densidad de 4 X 107 clulas por ml. Las clulas se empastillaron
por centrifugacin a 1000 X g (2,000 a 3,000 rpm en una centrfuga clnica) durante 12

MATERIAL Y MTODOS 53

minutos a 4oC. La pastilla se sec invirtiendo los tubos en papel absorbente y las clulas se
resuspendieron mezclando moderadamente en 1/3 del volumen original de solucin RF1
(RbCl 100 mM, MnCl24H2O 50 mM, acetato de potasio 30 mM. CaCl22H2O 10 mM,
glicerol 15% pH 5.8), se incubaron en hielo 15 min y se centrifugaron de nuevo a 1,000 X g
durante 15 min a 4oC. Las pastillas se resuspendieron en 1/12.5 del volumen original de
solucin RF2 (MOPS 10 mM, RbCl 10 mM, CaCl2.2H2O 75 mM, glicerol 15%, pH 6.8) y
se incubaron en hielo por 15 min. Las clulas se distribuyeron en alcuotas de 250 l, se
congelaron en una mezcla de hielo seco-etanol y se conservaron a -70oC. Para la
transformacin, 50 l de clulas competentes se incubaron en hielo con 1.5 l de la
construccin pRSET A-TBP (a una concentracin de 3 ng/l), durante 30 min. Se les dio
un choque trmico a 42o C durante 45 seg y se incubaron 2 min en hielo. Se aadieron 200
l de medio LB (Luria-Bertani, triptona 1%, extracto de levadura 0.5%, NaCl 0.05%) y se
incubaron a 37oC con agitacin (225 rpm), durante 1 hora. Por ltimo, se inocularon en
placas de LB-ampicilina (100 g/ml) y se incubaron toda la noche a 37oC. Para las clulas
BL21(DE3)pLysS se adicion al medio cloranfenicol a 34 g/ml.

Extraccin del DNA plasmdico por lisis alcalina (minipreps)

De acuerdo al mtodo descrito por Sambrook y Rusell (2001), se picaron 5 a 10
colonias transformadas de la cepa DH5 o BL21(DE3)pLysS y cada una se inocul en 5 ml
de LB-ampicilina (100 g/ml) toda la noche. Se transfirieron 1.5 ml de cultivo a tubos
eppendorf de 1.5 ml y se centrifugaron 30 seg a 14,000 X g para empastillarlas, se elimin
el sobrenadante y se sec la pastilla. Se agregaron 100 l de solucin 1 (glucosa 50 mM,
Tris 25 mM pH 8, EDTA 10 mM pH 8.0) y se agitaron los tubos en vrtex hasta que se
resuspendieron las pastillas. Posteriormente se agregaron 200 l de solucin 2 (NaOH 0.2

MATERIAL Y MTODOS 54

N, SDS 1%) agitando los tubos suavemente por inversin y se colocaron en hielo por 5 min
Se aadieron 150 l de solucin 3 (acetato de potasio 5M 120 ml, CH3COOH glacial 23
ml, H2O 57 ml), se mezclaron suavemente en posicin invertida para dispersar toda la
solucin en el lisado bacteriano y se incubaron en hielo 5 min Se centrifugaron a 14,000 X
g durante 5 min a 4oC. Se recuper el sobrenadante en tubos nuevos y se agregaron 400 l
de fenol (en campana de extraccin de vapores), se mezcl en vrtex y se centrifugaron a
14,000 X g 3 min a 4oC. Se repiti el paso anterior, se recuper la fase acuosa y se pas a
tubos nuevos. Se agregaron 400 l de cloroformo, se agit nuevamente en vrtex y se
centrifugaron a 14,000 X g. Se recuper la fase acuosa (aproximadamente 150 l), se
agregaron 2 volmenes de etanol absoluto (aproximadamente 300 l) se mezcl en vrtex y
los tubos se mantuvieron en hielo 10 min Se centrifugaron de nuevo 10 min a 14,000 X g,
se elimin el sobrenadante y se agregaron 200 l de etanol al 70% para lavar la pastilla. Se
centrifugaron 10 min a 14,000 X g. Se elimin nuevamente el sobrenadante y se dejaron
secando las pastillas de 10 a 20 min Las pastillas secas se resuspendieron en 30 l de TE
pH 8.0 (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM pH 8.0), se les agreg 1 l de RNasa A (10 mg/ml)
y se incubaron 30 min a 37oC. Finalmente, las clonas se analizaron por restriccin
enzimtica con las enzimas correspondientes.

Restriccin enzimtica
Consisti en analizar la liberacin del fragmento clonado al digerir el DNA con las
enzimas correspondientes. En el caso de pRSETA-TBP se tomaron 5 l de DNA de las
minipreps, se transfirieron en tubos eppendorf de 0.6 ml y se les agregaron 5 l de una
mezcla de las enzimas Bam HI (NEB 20 U/l), Eco RI (NEB 20 U/l) en 38 l de H2O que
contenan 10 l de buffer 2 (NEB 10 X) para cada 10 reacciones, lo que corresponda a 2 U

MATERIAL Y MTODOS 55

de cada enzima por reaccin. Las muestras se incubaron a 37oC durante 2 h y se analizaron
por electroforesis en geles de agarosa al 1 % en TAE 1X (diluir 1:50 el stock TAE 50X;
Tris base 242 g, cido actico glacial 57.1 ml, EDTA 37.2 g aforado a 1 l).
Para la construccin pRSET A/5512 del gen que codifica para el homlogo del
TAFII250, se emplearon las enzimas Bam HI (NEB 20 U/l) y Xho I (NEB 20U/l) en las
mismas proporciones que para las reacciones para pRSET A-TBP.

Electroforesis en geles de agarosa

Se prepar el gel al 1% con 0.5 g de agarosa en 50 ml de TBE 1X (Tris base 10.8
g, cido brico 5.5 g, EDTA 0.5 M pH 8 4 ml, aforado a 1 l) o TAE 1X se calent para
disolverla y se dej enfriar un poco para agregarle 5 l de bromuro de etidio de un stock de
10 mg/ml. El gel polimerizado se coloc en la cmara y se aadieron 300 ml de TBE o
TAE 1X, segn el caso y se cargaron las muestras con buffer de carga (azul de bromofenol,
xileno, cianol) (Sambrook y Russell, 2001).

Expresin de la EhTBP recombinante

Cada colonia transformante de la cepa BL21(DE3)pLysS se inocul en 5 ml de
medio 2XYT (triptona 16 g, extracto de levadura 10 g, NaCl 5 g, pH 7.5 aforado a 1 l) que
contenan ampicilina (100 g/ml), cloranfenicol (34 g/ml) y se incubaron a 37oC toda la
noche con agitacin (225 rpm). Del cultivo de toda la noche, se realiz una dilucin 1:25 en
250 ml de medio 2XYT con antibiticos en una matraz Erlenmeyer de 1 l y se incub de
nuevo a 37oC hasta que alcanzara una densidad ptica de 0.4 0.6. En ese momento se
adicion el inductor IPTG (isopropil--D-tiogalactopiransido) a una concentracin final
de 1 mM y se incub por 3 h ms. Se tom 1 ml de cultivo, se centrifug 30 seg a 12,000 X

MATERIAL Y MTODOS 56

g. La pastilla se resuspendi en 100 l de buffer de muestra 1X para electroforesis (TrisHCl 0.125 M pH 6.8, SDS 4%, glicerol 20%, -mercaptoetanol 10%), se hirvieron durante
5 min y se tomaron 20 l para analizarlas electroforticamente.

Anlisis electrofortico en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Este anlisis se realiz por el mtodo descrito por Laemmli (1970), utilizando como
agentes desnaturalizantes, el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) y el mercaptoetanol. Las electroforesis se realizaron en los sistemas miniprotean II (Bio-Rad,
EUA). Las muestras de protenas se diluyeron 1:2 en solucin amortiguadora de carga 2X
(solucin Laemmli) (Tris 0.5 M, pH 6.8, glicerol 20%, azul de bromofenol 0.2%, SDS 4%
y -mercaptoetanol 0.5%). Las suspensiones se sonicaron 5 ciclos de 10 seg de sonicacin
por 10 seg de reposo en hielo, en un sonicador Virlis modelo Virsonic 60 y se hirvieron
durante 5 min en bao mara. Terminada la electroforesis, se fijaron las protenas de
acuerdo al protocolo descrito por Ausubel y col. (1994), en una solucin de azul de
Coomasie R-250 (Bio-Rad) al 0.1% durante 20 min Los geles se destieron con una
solucin de metanol 40% y cido actico al 7%. Algunos geles se tieron con plata de
acuerdo a la tcnica descrita por Heukeshoven y Dernick (1988), que consisti en una
fijacin de las protenas con una mezcla de metanol-cido- actico-agua en una relacin
3:1:6 durante 30 min (100 ml). Se realiz una fijacin adicional y una reduccin con
glutaraldehdo al 0.5% y Na2S2O3 al 0.1%, en una solucin de etanol al 30% en tampn
NaCH3COO 0.4 M, pH 6.0, durante 30 min (100 ml). Se lav el gel sucesivamente con
agua desionizada daurante 2-3 h haciendo cambios cada 15 min para teirlo posteriormente
con una solucin de AgNO3 al 0.1% en metanol al 3%, conteniendo 25 l de formaldehdo
por cada 100 ml, durante 30 min Se enjuag rpidamente con agua desionizada y se revel

MATERIAL Y MTODOS 57

con una mezcla de Na2CO3 al 2.5% conteniendo 40 l de formaldehdo por cada 100 ml,
durante 30 seg. Se continu el revelado con la solucin de carbonato antes mencionada,
durante 6-10 min (100 ml). Se detuvo la reaccin con CH3COOH al 5% durante 10 min
Finalmente se hicieron dos lavados adicionales con agua desionizada, durante 10 min en
cada caso.

Purificacin de EhTBP recombinante (EhTBPr) bajo condiciones desnaturalizantes

Despus de 3 horas de induccin se cosecharon las bacterias BL21(DE3)pLysS que
expresaban la protena TBPr, se resuspendieron en 30 ml de solucin amortiguadora A
(GuHCl 6 M, fosfato de sodio 0.1 M, Tris-HCl 0.01 M pH 8) y se mantuvieron en agitacin
durante 3 h a temperatura ambiente. Se centrifugaron a 10,000 X g durante 15 min a 4o C y
se colect el sobrenadante. La resina de agarosa nitrilo triacetato-Ni+2 se empaquet en una
columna de 1 ml y se equilibr con 10 ml de solucin amortiguadora A con un flujo de 10 15 ml/ h con una bomba peristltica (Masterflex, E.U.A.). Se adicion una muestra de 2 ml
y luego se lav la columna con 10 ml de solucin amortiguadora A, 6 ml de solucin
amortiguadora B (urea 8 M, fosfato de sodio 0.1 M, Tris-HCl 0.01 M pH 8), 6 ml de
solucin amortiguadora C (urea 8 M, fosfato de sodio 0.1 M, Tris-HCl 0.01 M, pH 6.3), 6
ml de solucin amortiguadora D (Urea 8 M, fosfato de sodio 0.1 M, Tris-HCl 0.01 M, pH
5.9), y se eluy la protena con 4 ml de solucin amortiguadora E (Urea 8 M, fosfato de
sodio 0.1 M, Tris-HCl 0.01 M, pH 4.5). Se equilibr nuevamente la columna con solucin
amortiguadora A y se repiti el proceso 3 veces. Se tomaron alcuotas de 500 l de cada
una de las fracciones y se precipitaron con 1/10 de volumen de TCA fro durante 30 min, se
centrifugaron a 12,000 X g durante 15 min a 4o C y los precipitados se lavaron con etanol al
70 % dos veces. Las muestras se analizaron en geles de poliacrilamida al 12 % con SDS.

MATERIAL Y MTODOS 58

Purificacin de EhTBP recombinante (EhTBPr) bajo condiciones nativas

Para los ensayos de actividad biolgica, la EhTBPr se purific en condiciones
nativas siguiendo el protocolo descrito en el manual de sistemas de QIAexpressionist
(Qiagen). Las bacterias que expresaban la EhTBPr fueron empastilladas y guardadas a -20 o
C hasta su utilizacin. Se incubaron en hielo por 15 min y se resuspendieron en 2-5 ml de
buffer de lisis por gramo de peso seco (NaH2PO4 50 mM pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol
10 mM), se adicion lisozima a una concentracin final de 1 mg/ml y se continu la
incubacin a 4o C por 30 min. Las clulas se sonicaron por 6 periodos de 10 seg cada uno
con reposos de 20 seg entre cada sonicacin. El lisado se centrifug a 10,000 X g durante
20-30 min a 4o C para empastillar los restos celulares. El sobrenadante (lisado clarificado)
se transfiri a tubos eppendorf de 1.5 ml y se incub con 1 ml de resina de nquel (agarosa
Ni-NTA) (Qiagen) previamente equilibrada con 5 volmenes de buffer de lisis, en agitacin
suave por 1 h a 4o C. La mezcla de lisado-resina se transfiri a una columna, se lav con 8
ml de buffer de lavado (NaH2PO4 50 mM pH 8.0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) y se
eluy la protena con 2 ml de buffer de elucin (NaH2PO4 50 mM pH 8.0, NaCl 300 mM,
imidazol 250 mM). Una vez obtenida la fraccin purificada, colectada en tubos eppendorf
de 1.5 ml, la protena se someta a su cuantificacin y a ensayos de retardamiento.

Elucin de protenas a partir de gel de poliacrilamida

Se cortaron los extremos del gel para teirlos con azul de coomasie y se emplearon
para guiarse y cortar el gel correspondiente a la banda de la protena EhTBPr. Se cort
finamente la acrilamida y se le adicionaron 100200 l de una solucin de bicarbonato de
amonio 50 mM pH 7.8, SDS 0.1% y se incub a 37oC en tubos eppendorf de 1.5 ml
durante 2 h. Se centrifugaron a 12,000 X g durante 5 min, se recuper el sobrenadante, se

MATERIAL Y MTODOS 59

analiz por SDS-PAGE y se dializ contra una solucin de NaCl al 0.85% toda la noche.
La protena obtenida por ste mtodo se emple para obtener anticuerpos policlonales antiEhTBP.

Obtencin de anticuerpos anti-TBP de E. histolytica

Un conejo macho de la cepa New Zeland de 1.7 kg de peso (aproximadamente de 2
meses de edad) se sangr para obtener el suero preinmune y se inmuniz por va
intramuscular, en el muslo derecho con 0.5 ml de una emulsin preparada con adyuvante
completo de Freund que contena aproximadamente 150 g de EhTBPr. Se aplic un
refuerzo a las 2 semanas por va intramuscular en el muslo izquierdo, con 150 g de
protena en adyuvante incompleto de Freund. Despus de 7 das se sangr de la vena
marginal de la oreja y los sueros se analizaron por Western-blot. Se esperaron 2 meses para
dar el tercer reto por va subcutnea en 5 8 puntos de inoculacin con 150 g de protena
total en adyuvante incompleto de Freund. Despus de 8 das se sangr al conejo de la vena
marginal de la oreja, se separ el suero y se procedi a determinar la respuesta de
anticuerpos.

Purificacin del anticuerpo por inmunoadsorcin

El suero obtenido del conejo inoculado con la protena EhTBPr se precipit con una
solucin saturada de sulfato de amonio (100 g de sulfato de amonio en 100 ml de H2O). El
pH de esta solucin se ajust a 7.8 con NaOH 2N, inmediatamente antes de la
precipitacin. A 20 ml de suero se les agreg, gota a gota en un bao de hielo y con
agitacin suave, un volumen igual de sulfato a amonio saturado hasta alcanzar el 50% de
saturacin. El precipitado obtenido se centrifug durante 30 min a 1,000 X g. Se
resuspendi en solucin salina al 0.85% a pH 7.8 hasta que alcanz el volumen original.

MATERIAL Y MTODOS 60

Esta preparacin se precipit nuevamente con sulfato de amonio saturado hasta alcanzar el
33 % de saturacin, en las mismas condiciones que la anterior. El precipitado obtenido se
solubiliz en la menor cantidad de solucin salina y se dializ en fro y con agitacin contra
PBS durante 3 das, con 2 a 3 cambios durante el da. La EhTBPr purificada se separ en
SDS-PAGE al 12%, se transfiri a nitrocelulosa, se cort la banda correpondiente a la
protena y se incub con el anticuerpo parcialmente purificado 10 min a temperatura
ambiente. Finalmente el anticuerpo se eluy con glicina 100 mM pH 2.3 e inmediatamente
se neutraliz con 1/10 del volumen de TrisHCl 1 M pH 8.0.

Ensayos de inmunofluorescencia indirecta

Para determinar la localizacin subcelular de la EhTBP, se llevaron a cabo ensayos
de inmunofluorescencia para microscopa confocal. Trofozotos de la clona A, fueron
crecidos en cubreobjetos estriles, fijados 1 hora a 37oC con paraformaldehdo (PFA) al
3.8% (Sigma, EUA) pH 7.4, permeabilizados con Tritn X-100 0.1% y bloqueados con
BSA 1%. Los trofozotos fijados se incubaron con una dilucin 1:10 de anticuerpos
policlonales anti-EhTBPr, producidos en conejo y despus se incubaron con un segundo
anticuerpo anti-IgGs de conejo a una dilucin 1:1,000 marcado con un fluorforo Cy2 Dye
(Amersham). Finalmente, las clulas fueron contrateidas con yoduro de propidio 0.5
mg/ml en PBS durante 5 min y se examinaron con el microscopio confocal MRC 1024
(Bio-Rad).

Ensayos de Western blot

Despus de separar las protenas en SDS-PAGE al 12%, los geles se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa en sistemas de electrotransferencia (BioRad). Consistieron en
equilibrar los geles en solucin de transferencia (Tris base 10 g, glicina 14.4 g, metanol

MATERIAL Y MTODOS 61

20%) y colocarlos en el sistema de emparedado en el siguiente orden de polo negativo a

positivo: fibra, 2 piezas de papel Wathman, gel, membrana de nitrocelulosa, 2 piezas de
papel Watman y fibra. Se cerr el sandwich y se sumergi en la cmara de electroforesis
en solucin de transferencia. La cmara se coloc en hielo y la transferencia se efectu a
400 mA por 40 min. Una vez terminada la electrotransferencia, se verific la eficiencia de
sta y la integridad de las protenas al teir la membrana con rojo de Ponceau (rojo de
Ponceau 0.1%, cido actico 1%). Para la deteccin de la EhTBP recombinante y en
extractos nucleares, se lav la membrana con PBS 1X-Tween 20 al 0.05% para desteirla y
se bloque con Tween 20 al 0.05% (v/v) y leche descremada al 5% (p/v) en PBS por 2 h a
temperatura ambiente. Se incub toda la noche a 4oC con el anticuerpo anti-EhTBPr
(1:1,000) en PBS-Tween y albmina al 1%. La inmunorreactividad se detect con un
anticuerpo anti-IgG de conejo producido en cabra, marcado con peroxidasa (Zymed)
(1:20,000) y el mtodo de quimioluminiscencia, usando el kit ECL Plus (Amersham).

Marcaje de oligonucletidos con [- 32P]ATP

100 ng de cada oligonucletido se incubaron con 1 l de [- 32P]ATP (10 Ci) y 1
l (10 U/l) de la enzima T4 polinucletidocinasa (T4PNK) (Gibco, BRL) en buffer de
reaccin 5X forward (Gibco, BRL) en un volumen de reaccin de 10 l a 37oC durante 40
min. Terminada la reaccin de marcaje, el volumen se llev a 100 l con agua de ampolleta
y los oligonucletidos se purificaron por cromatografa de filtracin en gel en columnas de
1 ml de Sephadex G-25 (Pharmacia-Lakeside). La incorporacin de la marca se cuantific
en un contador de lquido de centelleo (Beckman SJ-6500). De cada oligonucletido se
emplearon 10,000 cpm en cada reaccin de los ensayos de retardamiento.

MATERIAL Y MTODOS 62

Ensayos de retardamiento
Alcuotas de 10 l de extractos de bacterias BL21(DE3)pLysS transformadas con el
plsmido pRSETA-TBP, 2 a 25 g de EN, o 30 a 260 ng de EhTBPr purificada (LunaArias y col., 1999) fueron usados para los ensayos de retardamiento (Gmez y col., 1998).
En un volumen de 20 l de reaccin, EN o EhTBPr se incubaron durante 15 min a 4oC con
poli (dG-dC) (1 g/l) en buffer de unin que contena HEPES 12 mM pH 7.9, KCl 60
mM, glicerol 10 % (p/v), DTT 1 mM, EDTA 1 mM, espermidina 1 mM y MgCl2 1mM. En
seguida se adicionaron por separado, los oligonucletidos de doble cadena marcados en sus
extremos con [- 32P]ATP (10,000 cpm, 157 pM): 5-TATTTAAA-3 [1], 5-TAgTgAAA3 [2], 5-TATTggAA-3 [3], 5-TATgTAAA-3 [4], 5-gAgTTAAA-3 [5], 5-TAT_
_AAA-3 [6], 5-TAT_ _AAg-3 [7] and 5-TATTaAAA-3 [8]. La incubacin continu
por 10 min ms a 4oC. Para los ensayos de superretardamiento, antes de adicionar los
oligonucletidos, las reacciones se preincubaron 15 min a 4oC con 1 o 5 l de anticuerpo
anti-EhTBPr (1:100) (Luna-Arias y col., 1999) o con 5 l de anticuerpo anti-actina de E.
histolytica (1:100) donado amablemente por el Dr. Jos Manuel Hernndez del
Departamento de Biologa Celular del CINVESTAV-IPN. Las mutaciones introducidas en
la caja TATTTAAA considerada consenso para E. histolytica estn representadas en letras
negritas minsculas y las deleciones en guiones bajos. Todos los oligonucletidos fueron
diseados con un tamao de 18 pb, a partir de la caja TATA del promotor del gen EhPgp5,
con sitios de corte para las enzimas Bam HI y Eco RI en sus extremos. Los nmeros en
corchetes despus de la secuencia, identifican a cada oligonucletido. En los experimentos
de competencia, un exceso molar de 300 veces de cada oligonucletido, de la secuencia
TATTTAAA [1] o de un competidor inespecfico (poli dG-dC), se incubaron con la mezcla

MATERIAL Y MTODOS 63

de reaccin 10 min antes de adicionar la sonda marcada. La electroforesis de las muestras

se llev a cabo en geles no desnaturalizantes de poliacrilamida al 6% (PAGE) en buffer
TBE 0.5 X (Tris base 5.4 g, cido brico 2.75 g, EDTA 0.25 M pH 8). Los geles se secaron
al vaco y los complejos radiactivos se detectaron en el aparato Phosphor Imager (BioRad).
Las bandas radiactivas retardadas se cuantificaron por densitometra empleando el software
Quantity One versin 4 (BioRad).

Ensayos de UV-crosslinking
Se realizaron en un volumen de reaccin de 20 l con 60 g de extractos nucleares
y 50,000 cpm/reaccin del oligonucletido TATTTAAA [1] marcado radiactivamente. Se
incubaron las protenas 10 min a 4oC con el buffer de unin, se agreg el oligo y se
incubaron 15 min ms a 4oC. Las reacciones se irradiaron 15 min a 320 nm en la superficie
de un transiluminador de luz ultravioleta (UVP, Inc.), para favorecer la formacin de
enlaces covalentes DNA-protena. Se recuperaron las reacciones en buffer de muestra 2X
para protenas y se hirvieron durante 5 min Se cargaron en un gel desnaturalizante de
poliacrilamida al 12% y los complejos se analizaron en el aparato Phophor Imager.

Cromatografa de filtracin en gel y de intercambio inico

Para purificar el factor de transcripcin TFIID se llev a cabo el esquema de
purificacin descrito por Wampler y col. (1990). Toda esta metodologa se realiz a 4oC
para evitar la degradacin de las protenas nucleares. A partir de extractos nucleares crudos
de trofozotos de la clona A de Entamoeba histolytica se purificaron parcialmente los
factores generales de transcripcin, por cromatografa de intercambio inico, iniciando con
una cromatografa de filtracin en gel en una columna de Sephadex G-25 para desalar las
muestras. Aproximadamente 1 mg de extractos nucleares se pasaron a travs de columnas

MATERIAL Y MTODOS 64

de Heparina-agarosa previamente equilibradas con solucin amortiguadora I (Hepes 20

mM, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 0.5 mM). Se colectaron las proteinas
no unidas, y se hicieron lavados (3 volmenes de columna) con solucin amortiguadora I,
colectando estas ltimas fracciones como lavados. Las protenas unidas a la columna se
eluyeron con 3 volmenes de columna empleando gradientes discontnuos de KCl 0.08,
0.18, 0.4 y 1 M en solucin amortiguadora I. Las fracciones de elucin, se recolectaron en
tubos Falcon de 15 ml y se concentraron en centricn YM-10 (Ambin) hasta un volumen
final de 50-100 l, finalmente se analizaron por SDS-PAGE en geles al 12% teidos con
plata y en ensayos de retardamiento.

Cuantificacin de los complejos DNA-protena

Los complejos formados por los distintos oligonucletidos incubados con EN as
como con la protena recombinante, se cuantificaron por anlisis densitomtrico midiendo
los pixeles en las bandas retardadas, en el aparato Phosphor Imager, mediante el programa
Quantity One (versin 4). Los pixeles se normalizaron contra la sonda libre (observada en
el frente del gel) para corregir la cantidad de radiactividad total (cpm) cargada en cada
carril del gel.

Determinacin de las constantes de disociacin (KD) de los complejos DNA-protena

Las KD de EN y EhTBPr para cada caja TATA, se determinaron mediante el mtodo
descrito por Coleman y Pugh (1995) con algunas modificaciones para considerar los errores
experimentales. La formacin de complejos entre EN o EhTBPr y el DNA marcado
radiactivamente, se midi en funcin de la concentracin de protena. La fraccin (F) del
DNA cuya migracin electrofortica fue retardada, se calcul mediante la ecuacin 1
F = (Sx-S0)/(Sf - S0)

(Ec. 1)

MATERIAL Y MTODOS 65

En donde Sx es la radiactividad presente en el complejo DNA-proteina retardado a una

concentracin de protena x. S0 es la cantidad de radiactividad presente cuando x = 0
(ausencia de protena). Sf es la radiactividad presente cuando F se vuelve independiente de
x (cuando la reaccin alcanz su punto de saturacin). Para determinar Sf con exactitud
para cada EMSA, graficamos los valores de Sx para cada concentracin de EN o de EhTBPr
(x). Entonces, determinamos la funcin polinmica que mejor describa el comportamiento
de la curva como:
ln Sx = a0 + a1x + a2x2 + ... + anxn + E-N(0,1)

(Ec. 2)

En donde ln Sx es el logaritmo natural de Sx, an es el coeficiente numrico, n es el grado de

la ecuacin y E es el error residual en el anlisis de regresin (Atkinson, 1985; LopezCanovas y col., 1998). Debido a que las cpm eran variables discretas, empleamos el ln Sx
(Ec. 2) para garantizar la distribucin normal del error residual en el anlisis de regresin.
El anlisis de ajuste se realiz mediante el anlisis de regresin de mnimos cuadrados. El
grado de la Ecuacin 2 que determinamos en nuestros experimentos fue n = 2, que
corresponda a la potencia de x correspondiente al mnimo coeficiente que difera
significativamente de cero. Posteriormente se determin la t de student para cada an como
tn = (an 0)/Saj, en donde j va de 0 a n, y San corresponde a la desviacin estndar del
coeficiente an. La diferencia (an 0) se tom como significativa solo si la probabilidad de la
t de student P(t) era menor de 0.05.
Una vez que se obtuvieron los coeficientes de la Ecuacin 2 para cada experimento,
determinamos la concentracin de EhTBP xmax a la cual la curva tuvo el valor mximo
mediante la derivada (d) de la Ec. 2 e igualndola a cero (Ec.3).
d(ln Sx)/d(x) = 0

(Ec. 3)

Posteriormente se emple el valor de xmax en la Ec. 2 para determinar el valor de Sf.

Finalmente, F se calcul con la Ec. 1 para cada concentracin de EhTBP estudiada. Para

MATERIAL Y MTODOS 66

calcular la cantidad de EhTBP en extractos nucleares, se realizaron curvas de calibracin

mediante ensayos de Western blot empleando diferentes concentraciones de EhTBPr
purificada (1-10 ng) que fueron incubadas con el anticuerpo anti-EhTBP. La intensidad de
las bandas se cuantific por densitometra y se grafic como una funcin de la
concentracin de EhTBPr. Esta curva estndar se utiliz para calcular por interpolacin la
cantidad de EhTBP en EN, la cual es equivalente a TFIID si se asume arbitrariamente que
una molcula de EhTBP forma parte de un complejo TFIID.

Determinacin de la relacin molar EhTBP/TATA cuando F = 1

Siguiendo el mtodo descrito por Coleman y Pugh (1995) determinamos la fraccin
de protena EhTBP activa que se una a las cajas TATA (protena activa no unida ms
protena activa unida), asumiendo una estequiometra de unin de 1. Por lo tanto, F se
grafic como una funcin de la relacin molar de la EhTBP total para cada oligonucletido.
El ln F se ajust en la Ec. 2 como una funcin polinmica de la relacin molar de
EhTBP/oligonucletido TATA. El ajuste se hizo por el mtodo de mnimos cuadrados y el
mximo de la curva se determin como se explic anteriormente. Cuando F = 1 (punto de
saturacin), el recproco del intercepto de x se multiplic por la concentracin de EhTBP
total para obtener la fraccin total de EhTBP activa en la mezcla. A esta relacin se le
llam (x/TATA)max, que de a cuerdo a Coleman y Pugh (1995) debe corresponder a F = 1.

Intervalos de confianza (IC) de las predicciones de la funcin polinmica

Los intervalos de confianza se calcularon empleando Yp IC, en la cual Yp
corresponde al valor anticipado por la funcin para una concentracin x, e IC se defini por
la ecuacin 4.
IC = [1/t(0.975, gl)] { [XR-1X] 2 }1/2

Ec. 4

MATERIAL Y MTODOS 67

En donde t(0.975, gl) correponde a la prueba de t de Student para 0.975 percentil, y gl son
los grados de libertad; X' es el vector de los valores elevados a la potencia del vector
transpuesto X, R-1 corresponde al inverso de la matriz de regresin, y 2 es la varianza
residual.

Determinacin de las constantes de disociacin (KD)

La KD de los complejos DNA-protena se calcul mediante la ecuacin 5 (Coleman
y Pugh, 1995)
F = P/(KD + P)

Ec. 5

Donde P es la EhTBP activa no unida. P se relacion a la concentracin de EhTBP total

activa PT por la ecuacin 6
PT = P + PD

Ec. 6

En donde, PD corresponde a la concentracin de EhTBP presente en el complejo DNAprotena. La constante de asociacin aparente, Ka es el recproco de KD.
Como la ecuacin 5 es una funcin hiperblica, entonces, 1/F deba corresponder a
una funcin lineal de 1/P y por lo tanto, la KD era la pendiente de esta recta. Estas dos
variables fueron ajustadas por el mtodo de regresin robusta (Atkinson, 1985; LopezCanovas, y col., 1998) que evita el efecto que elimina los datos que caen fuera de la lnea
de los valores de KD. Este ajuste no asuma la distribucin normal del error residual. Los
clculos de los coeficientes y las varianzas se realizaron programando los algoritmos
iterativos, que usaban los estimados de mnimos cuadrados como valores iniciales. Esta
programacin fu elaborada por la Dra. Ana Mara Rivern del Centro Nacional de
Investigacin Cientfica (CNIC) de la Habana, Cuba.

RESULTADOS

68

V. RESULTADOS
5.1. Localizacin del gen Ehtbp y de la protena EhTBP en trofozotos de E.
histolytica y prediccin de la estructura terciaria de la protena.
En trofozotos de E. histolytica se han encontrado diferentes organelos
citoplasmticos que contienen DNA. Estos organelos se han reportado como EhkO (Orozco
y col., 1997) y como criptn (Mai y col., 1999; Ghosh y col., 2000). En los organelos
denominados EhkOs (Orozco y col., 1997), el DNA parece estar organizado en redes como
las descritas en los cinetoplastos de Tripanosomtidos (Baez-Camargo y col., 1996). La
funcin de EhkO no ha sido determinada, sin embargo, se han identificado la enzima
piruvato ferredoxina xido reductasa (PFO), que participa en el metabolismo anaerbico y
algunos factores de transcripcin tales como EhC/EBP (homlogo al activador
transcripcional C/EBP) (Marchat y col., 2002) y Ehp53 (homlogo al supresor de tumor
p53) (Mendoza y col., 2003), lo que sugiere que los EhkOs pudieran ser organelos
transcripcionalmente activos.
Estos hallazgos interesantes sugeran la necesidad de localizar intracelularmente el
gen Ehtbp, as como la protena EhTBP, ya que nuestra hiptesis era que solo se
encontraran en el ncleo debido a que se trata de un factor de la maquinaria basal de
transcripcin.

5.1.1. Localizacin intracelular del gen Ehtbp

Para localizar intracelularmente el gen Ehtbp, llevamos a cabo ensayos de PCR in
situ empleando los oligonucletidos TBP1 y TBP2 que amplifican el gen Ehtbp de 702 pb.
En el 100% de las clulas se detect el gen en el ncleo; sin embargo, en un 95 % de los
trofozotos observados se detectaron tambin pequeas seales fluorescentes fuera del
ncleo, posiblemente en el organelo reportado como EhkO (Orozco y col., 1997). Esto

RESULTADOS

69

sugiere fuertemente que existe ms de una copia del gen en los trofozotos (Fig. 9) (LunaArias y col., 1999). La siguiente cuestin era localizar a la protena codificada por este gen.

5.1.2. Localizacin intracelular de EhTBP

Los ensayos de inmunofluorescencia y microscopa confocal revelaron que la
protena EhTBP est localizada tanto en el ncleo como en estructuras subcelulares,
probablemente correspondientes al organelo EhkO. De acuerdo con nuestros experimentos
de PCR in situ, EhTBP colocaliz con el material teido con yoduro de propidio en EhkO y
en el ncleo, confirmando que este nuevo organelo contiene material gentico, el cual
pudiera ser transcripcionalmente activo (Fig. 10) (Luna-Arias y col., 1999).

5.1.3. Prediccin de la estructura tridimensional de la EhTBP

A partir de la secuencia deducida de aminocidos de la protena recombinante
EhTBP, se realizaron estudios in silico para predecir el plegamiento de la protena a partir
de la estructura cristalina de la TBP de humano (Fig. 11). La estructura de la EhTBP result
ser bsicamente idntica a sus protenas homlogas en eucariontes. El extremo carboxilo
terminal de 182 residuos de aminocidos (residuos 48-229) present dos repetidos directos
(DR1, residuos 57-116 y DR2, residuos 147-207) descritos en otros organismos como los
responsables de la unin de la protena al DNA. EhTBP qued plegada en una estructura
simtrica / que recuerda a una silla de montar molecular con dos dominios
estructurales de 59-60 aminocidos relacionados por una simetra intramolecular de dos
veces. Cada dominio o repetido estructural comprende aproximadamente la mitad del
extremo carboxilo terminal filogenticamente conservado.

RESULTADOS

70

Figura 9. Localizacin intracelular del gen Ehtbp mediante PCR in situ y microscopa
confocal. Trofozotos de E. histolytica de la clona A en fase exponencial se sometieron a PCR in
situ como se describi en Material y mtodos. (a). PCR in situ del gen Ehtbp amplificado con los
oligonucletidos TBP1 y TBP2. Las clulas se observaron en el canal azul. (b) Las clulas fueron
contrateidas con yoduro de propidio y se observaron en el canal rojo. (c) Microscopa de
transmisin de las clulas observadas en (a) y en (b). (d) Clulas tratadas como en (a) sin la enzima
ampliTaq en la reaccin de PCR. N, ncleo; EhkO, organelo EhkO.

RESULTADOS

71

Consiste de cinco lminas- plegadas antiparalelas y dos hlices-. Las dos hlices
quedaron perpendiculares entre s, en la superficie convexa de las lminas formando el
ncleo hidrofbico de cada dominio. La superficie cncava de la molcula se form con
las cadenas centrales de las lminas- antiparalelas, la cuales contienen los aminocidos
implicados en la unin al DNA (Fig. 11). Este plegamiento permite deducir la
funcionalidad de la protena EhTBP ya que present los aminocidos importantes para su
interaccin con el DNA plegados en la superficie convexa de la protena y esto es idntico a
los implicados en la unin al DNA para la TBP de humano (ver ms adelante).

RESULTADOS

72

Figura 10. Localizacin intracelular de EhTBP con anticuerpos anti-EhTBP y microscopa

confocal. Trofozotos de la clona A se crecieron exponencialmente, se fijaron y permeabilizaron y
se incubaron con el anticuerpo anti-EhTBP de conejo (ver Material y Mtodos) y con un anticuerpo
anti-IgG de conejo. Las clulas tratadas se contratieron con yoduro de propidio. (a) Control
negativo con clulas

incubadas con el anticuerpo secundario acoplado al fluorforo Cy2 y

observadas en el canal verde. (b) Clulas teidas con yoduro de propidio y observadas en el canal
rojo. (c) Clulas tratadas con el anticuerpo policlonal anti-EhTBP y con el anticuerpo secundario
observadas en el canal verde. (d) Clulas tratadas como en (b) y en (c) observadas simultneamente
en ambos canales. N, ncleo; EhkO, organelo EhkO.

RESULTADOS

73

DR1

DR2

DR1

DR2

DR1

DR2

DR1

DR2

Fig. 11 Estructura tridimensional de EhTBP. La prediccin se llev a cabo empleando el

algoritmo SWISS-MODEL versin 3.5 que compar las secuencias de otras TBP ya cristalizadas
con la secuencia de EhTBP. A y C, representacin de listones que muestran las lminas -plegadas
y las hlices-; B, Residuos de aminocidos accesibles a solventes (azul) y no accesibles (amarillo);
D, Representacin de bolas que muestran la distribucin de residuos hidrofbicos (rojo) e
hidroflicos (azul). DR, repetido directo.

RESULTADOS

74

5.2. Caracterizacin de EhTBP en extractos nucleares

La secuencia TATTTAAA, localizada entre 25 y -30 pb del sitio de inicio de la
transcripcin de algunos genes de E. histolytica, se ha propuesto como el sitio consenso de
unin para la EhTBP (Bruchhaus, y col., 1993). Sin embargo, la presencia de esta protena
en los complejos formados con extractos nucleares de E. histolytica no haba sido
comprobada.

5.2.1. Identificacin de EhTBP en los complejos DNA-Extractos Nucleares

En este estudio demostramos la presencia de EhTBP en los complejos DNA-EN
mediante ensayos de superretardamiento, crosslinking y Western blot. Cuando el
oligonucletido TATTTAAA [1], marcado radiactivamente, se incub con EN frescos, la
movilidad electrofortica de ste fue retardada formndose una sola banda (Fig. 12A, carril
1). Este complejo fue competido especficamente por un exceso molar de 300 veces
empleando el mismo oligonucletido sin marca, mientras que se mantuvo con el
competidor inespecfico poli(dG-dC) o el oligonucletido TtTTTtttt [7] (Fig. 12A carriles 3
y 4, respectivamente).
La presencia de EhTBP en este complejo se demostr en los ensayos de
superretardamiento con el anticuerpo anti-EhTBP como se aprecia en la figura 12B (carril
3). Cuando 1 l de anticuerpo anti-EhTBP se adicion a la mezcla de reaccin, se
visualizaron dos bandas. Una de ellas comigr con la formada por los EN y el
oligonucletido TATTTAAA [1], mientras que la migracin de la otra banda fue ms lenta
debido al superretardamiento producido por el anticuerpo. Cuando se utilizaron 5 l del
mismo anticuerpo, la formacin del complejo fue inhibida (Fig. 12B, carril 4), como se ha

EN
ce
oligo (dT)18
poly (dG-dC)
EhTBPr
EhActina r

+
-

+
+
-

+
+
-

+
+
-

C
+
-

+
+
-

+
+
-

+ +
- - - - - +
kDa

RESULTADOS

75

+
+
+

E
EN
UV
ce
ci

+
-

+
-

+
+
-

+
+
+
-

+
+
+

+
-

+
-

+
+
-

+
+
+
-

25
15
10
7
5
3

2
2
1

Fig.12. Identificacin de EhTBP en extractos nucleares (EN) de trofozotos de E.

histolytica. (A) EN (25 g) y 10,000 cpm (157 pM) del oligonucletido TATTTAAA [1] marcado
con [-32P]ATP se incubaron 15 min a 4o C en los ensayos de retardamiento descritos en Material y
Mtodos. Carril 1, sin competidor; carril 2, oligo TATTTAAA [1] sin marcar en un exceso molar de
300 veces, como competidor especfico (ce); como competidores inespecficos se emplearon
poli(dG-dC), carril 3 y oligo (dT)18, carril 4, en excesos molares de 300 veces con respecto a la
sonda marcada. (B) Ensayo de superretardamiento con los anticuerpos anti-EhTBPr. El EMSA se
realiz como el anterior, slo que antes de agregar la sonda marcada, la mezcla de reaccin se
preincub con: carril 1, sin EN; carril 2, sin anticuerpos; carril 3, 1 l de anti-EhTBPr purificado;
carril 4, 5 l del mismo anticuerpo. (C) Superretardamiento realizado como en B, pero con
anticuerpos anti-EhActina. Carril 1, sin anticuerpo; carril 2, 5 l del anticuerpo anti-EhActina. (D)
Ensayo de entrecruzamiento con UV (UV-crosslinking) de EN (60 g) y el oligonucletido
TATTTAAA (1) (50,000 cpm, 785 pM). Las mezclas para los EMSA se irradiaron con UV a una
longitud de onda de 320 nm durante 10 min a 4o C, se analizaron en SDS-PAGE al 12% y la
radiactividad se detect en el sistema PhosphorImager como se explica en Material y Mtodos.
Carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, sonda libre no irradiada; carril 3, sonda libre
irradiada; carril 4, mezcla EN-oligonucletido no irradiada; carril 5, mezcla EN-oligonucletido
irradiada; carril 6, mezcla irradiada de EN-oligonucletido preincubada con el oligo TATTTAAA
sin marcar en un exceso molar de 300 veces, como competidor especfico (ce); carril 7, mezcla
irradiada de EN-oligonucletido con un exceso molar de 300 veces de poli(dG-dC), como
competidor inespecfico (ci). (E) Ensayo de Western-blot de los complejos DNA-protena
mostrados en D, incubados con anticuerpos anti-EhTBPr.

RESULTADOS

76

reportado para otros ensayos de superretardamiento (Bidder, y col., 2002), lo cual significa
que los anticuerpos reconocen el dominio de unin al DNA de la EhTBP y compiten con el
DNA por el sitio activo de la protenas bloqueando la formacin de complejos DNAproteina. Como control se emplearon anticuerpos dirigidos contra actina, para verificar la
especificidad del superretardamiento, los cuales no afectaron la migracin del complejo
DNA-EN (Fig. 12C, carril 2).
Con el objeto de determinar el peso molecular de las protenas que estaban
interactuando directamente con el DNA y confirmar si esta protena corresponda a la
EhTBP, se llevaron a cabo los ensayos de entrecruzamiento (UV-crosslinking). Empleando
extractos nucleares y el oligonucletido TATTTAAA [1] irradiados con luz UV,
observamos un complejo DNA-protena de 50 kDa (Fig. 12D, carril 5). Este complejo
disminuy notablemente cuando adicionamos un exceso molar de 300 veces del
oligonucletido sin marcar (fro) a la mezcla de reaccin, pero se mantuvo en presencia del
competidor inespecfico (Fig. 12D, carriles 6 y 7), lo que confirma la especificidad del
complejo DNA-protena. No se observaron complejos en los carriles correspondientes al
oligonucletido libre no irradiado e irradiado (Fig. 12D, carriles 2 y 3, respectivamente) y a
la mezcla oligonucletido-EN sin irradiar (Fig. 12D, carril 4). En los ensayos de Western
blot de las protenas irradiadas con UV (mostradas en la Fig. 12D), el anticuerpo antiEhTBPr reconoci la banda de 50 kDa y si restamos los 11 kDa correspondientes al
oligonucletido, se infiere la presencia de EhTBP en el complejo. Probablemente EhTBP
en este complejo, se encontraba asociada a otra protena no identificada de
aproximadamente 13 kDa (Fig. 12E). El anticuerpo tambin reconoci la misma banda en
el carril donde el oligonucletido TATTTAAA [1] sin marca, fue empleado como
competidor especfico. Como se esperaba, la protena EhTBP no unida comigr en el gel

RESULTADOS

77

con el marcador de 25 kDa. Estos resultados demostraron la presencia de EhTBP en los

complejos EN-oligo TATTTAAA [1].

5.2.2. Formacin de complejos de EN con diferentes cajas TATA

En algunos promotores de genes de E. histolytica se han encontrado secuencias que
pudieran ser equivalentes a cajas TATA. Con el objeto de determinar si los EN presentaban
una actividad de unin a diferentes secuencias TATA, analizamos la formacin de
complejos de EN con diferentes secuencias TATA presentes en algunos promotores de
genes de E. histolytica (oligonucletidos [1], [6], [7] y [8]) y mutaciones de la sonda
TATTTAAA [1] (oligonucletidos [2], [3], [4] y [5]) (Tabla I). Se introdujeron gs en las
posiciones 1, 3, 4, 5 y 6 de la caja TATTTAAA [1] debido a que para las TBPs de levadura
y humano estas posiciones inhiben su capacidad de unin al DNA (Wobbe y Struhl, 1990;
Strubin y Struhl, 1992).
En los ensayos de retardamiento se observ una banda en la mayora de los casos.
Los complejos formados con las variantes de la caja TATA, a esta concentracin de EN,
presentaron distinta intensidad, lo que sugiere que los EN tienen diferente afinidad por estas
variantes. Cuando las Ts en la tercera y quinta posiciones, se cambiaron por g (TagTgAAA
[2]), la intensidad del complejo disminuy notablemente (Fig. 13A, carril 2).
Inesperadamente, con dos gs en la quinta y sexta posiciones (TATTggAA [3]) (Fig.
13A, carril 3) y el cambio de una T por g en la cuarta posicin (TATgTAAA [4]), o la
sustitucin de la T en la primera y tercera posiciones por g (gAgTTAAA [5]) dieron
complejos ms intensos que con el oligonucletido TATTTAAA [1] (Fig. 13A, carriles 3,
4, 5).

RESULTADOS

78

Tabla 1. Posiciones de la secuencia TATTTAAA (1) y posibles variantes en promotores de genes de E. histolytica.

Variantes TATA

Promotor del
Gen

Primer
nucletido b

Referencia

(-31) c
(-30) d

(Prez, y col., 1998)

(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica)

(1 2 3 4 5 6 7 8)a
5-T A T T T A A A-3(1)

5-T A g T g A A A-3(2)

EhPgp5
Ehactin
No encontrado

5-T A T T g g A A-3(3)

No encontrado

5-T A T g T A A A-3(4)

No encontrado

5-g A g T T A A A-3(5)

No encontrado

5-T A T _ _ A A A-3(6)

5-T A T _ _ A A g-3(7)

Ehtbp
Ehtub1
EhRabB
Ehenol

(-109) c
(-27) d
(-44) c
(-50) d

(No publicado)
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica)
(No publicado)
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica)

5-T A T T a A A A-3(8)

Ehpfo

(-31) c

(Rodrguez, y col., 1996)

Los nmeros muestran la posicin de la base en las variantes TATA.

Posicin de nucletido referida a los sitios de

inicio de la transcripcin determinados experimentalmentec e in silicod. Posibles cajas TATA definidas como secuencias
ro arriba de los sitios ATTCA/G, ATCA o ACGC consenso de inicio de la transcripcin.

79

TA
TT
TA TAA
A
gT
gA
A
TA
A
TT
g
g
AA
TA
Tg
TA
gA
gT AA
TA
AA
TA
T_
_
A
TA
T_ AA
_A
TA
Ag
TT
aA
AA

TA
TT
TA TAA
A
gT
gA
AA
TA
TT
TA ggAA
Tg
gA TAAA
gT
TA
AA
TA
T_
TA _AA
A
T_
_A
Ag
TA
TT
aA
AA

RESULTADOS

sl

Fig. 13. Complejos formados con EN y diferentes cajas TATA. (A) Ensayo de
retardamiento de EN incubados con 10,000 cpm (157pM) del oligonucletido correpondiente
marcado con [-32P]P. (B) Ensayo de superretardamiento de EN con las diferentes cajas TATA
como en A, pero las mezlcas de reaccin se preincubaron con 5 l de anticuerpo anti-EhTBPr 15
min antes de agregar cada oligonucletido. Las flechas indican los complejos formados (c) y la
sonda libre (sl).

RESULTADOS

80

Los oligonucletidos sin las Ts en la cuarta y sexta posiciones (TAT _ _ AAA [6]) o
con un cambio adicional de la ltima A por g (TAT_ _AAg [7]) aparentemente no
afectaron la cantidad de complejo formado (Fig. 13A, carriles 6, 7).
Cuando la T en la quinta posicin se cambi por una a (TATTaAAA [8]), se
formaron dos complejos (Fig. 13A, carril 8), los cuales fueron especficos, porque ambos
fueron competidos por el anticuerpo anti-EhTBPr (Fig. 13B, carril 8). En geles en donde las
mezclas de reaccin fueron preincubadas con el anticuerpo anti-EhTBPr (5 l) la formacin
de los complejos fue abatida, confirmando la presencia de EhTBP en los complejos (Fig.
13B), mientras que en un experimento control en el cual se incub la mezcla de reaccin
del oligonucletido TATTTAAA [1] con 5 l del anticuerpo anti-EhActina, no se afect la
formacin del complejo (Fig. 12C). Estos resultados mostraron que EhTBP en EN es
promiscua en su capacidad de formar complejos con las diferentes cajas TATA.

5.2.3. Ensayos de competencia

Para verificar la especificidad de los complejos formados con EN y las diferentes
cajas TATA, observados en la figura 13, se realizaron ensayos de competencia
preincubando las mezclas de reaccin, con el oligonucletido TATTTAAA [1] fro, en un
exceso molar de 300 veces con respecto a la sonda marcada. En estos ensayos, todos los
complejos formados con EN y las diferentes caja TATA empleadas, fueron completamente
competidos por el oligonucletido TATTTAAA [1] (Fig. 14 A-G). Estos resultados
confirmaron la hiptesis de que EhTBP es parte de los complejos formados por los
extractos nucleares y que es capaz de unirse a las variantes de la caja TATA.
Posteriormente se realizaron experimentos cuantitativos para verificar si las diferencias

RESULTADOS

A
EN
TATTTAAA
Poli (dG-dC)

+
-

+
+
-

+
+

+
-

+
+
-

+
+

+
-

+
+
-

+
+

+
-

+
+
-

+
+

3 4

TAgTgAAA[2]

TATTggAA[3]

EN
TATTTAAA
Poli (dG -dC)

+
-

+
+
-

+
+

TAT_ _AAA[6]

TATgTAAA[4]

gAgTTAAA[5]

81

+
-

+
+
-

+
+

TAT_ _AAg[7]

+
-

+
+
-

+
+

3 4

TATTgAAA[8]

Fig. 14. Ensayos de competencia de los complejos formados con EN y variantes de la caja
TATA. A-G Los EMSA se realizaron como en la Fig. 12. Carriles 1, sonda libre; carriles 2,
reaccin EN-oligonucletido sin competidor; carriles 3, oligonucletido TATTTAAA [1] sin
marcar en un exceso molar de 300 veces como competidor especfico y carriles 4, poli (dG-dC) en
un exceso molar de 300 veces como competidor inespecfico. El oligo marcado para cada caso, se
muestra debajo de cada gel.

RESULTADOS

82

observadas en la intensidad de los complejos formados con EN y las diferentes cajas TATA
tambin reflejaba diferencias en la afinidad de EhTBP por estas secuencias.

5.2.4. Cuantificacin de la afinidad de EN por las diferentes cajas TATA

La unin de EhTBP en EN a las diferentes cajas TATA se cuantific con diferentes
concentraciones de EN y 10,000 cpm (157 pM) de cada oligonucletido. Las variaciones
experimentales para cada gel fueron normalizadas con la radiactividad total en cada carril
(complejos formados ms la sonda libre). En algunos experimentos se observaron dos
complejos; en todos los casos, su especificidad fue comprobada mediante ensayos de
competencia y slo los complejos especficos fueron analizados. Los complejos formados a
diferentes concentraciones de EN con las cajas TATA se muestran en la figura 15A-H.
Los complejos DNA-protena se cuantificaron con la finalidad de calcular los
valores de KD para EN con cada oligonucletido, empleando el mtodo descrito por
Coleman y Pugh (1995) (Material y Mtodos). Inicialmente, cuantificamos por
densitometra las cpm presentes en el complejo DNA-protena retardado (Sx) para cada
concentracin analizada de EN (x). En seguida, los valores del logaritmo natural de Sx (ln
Sx) se graficaron contra una concentracin dada de EN (x). Como las cpm eran una variable
discreta, empleamos ln Sx (Ec. 2) para garantizar la distribucin normal del error residual
(E) en el anlisis de regresin para obtener datos ms precisos y representativos (Atkinson,
1985; Lopez-Canovas, y col., 1998). Por lo tanto, los datos experimentales se ajustaron a
una funcin polinmica de x (Fig. 16A-H). En todos los casos obtuvimos una funcin
polinmica de segundo grado que describa la relacin entre ln Sx y x (Tabla 2). El resumen
de coeficientes, varianzas y los resultados del anlisis de t de student obtenidos para cada
caso se presentan en la tabla 2. La cantidad de EhTBP en EN se determin mediante

RESULTADOS

83

[EN]

2 3

TATTTAAA (1)

TATTggAA (3)

TAgTgAAA (2)

[EN]

2 3

gAgTTAAA (5)

TATgTAAA (4)

TAT__AAA (6)

[EN]

TAT__AAg (7)

4 5

7 8

TATTaAAA (8)

Fig. 15. Cuantificacin de la afinidad de EN por diferentes cajas TATA. (A-H) EMSA de
los diferentes oligonucletidos marcados con [-32P]P (10,000 cpm, 157 pM) incubados: sin EN,
(carril 1), 2 g (carril 2); 4 g (carril 3); 6 g (carril 4); 8 g (carril 5); 10 g (carril 6); 12 g
(carril 7); 14 g (carril 8) de EN. Las variantes de la caja TATA empleadas en los EMSA se
muestran debajo de cada gel. Las flechas indican los complejos considerados en el anlisis.

7.39

6.87

7.96

7.28

6.72

7.86

7.17

5.58

7.77

7.05

6.43

7.68

6.94

6.29

7.59

6.83

6.14

7.49

6.72

6
1

2.16 3.32 4.48 5.64 6.81 7.97

[x]

7.4
1

7.18

7.38

7.93

7.04

7.33

7.85

6.91

7.29

ln SX

7.24

6.77

7.7

6.63

7.2

7.63

6.49

7.15

6.35

2.16 3.32 4.48 5.64 6.01 7.97

[x]
(nM)

7.11
1

2.32 3.65 4.98 6.31 7.64 8.96

[x]
(nM)
gAgTTAAA(5)

2.32 3.65 4.98 6.31 7.64 8.96

[x]
(nM)
TATTaAAA(8)

TATgTAAA(4)

1.99 2.99 3.98 4.98 5.98 6.97

[x]
(nM)
TAT_ _AAA(6)

6.81

7.07

6.66

6.94

6.5

ln SX

7.21

6.8

6.35

6.67

6.18

6.54

6.04

6.4

(nM)

TATTggAA(3)

7.55

1.83 2.66 3.49 4.32 5.15 5.98

[x]

(nM)

TAgTgAAA(2)

ln SX

ln SX

TATTTAAA(1)

ln SX

2.22 3.65 4.98 6.31 7.64 8.96

[x]

(nM)

7.78

84

ln SX

ln SX

ln SX

RESULTADOS

2.32 3.65 4.98 6.31 7.64 8.96

[x]
(nM)
TAT_ _AAg(7)

5.00

Figura 16. Representacin grfica de los datos obtenidos en la cuantificacin de complejos

formados con EN y las diferentes cajas TATA. (A-H) ln Sx (radiactividad presente en los complejos
DNA-protena) versus x (concentracin de EhTBP). Los datos fueron obtenidos de los
experimentos de la figura 15. Los puntos representan los datos experimentales y las lneas contnuas
las cruvas predichas por la funcin polinmica de segundo grado (Ec. 2 en Material y Mtodos). El
oligonucletido empleado para cada experimento se muestra debajo de cada grfica.

RESULTADOS

85

ensayos de Western blot utilizando diferentes concentraciones de EhTBPr incubadas con el

anticuerpo anti-EhTBP y por interpolacin de la densitometra de las bandas observadas
(ver Material y Mtodos).
Una vez que definimos la relacin matemtica entre ln Sx y x para cada
experimento, determinamos la cantidad promedio de radiactividad (Sf) presente en los
complejos DNA-protena cuando la reaccin alcanz el punto de saturacin. Esto se realiz
utilizando primeramente la ecuacin 3 para calcular el valor de x al cual la funcin
matemtica tena un mximo (xmax). Para los oligonucletidos TATTTAAA [1],
TAgTgAAA [2], TATTggAA [3], TATgTAAA [4], gAgTTAAA [5], TAT_ _AAA [6],
TAT_ _AAg [7] y TATTaAAA [8], los valores de xmax fueron 6.34, 6.00, 4.84, 7.98, 5.57,
4.10, 6.52 y 7.17 nM, respectivamente. Los cuales corresponden a los valores de Sf de 1618,
920, 2850, 2935, 1308, 1601, 1337 y 873 cpm, respectivamente.
El siguiente paso fue obtener el valor de F para cada oligonucletido unido a EN
empleando la Ecuacin 1 como se describi en Material y Mtodos. Estos valores se
graficaron contra la relacin molar EN/TATA. Los valores de F tambin se ajustaron a una
funcin polinmica de la relacin molar EN/oligonucletido TATA. La figura 17A muestra
un ejemplo de los valores de F obtenidos experimentalmente para el oligo TAT_ _AAg
[7], incubado con EN. Los resultados para todos los oligonucletidos mostraron una
funcin polinmica de segundo grado (Tabla 2). El anlisis estadstico di resultados
similares a los obtenidos mediante la Ec. 2. Posteriormente, obtuvimos la relacin molar
EN/oligonucletido TATA a la cual F corresponda a 1 (valor mximo). Estos valores
fueron 45, 34, 31, 50, 48, 31, 42 y 37 para los oligonucletidos TATTTAAA [1],
TAgTgAAA [2], TATTggAA [3], TATgTAAA [4], gAgTTAAA [5], TAT_ _AAA [6],

RESULTADOS

-3

2.14

-0.12

1.94

-0.26

1.75

1/F

ln F

9.69X10

86

-0.39

1.56

-0.53

1.37

-0.66

1.10
0.99

-0.8
6

15

23

32

40

49

57

1X1010 2X1010 3X1010 4X1010 5X1010 7X1010

Relacin molar EN/TATA

1/P
TAT_ _AAg [7]

Figura 17. Relacin entre ln F y la relacin molar EN/ TAT_ _ AAg [7] y entre 1/F y 1/P.
(A) Datos experimentales obtenidos de la relacin entre ln F y la relacin molar EN/TAT_ _ AAg
[7]. (B) Representacin grfica de 1/F y 1/P para los complejos EN/ TAT_ _ AAg [7]. Los puntos
representan datos obtenidos experimentalmente y las lneas contnuas corresponden a las curvas
tericas obtenidas por la funcin polinmica de segundo grado (A). (B) corresponde a la funcin
lineal para la estimacin de los valores de KD.

2.90x10-2
1.50x10-1
5.80x10-2
2.50x10-2
8.80x10-2
1.06x10-1
1.83x10-2
2.90x10-2

-2.10x10-2
-2.92x10-2
-3.51x10-2
-7.15x10-3
-3.94x10-2
-2.30x10-2
-2.61x10-2
-2.34x10-2

2.74x10-1
3.50x10-1
3.40x10-1
1.26x10-1
4.40x10-1
1.88x10-1
3.40x10-1
3.35x10-1

6.49
5.80
7.13
7.43
5.96
6.99
6.10
5.57

1.02x10-3
4.23x10-3
3.42x10-3
8.97x10-4
2.54x10-3
4.82x10-3
5.29x10-4
8.40x10-4

S2a1
1.21x10-5
4.10x10-5
6.80x10-5
1.10x10-5
2.44x10-5
7.26x10-5
5.10x10-6
8.04x10-6

S2a2
a1

-8.98x10-1 4.01x10-2
-1.05
6.2x10-2
-1
-8.23x10
5.34x10-2
-1
-5.52x10
2.21x10-2
-1.22
5.10x10-2
-1
-3.85x10
2.51x10-2
-1.11
5.34x10-2
-1.20
6.44x10-2

a0
-4.35x10-4
-9.02x10-4
-8.70x10-4
-2.21x10-4
-5.26x10-4
-4.10x10-4
-6.42x10-4
-8.63x10-4

a2

4.40x10-2
1.50x10-1
5.80x10-2
2.50x10-2
8.80x10-2
1.61x10-1
1.83x10-2
2.90x10-2

S2a0

ln F vs relacin molar EN/TATA

2.29x10-5
1.31x10-4
8.42x10-5
2.78x10-5
3.40x10-5
8.56x10-5
1.30x10-5
3.10x10-5

S2a1

1.38x10-8
3.90.x10-8
4.10x10-8
1.02x10-8
4.35x10-9
2.28x10-8
3.70x10-9
1.10x10-8

S2a2

estndar de los coeficientes an.

a son los coeficientes de la ecuacin ln Sx = a0 + a1x + a2x2 + E-N(0,1) y ln F = a0 + a1(EhTBP/TATA) + a2(EhTBP/TATA)2 + E-N(0,1). Sa es la desviacin

1
2
3
4
5
6
7
8

S2a0

a2

a1

a0

ln Sx vs x

Tabla 2. Relacin matemtica entre ln Sx vs x, y ln F vs relacin molar EN/TATA

RESULTADOS
87

RESULTADOS

88

TAT_ _AAg [7] y TATTaAAA [8], respectivamente. El recproco de estos valores fue
empleado para calcular la concentracin de protena total activa (PT) (Material y Mtodos).

5.2.5. Constantes de disociacin de EN para las diferentes cajas TATA.

Para obtener los valores de KD de EN por las diferentes cajas TATA, primero
calculamos la concentracin de protena activa en EN empleando los valores de F a
diferentes concentraciones de EN. El recproco de los valores de F dio la siguiente funcin
lineal: (1/F) = 1 + KD (1/P).
La pendiente de la funcin lineal corresponde a la KD, por lo tanto, los datos (1/F) y
(1/P) se ajustaron por el mtodo de regresin lineal robusta (Atkinson, 1985; LopezCanovas y col., 1998), los cuales deberan dar una ecuacin del tipo (1/F) = c0 + c1 (1/P) si
las variables estaban relacionadas linealmente. Un ejemplo del ajuste entre estas variables,
empleando el mtodo de regresin lineal robusta, se presenta para el oligonucletido TAT_
_AAg [7] (Fig. 17B). Estos clculos se realizaron para todos los oligonucletidos TATA
incubados con EN.
Los valores de KD y sus desviaciones estndar se muestran en la Tabla 4. Los
valores de EN por las diferentes cajas TATA variaron entre 1.75 ( 1.86) x 10-12 y 3.25 (
0.87) x 10-11 M, los cuales corresponden a los oligonucletidos TATgTAAA [4] y
TAgTgAAA [2], respectivamente. La KD para el oligonucletido TATTTAAA [1] fue de
9.83 ( 2.06) x 10-12 M. El oligonucletido TATgTAAA [4] present la KD ms baja, cuyo
valor fue de 1.75 ( 1.86) x 10-12 M.
Los valores de KD para los oligonucletidos TAT_ _AAA [6] y TATTggAA [3]
fueron de 4.63 ( 3.15) x 10-12 y 4.86 ( 0.32) x 10-12 M (sin diferencia significativa).
Interesantemente la KD ms alta fue para el oligo TAgTgAAA [2] con un valor de 3.25 (

RESULTADOS

89

0.87) x 10-11 M. La afinidad ms alta, calculada como el recproco de la KD, fue para el
oligonucletido TATgTAAA [4] en Extractos Nucleares. Para el oligo TATTTAAA [1],
considerado como caja TATA consenso, la afinidad fue relativamente menor, mientras que
la afinidad ms baja se obtuvo para el oligonucletido TAgTgAAA [2].

5.3. Caracterizacin de EhTBP recombinante

Para estudiar la capacidad de unin al DNA de la EhTBPr y eliminar la influencia
de otras protenas presentes en extractos nucleares en esta actividad de unin, llevamos a
cabo ensayos de retardamiento con la protena EhTBPr purificada en condiciones nativas y
el oligonucletido TATTTAAA [1].

5.3.1. EhTBP recombinante se une al oligonucletido TATTTAAA [1]

Primeramente, se expres la protena recombinante en bacterias, como un
polipptido fusionado a una etiqueta de 6 histidinas, la cual permiti su purificacin por
cromatografa de afinidad a metales inmobilizados (IMAC). Su identidad e integridad se
verificaron por SDS-PAGE al 12 % (el gel fue teido con azul de Coomasie) (Fig. 18A) y
por ensayos de Western blot empleando el anticuerpo anti-EhTBPr (Fig. 18B). La EhTBPr
purificada form un complejo con el oligonucletido TATTTAAA[1] (Fig. 18C, carril 2).
Este complejo fue competido por la misma sonda fra, mientras que se mantuvo en
presencia del competidor inespecfico poli (dG-dC) (Fig. 18C, carriles 3 y 4,
respectivamente). Para descartar la actividad de unin a la caja TATA de protenas
bacterianas contaminantes, se realizaron ensayos de retardamiento con extractos
bacterianos. Se detect la formacin de un complejo cuando la sonda se incub con
extractos de clulas BL21(DE3)pLysS inducidas, es decir, que expresaban la EhTBP

RESULTADOS

kDa

kDa

250
150
100
75

250
150
100
75

50

50

37

37

25

25

bi
bsi
EhTBPr
ce
ci

90

+
-

+
+
-

+
+

+
-

+
-

Fig. 18. Inmunodeteccin de EhTBPr y EMSA del oligonucletido TATTTAAA [1] con
EhTBPr. (A) SDS-PAGE al 12% teido con azul de Coomassie de la EhTBPr purificada en
condiciones nativas. Carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, EhTBPr purificada. (B)
Ensayo de Western blot de la EhTBPr purificada incubada con anticuerpos policlonales de conejo
anti-EhTBPr. Carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, tira de nitrocelulosa con la EhTBPr
purificada, incubada con anticuerpo anti-EhTBPr y con un anticuerpo secundario anti-conejo
acoplado a peroxidasa. Carril 3, como en el carril 2, pero sin anticuerpo secundario. (C) EMSA de
la EhTBPr incubada con el oligonucletido TATTTAAA [1] como se describi en Material y
Mtodos. Carril 1, sonda libre; carril 2, sin competidor; carril 3, exceso molar de 300 veces del
oligo TATTTAAA sin marcar, como competidor especfico (ce); carril 4, exceso molar de 300
veces de competidor inespecfico poli (dG-dC) (ci). (D) EMSA con 15 g de extractos bacterianos.
Carril 1, sonda libre; carril 2, extractos bacterianos sin inducir (bsi); carril 3, bacterias inducidas (bi)
que expresaban la EhTBPr.

RESULTADOS

91

recombinante (Fig.18D, carril 3), mientras que en el ensayo de retardamiento con extractos
bacterianos no inducidos (que no expresaban la protena EhTBPr), incubados con la misma
sonda, no se observ la formacin de complejo DNA-protenas, (Fig. 18D carril 2). Estos
hallazgos, confirman que la protena recombinante EhTBP presenta actividad de unin a la
caja TATA.

5.3.2. Formacin de complejos de EhTBPr con diferentes cajas TATA

En humanos y en otros organismos, se han reportado diferentes cajas TATA
funcionales (Wobbe y Struhl, 1990; Strubin y Struhl, 1992). Por otro lado, la secuencia
TATTTAAA y variantes de sta se han encontrado en algunos de los promotores de genes
de E. histolytica, entre -20 y -40 pb ro arriba del sitio de inicio de la transcripcin (Purdy y
col., 1996), aunque otras variantes se han encontrado experimentalmente a distancias
mayores en los promotores de los genes Ehtbp y EhRabB (comunicacin personal Dr.
Mario Alberto Rodrguez del Departamento de Patologa Experimental de CINVESTAVIPN).
En esta parte del trabajo, estudiamos la capacidad de EhTBPr de unirse a las
diferentes cajas TATA empleadas con EN, mediante ensayos de retardamiento. Se
utilizaron 300 ng (433 nM) de EhTBPr purificada y 10,000 cpm (157 pM) de cada sonda.
La Fig. 19A muestra un experimento representativo en donde EhTBPr se une a todos los
oligonucletidos empleados. Como en los experimentos llevados a cabo con EN, la protena
recombinante form un complejo de menor intensidad con el oligonucletido TAgTgAAA
[2] con respecto al formado con el oligonucletido TATTTAAA [1] considerado como caja
TATA consenso para E. histolytica. Los complejos formados con los oligonucletidos
TATgTAAA[4], gAgTTAAA[5], TAT_ _ AAA [6] y TAT_ _ Aag [7] tambin fueron

RESULTADOS

B
EhTBPr
ce
TATTTAAA
ci

3 4

- + + + +
- - + - - - - + - - - - +

3 4 5

E
EhTBPr
ce
TATTTAAA
ci

F
-

+
-

+ + +
+ - - + - - +

gAgTTAAA [5]

+
-

TAgTgAAA [2]

+ + +
+ - - + - - +

TATTggAA [3]

+
-

+ + +
+ - - + - - +

TAT_ _AAA [6]

92

+
-

+
+
-

+
+
-

+
+

TATgTAAA [4]

+
-

+ + +
+ - - + - - +

TAT_ _AAg [7]

+ + +
+ - - + - - +

+
-

TATTaAAA [8]

Fig. 19. Formacin de complejos de EhTBPr con diferentes cajas TATA. (A) EMSA de
EhTBPr purificada (433 nM) incubada con 10,000 cpm (157 pM) de los diferentes
oligonucletidos marcados con [-32P]ATP: carril 1, TATTTAAA [1]; carril 2, TAgTgAAA [2];
carril 3, TATTggAA [3]; carril 4, TATgTAAA [4]; carril 5, gAgTTAAA [5]; carril 6, TAT_ _AAA
[6]; carril 7, TAT_ _AAg [7]; carril 8, TATTaAAA [8]. (B-H) Ensayos de competencia de los
complejos formados con EhTBPr y las variantes de la caja TATA mostradas debajo de cada gel.
Carril 1, sonda libre; carril 2, sin competidor; carril 3, exceso molar de 300 veces del oligo
correspondiente sin marcar, como competidor especfico (ce); carril 4, exceso molar de 300 veces
del oligo TATTTAAA [1] y carril 5, competidor inespecfico poli (dG-dC) (ci).

RESULTADOS

93

menos intensos que con el TATTTAAA [1]. Todos los complejos formados con la EhTBPr
y las diferentes cajas TATA, fueron competidos tanto por la misma sonda correspondiente,
como por el oligonucletido TATTTAAA [1] (Fig. 19B-H). En algunos ensayos se
observaron dos complejos, con los oligonucletidos TAT_ _ AAA [6] y TAT_ _ Aag [7],
los cuales fueron competidos especficamente tanto por su correspondiente oligonucletido
como por el oligonucletido TATTTAAA [1] sin marcar. La presencia de dos complejos en
algunos experimentos con la EhTBPr pueden deberse a cambios conformacionales de los
complejos DNA-protena, los cuales pueden estar afectando su migracin electrofortica.
Para descartar la posibilidad de que la EhTBPr pudiera unirse a cualquier secuencia
rica en A-T, se realizaron ensayos de competencia con la protena recombinante incubada
con el oligonucletido TATTTAAA [1] marcado y los oligonucletidos TtTTTttt [9],
TATaTAtA [10] o TtTTaAAA [11] como competidores en un exceso molar de 300 veces.
Estos oligonucletidos no compitieron por los complejos EhTBPr-TATTTAAA [1],
indicando que esta protena no se une indiscriminadamente a secuencias ricas en A-T (Fig.
20A). Por otro lado, comprobamos que la EhTBPr no se uniera a oligonucletidos de
cadena sencilla, para lo cual, la sonda marcada se pas a travs de una columna de
hidroxiapatita y la radiactividad se cuantific en las fracciones no unidas y en los eluidos.
Ms del 99% de la radiactividad se encontr unida a la columna y se eluy con buffer de
fosfatos 0.4 M. La Figura 20B, muestra el perfil de elucin para el oligonucletido
TATTTAAA [1], como un experimento representativo.
Todos estos resultados mostraron que an la EhTBPr sin la modulacin de otras
protenas, tiene la capacidad in vitro, de unirse a diferentes elementos TATA, aunque la
estabilidad de los complejos puede ser un factor importante en la cantidad de complejos
formados a una concentracin y a un tiempo determinados.

RESULTADOS

A
-

B
+
-

+
+
-

+ + +
- - + - - + - - +

100
% de radiactividad cpm / fraccin

EhTBPr
poli (dG-dC)
TtTTTttt [9]
TATaTAtA [10]
TtTTaAAA [11]

94

80
60
40
20
0
1

1 2

3 4

TATTTAAA [1]

10

6
CS

CD

Fig. 20. Ensayo control de unin de EhTBPr a secuencias ricas en A-T. (A) EhTBPr
purificada (433 nM) incubada con 10,000 cpm (157 pM) del oligo TATTTAAA [1]. Carril 1, sonda
libre; carril 2, EhTBPr incubada con el oligo TATTTAAA [1]; Como competidores inespecficos:
carril 3, EhTBPr preincubada con un exceso molar de 300 veces de poli (dG-dC) antes de aadir la
sonda marcada TATTTAAA [1]; carril 4, EhTBPr preincubada con el oligonucletido TtTTTttt [9]
sin marcar; carril 5, oligonucletido TATaTAtA [10] fro y carril 6, oligonucletido TtTTaAAA
[11]. (B) Perfil de elucin del oligonucletido TATTTAAA [1] marcado pasado a travs de una
columna de hidroxiapatita. Fraccin 1, DNA de cadena sencilla no unido (CS); fracciones 2-6,
lavados con 2.5 ml de buffer de fosfatos 0.12 M pH 6.8 (L); fracciones 7-11, elucin con 2.5 ml de
buffer de fosfatos 0.4 M pH 6.8 (CD). El volumen de cada fraccin fue de 0.5 ml. La radiactividad
est representada como el porcentaje de radiactividad total (30,000 cpm) cargada en la columna.

11

RESULTADOS

95

5.3.3. Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por las diferentes cajas TATA

La actividad de unin de la EhTBP recombinante a las diferentes cajas TATA, se
cuantific al igual que para extractos nucleares, a concentraciones crecientes de EhTBPr
purificada y 10,000 cpm de cada oligonucletido. Las variaciones experimentales tambin
fueron normalizadas con la radiactividad total en cada carril (complejos formados ms la
sonda libre). En la figura 21A-H, se muestran los complejos formados a diferentes
concentraciones de EhTBPr con los diferentes oligonucletidos. Con la finalidad de
calcular los valores de KD, los complejos DNA-protena en cada EMSA se cuantificaron
empleando el mtodo descrito por Coleman y Pugh (1995) (ver Material y Mtodos). Las
cpm presentes en el complejo DNA-protena retardado (Sx) se cuantificaron por
densitometra para cada concentracin analizada de EhTBPr purificada (x). Posteriormente,
los valores del logaritmo natural de Sx (ln Sx) se graficaron contra una concentracin dada
de EhTBPr (x). Como las cpm eran una variable discreta, empleamos ln Sx (Ec. 2) para
garantizar la distribucin normal del error residual (E) en el anlisis de regresin para
obtener datos ms precisos y representativos (Atkinson, 1985; Lopez-Canovas, y col.,
1998). Por lo tanto, los datos experimentales se ajustaron a una funcin polinmica de x
(Fig. 22A-H). Al igual que en extractos nucleares, en todos los casos obtuvimos una
funcin polinmica de segundo grado que describa la relacin entre ln Sx y x (Tabla 3). El
resumen de coeficientes, varianzas y los resultados del anlisis de t de student obtenidos
para cada caso se presentan en la tabla 3.
Una vez que se defini la relacin matemtica entre ln Sx y x para cada experimento,
determinamos la cantidad promedio de radiactividad (Sf) presente en los complejos DNAprotena cuando la reaccin alcanz el punto de saturacin. Esto se realiz utilizando
primeramente la ecuacin 3 para calcular el valor de x al cual la funcin matemtica tena

RESULTADOS

96

[EhTBPr]

TATTTAAA [1]

TAgTgAAA [2]

TATTggAA [3]

[EhTBPr]

TATgTAAA [4]

gAgTTAAA [5]

TAT_ _AAA [6]

[EhTBPr]

TAT_ _AAg [7]

TATTaAAA [8]

Fig. 21. Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por diferentes cajas TATA en funcin de
la concentracin de EhTBPr. (A-H) EMSA de los diferentes oligonucletidos marcados con [32

P]ATP (10,000 cpm 157 pM) incubados: carril 1, 0 nM; carril 2, 50 nM; carril 3, 97 nM; carril 4,

145 nM; carril 5, 193 nM; carril 6, 242 nM; carril 7, 290 nM; carril 8, 358 nM de EhTBPr. Las
variantes de la caja TATA empleadas en los EMSA se muestran debajo de cada gel. Las flechas
sealan los complejos analizados.

7.04

6.55

6. 41

6.89

6.27

6.24

6.75

5.98

6.07

6.61

5.69
5.4

5.73

6.33

5.12

5.56

6.16
48 113 177 242 306 371 435
[x]
(nM)
TATTTAAA [1]

4.83
48 105 161 217 274 330 387
[x]
(nM)
TAgTgAAA [2]

5.39
48 105 161 217 274 330 387
[x]
(nM)
TATTggAA [3]

5.71

5.95

6. 17

5.65

5.88

6.09

5.59

5.8

5.53

ln SX

ln SX

5.92

5.72

5.47

5.65

5.84

5.41

5.57

5.75

97

5.49
48

145 193 242 290 338

[x]
(nM)
TATgTAAA [4]

97

145 193 242 290 338

[x]
(nM)
gAgTTAAA [5]

5.67
48 105 161 217 274 330 387
[x]
(nM)
TAT_ _AAA [6]

H-1

H-2

5.83

5.78

5.1

5.68

5.65

4.88

5.53

5.52

ln SX

5.31

4.66

5.38

ln SX

ln SX

5.35
48

ln SX

5.19

6.47

97

ln SX

ln SX

ln SX

RESULTADOS

5.4

4.44

5.22

5.27

4.22

5.07

5.14

4.01
48 105 161 217 274 330 387
[x]
(nM)
TAT_ _Aag [7]

4.92
48 105 161 217 274 330 387
[x]
(nM)
TATTaAAA [8]

5.01
48 105 161 217 274 330 387
[x]
(nM)
TATTaAAA [8]

Figura 22. Representacin grfica de los datos obtenidos en la cuantificacin de complejos

formados con EhTBPr y las diferentes cajas TATA. (A-H) ln Sx (radiactividad presente en los
complejos DNA-protena) versus x (concentracin de EhTBPr). Los datos fueron obtenidos de los
experimentos de la figura 21. H-1 y H-2 corresponden a los complejos formados con el oligo 8 de
migracin ms lenta y migracin ms rpida, respectivamente. Los puntos representan los datos
experimentales y las lneas contnuas las curvas tericas obtenidas de la funcin polinmica de
segundo grado (Ec. 2, Material y Mtodos). El oligonucletido empleado en cada expermiento se
muestra debajo de cada grfica.

1.48x10-6
1.25x10-5
2.55x10-6
4.31x10-6
7.31x10-6
2.98x10-6
3.71x10-6
9.94x10-7
1.76x10-6

1.20x10-1
8.24x10-1
1.68x10-1
2.23x10-1
3.78x10-1
1.96x10-1
2.44x10-1
6.54x10-2
1.16x10-1

-1.34x10-5
-2.77x10-5
-1.16x10-5
-6.75x10-6
-4.67x10-6
-8.03x10-6
-2.73x10-5
-1.24x10-5
-1.30x10-5

7.66x10-3
1.56x10-2
7.91x10-3
2.17x10-3
2.56x10-3
4.34x10-3
1.42x10-2
7.62x10-3
7.28x10-3

5.85
4.37
5.04
5.48
5.47
5.48
3.39
4.61
4.76

a0

-1.10
6.01x10-12
-2.19
6.31x10-11
-1.34
1.29x10-11
-1
-11
-1.74x10
2.75x10
-11
-3.41x10-1
4.67x10
-11
-5.87x10 -1
1.50x10
-11
-1.86
1.87x10
-1.17
5.01x10-12
-1.02
8.85x10-12

S2a2
1.12x10-3
2.74x10-3
1.24x10-3
3.82x10-4
2.92x10-4
5.78x10-4
2.23x10-3
1.46x10-3
1.40x10-3

a1
-2.86x10-7
-8.56x10-7
-2.87x10-7
-2.09x10-7
-6.24x10-8
-1.42x10-7
-6.71x10-7
-4.57x10-7
-4.80x10-7

a2

S2a1
3.16x10-8
3.87x10-7
6.29x10-8
1.33x10-7
9.77x10-8
5.30x10-8
9.13x10-8
3.67x10-8
6.48x10-8

S2a0
1.20x10-1
8.24x10-1
1.68x10-1
2.23x10-1
3.78x10-1
1.96x10-1
2.44x10-1
6.54x10-2
1.16x10-1

ln F vs relacin molar EhTBPr/TATA

2.76x10-15
6.03x10-14
7.80x10-15
2.63x10-14
8.34x10-15
4.72x10-15
1.13x10-14
6.82x10-15
1.20x10-14

S2a2

desviacin
desviacin estndar de los coeficientes an. I, complejo DNA-proteina de migracin lenta; II, complejo DNA-proteina de migracin rpida

a corresponde a los coeficientes de la ecuacin ln Sx = a0 + a1x + a2x2 + E-N(0,1) y ln F = a0 + a1(rEhTBP/TATA) + a2(rEhTBP/TATA)2 + E-N(0,1). Sa es la

1
2
3
4
5
6
7
8I
8II

S2a1

S2a0

a2

a1

a0

ln Sx vs x

Tabla 3. Relacin matemtica entre ln Sx vs x y ln F vs relacin molar EhTBPr/TATA.

RESULTADOS
98

RESULTADOS

99

un mximo (xmax). Los valores de xmax obtenidos para cada oligonucletido incubado con la
EhTBP recombinante fueron los siguientes: oligo TATTTAAA [1], 280 nM; oligo
TAgTgAAA [2], 287 nM; oligo TATTggAA [3], 340 nM; oligo TATgTAAA [4], 161 nM;
oligo gAgTTAAA [5], 270 nM; oligo TAT_ _AAA [6], 270 nM; oligo TAT_ _AAg
[7], 261 n y para el oligo TATTaAAA [8], 307 y 280 nM para los complejos I y II,
respectivamente. Estos valores corresponden a los siguientes valores de Sf: 1038, 703, 590,
288, 334, 431, 190, 325 cpm respectivamente y para el complejo II del oligonucletido
TATTaAAA [8] fue de 324. El siguiente paso fue obtener el valor de F para cada
oligonucletido unido a EhTBPr, empleando la Ecuacin 1. Estos valores se graficaron
contra la relacin molar EhTBPr/TATA. Los valores de F tambin se ajustaron a una
funcin polinmica de la relacin molar EhTBPr/oligonucletido TATA. La figura 23
muestra un ejemplo de los valores de F obtenidos experimentalmente para el oligo TAT_
_AAg [7], incubado con EhTBPr. Los resultados para todos los oligonucletidos mostraron
una funcin polinmica de segundo grado (Tabla 3). El anlisis estadstico di resultados
similares a los obtenidos mediante la Ec. 2. Posteriormente, obtuvimos la relacin molar
EhTBPr/oligonucletido TATA a la cual F corresponda a 1 (valor mximo). Los valores
de la relacin molar EhTBPr/oligonucletido en F = 1, fueron 1960, 1600, 2164, 915, 2337,
2030, 1664 para los oligonucletidos TATTTAAA [1], TAgTgAAA [2], TATTggAA [3],
TATgTAAA [4], gAgTTAAA [5], TAT_ _AAA [6] y TAT_ _AAg [7], respectivamente; y
para los complejos formados con el oligo TATTaAAA [8] los valores fueron 1600 y 1458
para las bandas de migracin lenta y rpida, respectivamente. El recproco de estos valores
fue empleado, para calcular la concentracin de protena total activa (PT) (Material y
Mtodos).

RESULTADOS

100

Estos resultados demostraron que la capacidad de unin al DNA de EhTBP requiere

menor concentracin de protena en extractos nucleares que de protena recombinante
purificada, posiblemente por la modulacin que otros factores presentes en EN ejercen
sobre EhTBP en su unin al DNA.

5.3.4. Constantes de disociacin de EhTBPr para las diferentes cajas TATA.

Para obtener los valores de KD de EhTBPr por las diferentes cajas TATA, primero
calculamos la concentracin de EhTBP activa en la fraccin purificada de EhTBPr,
empleando los valores de F a diferentes concentraciones de EhTBPr. El recproco de los
valores de F dio la siguiente funcin lineal: (1/F) = 1 + KD (1/P). La pendiente de la
funcin lineal corresponde a la KD, por lo tanto, los datos (1/F) y (1/P) se ajustaron por el
mtodo de regresin lineal robusta (Atkinson, 1985; Lopez-Canovas, y col.,1998), los
cuales deberan dar una ecuacin del tipo (1/F) = c0 + c1 (1/P) si las variables estaban
relacionadas linealmente. Un ejemplo del ajuste entre estas variables, empleando el mtodo
de regresin lineal robusta, se presenta para el oligonucletido TAT_ _AAg [7] (Fig. 23A,
B). Estos clculos se realizaron para todos los oligonucletidos TATA incubados con
EhTBPr. Los valores de KD y sus desviaciones estndar se muestran en la Tabla 4. Los
valores de EhTBPr variaron de 6.6 ( 3.15) x 10-12 a 1.60 ( 0.37) x 10-10 M, que
corresponden a los oligonucletidos gAgTTAAA [5] y TAgTgAAA [2], respectivamente.
Aparentemente, con el oligo TATgTAAA [4], se alcanz la saturacin muy
tempranamente, es decir, por debajo de las concentraciones de EhTBPr utilizada en estos
experimentos, por lo que los datos no se ajustaron al anlisis de regresin (Fig. 22D) y los
valores de KD no se pudieron

RESULTADOS

0.06

3.46

-0.15

3.03

-0.37

2.6

1/F

ln F

101

-0.59

2.17

-0.81

1.74

-1.02

1.31

-1.24
308 667 1027 1386 1746 2105 2464

0.88
0.43 0.95 1.47 1.99 2.51 3.03 3.55

Relacin molar EhTBPr/TATA

1/P

TAT_ _AAg [7]

Figura 23. Relacin entre ln F y la relacin molar EhTBPr/ TAT_ _ AAg [7] y entre 1/F y
1/P. (A) Datos experimentales obtenidos de la relacin entre ln F y la relacin molar EhTBPr/TAT_
_ AAg [7]. (B) Representacin grfica de 1/F y 1/P para los complejos EhTBPr/ TAT_ _ AAg [7].
Los puntos representan datos obtenidos experimentalmente y las lneas continuas corresponden a las
curvas tericas obtenidas por la funcin polinmica de segundo grado (A). (B) corresponde a la
funcin lineal para la estimacin de los valores de KD.

RESULTADOS

102

Tabla
T
abla 4. Constantes de disociacin de EhTBP por variantes de caja TATA.
(KD Sd) M
Oligonucletido

EN

EhTBPr

5-T A T T T A A A-3[1]

9.75 ( 2.12) x 10-12

1.96 ( 0.58) x 10-11

5-T A g T g A A A-3[2]

3.25 ( 0.87) x 10-11

1.60 ( 0.37) x 10-10

5-T A T T g g A A-3[3]

4.85 ( 0.32) x 10-12

3.18 ( 1.16) x 10-11

5-T A T g T A A A-3[4]

1.74 ( 1.85) x 10-12

5-g A g T T A A A-3[5]

1.76 ( 0.79) x 10-11

6.60 ( 3.15) x 10-12

5-T A T _ _ A A A-3[6]

5.19 ( 3.44) x 10-12

1.04 ( 0.39) x 10-11

5-T A T _ _ A A g-3[7]

1.65 ( 0.47) x 10-11

8.26 ( 2.2) x 10-11

5-T A T T a A A A-3[8]

2.95 ( 0.63) x 10 -11

4.28 ( 0.47) x 10-11 I

3.94 ( 0.44) x 10-11II

ICorresponde

al complejo DNA-protena de migracin rpida

IICorresponde

al complejo DNA-protena de migracin lenta

Sd, Desviacin estndar

RESULTADOS

103

determinar. La KD de EhTBPr para el oligonucletido TATTTAAA [1] fue de 1.96 (

0.58) x 10-11; por lo tanto, la protena recombinante present una actividad especfica de
unin al DNA 10 veces ms baja que la EhTBP en EN (comparar datos de Tabla 4). El
oligonucletido TATgTAAA [4] present la KD ms baja, posiblemente con la EhTBPr.
Los valores de KD para los oligonucletidos TAT_ _AAA [6] y TATTggAA [3] fueron de
1.04 ( 0.39) x 10-11 y 3.18 ( 1.16) x 10-11 M, respectivamente (sin diferencia
significativa). Interesantemente la KD ms alta fue para el oligo TAgTgAAA [2] con un
valor de 1.60 ( 0.37) x 10-10. La afinidad ms alta, calculada como el recproco de la KD,
fue para el oligonucletido gAgTTAAA [5] con una valor de KD de 6.6 ( 3.15) x 10-12.
Para el oligo TATTTAAA [1], considerado como la caja TATA consenso, la afinidad fue
relativamente menor, mientras que la menor afinidad se obtuvo para el oligonucletido
TAgTgAAA [2]. En general se observaron valores de KD ms bajos en Extractos Nucleares
que los de EhTBPr, lo que sugiere que los factores asociados a EhTBP modulan su afinidad
por las diferentes cajas TATA.

5.3.5. Formacin de complejos de la EhTBPr con el oligonucletido GAAC

El ncleo de algunos promotores de genes de E. histolytica contienen adems de la
secuencia reportada como caja TATA consenso, una secuencia GAACT designada
elemento GAAC cuya localizacin es variable entre la caja TATA y el sitio de inicio de la
transcripcin. Mutaciones en este elemento del gen hgl5 disminuyen drsticamente la
actividad de un gen reportero y alteran el sitio de inicio de la transcripcin. Esto indica que
el elemento GAAC juega un papel importante en el control transcripcional (Singh y col.,
1997). Se han propuesto dos modelos para explicar el papel del elemento GAAC: i) la
unin de una protena a este elemento, que forma parte del factor TFIID y ii) la proteina

RESULTADOS

104

que se une a este elemento funciona para atraer a la TBP a la caja TATA (Singh y Rogers,
1998). Con la finalidad de establecer si EhTBP era capaz de unirse a esta secuencia, se
realizaron ensayos de retardamiento con la protena recombinante. Como control se utiliz
la formacin del complejo de ETBPr con el oligonucletido TATTTAAA [1] (Fig. 24A,
carril 1). EhTBPr form un complejo con el elemento GAAC, con una migracin
electrofortica igual al del control y con una intensidad y definicin semejante (Fig. 24A,
carril 2). Este ensayo verifica que la EhTBP posee la capacidad de unirse a esta secuencia y
que posiblemente es un sitio para la unin del factor TFIID, del cual EhTBP forma parte.

5.3.6. Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por el elemento GAAC

Debido a que EhTBPr era capaz de unirse al elemento GAAC, se hicieron ensayos
de retardamiento a diferentes concentraciones de EhTBPr y 10,000 cpm del oligonucletido
GAAC, para cuantificar la afinidad de EhTBPr por esta secuencia. Al igual que para EN y
EhTBPr con otras cajas TATA, los complejos DNA-protena (Fig. 24B), se cuantificaron
para calcular los valores de KD de la EhTBPr con el elemento GAAC, empleando el mtodo
descrito por Coleman y Pugh (1995). Primero se cuantificaron por densitometra las cpm
presentes en el complejo DNA-protena retardado (Sx) para cada concentracin analizada de
EhTBPr (x). Los valores del logaritmo natural de Sx (ln Sx) se graficaron contra una
concentracin dada de EhTBPr (x) (Atkinson, 1985; Lopez-Canovas, y col., 1998). Los
datos experimentales se ajustaron a una funcin polinmica de x (Fig. 24C).
Posteriormente, se determin la cantidad promedio de radiactividad (Sf) presente en los
complejos DNA-protena cuando la reaccin alcanz el punto de saturacin, utilizando la
ecuacin 3 para calcular la concentracin de EhTBPr (x) a la cual la funcin matemtica
tena un mximo (xmax).

RESULTADOS

A
rEhTBP
TATTTAAA
GAACTA

B
+ +
+
- +

105

[EhTBPr]

6.87
6.75

ln Sx

6.63
6.51
6.38
6.26

6.14
48

105

161

217

[x]

274

330

387

(nM)

Figura 24. Ensayo de retardamiento con la EhTBPr y el elemento GAAC. (A) 10,000 cpm
del oligonucletido TATTTAAA [1] (carril 1) o del elemento GAAC (carril 2), se incubaron con 30
ng de EhTBPr purificada. (B) Cuantificacin de la afinidad de EhTBPr por la secuencia GAACT en
funcin de la concentracin de la protena. Carril 1, sin EhTBPr; carril 2, 2 ng; carril 3, 4 ng; carril
4, 6 ng; carril 5, 8 ng; carril 6, 10 ng; carril 7, 12 ng; carril 8, 14 ng. (C) Grfica de los datos
obtenidos en la cuantificacin de complejos formados en B. ln Sx (radiactividad presente en los
complejos DNA-protena) versus x (concentracin de EhTBPr). Los puntos representan los datos
experimentales y las lneas contnuas las curvas predichas por la funcin polinmica de segundo
grado (Ec. 2 en Material y Mtodos).

RESULTADOS

106

Este valor fue de 304.52 nM y corresponde al valor de Sf de 955 cpm. El siguiente paso fue
obtener el valor de F para el oligonucletido unido a EhTBPr, empleando la Ecuacin 1.
Este valor se grafic contra la relacin molar EhTBP/TATA (Fig. 25A) y tambin se ajust
a una funcin polinmica de la relacin molar EhTBP/oligonucletido GAACT para
obtener el valor de esta relacin molar al cual F corresponda a 1 (valor mximo), que fue
de 1962.76. El recproco de este valor fue empleado para calcular la concentracin de
protena total activa (PT) (Material y Mtodos), como en el caso de EN y EhTBPr con otros
oligonucletidos.
Con este par de resultados se demostr que la EhTBPr tiene la capacidad de unirse
tanto a secuencias variantes de la caja TATA como al elemento GAACT propuesto como
un sitio de unin para la maquinaria basal, y adems presenta una actividad de unin
semejante al que mostr con las variantes de la caja TATA.

5.3.7. Constantes de disociacin de EhTBPr para la secuencia GAAC.

Siguiendo una estrategia similar a la ya descrita, empleando el mtodo de regresin
robusta lineal, se ajustaron las variables 1/F y 1/P (Fig. 25B). Finalmente encontramos que
el valor de KD fue de 1.752 ( 0.482) x 10-11 M.
Este valor es parecido al que mostr EhTBP para los oligonucletidos diseados
con las variantes de caja TATA, as como para el oligonucletido TATTTAAA [1] que es
considerado la caja TATA consenso para los promotores de genes de E. histolytica.
Este resultado, sugiere fuertemente que el elemento GAAC es un sitio al cual se une
el factor TFIID, a travs de EhTBP. Sin embargo, se necestian estudios de transcripcin in
vitro, as como de transfeccin con un promotor que contenga el elemento GAAC para
determinar si la unin de EhTBP es funcional.

RESULTADOS

B
6.92

-0.11

1.83

-0.24

1.67

1/F

ln F

107

-0.36

1.5

-0.48

1.33

-0.6

1.16

-0.72
311 675 1038 1042 1765 2129 2492

Relacin molar EhTBPr/GAAC

0.99
1X1010 2X10103X10104X1010 5X1010

1/P

Figura 25. Relacin entre ln F y la relacin molar EhTBPr/ GAAC y entre 1/F y 1/P. (A)
Datos experimentales obtenidos de la relacin entre ln F y la relacin molar EhTBPr/GAAC. (B)
Representacin grfica de 1/F y 1/P para los complejos EhTBPr/ GAAC. Los puntos representan
datos obtenidos experimentalmente y las lneas contnuas corresponden a las curvas pronosticadas
obtenidas por la funcin polinmica de segundo grado (A). (B) corresponde a la funcin lineal para
la estimacin de los valores de KD.

RESULTADOS

108

5. 4. Purificacin parcial del factor TFIID

En esta parte de resultados, describimos el fraccionamiento bioqumico de la
maquinaria basal de la RNA Pol II, con la finalidad de observar la modulacin de la unin
de EhTBP a diferentes cajas TATA, nicamente por la maquinaria basal y no por otros
factores que se encuentran en extractos nucleares.

5.4.1. Cromatografa de filtracin en gel y de intercambio inico

Siguiendo el esquema de purificacin descrito por Wampler y colaboradores (1990),
llevamos a cabo la purificacin parcial del factor TFIID a partir de extractos nucleares de la
clona A de E. histolytica, mediante cromatografa de filtracin en gel y de intercambio
inico (Fig. 26).
Las fracciones parcialmente purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE en geles al
12%. Los geles se tieron con plata para observar el patrn electrofortico de cada fraccin.
Todas las fracciones mostraron un patrn diferencial, debido a la composicin de cada una
de ellas (Fig. 27A). En el carril 6 se muestra el patrn de la faccin 0.4 M de KCl, que en
algunos procesos de purificacin, mostr un enriquecimiento en una banda que migr con
el marcador de 25 kDa (Fig. 27A, carril 8).
Con estas fracciones parcialmente purificadas se realizaron ensayos de Western blot
empleando el anticuerpo anti-EhTBPr para verificar la presencia de la protena en la
fraccin de elucin de 0.4 M de KCl. La figura 27B muestra que el anticuerpo reconoci
una protena de 25 kDa en todas las fracciones; sin embargo, se observ un reconocimiento
mucho mayor en la fraccin de elucin con KCl 0.4 M. Con este ensayo se confirm que
EhTBP estaba formando parte de esta fraccin as como otras protenas que pueden

RESULTADOS

109

Fraccionamiento de Factores de transcripcin de RNA Polimerasa II

de Entamoeba histolytica

Extractos nucleares
de trofozotos

Sephadex G-25

Heparina-agarosa

0.08

0.18

0.4

Gradiente
discontnuo de
KCl (M)

Immunoprecipitacin
Anti- EhTBP

Figura 26. Esquema de purificacin de los factores generales de transcripcin de RNA

polimerasa II a partir de Extractos Nucleares crudos de tofozotos de E. histolytica.

RESULTADOS

110

A
108

105
82

79

55
49
38

47
33

30

25

26

19

21
16
PM

Figura 27. Patrn electrofortico de las fracciones parcialmente purificadas de EN de

trofozotos de E. histolytica. A, SDS-PAGE al 12% teido con plata. PM, marcadores de peso
molecular; carril 1, EN crudos; carril 2, EN despus de pasarlos por la columna de Sephadex G-25;
carril 3, lavados de la columna de Heparina-agarosa (no unido); carril 4, fraccin de elucin con
KCl 0.08 M; carril 5, fraccin eluda con KCl 0.18 M; carriles 6 y 8, fraccin de elucin con KCl
0.4 M de dos procesos independientes y carril 7, fraccin de elucin con KCl 1 M. B, Western blot
de las fracciones parcialmente purificadas observadas en A. Las protenas se transfirieron a una
membrana de nitrocelulosa, se incubaron con una dilucin de 1:1000 de anticuerpo anti-EhTBPr
(Material y Mtodos). Los carriles corresponden a los observados en A.

RESULTADOS

111

corresponder a los factores asociados a TBP. En algunos carriles el anticuerpo reconoci

bandas de mayor peso molecular (Fig. 27B, carriles 1-3) que pueden corresponder a
dmeros de la EhTBP o a que sta se encuentra asociada a otras protenas en los extractos
nucleares. Las bandas de pesos moleculares menores a 25 kDa se pueden explicar por
reaccin cruzada del anticuerpo con factores relacionados a TBP, sin embargo, no se
descarta la posibilidad de que se trate de un reconocimiento inespecfico del anticuerpo
policlonal anti-EhTBP. Los pesos moleculares de las protenas parcialmente purificadas se
calcularon y corresponden a pesos esperados para protenas homlogas a factores asociados
a TBP (TAFs) en la amiba (Fig. 27A, carriles 6, 8). Sin embargo, hasta este momento es
imposible decir que corresponden a factores asociados a TBP y que forman parte del
complejo TFIID.
Mediante anlisis in silico se encontraron clonas en el proyecto genoma de E. histolytica
que presentan homologa a algunos de los TAFs reportados para otros organismos. Como el
TAF1 (TAFII 250) present una identidad del 39, 36 y 34% y una homologa del 57, 55 y
54% con respecto a sus homlogos en humano, Drosophila y levadura, respectivamente. El
TAF2 present una identidad del 22% y una homologa del 41% con respecto a sus
homlogos de humano y Drosophila, un 20% de identidad y un 36% de homologa en
levadura.
El TAF 3 (TAFII140) de humano se utiliz para realizar una bsqueda de clonas en E.
histolytica, de las cuales una present una identidad con la de humano del 30% y una
homologa del 50%. Esta clona encontrada en la amiba, con nmero de acceso
Q51DJ2_ENTHI, present identidad con el TAFII155 de Drosophila del 25%, as como
una homologa del 47%. Curiosamente, con levadura present una identidad del 22% y una
homologa del 44% con el TAF8 con un peso molecular de 65 kDa y no como se esperaba,
que presentara homologa con su correspondiente homlogo. Estos ensayos in silico se

RESULTADOS

112

realizaron basados en el proyecto de secuenciacin del genoma de E. histolytica utilizando

el servicio de red Blast en la pgina SIB (resultados no mostrados).

5.4.2. Ensayos de retardamiento y competencia con las fracciones purificadas

Estos ensayos se realizaron con la finalidad de comparar los complejos que se
formaron con EN y el oligonucletido TATTTAAA[1] y aquellos formados con el mismo
oligonucletido y las fracciones purificadas, para demostrar la actividad de unin al DNA
de la fraccin 0.4 M y verificar su especificidad. Los complejos formados en todos los
casos, es decir, con EN y las fracciones purificadas, migraron a la misma altura, sugiriendo
que se trata de los mismos factores que estn asociados a EhTBP formando el complejo
DNA-protenas. Sin embargo, se observ un complejo de menor tamao probablemente
debido a la degradacin de protenas o al desensamble del factor TFIID en EN (Fig. 28A,
carriles 2 y 3). Los ensayos de retardamiento mostraron actividad de unin al
oligonucletido TATTTAAA[1] en la fraccin de elucin con KCl 0.4 M (Fig. 28A, carril
6). Con la fraccin obtenida con KCl 0.18 M, se observ la formacin de un complejo
aunque ms dbil, que puede explicarse por el gradiente discontinuo empleado o por la
saturacin de la columna (Fig. 28A, carril 5).
Para verificar la especificidad de los complejos se hicieron ensayos de competencia
empleando un exceso molar de 300 veces de los competidores tanto especfico como
inespecfico (Fig. 28B,C). Con extractos nucleares se confirm una vez ms que los
complejos son especficos pues son competidos por el mismo oligonucletido fro
(competidor especfico) (Fig. 28B). Este experimento se utiliz como control para el
ensayo de competencia de la fraccin de KCl 0.4 M, en donde se observ que el complejo

RESULTADOS

A
EN
G-25
KCl 0.08 M
KCl 0.18 M
KCl 0.4 M
KCl 1 M

B
-

+
-

+
-

+
-

+
-

+
-

5 6

EN
ce

113

+
-

+
+

KCl 0.4 M +
ce
ci
-

+
+
-

+
+

Figura 28. Ensayo de retardamiento y competencia con extractos nucleares crudos y la

fraccin parcialmente purificada. (A), EMSA con las fracciones purificadas incubadas con 10,000
cpm del oligonucletido TATTTAAA [1], carril 1, sonda libre; carril 2, EN crudos; carril 3,
extractos despus de pasarlos por la columna de Sephadex G-25; carril 4, fraccin eluida con KCl
0.08 M; carril 5, fraccin eluida con KCl 0.18 M; carril 6, fraccin eluda con KCl 0.4 M y carril 7;
fraccin eluida con KCl 1 M de la cromatografa de intercambio inico en columna de heparinaagarosa. (B), Ensayo de competencia de EN. Carril 1, sonda libre; carril 2, sonda incubada con EN;
carril 3, EN incubados con un exceso molar de 300 veces del mismo oligonucletido sin marcar
(competidor especfico, ce). (C), Ensayo de competencia de la fraccin 0.4 M KCl, carril 1, sin
competidor; carril 2, competidor especfico (ce) en un exceso molar de 300 veces; carril 3,
competidor inespecfico (ci) poli (dG-dC).

RESULTADOS

114

es especfico, ya que fue competido por el competidor especfico y no por el poli (dG-dC),
utilizado como competidor inespecfico. Estos resultados, comprueban la presencia de
protenas en esta fraccin parcialmente purificada con capacidad de unirse especficamente
a la caja TATA considerada como consenso.

5.4.3. Formacin de complejos de la fraccin de KCl 0.4 M con diferentes cajas TATA
Una vez que se comprob que la fraccin 0.4 M KCl se una al oligonucletido
TATTTAAA [1], y para descartar la posible influencia de otros factores en la capacidad
EhTBP para unirse a las diferentes cajas TATA, se realizaron ensayos de retardamiento
utilizando los oligonucletidos que se emplearon en EN y con la EhTBPr purificada. Esta
fraccin, al igual que EN y que EhTBPr, present la capacidad de unirse a todos los
oligonucletidos empleados, aunque con distinta intensidad, sugiriendo que esta fraccin
presentaba distinta afinidad por las variantes de la caja TATA utilizadas. En el caso de los
oligonucletidos TAgTgAAA [2], TAT_ _AAA [6] y TATTaAAA [8] los complejos
fueron muy dbiles (Fig. 29, carriles 2, 6, 8). Con los oligonucletidos TATTTAAA [1],
TATTggAA [3], TATgTAAA [4] y TAT_ _AAg [7] y gAgTTAAA [5], los complejos
fueron relativamente mejor definidos y de mayor intensidad (Fig. 29, carriles 1, 3-5, 7).
Entre estos oligos, el complejo ms intenso se observ con el oligonucletido TATgTAAA
[4].
En estos experimentos se incluy el oligonucletido que contena al elemento
GAAC (GAACT) que ha sido descrito como un elemento que dirige la formacin estable
del compejo de preiniciacin, es decir, un posible sitio de unin de TFIID que se encuentra
en el ncleo promotor del gen de la subunidad mayor de la lectina N-acetil--Dgalactosamina (hgl5) (Singh, y col., 1997). El ensayo de retardamiento mostr que la

T A AAA
TT
ggA
A
TA
Tg
TA
gA
AA
gT
TA
AA
TA
T_
_A
AA
TA
T_
_A
Ag
TA
TT
a
GA AAA
AC
TA

115

gT
g

TA

TA
TT

TA

AA

RESULTADOS

Figura 29. Ensayo de retardamiento con la fraccin de elucin de KCl 0.4 M parcialmente
purificada y las diferentes cajas TATA. Se emplearon 10,000 cpm de cada oligonucletido y se
incubaron con 10 l de la fraccin de KCl 0.4 M concentrada en centricn YM-10
(aproximadamente 250 ng). Carril 1, oligo TATTTAAA [1]; carril 2, TAgTgAAA [2]; carril 3,
TATTggAA [3]; carril 4, TATgTAAA [4]; carril 5, gAgTTAAA [5]; carril 6, TAT_ _AAA [6];
carril 7, TAT_ _AAg [7]; carril 8, TATTaAAA [8] y carril 9, oligo GAACTA.

RESULTADOS

116

fraccin purificada tena la capacidad de unirse a esta secuencia aunque posiblemente la

afinidad sea menor, pues el complejo formado era de menor intensidad con respecto al
complejo formado con el oligonucletido TATTTAAA [1] considerado como caja TATA
consenso para los promotores de los genes de E. histolytica (Fig. 29, carril 9).
Con estos resultados, se demostr que la fraccin parcialmente purificada eluida
con KCl 0.4 M tambin tiene capacidad de unirse a las variantes de caja TATA; sin
embargo, no determinamos la KD para poder compararlas con los valores de KD de los
extractos nucleares y de la EhTBPr.
Estos experimentos indican que los factores asociados a EhTBP posiblemente
modulan su afinidad por las diferentes cajas TATA, aunque sugieren una afinidad
diferencial, sin embargo, no descartamos la posibilidad de errores experimentales.
Interesantemente, con estos resultados se observ que la constante de afinidad de
EhTBPr para el elemento GAAC, es muy similar a la que present para el oligonucletido
TATTTAAA [1], considerado como caja TATA consenso para los promotores de genes de
E. histolytica, lo que sugiere fuertemente que el factor TFIID se une a esta secuencia en el
promotor del gen de la lectina reportado por Singh y colaboradores (1997). Sin embargo,
ensayos in vivo son necesarios para determinar que este elemento es un sitio de unin para
EhTBP.

DISCUSIN 117

VI. DISCUSIN
Uno de los puntos de control ms importante en la regulacin de la expresin de
genes es el inicio de la transcripcin. sta es llevada a cabo por una serie de protenas que
se unen a secuencias especficas del DNA para posicionar a la RNA polimerasa en el sitio
adecuado. Entre las mltiples protenas que se conocen como factores basales de
transcripcin se encuentra el factor TFIID, que es un complejo de aproximadamente 14
subunidades, altamente conservado en la escala evolutiva y uno de los primeros factores
en reconocer y unirse al ncleo de promotores de genes que codifican protenas. La
protena de unin a la caja TATA (que forma parte del factor TFIID) es considerada un
factor central en la transcripcin, ya que a travs de su unin al DNA, recluta a la
maquinaria de transcripcin.
En E. histolytica, se desconocen los mecanismos por los cuales este parsito es
capaz de presentar variabilidad en su capacidad invasiva. Se cree que estos mecanismos
estn regulados transcripcionalmente, por lo que en este trabajo iniciamos el estudio de la
maquinaria basal de transcripcin para dilucidar los mecanismos moleculares que
conllevan a la expresin de genes.
El punto inicial de nuestro estudio fue la clonacin y expresin de la protena
EhTBP para caracterizarla como factor nuclear de unin al DNA. Los ensayos de PCR in
situ sugieren que existe ms de una copia del gen Ehtbp en los trofozotos, localizadas en
diferentes molculas de DNA, una en el ncleo y otra en el organelo EhkO (Fig. 9). En
plantas como Arabidopsis thaliana y Zea mays, se han reportado dos genes que codifican
para TBP y mapean en segmentos distintos de cromosomas separados (Gasch y col.,
1990; Haas y Feix, 1992). Posiblemente en E. histolytica existen dos genes que codifican
para TBP; sin embargo, no podemos descartar la presencia de otros factores relacionados

DISCUSIN 118

a TBP, ya que en otros organismos existen esta clase de factores que son capaces de
reemplazar a TBP en ensayos de transcripcin in vitro (Buratowski, 1997; Hansen, y col.,
1997). Con los ensayos de inmunocitoqumica, en donde se emplearon los anticuerpos
anti-EhTBPr, se confirm la presencia de EhTBP en el ncleo y en estructuras
subcelulares correspondientes al organelo EhkO. Estos resultados, aunados a los ensayos
de PCR in situ, sugieren que este organelo no solo contiene material gentico sino que es
transcripcionalmente activo, es decir, quiz el EhkO contiene la maquinaria de
transcripcin de sus genes. Un primer indicio de esta suposicin es la presencia de
factores de transcripcin como EhC/EBP, homlogo al activador transcripcional C/EBP
(Marchat y col., 2002); Ehp53, homlogo a la protena p53 supresora de tumores y
EhTBP (Luna-Arias y col., 1999), ortloga a TBP en clulas eucariontes y en archaea,
que es un factor de la maquinaria basal de transcripcin. Estos hallazgos junto con el
hecho de que EhkO posee una enzima que participa en el metabolismo anaerobio, como
la piruvato ferredoxina xidorreductasa (EhPFO) (Rodrguez y col., 1998), lo hacen
parecido a las mitocondrias.
Los mtodos para predecir el plegamiento terico de protenas proporcionan
suficiente informacin esencial del arreglo espacial de residuos importantes para el
diseo de experimentos, por lo que la utilizacin de estos mtodos proporcionaron una
herramienta importante no solo en sugerir la estructura tridimensional de la EhTBP, sino
tambin en sugerir sus funciones biolgicas. El dominio C-terminal de EhTBP
filogenticamente conservado, comprende 182 residuos de aminocidos, posee dos
repetidos directos descritos en otras TBPs como los responsables de la unin al DNA,
estos flanquean una regin altamente bsica conocida como dominio bsico por lo que la
estructura tridimensional de EhTBP present un plegamiento muy similar al de otras

DISCUSIN 119

TBPs, lo que sugiere que se trata de una protena de unin a secuencias conocidas como
cajas TATA.
La secuencia TATTTAAA se ha propuesto como sitio consenso para la unin de
EhTBP, ya que se encuentra en la posicin 30 del sitio de inicio de la transcripcin de
aproximadamente 20 genes estudiados en E. histolytica (Bruchhaus, y col., 1993); sin
embargo, no existan reportes de la unin de EhTBP a esta secuencia. En este trabajo
demostramos experimentalmente la presencia de EhTBP en los complejos formados in
vitro, entre extractos nucleares y el oligonucletido TATTTAAA y adems se demostr
la especificidad de esta unin (Fig. 12).
Basados en un estudio cristalogrfico de rayos X de la isoforma dos de TBP de A.
thaliana, Patikoglou y col., (1999) definieron la secuencia TATA como una regin
variable de 8 pb formada por 5-T >> c > a = g/ A >> t/ T >> a = c/ A >> t/ T >> a/ A >>
g > c = t/ A = T > g > c/ G = A > c = t-3, donde cada lnea diagonal separa la posicin de
cada base en la secuencia TATA. Recientemente, Basehoar y col., (2004) identificaron en
S. cerevisiae a la caja TATA como TATA(A/T)A(A/T)(A/G). La isoforma 2 de TBP A.
thaliana reconoce 10 variantes de esta secuencia TATA del promotor tardo de
adenovirus, que en muchos organismos se encuentra localizada entre las posiciones 25 y
40 pb del sitio de inicio de la transcripcin. Sin embargo, algunos promotores de S.
cerevisiae presentan la caja TATA entre 40 y 120 pb (Basehoar y col., 2004).
Ciertos genes de E. histolytica contienen diferentes elementos TATA (Tabla I)
que pudieran ser utilizados por el factor de transcripcin TFIID. El gen Ehtbp presenta la
secuencia TAT_ _ AAA localizada a 109 pb del sitio de inicio de la transcripcin
(Luna-Arias y col., 1999). Recientes resultados tambin indican que la caja TATA del

DISCUSIN 120

promotor del gen EhrabB mapea a 44 pb del sitio de inicio de la transcripcin (Dr.
Mario Alberto Rodrguez, comunicacin personal).
Basndonos en los reportes de posibles cajas TATA en promotores de genes de E.
histolytica y de la afinidad que presentan otras TBP al cambiar bases en las cajas TATA,
estudiamos la afinidad de EhTBP por diferentes cajas TATA presentes en promotores de
genes de E. histolytica y por versiones mutadas de la secuencia TATTTAAA diseadas
por nosotros. Los resultados mostraron que tanto EhTBP en extractos nucleares como la
protena recombinante purificada, forman complejos especficos con todas las variantes
estudiadas, aunque con diferente afinidad, lo que sugiere una especificidad de unin al
DNA ms relajada que la descrita en otros sistemas.
La actividad de unin al DNA de las TBPs de H. sapiens (Strubin, y Struhl, 1992;
Patikoglou, 1999), A. thaliana (Patikoglou, 1999) y S. cerevisiae se ve afectada
severamente cuando se introduce una g en la primera, tercera, cuarta, quinta y sexta
posiciones de oligonucletidos TATA; en cambio EhTBP form complejos con los
oligonucletidos TagTgAAA [2] y TATTggAA [3] empleados en nuestro estudio,
indicando que las g's en estas posiciones disminuyen la afinidad pero no afectan la unin
al DNA de EhTBP y mostrando que, al menos in vitro, EhTBP es ms promiscua que
otras TBPs estudiadas; sin embargo, estudios in vivo son necesarios para determinar si
esto ocurre en los trofozotos.
Posteriormente analizamos tanto la afinidad de EhTBP presente en extractos
nucleres como de la EhTBPr por la secuencia TATTTAAA y por las variantes de sta.
Los valores de KD en extractos nucleares por las diferentes cajas TATA variaron entre
1.75 x 10-12 y 3.25 x 10-11 M, mientras que los de EhTBPr fueron de 6.60 x 10-12 y 1.60 x
10-10 M (Tabla 4). Estos resultados indican que en general, EhTBP en extractos nucleares

DISCUSIN 121

presenta mayor afinidad por las diferentes cajas TATA, debido posiblemente, a la
modulacin que ejercen sobre EhTBP factores presentes en extractos nucleares
correspondientes a factores asociados a TBP o a protenas relacionadas con la activacin
transcripcional. Con la purificacin parcial del factor TFIID, hemos demostrado
experimentalmente la modulacin que ejercen los factores asociados a EhTBP. Sin
embargo, es necesario hacer ensayos de inmunoprecipitacin para descartar esta
modulacin en la actividad de unin de EhTBP al DNA, por otros factores distintos al
complejo TFIID, como se ha demostrado en otros sistemas (Ge y Roeder, 1994; Solow y
col., 1999). B-TFIID es otro complejo que contiene TBP unida a una protena
denominada B-TAF1 de la familia de las ATPasas SNF2 y que participa en la
transcripcin mediada por RNA Pol II, aunque su funcin en la formacin del PIC no est
bien establecida. En ensayos in vitro este factor se capaz de interactuar con el DNA y
mantener niveles basales de transcripcin (Klejman y col., 2005). En E. histolytica an
no se sabe de la existencia de este factor y de otras protenas que pudieran influenciar la
actividad de unin al DNA de EhTBP.
Por otro lado, los valores de KD de EN fueron un orden de magnitud ms grandes
que los valores de la protena recombinante, excepto para el oligonucletido gAgTTAAA
[5], con el que EhTBPr present una KD (6.6 x 10-12 M) similar a la de EN para otras
secuencias. Esto muestra que EhTBPr posee una afinidad muy alta para este
oligonucletido, mientras que en extractos nucleares la afinidad fue 10 veces menor, con
un valor de KD de 1.76 x 10-11 M. En extractos nucleares, la mayor afinidad fue para el
oligonucletido TATgTAAA [4], al cual la isoforma 2 de TBP de A. thaliana no se une
(Patikoglou y col., 1999), mientras que para la EhTBPr los datos experimentales
alcanzaron el valor saturante rpidamente, por lo que el modelo matemtico del clculo

DISCUSIN 122

de KD no es aplicable. Posiblemente la afinidad de EhTBPr para este oligonucletido es

mucho ms alta que para los dems; sin embargo, se tendran que hacer los experimentos
a concentraciones mucho ms pequeas de protena para poder calcular con precisin la
KD antes de que se alcance la saturacin.
Considerando que la mayor afinidad en ambos casos fue para la secuencia
TATgTAAA, con el oligonucletido TATTTAAA [1] se obtuvo una afinidad intermedia
similar a la observada para la secuencia TAT_ _ AAA [6], presente en los promotores de
los genes Ehtbp, Ehtub1, EhrabB y Ehenol (Tabla 1). Estos datos sugieren fuertemente
que adems de la secuencia consenso TATTTAAA, los elementos TATgTAAA y TAT_
_AAA pueden funcionar como cajas TATA para la unin de EhTBP en los promotores
que los contengan.
Las variaciones de nucletidos en la posicin 5 reducen la afinidad de EhTBP
(tanto recombinante como en extractos nucleares) por las variantes con este tipo de
cambios con respecto al oligonucletido TATTTAAA [1], aunque no se inhibe su unin
al DNA, lo cual sugiere que EhTBP es ms promiscua que otras TBP estudiadas. Para el
oligonucletido TAgTgAAA [2], EhTBP present la ms baja afinidad.
Por lo tanto, basndonos en nuestros experimentos in vitro podemos proponer la
caja

TATA

para

los

promotores

de

genes

de

E.

histolytica

como:

5-

(1:T/G)(2:A)(3:T/G)(4:T/G/A)(5:T/G/A)(6:A/G)(7:A)(8:A)-3 (los nmeros indican la

posicin del nucletido en la caja TATA). Sin embargo, ensayos de transcripcin in vitro
son necesarios para establecer la prioridad de cada base en las diferentes posiciones,
adems de que experimentos in vivo demostrarn la funcin de estos elementos TATA en
trofozotos.

DISCUSIN 123

El elemento GAAC, ha sido reportado como una secuencia que juega un papel
importante en el control transcripcional del promotor del gen hgl5 de la subunidad pesada
de la lectina inhibible por galactosa. Posiblemente sea una secuencia a la cual se une el
factor TFIID o la protena que se une a este elemento ayuda a posicionar al TFIID para
formar el PIC e iniciar la transcripcin (Singh y col., 1997). Basndonos en estos
reportes, demostramos la unin de EhTBPr a esta secuencia en ensayos de retardamiento
en donde se form un complejo de migracin electrofretica igual al complejo formado
entre EhTBPr y el oligonucletido TATTTAAA (Fig. 24A). Adems la afinidad de
EhTBPr por esta secuencia fue similar a la observada con las variantes de la caja TATA.
Estos resultados sugieren fuertemente que el elemento GAAC, al menos in vitro es un
posible sitio potencial de unin para el factor TFIID. Cabe sealar que el elemento
GAAC juega un papel importante en el control de la transcripcin del gen hgl5, ya que en
ensayos de transfeccin cuando este elemento es mutado aparecen nuevos sitios de inicio
de la transcripcin, lo que sugiere que facilita el posicionamiento del factor TFIID en el
ncleo del promotor permitiendo una expresin regulada del gen hgl5. Pero se requieren
ensayos que permitan establecer si TFIID se une al elemento GAAC en los trofozotos de
E. histolytica.
En las curvas se observaron cadas despus del punto de saturacin (Fig. 16 y 22),
lo que puede explicarse por la dimerizacin u oligomerizacin (Perez-Howard y col.,
1995) de las molculas de EhTBP a altas concentraciones. Estos multmeros no tienen la
habilidad de unirse al DNA, ya que se asocian a travs de interacciones hidrofbicas
entre los residuos de aminocidos localizados en la superficie cncava de la protena. Sin
embargo, no podemos descartar mltiples eventos de unin de EhTBP al DNA.

DISCUSIN 124

Finalmente, realizamos un alineamiento de EhTBP con las TBPs de H. sapiens, A.

thaliana y S. crevisiae. EhTBP posee 37 residuos de aminocidos reportados como
responsables de la unin a la caja TATA, en las mismas posiciones que las otras TBPs
(Nikolov, y col., 1996; Patikoglou, y col., 1999). De estos residuos, 30 son idnticos (Fig.
30, puntas de flecha blancas). De los 7 residuos restantes, 5 son conservados y 2 son
cambios no conservados (Fig. 30, puntas de flecha negras). Interesantemente, EhTBP
presenta una treonina (T), en la posicin 192, la cual corresponde a una valina (V), en la
posicin 203 de la TBP de levadura, 161 en A. thaliana y 301 en humano (Fig. 30,
flecha). Strubin y Struhl (1992) sustituyeron la valina 203 de la TBP de levadura por una
treonina y la mutante resultante mostr una actividad de unin incrementada por la
secuencia TGTAAA del promotor del gen his3 al que no se una cuando la secuencia era
TATAAA. Por lo tanto, la sola presencia de T192 en EhTBP podra estar modulando su
especificidad de unin a las variantes de la caja TATA. Sin embargo, para confirmar esta
hiptesis de trabajo se requieren experimentos que involucren anlisis mutacionales y
estudios de difraccin de rayos-X .
La promiscuidad en la actividad de unin al DNA, mostrada por EhTBP in vitro
puede haberle conferido a E. histolytica una ventaja evolutiva, ya que ciertas mutaciones
en la caja TATA no afectaran la expresin de sus genes o puede ser un mecanismo de
regulacin del inico de la transcripcin.
Es posible que en E. histolytica el factor TFIID est conformado por menos
factores asociados a TBP, ya que aunque se encontraron algunos homlogos mediante
anlisis in silico, la purificacin parcial de este factor mostr al menos 8 subunidades. En
eucariontes superiores los TAFs forman complejos diferenciales que se expresan de una

DISCUSIN 125

ScTBP
ArathTBP2
HsTBP
EhTBP

36
11
121
34

------------PATTFQSEEDIKRAAPESEKD-TSATSGIVPTLQNIVATVTLGCRLDL
------------PVDLTKHP------------------SGIVPTLQNIVSTVNLDCKLDL
LFHSQTLTTAPLPGTTPLYPSPMTPMTPITPATPASESSGIVPQLQNIVSTVNLGCKLDL
-----------YMSTSTESQER-----S--LNN---P-NDTHPEIVNVVSTFQLGVKLEL
.* *

ScTBP
ArathTBP2
HsTBP
EhTBP

83
41
181
72

KTVALHARNAEYNPKRFAAVIMRIREPKTTALIFASGKMVVTGAKSEDDSKLASRKYARI
KAIALQARNAEYNPKRFAAVIMRIREPKTTALIFASGKMVCTGAKSEHLSKLAARKYARI
KTIALRARNAEYNPKRFAAVIMRIREPRTTALIFSSGKMVCTGAKSEEQSRLAARKYARV
RKIVQKARNAEYNPKRFAGAIMRISSPKSTALIFQTGKIVCTGTRSIEESKIASKKYAKI
*
**** * *
* * * : * * **

ScTBP
ArathTBP2
HsTBP
EhTBP

143
101
241
132

IQKIGFAAKFTDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAFSHGTFSSYEPELFPGLIYRMVKPKI
VQKLGFPAKFKDFKIQNIVGSCDVKFPIRLEGLAYSHSAFSSYEPELFPGLIYRMKLPKI
VQKLGFPAKFLDFKIQNMVGSCDVKFPIRLEGLVLTHQQFSSYEPELFPGLIYRMIKPRI
IKKIGYPIHYSNFNVQNIVGSCDVKFQIALRTLVDSYLAFCQYEPEVFPGLVYRMASPKV
** *
:** : *
:

ScTBP
ArathTBP2
HsTBP
EhTBP

203
161
301
192

VLLIFVSGKIVLTGAKQREEIYQAFEAIYPVLSEFRKM----VLLIFVSGKIVITGAKMREETYTAFENIYPVLREFRKVQQ--VLLIFVSGKVVLTGAKVRAEIYEAFENIYPILKGFRKTT---TLLVFSTGKVVLTGAKDEESLNLAYKNIYPILLANRKEDISNQ
. * * : * * ** *

Figura 30. Alineamiento de los dominios de unin al DNA de EhTBP con otras TBPs.
Secuencias del dominio C-terminal conservado de Saccharomyces cerevisiae (residuos 36203)(ScTBP) (P13393), Arabidopsis thaliana (residuos 11-161) (Arath TBP2) (P28148), Homo
sapiens (residuos 121-301) (hTBP) (P20226) y Entamoeba histolytica (residuous 34192)(EhTBP) (P52653), se alinearon empleando el programa CLUSTAL W. Las cajas negras
indican los aminocidos idnticos y las grises los cambios conservados. Las puntas de flecha
indican los 37 residuos de aminocidos involucrados en la unin al DNA. La flecha indica el
cambio de aminocido en la posicin 192 de EhTBP.

DISCUSIN 126

manera tejido especfica como una forma de regular la expresin de genes, sin embargo,
en E. histolytica, es posible que la regulacin de la expresin de genes se lleve a cabo
mendiante otros mecanismos en los cuales slo se necesita la presencia del factor TFIID.

CONCLUSIONES 127

VII. CONCLUSIONES
1.- Con base en la secuencia de aminocidos, EhTBP adopta una estructura
tridimensional terica de una silla de montar molecular, idntica a la de otras TBPs.

2.- Se localiz intracelularmente el gen Ehtbp en el ncleo y en otro organelo que

contiene DNA, reportado como EhkO, lo que sugiere que existen dos copias del gen en
Entamoeba histolytica.

3.- Los ensayos de microscopa confocal e inmunofluorescencia revelaron que EhTBP

est localizada en el ncleo y en estructuras subcelulares correspondientes al organelo
EhkO.

4.- Se demostr la presencia de EhTBP en extractos nucleares.

5.- EhTBP en extractos nucleares se une especficamente a la secuencia TATTTAAA y a

diferentes secuencias relacionadas con la caja TATA.

6.- La protena recombinante purificada present actividad de unin especfica a la

secuencia TATTTAAA, considerada como caja TATA consenso para promotores de
genes de E. histolytica y a otras variantes de esta.

7.- La afinidad de EhTBP en extractos nucleares por las diferentes cajas TATA, fue 10
veces mayor a la mostrada por la protena recombinante purificada, lo que sugiere la

CONCLUSIONES 128

modulacin en la actividad de unin al DNA, de factores presentes en extractos

nucleares.

8.- La promiscuidad de EhTBP es mayor que la reportada para TBPs de Homo sapiens,
Saccharomyces cerevisiae y Arabidopsis thaliana.

9.- Con base en nuestros experimentos in vitro podemos proponer una caja TATA para
los

promotores

de

genes

de

E.

histolytica

como:

5-

(1:T/G)(2:A)(3:T/G)(4:T/G/A)(5:T/G/A)(6:A/G)(7:A)(8:A)-3

10.- Los ensayos de cromatografa de afinidad permitieron purificar un complejo

multiprotico con actividad de unin al DNA formado por al menos 9 subunidades entre
los 16 y 105 kDa.

11.- La fraccin de KCl 0.4 M parcialmente purificada present actividad de unin a las
diferentes cajas TATA.

12.- EhTBP se une al oligonucletido que contiene el elemento GAACT con una afinidad
similar a la mostrada para las variantes de caja TATA, lo que sugiere que puede ser un
sitio de unin para el complejo TFIID.

PERSPECTIVAS 129

VIII. PERSPECTIVAS
El presente trabajo es una contribucin inicial al estudio de los mecanismos de regulacin de
la expresin de genes en E. histolytica. Aunque estos estudios in vitro dan una primera
aproximacin de lo que ocurre con EhTBP en la maquinaria de transcripcin basal de E. histolytica,
es necesario implementar experimentos tales como ensayos de transfeccin con plsmidos que
contengan las diferentes secuencias TATA clonadas frente a un gen reportero para verificar su
actividad y as determinar si las variantes de la caja TATA funcionan como sitio de unin in vivo
para EhTBP. Por otra parte ensayos de inmunoprecipitacin de la cromatina mostrarn a qu
secuencias se est uniendo EhTBP in vivo al igual que los ensayos de UV-crosslinking in situ.
La generacin de protenas mutantes en algunos de los aminocidos implicados en la unin
al DNA, permitir determinar cuales son los residuos ms importantes que permiten no slo la
unin sino tambin la modifican. El simple cambio del aminocido valina por treonina encontrado
en la posicin 192 de EhTBP, sugiere experimentos que pudieran confirmar si efectivamente este
residuo es importante en la unin al DNA.
Con la fraccin parcialmente purificada de KCl 0.4 M, es necesario hacer ensayos de
retardamiento a diferentes concentraciones de protenas para verificar si efectivamente la
modulacin que ejercen factores presentes en extractos nucleares, en la capacidad de unin al DNA
de EhTBP, es ocasionada por los factores asociados a EhTBP en el complejo TFIID.
Por otro lado, los ensayos de inmunoprecipitacin, empleando el anticuerpo anti-EhTBPr
purificado, permitirn la caracterizacin de las fracciones purificadas en ensayos de transcripcin in
vitro y la secuenciacin de algunos de sus componentes.
Diversos estudios han documentado la existencia de factores relacionados a TBP que pueden
llevar a cabo papeles complementarios en la regulacin transcripcional. En E. histolytica se tienen
evidencias de la existencia de estos factores en anlisis iniciales. Todos estos estudios darn una
visin ms amplia de lo que est ocurriendo in vivo en E. histolytica con respecto a la expresin de
sus genes.

REFERENCIAS 130

IX. REFERENCIAS
Albright, S. R., y Tjian, R. (2000). TAFs revisited: more data reveal new twists and confirm old
ideas. Gene. 242: 1-13.
Apone, L. N., Virbasius, C. A., Holstege, F. C., Wang, J., Young, R. A., Green, M. R. (1998).
Broad, but not universal, transcriptional requirement for yTAFII17, a histone H3-like TAFII
present in TFIID and SAGA. Mol. Cell 2: 653-661.
Atkinson, A. C. (1985). The algebra of deletion. In Plots, Transformations and Regression: an
Introduction to Graphical Methods of Diagnostic Regression Analysis (Copas, J.B., Dawid, A. P.,
Eagleson, G. K., Pierce, D. A., y Silverman, B. W., eds) pp. 13-15. Oxford University Press,
Oxford, UK.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J.G., Smith, J.A. y Struhl, K.
(Eds.) (1994). Curr. Prot. Mol. Biol. Vol.2., Cap. 9 y 12. Current Protocols and John Wiley and
Sons. U.S.A.
Baez-Camargo, M., Gharaibeh, R., Rivern, A. M., Hernndez, F. C., Luna, J. P., Gariglio, P.
Chavez, P. y Orozco, E. (1996). Gene amplification in Entamoeba histolytica. Invasion
Metastasis 16: 269-279.
Bauelos-Barrn, C. (2002). Identificacin y localizacin subcelular de las P-glicoprotenas
(EhPgps) de Entamoeba histolytica. Tesis de Maestra. CINVESTAV-IPN. Mxico, D. F.
Barreda, R. (1999). Epidemiologa de la amibiasis intestinal. Amibiasis. Cuarta reunin de
expertos. Ed. Medicina y mercadotecnia S. A. de C. V. pp. 1-6.
Basehoar, A. D., Zanton, S. A., y Pugh, F. (2004). Identification and distinct regulation of yeast
TATA-box containing genes. Cell 116: 699-700.
Bendesky, A. (2002). El metronidazol incrementa la proliferacin celular y sus metabolitos son
an ms dainos. Gaceta Biomdicas. rgano informativo del Instituto de Investigaciones
Biomdicas de la UNAM. Febrero de 2002. Ao 7, No. 2. Pg. 14.

REFERENCIAS 131

Berk, A.J. (1999). Activation of RNA polymerase II transcription. Curr. Opin. Cell. Biol. 11:
330-335.
Bidder, M., Shao, J. S., Charlton-Kachigian, N., Loewy, A. P. Semenkovich, C. F. y Towler, D.
A. (2002). Osteopontin transcription in aortic vascular smooth muscle cells is controlled by
glucose-regulated upstream stimulatory factor and activator protein-1 activities. J. Biol. Chem.
277: 44485-44496.
Birney, E., Kumar, S. y Krainer, A. R. (1993). Analysis of the RNA-recognition motif and RS
and RGG domains: conservation in metazoan pre-mRNA splicing factors. Nucleic Acids Res. 25:
5803-5816.
Blackwood, E. M. y Kadonaga, J. T. (1998). Going the distance: a current view of enhancer
action. Science 281:61-63.
Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.
Brand, M., Yamamoto, K., Staub, A. y Tora, L. (1999). Identification of TATA-binding proteinfree TAFII-containing complex subunits suggests a role in nucleosome acetylation and signal
transduction. J. Biol. Chem. 274: 18285-18289.
Breathnach, R. y Chambon, P. (1981). Organization and expression of eucaryotic split genes
coding for proteins. Annu. Rev. Biochem. 50: 349-383.
Brownell, J. E. y Allis, C. D. (1996). Special HATs for special occasions: linking histone
acetylation to chromatin assembly and gene activation. Curr. Opinion Gen. Dev. 6: 176-184
Bruchhaus, I., Leippe, M., Lioutas, C., y Tannich, E. (1993). Unusual gene organization in the
protozoan parasite Entamoeba histolytica. DNA Cell. Biol. 10: 925-933.
Bucher, P. (1990). Weight matrix descriptions of four eukaryotic RNA polymerase II promoter
elements derived from 502 unrelated promoter sequences. J. Bol. Mol. 212: 563-578
Bulger, M. y Groudine, M. (1999). Looping versus linking: toward a model for long-distance
gene activation. Genes Dev. 13:2465-2477.
Buratowski, S. (1994). The basics of basal transcription by RNA polymerase II. Cell 77: 1-3.

REFERENCIAS 132

Buratowski, S. (1997). Multiple TATA-binding factors come into style. Cell 91: 13-15.
Burke, T. W. y Kadonaga, J. T. (1996). Drosophila TFIID binds to a conserved downstream
basal promoter element that is present in many TATA-box deficient promoters. Genes Dev. 10:
711-724.
Burley, S. K. y Roeder, R. G. (1996). Biochemistry and Structural Biology of Transcription
Factor IID (TFIID). Annu. Rev. Biochem. 65: 769-799.
Butler, E. F. y Kadonaga, J. T. (2002). The RNA polymerase II core promoter: a key component
in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16:2583-2592.
Buss, H., Lioutas, C., Dobinsky, S., Nickel, R., Tannich, E. (1995). Analysis of the 170-kDa
lectin gene promoter of Entamoeba histolytica. Mol. Biochem. Parasitol. 72: 1-10.
Butler, J. E. y Kadonaga, J. T. (2002). The RNA polymerase II core promoter: a key component
in the regulation of gene expression. Genes Dev. 16: 2583-2592.
Caballero-Salcedo, A., Viveros-Rogel, M. Salvatierra, B., Tapia-Conyer, R., Seplveda Amor, J.,
Gutirrez, G. Y. y Ortz-Ortz, L. (1994). Seroepidemiology of amebiasis in Mxico. Am. J. Trop.
Med. Hyg. 50: 412-419.
Campbell, K. M., Ranallo, R. T., Stargell, L. A. y Lumb, K. J. (2000) Reevaluation of
Transcriptional Regulation by TATA-Binding Protein Oligomerization: Predominance of
Monomers. Biochem. 39: 2633-2638.
Cavallini, B., Faus, I., Matthes, H., Chipoulet, J. M., Winsor, B., Egly, J. M. y Chambon, P.
(1989). Cloning of the gene encoding the yeast protein BTF1Y, which can substitute for the
human TATA box-binding factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 9803-9807.
Chalkley, G. E. y Verrijzer, C. P. (1999). DNA binding site selection by RNA polymerase II
TAFs: a TAF(II)250-TAF(II)150 complex recognizes the initiator. EMBO J. 18: 4835-4845
Chiang, C. M. y Roeder, R. G. (1995). Cloning of an Intrinsic Human TFIID Subunit That
Interacts with Multiple Transcriptional Activators, Science 267: 531-535.

REFERENCIAS 133

Coleman, R. A., y Pugh, B. F. (1995). Evidence for Functional Binding and Stable Sliding of the
TATA Binding Protein on Nonspecific DNA. J. Biol. Chem. 270, 23: 13850-13859.
Comai, L., Tanese, N. y Tjian, R.,(1992), The TATA-Binding Protein and Associated Factors Are
Integral Components of the RNA Polymerase I Transcription Factor, SL1. Cell. 68: 965-976.
Conaway, R. C. y Conaway, J. W. (1993). General initiation factors for RNA polymerase II.
Ann. Rev. Biochem. 62:161-190.
Conde-Bonfil, M. C. y de la Mora, C. (1992). Entamoeba histolytica: a standing threat. Salud
Pblica, Mxico. 34: 335-341.
Corliss, J. O. (1987). Protistan phylogeny and eukaryogenesis. Int. Rev. Cytol. 100: 319-370.
Despommier, D. F. and Karapelou, J. W. (1987). Parasitic life cycles. Springer Verlag. New
York, E.U.A. p. 22-23.
Dantonel, J. C., Wurtz, J. M. Poch, O., Moras, D., y Tora, L. (1999). The TBP-like factor: an
alternarive transcription factor in metazoa? Trends Biochem. Sci. 24: 335/339.
De Menezes Feitosa, L., Salgado, L. M., Rodrguez, M. A., Vargas, M. A. y Orozco, E. (1997).
Phenotype variability and genetic polymorphism in Entamoeba histolytica clonal populations.
Arch Med Res. 28: 27-29.
Despommier, D. F. Y Karapelou, J. W. (1987). Parasitic life cycles. Springer Verlag. New York,
E. U. A. p. 22-23.
Diamond, L. S., Harlow, R. y Cunnick, C. (1978). A new medium for the axenic cultivation of
Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72: 431-432.
Dignam, J.D., Lebovitz, R.M. y Roeder, R.G. (1983). Accurate Transcription Initiation by RNA
Polymerase II in a Soluble Extract from Isolated Mammalian Nuclei. Nucl. Acid.Res. 11: 14751489.

REFERENCIAS 134

Dikstein, R., Ruppert, S. y Tjian, R., (1996). TAFII250 Is a Bipartite Protein Kinase That
Phosphorylates the Basal Transcription Factor RAP74. Cell 84: 781-790.
Drapkin, R. y Reinberg, D. (1994). The multifunctional TFIIH complex and transcriptional
control. TIBS. Special Issue 19:504-508.
Dynlacht, B.D., Hoey, T. y Tjian, R. (1991). Isolation of coactivators associated with the TATAbinding protein that mediate transcriptional activation. Cell 63: 563-576.
Eisenmann, D. M., Dollard, C. y Winston, F. (1989). SPT15, the gene encoding the yeast TATA
binding factor TFIID, is required for normal transcription initiation in vivo. Cell 58: 1183-1191.
Evans, R., Fairley, J. A. y Roberts, S. G. (2001). Activator-mediated disruption of sequencespecific DNA contacts by the general transcription factor TFIIB. Genes Dev. 15: 2945-2949.
Freiman, R. N., Albright, S. R., Chu, L. E., Zheng, S., Liang, H. E., Sha, W. C. y Tjian, R.
(2002). Redundant role of tissue-selective TAF(II)105 in B lymphocytes. Mol. Cell. Biol. 22:
6564-6572.
Gangopadhyay, S. S., Ray, S. S., Sinha, P., Lohia, A. (1997). Unusual genome organisation in
Entamoeba histolytica leads to two overlapping transcripts. Mol. Biochem. Parasitol. 89: 73-83.
Gasch, A., Hoffmann, A., Horikoshi, M., Roeder, R. G. y Chua, N. H. (1990). Arabidopsis
thaliana contains two genes for TFIID. Nature 346: 390-394.
Ge, H., y Roeder, R. G. (1994). The high mobility group protein HMG1 can reversibly inhibit
class II gene transcription by interaction with the TATA-binding protein. J. Biol.. Chem.269:
17136-17140.
Ghosh, S., Field, J., Rogers, R., Hickman, M. y Samuelson, J. (2000). The Entamoeba histolytica
mitochondrion-derived organelle (crypton) contains double-stranded DNA and appears to be
bound by a double membrane. Infect Immun 68: 4319-4322.
Gilchrist, C. A., Mann, B. J. y Petri, W. A. Jr. (1998). Control of ferredoxin and Gal/GalNAc
lectin gene expression in Entamoeba his-tolytica by a cis-acting serum-responsive element.
Infect. Immun. 66: 23832386.

REFERENCIAS 135

Gilchrist, C. A., Holm, C. F., Hughes, M. A., Schaenman, J., Mann, B. J. y Petri, W. A., Jr.
(2001). Identification and characterization of an Entamoeba histolytica URE3 sequence-specific
DNA binding protein containing EF-hand motifs. J. Biol. Chem. 276: 1183811841.
Gilchrist, C. A., Leo, M., Line, C. G., Mann, B. J. y Petri, W. A. Jr. (2003). Calcium modulates
promoter occupancy by the Entamoeba histolytica Ca2+-binding transcription factor URE3-BP.
J. Biol. Chem. 278: 4646-4653.
Gmez, C., Prez, D. G., Lpez-Bayghen, E. y Orozco, E. (1998). Transcriptional analysis of the
EhPgp1 Promoter of Entamoeba histolytica Multidrug-resistant Mutant. J. Biol. Chem. 273:
7277-7284.
Goodrich, J.A., Hoey, T., Thut, C. J., Admon, A. y Tjian, R. (1993). Drosophila TAFII 40
Interacts with Both a VP16 Activation Domain and the Basal Transcription Factor TFIIB. Cell
75: 519-530.
Goodrich, J. A., Cutter, G., y Tjian, R. (1996). Contacts in context: promoter specificity and
macromolecular interactions in transcription. Cell 84: 825-830.
Goodrich, J.A. y Tjian R. (1994). TBP-TAF complexes: selectivity factors for eukaryotic
transcription. Curr. Opin. Cell. Biol. 6: 403-409.
Goodrich, J. A., Cutter, G. y Tjian, R. (1996). Contacts in context: promoter specificity and
macromolecular interactions in transcription. Cell 84: 825-830.
Greenblatt, J. (1997). RNA polymerase II holoenzyme and transcriptional regulation. Curr. Opin.
Cell. Biol. 9: 310-319.
Guo, Z. y Stiller, J.W. (2005). Comparative Genomics and Evolution of Proteins Associated with
RNA Polymerase II C-Terminal Domain. Mol. Biol. Evol. 0: 2152.
Haass, M. M., y Feix, G. (1992). Two different cDNAs encoding TFIID proteins of maize. Fed.
Eur. Biochem. Soc. 3: 294-298.

Hahn, S., Buratowski, S., Sharp, P. A. y Guarente, L. (1989). Isolation of the gene encoding the
yeast TATA binding protein TFIID: a gene identical to the SPT15 suppressor of Ty element
insertions. Cell 58: 1173-1181.

REFERENCIAS 136

Hahn, S., Buratowski, S., Sharp, P. A. y Guarente, L. (1989). Yeast TATA-binding protein TFIID
binds to TATA elements with both consensus and nonconsensus DNA sequences. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 86: 5718-5722.
Hahn, S. (1998). The role of TAFs in RNA polymerase II transcription. Cell 95: 579-582.
Hanahan, D. (1983). Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J Mol. Biol.
166: 557-580.
Hansen, S. K., Takada, S., Jacobson, R. H., Lis, J. T. y Tjian, R. (1997). Transcription properties
of a cell type-specific TATA-binding protein, TRF. Cell 91: 71-83.
Hernandez, N. (1993).TBP, a universal eukaryotic transcription factor? Gen. Dev. 7: 1291-1308.
Hernndez, R., Luna-Arias, J. P. y Orozco, E. (1997). Comparison of the Entamoeba histolytica
TATA-binding protein (TBP) structure with other TBP. Arch. Med. Res. 28: S43-S45.
Heukeshoven, J. Y Dernick, R. (1988). Improved silver staining procedure for fast staining in
PhastSystem development unit I. Staining of Sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 9: 2832.

Hiller, M. A., Lin, T. Y., Wood, C. y Fuller, M. T. (2001). Developmental regulation of

transcription by a tissue-specific TAF homolog. Genes Dev. 15: 1021-1030.
Hoey, T., Dynlacht, B. D., Peterson, M. G., Pugh, B. F. y Tjian, R. (1990). Isolation and
characterization of the Drosophila gene encoding the TATA Box Binding Protein, TFIID. Cell
61: 1179-1186.
Hoey, T., Weinzierl, R. O. J., Gill, G., Chen, J. L., Dynlacht, B. D. y Tjian, R. (1993). Molecular
Cloning and Functional Analysis of Drosophila TAF 110 Reveal Properties Expected of
Coactivators. Cell 72:247-260.
Hoffmann, A., Sinn, E., Yamamoto, T., Wang, J., Roy, A., Horikoshi, M. y Roeder, R. G. (1990).
Highly conserved core domain and unique N terminus with presumptive regulatory motifs in a
human TATA factor (TFIID). Nature 346: 387-390.

REFERENCIAS 137

Hoffmann, A., Chiang, C. M., Oelgeschlager, T., Xie, X., Burley, S. K., Nakatani, Y. y Roeder,
R. G. (1996). A histone octamer-like structure within TFIID. Nature 380: 356-359.
Holstege, F. C. P., Jennings, E. G., Wyrick, J. J., Lee, T. I., Hengartner, C. J., Green, M. R.,
Golub, T.R., Lander, E. S., Young, R. A. (1998). Dissecting the regulatory circuitry of a
eukaryotic genome. Cell 95: 717-728.
Horikoshi, M., Wang, C. K., Fujii, H., Cromlish, J. A., Weil, P. A. y Roeder, R. G. (1989).
Cloning and structure of a yeast gene encoding a general transcription initiation factor TFIID that
binds to the TATA box. Nature 341: 299-303.
Hrdy, I. y Muller, M. (1995). Primary structure and eubacterial relationships of the piruvate
ferredoxin oxidoreductase of the amitochondriate eukariote Trichomonas vaginalis. J. Mol. Evol.
41: 388-396.
Jackson, T.F.H.G. (2000) Epidemiology. In: Ravdin, J.I. (Ed.), Amebiasis. Imperial College
Press, London, pp. 47-63.
Johnson, S. A. S., Dubeau, L., Kawalek, M., Dervan, A., Schntal, A., Dang, C. V. y Johnson, D.
L. (2003). Increased Expression of TATA-Binding Protein, the Central Transcription factor, Can
Contribute to Oncogenesis. Mol. Cell. Biol. 23: 3043-3051.
Kadonaga, J.T. y Tjian, R. (1986). Affinity purification of sequence-specific DNA binding
proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 5889-5893.
Kao, C. C., Lieberman, P. M., Schmidt, M. C., Zhou, Q., Pei, R. y Berk, A. J. (1990). Cloning of
a transcriptionally active human TATA binding factor. Science 248: 1646-1650.
Kaufmann, J., Ahrens, K., Koop, R., Smale, S. T. Y Muller, R. (1998). CIF150, a human cofactor
for transcription factor IID-dependent initiator function. Mol. Cell. Biol. 1: 233-239.
Kenan, D. J., Query, C. C. y Keene, J. D. (1991). RNA recognition: towards identifying
determinants of specificity. Trens Biochem Sci. 6: 214-220.

REFERENCIAS 138

Klejman, M. P., Zhao, X., Van Schaik, F. M. A., Herr, W. Y Timmers, H. Th. M. (2005).
Mutational analysis of BTAF1-TBP intaraction: BTAF1 can rescue DNA-binding defective TBP
mutants. Nucl. Acid.Res. 33: 5426-5436.
Knigth, R., Skolimowski, I. M. y Edwards, D. I. (1978). The interaction of reduced metronidazole
with DNA. Biochem. Pharmacol. 27: 2089-2093.
Kollmar, R. y Farnham, P. J. (1993). Site-specific initiation of transcription by RNA polymerase
II. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 203: 127-139.
Kokubo, T., Gong, D. W., Yamashita, S., Horikoshi, M., Roeder, R. G. y Nakatani, Y. (1993).
Drosophila 230-kD TFIID subunit, a functional homolog of the human cell cycle gene product,
negatively regulates DNA binding of the TATA box-binding subunit of TFIID. Genes Dev. 7:
1033-1046.
Komarnitsky, P. B., Michel, B., Buratowski, S. (1999). TFIID-specific yeast TAF40 is essential
for the majority of RNA polymerase II-mediated transcription in vivo. Genes Dev. 13: 24842489.
Kutach, A. K. y Kadonaga, J. T. (2000). The downstream promoter element DPE appears to be as
widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Mol. Cell. Biol. 20: 4754-4764.
Lagrange, T., Kapanidis, A. N., Tang, H., Reinberg, D. y Ebright, R. H. (1998). New core
promoter element in RNA polymerase II-dependent transcription: sequence-specific DNA
binding by transcription factor IIB. Genes Dev. 12: 34-44.
LaRusso, N. F., Tomas, M. y Lipman, R. (1977). Interaction of metronidazole with nucleic acids
in vitro. Mol. Pharmacol. 13: 872-882.

Lee, T. I. y Young, R. A. (1998). Regulation of gene expression by TBP-associated proteins.

Genes Dev. 12: 1398-1408.
Lee, T. I. y Young, R. A. (2000). Transcription of eukaryotic protein-coding genes. Annu. Rev.
Genet. 34: 77-137.

REFERENCIAS 139

Lee, M. y Struhl, K. (2002). Multiple functions of noncoserved N-terminal domain of yeast

TATA-binding protein. Genetics 158: 87-93.
Levine, N. D., Corliss, J. O., Cox, F. E., Deroux, G., Grain, J., Honigberg, B. M., Leedale, G. F.,
Loeblich, A. R., 3rd, Lom, J., Lynn, D., Merinfeld, E. G., Page, F. C., Poljansky, G., Sprague, V.,
Vavra, J. y Wallace, F. G. (1980). A newly revised classification of the protozoa. J. Protozool.
27: 37-58.

Levine, M. y Tjian, R. (2003). Transcription regulation and animal diversity. Nature. 424:147151.
Leyva-Leyva, M., Gariglio, P., Rangel, L.M., Valds, J., Ayala, P. y Orozco, E. (1993),
Expression of sequences related to c-Myc in Entamoeba Parasitol. Res. 79: 153-159.

Li, E., Kunz-Jenkins, C., Stanley, S. L. Jr. (1992). Isolation and characterization of genomic
clones encoding a serine-rich Entamoeba histolytica protein. Mol. Biochem. Parasitol. 50: 355358.
Lioutas, C. y Tannich, E. (1995).Transcription of protein-coding genes in Entamoeba histolytica
is insensitive to high concentrations of alpha-amanitin. Mol. Biochem. Parasitol. 73: 259-261.
Lpez-Camarillo, C., Luna-Arias, J. P., Marchat, L. A. y Orozco, E. (2003). EhPgp5 mRNA
stability is a regulatory event in the Entamoeba histolytica MDR phenotype. J. Biol. Chem.
278:11273-11280.
Lopez-Canovas, L., Biscay, R., Noa, M. D., Perez-Perez, G., Herrera, J. A., Orozco, E., y
Riveron, A. M., (1998). Comparison of DNA migration in two CHEF chambers of different sizes.
J. Chromat. 806: 187-197.
Luna-Arias, J. P., Hernandez-Rivas, R., de Dios-Bravo, G., Garca, J., Mendoza, L. y Orozco, E.
(1999). The TATA-box binding protein of Entamoeba histolytica: cloning of the gene and
location of the protein by immunofluorescence and confocal microscopy Microbiol. 145: 33-40.
Mai, Z., Gosh, S., Frisardi, M., Rosenthal, B., Rogers, R. y Samuelson, J. (1999). Hsp60 is
targeted to a cryptic mitochondrion-derived organelle in the microaerophilic protozoan parasite
Entamoeba histolytica. Mol. Cell. Biol. 19: 2198-2205.

REFERENCIAS 140

Marchat, L. A., Gmez, C., Prez, D. G., Paz, F., Mendoza, L. y Orozco, E. (2002) Two
CCAAT/enhancer binding protein sites are cis-activator elements of the Entamoeba histolytica
EhPgp1 (mdr-like) gene expression. Cell. Microbiol. 4: 725-737.
Marchat, L. A., Pezet-Valdz, M., Lpez-Camarillo, C. y Orozco, E. (2003). Entamoeba
histolytica: expression and DNA binding of CCAAT/enhancer-binding proteins are regulated
through the cell cycle. Exp. Parasitol. 103: 82-87.
Martnez-Palomo, A. (1989) Amibiasis. Editorial Mdica Panamericana. Mxico. P. 206.

Margulis, L., Corliss, J.O., Melkonian, M. y Chapman, D. (1990). Handbook of Protoctista. The
structure, cultivation, habitats and life histories of eukariotic microorganisms and their
descendants exclusive of animals, plants and fungi. Jones and Bartlett Publishers, Boston, U.S.A.
p. 11.
Marvin, R. P. y White, R. J. (2000). Transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic Acids
Res. 28: 1283-1298.

Mendoza, L., Orozco, E., Rodrguez, M. A., Garca-Rivera, G., Snchez, T., Garca, E. y
Gariglio, P. (2003). Ehp53, an Entamoeba histolytica protein, ancestor of the mammalian tumour
suppressor p53. Microbiol. 149: 885-893.
Mizzen, C. A., Yang, X. J., Kokubo, T., Brownell, J. E., Bannister, A. J., Owen-Hughes, T.,
Workman, J., Wang, L., Berger, S. L., Kouzarides, T., Nakatani, Y., Allis, C. D. (1996). The
TAF(II)250 subunit of TFIID has histone acetyltransferase activity. Cell 87: 1261-1270.
Mizzen, C. A. y Allis, C. D. (2000). New Insights into an old Modification. Science 289 : 22902291.

Moqtaderi, Z., Bai, Y., Poon, D., Weil, P. A., Struhl, K. (1996). TBP-associated factors are not
generally required for transcriptional activation in yeast. Nature 383: 188-191.
Moqtaderi, Z., Keaveney, M. y Struhl, K. (1998). The histone H3-like TAF is broadly required
for transcription in yeast. Mol Cell. 2: 675-682.

REFERENCIAS 141

Myer, V.E. y Young, R.A. (1998). RNA polymerase II holoenzymes and subcomplexes. J. Biol.
Chem. 273: 27757-27760.

Nickel, R., y Tannich, E. (1994). Transfection and transient expression of chloramfenicol

acetyltransferase gene in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Proc. Natl. Acad. Sci.
91:7095-7098.

Nikolov, D. B. y Burley, S. K. (1994). 2.1 A resolution refined structure of a TATA box-binding

protein (TBP). Nat. Struct. Biol. 1: 621-637.

Nikolov, D. B., Chen, H., Halay, E. D., Usheva, A. A., Hisatake, K., Lee, D. K., Roeder, R. G. y
Burley, S. K. (1995). Crystal structure of a TFIIB-TBP-TATA-element ternary complex. Nature
377: 119-128.

Nikolov, D. B., Chen, H., Halay, E. D., Hoffmann, A., Roeder, R. G. y Burley, S. K. (1996).
Crystal structure of human TATA box-binding protein/TATA element complex. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 93 : 4862-4867.
Norris, S. M. y Ravdin, J. I. (1990). The phamacology of antiamebic drugs. In Amebiasis: human
infection by Entamoeba histolytica. Ravdin, J. I. (Ed). John Wiley & Sons. 734-740.

Ohler, U., Liao, G. C, Niemann, H. y Rubin, G. M. (2002). Computational analysis of core

promoters in the Drosophila genome. Genome Biol. 3: RESEARCH0087.
Orozco-Sols, D. R., (2003). Identificacin, Aislamiento y caracterizacin del gen que codifica
para un factor de transcripcin perteneciente a la familia C/EBP en Entamoeba histolytica. Tesis
de Maestra. ENMyH IPN, Mxico.
Orozco, E., Prez, G., Gmez, M. C. y Ayala, P. (1995). Multidrug resstanse in Entamoeba
histolytica. Parasitol. Today 11: 473-475.
Orozco, E. Suarez, M. E. y Sanchez, T. (1985). Differences in adhesion, phagocytosis and
virulence of clones from Entamoeba histolytica, strain HM1:IMSS. Int. J Parasitol. 15: 655-660.

REFERENCIAS 142

Orozco, E., Gharaibeh, R., Riveron, A. M., Delgadillo, D. M., Mercado, M., Sanchez, T., GomezConde, E., Vargas, M. A. y Lpez-Revilla, R. (1997). A novel cytoplasmic structure containing
DNA networks in Entamoeba histolytica trophozoites. Mol. Gen. Genet. 254: 250-257.
Orphanides, G. y Reinberg, D. (2002) A unified Theory of Gene Expresin. Cell. 108: 439-451.

O'shea-Greenfield, A. y Smale, S. T. (1992). Roles of TATA and initiator elements in

determining the start site location and direction of RNA polymerase II transcription. J. Biol.
Chem. 267: 1391-1402.
Padilla-Vaca, F., Ankri, S., Bracha, R., Koole, L. A. y Mirelman, D. (1999). Down regulation of
Entamoeba histolytica virulence by monoxenic cultivation with Escherichia coli 055 is related to
decrease in expression of the light (35-kilodalton) subunit of the Gal/GalNAc lectin. Infect
Immun. 67: 2096-2102.
Palmer, J. R. y Daniels, C. J. (1995). In vivo definition of an archaeal promoter. J. Bacteriol. 177:
1844-1849.
Patikoglou, G. A., Kim, J. L., Sun, L., Yang, S. H., Kodadek, T. y Burley, S. K. (1999). TATA
element recognition by the TATA box-binding protein has been conserved throughout evolution.
Genes Dev. 13: 3217-3230.
Prez, D. G., Gmez, C., Lpez-Bayghen, E., Tannich, E. y Orozco, E. (1998). Transcriptional
analysis of the EhPgp5 Promoter of Entamoeba histolytica Multidrug-resistant Mutant. J. Biol.
Chem. 273: 7277-7284.
Prez, E., Muoz, M.L. y Ortega, A.(1996). Entamoeba histolytica: involvement of pp125FAK in
collagen-induced signal transduction. Exp. Parasitol. 82: 164-170.
Perez-Howard, G. M., Weil, P. A. y Beechem, J. M. (1995). Yeast TATA binding protein
interaction with DNA: fluorescence determination of oligomeric state, equilibrium binding, onrate, and dissociations kinetics. Biochem. 34: 8005-8017.
Petri, W. A. Jr, Haque, R. y Mann, B. J. (2002). The bittersweet interface of parasite and host:
lectin-carbohydrate interactions during human invasion by the parasite Entamoeba histolytica.
Annu. Rev. Microbiol. 56: 39-64.

REFERENCIAS 143

Pham, A. D. y Sauer, F. (2000). Ubiquitin-activating/conjugating activity of TAFII250, a

mediator of activation of gene expression in Drosophila. Science 289: 2357-60.
Poon, D. y Weil, P.A. (1993), Immunnopurification of Yeast TATA-binding Protein and
Associated Factors, J. Biol. Chem. 268: 15325-15328.
Pugh, B. F. y Tjian, R. (1991). Transcription from a TATA-less promoter requires a multisubunit
TFIID complex Genes Develop. 5: 1935-1945.
Purdy, J. E., Pho, L. T., Mann, B. J. y Petri, W. A. Jr. (1996). Upstream regulatory elements
controlling expression of the Entamoeba histolytica lectin. Mol. Biochem. Parasitol. 78: 91-103.
Quon, D. V. K., Delgadillo, M. G., Khachi, A., Smale, S. T. y Johnson, P. J. (1994). Similarity
between a ubiquitous promoter element in an ancient eukaryote and

mammalian initiator

elements. Proc. Natl. Aca. Sci. USA. 91: 4579-4583.

Qureshi, S. A. y Jackson, S. P. (1998). Sequence-specific DNA binding by the S. shibatae TFIIB
homolog, TFB, and its effect on promoter strength. Mol. Cell. 1: 389-400.
Rabenstein, M. D., Zhou, S., Lis, J. T. y Tjian, R. (1999). TATA box-binding protein (TBP)related factor 2 (TRF2), a third member of the TBP family. Proc Natl Acad Sci USA. 96: 47914796.
Reese, J. C., Apone, L., Walker, S. S., Griffin, L. A. y Green, M. R. (1994). Yeast TAFIIS in a
multisubunit complex required for activated transcription. Nature 371: 523-527.
Reese, J. C. (2003). Basal transcription factors. Curr. Opin. Genetics Dev. 13: 114-118.
Reiter, W. D., Hudepohl, U. y Zillig, W. (1990). Mutational analysis of an archaebacterial
promoter: essential role of a TATA box for transcription efficiency and start-site selection in
vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9509-9513.
Rigby, P.W. J. (1993). Three in one and one in three: it all depends on TBP. Cell 72: 7-10.
Rodrguez, M. A., Hidalgo, M. E., Snchez, T., y Orozco, E. (1996). Cloning and characterization
of the Entamoeba histolytica pyruvate: ferredoxin oxidoreductase gene. Mol. Biochem. Parasitol.
78: 273-277.

REFERENCIAS 144

Rodrguez, M. A., Garca-Prez, R. M. , Mendoza, L., Snchez, T., Guilln, N. y Orozco, E.

(1998). The pyruvate: ferredoxin oxidoreductase enzyme is located in the plasma membrane and
in a cytoplasmic structure in Entamoeba. Microb. Pathog. 25: 1-10.
Rodrguez, M. A., Garca-Perez, R. M., Garca-Rivera, G., Lopez-Reyes, I., Mendoza, L., OrtizNavarrete, E. y Orozco, E. (2000). An Entamoeba histolytica rab-like encoding gene and protein:
function and cellular location. Mol. Biochem. Parasitol. 108: 199-206.

Ruppert, S., Wang, E. H. y Tjian, R. (1993). Cloning and expression of human TAFII250: a TBPassociated factor implicated in cell-cycle regulation. Nature 362: 175-179.
Rowlands, T., Baumann, P. y Jackson, S.P. (1994). The TATA-binding protein: a general
transcription factor in eukaryotes and archaebacteria. Science 264: 1326-1329.
Sambrook, J. y Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning. A Laboratory Manual Vol. 1 Cold
Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York.
Sanchez, M. A., Peattie, D. A., Wirth, D. y Orozco, E. (1994). Cloning, genomic organization and
transcription of the Entamoeba histolytica alpha-tubulin-encoding gene. Gene 146: 239-244.
Sanders, S. L., Klebanow, E. R., y Weil, P. A. (1999). TAF25p, a non-histone-like subunit of
TFIID and SAGA complexes, is essential for total mRNA gene transcription in vivo. J. Biol.
Chem. 274: 18847-18850.
Sauer, F. y Tjian, R. (1997). Mechanisms of transcriptional activation: differences and similarities
between yeast, Drosophila and man. Curr. Opin. Genetics Develop. 7: 176-181.
Schaenman, J. M., Gilchrist, C. A., Mann, B. J. y Petri, W. A. Jr. (2001). Identification of two
Entamoeba histolytica sequence-specific hgl5 enhancer-binding proteins with homology to the
RNA-binding motif RRM. J. Biol. Chem. 276: 16021609.
Schreiber, E., et al (1989). Rapid detection of octamer binding proteins with mini extracts,
prepared from a small number of cells. Nucl. Acid. Res.17: 6419.

REFERENCIAS 145

Schuster, F. L. (1990). Phylum Rhizopoda. En: Handbook of Protoctista. The structure,

cultivation, habitats and life stories of eukaryotic microorganisms and their descendants exclusive
of animals, plants and fungi. Margulis, L., Corliss, J. O., Melkonian, M, y D. Chapman (eds)
Jones & Bartlett Publishers, Inc. Boston, U.S.A. p. 3-18.
Sentenac, A. (l985). Eukaryotic RNA polymerases. Crit. Rev. Biochem. 18 : 31-91.
Sekiguchi, T., Nishimoto, T. y Hunter, T. (1999). Overexpression of D-type cyclins, E2F-1, SV40
large T antigen and HPV16 E7 rescue cell cycle arrest of tsBN462 cells caused by the
CCG1/TAF(II)250 mutation. Oncogene 18: 1797-806.
Shao, Z., Ruppert, S. y Robbins, P. D. (1995) The Retinoblastoma-susceptibility gene product
binds directly to the human TATA-binding protein-associated factor TAFII 250. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 92: 3115-3119.
Sharp, P.A. (l992).TATA-binding protein is a classless factor. Cell 68: 819-821.
Shatkin, A.J. y Manley, J.L. (2000) The ends of the affair: capping and polyadenylation. Nat.
Struct. Biol. 7: 838-842.
Shilatifard, A., Conaway, J. W. y Conaway, R. C. (1997). Mechanism and regulation of
transcriptional elongation and termination by RNA polymerase II. Curr. Opin.Genetics Develop.
7: 199-204.

Singer, V. L., Wobbe, C. R. y Struhl, K. (1990). A wide variety of DNA sequences can
functionally replace a yeast TATA element for transcriptional activation. Genes Dev. 4: 636-645.
Singh, U., Rogers, J. B., Mann, B. J., y Petri, W. A. Jr. (1997). Transcription initiation is
controlled by three core promoter elements in the hgl5 gene of the protozoan parasite Entamoeba
histolytica. Proc. Natl.Acad. Sci. USA 94: 8812-8817.
Singh, U., y Rogers, J. (1998). The novel core promoter element GAAC in the hgl5 gene of
Entamoeba histolytica is able to direct a transcription start site independent of TATA or initiator
regions. J. Biol. Chem. 273: 21663-21668.

REFERENCIAS 146

Singh, U., Gilchrist, C. A., Schaenman, J. M., Rogers, J. B., Hockensmith, J. W., Mann, B. J. y
Petri, W. A., Jr. (2002). Context-dependent roles of the Entamoeba histolytica core promoter
element GAAC in transcriptional activation and protein complex assembly. Mol. Biochem. Parasitol. 120: 107-116.
Smale, S. T. (1994). Core promoter architecture for eukaryotic protein-encoding genes. In
Transcription: Mechanisms and regulation. Conaway R. C. and Conaway J. W. (eds). Raven
Press Ltd, New York. Pp 63-81.
Smale, S. T., Jain, A., Kaufmann, J., Emami, K. H., Lo, K., Garraway, I. P. (1998). The initiator
element: a paradigm for core promoter heterogeneity within metazoan protein-coding genes. Cold
Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 63: 21-31.

Smale, S. T. (2001). Core promoters: Active contributors to combinatorial gene regulation. Genes
Dev. 15:2503-2508.
Smale, S. T. y Kadonaga, J. T. (2003). The RNA polymerase II core promoter. Annu. Rev.
Biochem. 72: 449-479.
Solow, S. P., Lezina, L., y Lieberman, P. M. (1999). Phosphorylation of TFIIA stimulates TATA
binding protein-TATA interaction and contributes to maximal transcription and viability in yeast.
Mol. Cell. Biol. 19 :2846-2852.
Strubin, M. y Struhl, K. (1992) Yeas and human TFIID with altered DNA-binding specificity for
TATA elements. Cell 68: 721-730
Struhl, K. (1994), Duality of TBP, the Universal Transcription Factor. Science 263: 1103-1104.
Struhl, K. (1998). Histone acetylation and transcriptional regulatory mechanisms. Genes Dev. 12:
599-606.

Suzuki, Y., Tsunoda, T., Sese, J., et al. (2001). Identification and characterization of the
potential promoter regions of 1031 kinds of human genes. Genome Res. 11: 677-684.
Svejstrup, J. Q., Vichi, P. y Egly, J. M. (1996). The multiple roles of transcription/repair factor
TFIIH. TIBS. Special Issue 21: 346-350.

REFERENCIAS 147

Takada, R., Nakatani, Y., Hoffmann, A., Kokubo, T., Hasegawa, S., Roeder, R. G. y Horikoshi,
M. (1992). Identification of human TFIID components and direct interaction between a 250-kDa
polypeptide and the TATA box-binding protein (TFIID tau). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
11809-11813.
Takada, S. et al. (2000) A TRF1:BRF complex directs Drosophila RNA polymerase III
transcription. Cell 101: 459-469.
Tannich, E. y Horstmann, R. D. (1992). Codon usage in pathogenic Entamoeba histolytica. J.
Mol. Evol. 34: 272-273.
Tora, L. (2002). A unified nomenclature for TATA box binding protein (TBP)-associated factors
(TAFs) involved in RNA polymerase II transcription. Genes Dev. 16: 673-675.
Triezenberg, S. J. (1995). Structure and function of transcriptional activation domains. Curr.
Opin. Genetics Develop. 5: 190-196.
Verrijzer, C. P., and Tjian, R. (1996). TAFs mediate transcriptional activation and promoter
selectivity. Trends Biochem. Sci. 9: 338-342.
Walker, S. S., Reese, J. C., Apone. L. M., Green, M. R. (1996). Transcription activation in cells
lacking TAFIIS. Nature 383: 185-188.
Walsh, J.A., (1988).Prevalence of Entamoeba histolytica infection. En: Amebiasis: human
infection by Entamoeba hitolytica. Ravdin, J.I. de John Wiley and Sons USA 93-105.
Wampler, S.L., Tyree, C. M. y Kadonaga, J. T. (1990). Fractionation of the General RNA
Polymerase II Transcription Factors from Drosophila Embryos. The Journal of Biol. Chem. 265:
21223-21231.
Wasylyk, B., Derbyshire, R., Guy, A., Molko, D., Roget, A., Toule, R. y Chambon, P. (1980).
Specific in vitro transcription of conalbumin gene is drastically decreased by single-point
mutation in T-A-T-A box. Poc. Natl. Acad. Sci. 77: 7024-7028.

REFERENCIAS 148

Wasylyk, B. y Chambon, P. (1981). A T to A base substitution and small deletions in the

conalbumin TATA box drastically decrease specific in vitro transcription. Nucleic Acids Res.9:
1813-1824.

Weinzierl, R. O., Ruppert, S., Dynlacht, B. D., Tanese, N. y Tjian, R. (1993). Cloning and
expression of Drosophila TAFII60 and human TAFII70 reveal conserved interactions with other
subunits of TFIID. EMBO J. :5303-5309.
West, A. G., Gaszner, M. y Felsenfeld, G. (2002). Insulators: many functions, many mechanisms.
Genes Dev. 16: 271-288.
White, R. J. y Jackson, S. P., (1992). The TATA-binding protein: a central role in transcription by
RNA polymerases I, II and III. Trends. Genet. 8: 284 - 288.
WHO/PAHO/UNESCO (1998) Report of a consultation of experts on amebiasis. Week. Epidem.
Rep. WHO. 72, 97-99.
Wobbe, C. R. y Struhl, K. (1990). Yeast and human TATA-binding proteins have nearly identical
DNA sequence requirements for transcription in vitro. Mol. Cell. Biol. 10: 3859-3867.
Wong, J. M., Liu, F. y Bateman, E. (l992). Isolation of genomic DNA encoding transcription
factor TFIID from Acanthamoeba castellanii: characterization of the promoter. Nucleic Acids
Res. 20: 18: 4817-4824.
Wong, J. M., Liu, F. y Bateman, E. (1992). Cloning and expression of the Acanthamoeba
castellanii gene encoding transcription factor TFIID. Gene 117: 91-97.
Wong, J. M. y Bateman, E. (1994). TBP-DNA interactions in the minor groove discriminate
between A:T and T:A base pairs. Nucleic Acids Res. 22: 1890-1896.
Young, R.A., (1991). RNA polymerase II. Annu. Rev. Biochem. 60: 68
Zenzie-Gregory, B., Khachi, A., Garraway, I. P. y Smale, S. T. (1993). Mechanism of initiatormediated transcription: evidence for a functional interaction between the TATA-binding protein
and DNA in the absence of a specific recognition sequence. Mol. Cell. Biol. 13: 3841-3849.

REFERENCIAS 149

Zhou, Q., Boyer, T, G. y Berk, A, J. (1993). Factors (TAFs) required for activated transcription
interact with TATA box-binding protein conserved core domain. Genes Dev. 7: 180-187.

APNDICE 150

X. APNDICE
Artculos publicados durante la elaboracin de esta Tesis doctoral:
- De Dios-Bravo, G., Luna-Arias, J. P., Rivern, A. M., Olivares-Trejo, J. J., Lpez-Camarillo, C. y
Orozco, E. (2005) Entamoeba histolytica TATA-box binding protein binds to different TATA
variants in vitro. FEBS J 272: 1-13.
- Guadalupe de Dios-Bravo, Csar Lpez, Juan Pedro Luna-Arias and Esther Orozco (2000).
DNA binding activity and predicted tertiary structure of the TATA binding Protein of Entamoeba
histolytica. Arch. Med. Res. 31, 4 S299-300.
- Luna-Arias, J. P., Hernandez-Rivas, R., De Dios-Bravo, G., Garca, J., Mendoza, L. y Orozco, E.
(1999). The TATA-box binding protein of Entamoeba histolytica: cloning of the gene and location
of the protein by immunofluorescence and confocal microscopy. Microbiol. 145: 33-40.
- Guadalupe de Dios-Bravo, Juan Pedro Luna-Arias Patricio Gariglio, Pedro Chvez and Esther
Orozco. (1997). Localization of a Retinoblastoma-Like Protein in Entamoeba histolytica. Arch.
Med. Res. 28, 21-23.

UN CAPITULO EN LIBRO:

1.- Rima Salah Gharaibeh, Guadalupe de Dios-Bravo y Juan Pedro Luna-Arias (2000). Sistemas
de expresin procarinticos en: Gentica y Biologa Molecular. E. Orozco y P. Gariglio. Ed.
LIMUSA pp 59 72.

Entamoeba histolytica TATA-box binding protein binds

to different TATA variants in vitro
Guadalupe de Dios-Bravo1,2, Juan Pedro Luna-Arias3, Ana Mara Riveron4, Jose J Olivares-Trejo5,
Cesar Lopez-Camarillo2 and Esther Orozco5
1
2
3
4
5

Programa de Biomedicina Molecular, Escuela Nacional de Medicina y Homeopata del Instituto Politecnico Nacional, Mexico
Programa de Ciencias Genomicas, Universidad de la Ciudad de Mexico, Mexico
Departamento de Biologa Celular, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados, Mexico
Departamento de Biologa Molecular, Centro Nacional de Investigacion Cientfica (CNIC), Habana, Cuba
Departamento de Patologia Experimental, Centro de Investigacion y de Estudios Avanzados, Mexico

Keywords
Entamoeba histolytica; KD; promiscuous
DNA-binding activity; TATA-binding protein;
TATA variants
Correspondence
Esther Orozco, Departamento de Patologa
Experimental, Centro de Investigacion y de
Estudios Avanzados, IPN. C. P. 07360,
Mexico, D. F.
Fax: +52 55 57477108
Tel: +52 55 50613800 ext 5642
E-mail: esther@mail.cinvestav.mx
(Received 23 June 2004, revised 8 December
2004, accepted 11 January 2005)
doi:10.1111/j.1742-4658.2005.04566.x

The ability of Entamoeba histolytica TATA binding protein (EhTBP) to

interact with different TATA boxes in gene promoters may be one of the
key factors to perform an efcient transcription in this human parasite. In
this paper we used several TATA variants to study the in vitro EhTBP
DNA-binding activity and to determine the TATA-EhTBP dissociation
constants. The presence of EhTBP in complexes formed by nuclear extracts
(NE) and the TATTTAAA oligonucleotide, which corresponds to the
canonical TATA box for E. histolytica, was demonstrated by gel-shift
assays. In these experiments a single NE-TATTTAAA oligonucleotide
complex was detected. Complex was retarded by anti-EhTBP Igs in supershift experiments and antibodies also recognized the cross-linked complex
in Western blot assays. Recombinant EhTBP formed specic complexes
with TATA variants found in E. histolytica gene promoters and other
TATA variants generated by mutation of TATTTAAA sequence. The dissociation constants of recombinant EhTBP for TATA variants ranged
between 1.04 (0.39) 10)11 and 1.60 (0.37) 10)10 m. TATTTAAA
and TAT_ _AAA motifs presented the lowest KD values. Intriguingly, the
recombinant EhTBP afnity for TATA variants is stronger than other
TBPs reported. In addition, EhTBP is more promiscuous than human and
yeast TBPs, probably due to modications in amino acids involved in
TBP-DNA binding.

Entamoeba histolytica is the protozoan responsible for

human amoebiasis. E. histolytica strains have distinct
capacity to damage cultured cells and human tissues
[14]. Expression of many molecules and cellular functions involved in E. histolytica pathogenicity such as
lectins [5,6], adherence molecules [7], proteases [8,9]
and amoebapores [10] correlates with its virulence.
Variability in virulence exhibited by E. histolytica
strains might be controlled in part by transcription of
these and other virulence genes.

Transcription factors cooperate with other proteins

to regulate gene expression. First, the preinitiation
complex (PIC) is positioned around the transcription
initiation site and then, PIC interacts with other
proteins bound to upstream motifs to facilitate the
RNA polymerase II function. The absence or the presence of some nuclear factors interacting with PIC may
inhibit or promote gene expression to modulate cellular functions [1113]. Mechanisms, molecules and
DNA sequences controlling the spatial and temporal

Abbreviations
EhTBP, Entamoeba histolytica TATA-box binding protein; EMSA, electrophoretic mobility shift assays; rEhTBP, recombinant Entamoeba
histolytica TATA-box binding protein; NE, nuclear extracts.

1354

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

G. de Dios-Bravo et al.

transcription patterns during growth, differentiation

and development have been widely studied [14,15].
In eukaryotes, general transcription factors such as
TFIID TFIIB, TFIIA, TFIIE, TFIIF RNA polymerase II and TFIIH are assembled on the core promoter before transcription begins [16,17].
The TATA binding protein (TBP) is the rst factor that binds DNA to recruit proteins on PIC and
initiate gene transcription [18,19]. Mammalian TBPs
can productively bind to a large number of diverse
TATA elements. An exhaustive statistical genomic
survey documented that the TATA box is an A Trich 8 bp segment, often anked by G C-rich
sequences [20].
Certain E. histolytica genes are activated or down
regulated during liver abscesses production by trophozoites [9] and during epithelia colonization and
invasion. However, we ignore which transcription
factors modulate these events and others related to
the parasite survival such as trophozoites differentiation into cysts. Few transcription factors have been
detected and cloned in E. histolytica. URE3-BP,
EhEBP1 and EhEBP2 proteins regulate the hgl5 gene
expression [21,22] and an EhC EBP-like protein is
involved in EhPgp1 gene activation [23,24]. Additionally, Ehtbp [25] and Ehp53 [26] have been characterized as the orthologous of the mammalian tbp and
p53 genes, respectively. The E. histolytica TATAbinding protein (EhTBP) is the only member of the
basal transcription machinery cloned and characterized in this parasite.
The EhTBP functional DNA-binding domain has
55% homology with human TBP, whereas the
EhTBP N-terminal domain is rich in hydrophobic
residues and quite different from mammalian TBPs
[25]. EhTBP C-terminus displays a predicted protein
structure tting to the crystallized human TBP
[27,28], but its biological activity has been poorly
studied.
E. histolytica gene promoters have the TATTTAAA
sequence, which is considered as the canonical TATA
box for EhTBP [29]. However, EhTBP binding to this
sequence has not been fully demonstrated. In addition,
TATTTAAA variants have been found surrounding
the core promoter, suggesting that these motifs could
also act as TATA boxes [30,31], but EhTBP afnity
for these sequences is also unknown. In this paper, we
studied the in vitro EhTBP binding afnity for different TATA sequences found in E. histolytica gene promoters and others designed by us producing mutations
in the TATTTAAA sequence. We also calculated the
KD of recombinant E. histolytica TBP (rEhTBP) for
several TATA variants.
FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

Promiscuous E. histolytica TBP

Results
E. histolytica nuclear extracts (NE) and TATTTAAA(1) oligonucleotide form specific complexes
Bruchhaus et al. [29] using NE in EMSA and doing
in silico analysis proposed that the TATTTAAA
sequence is the consensus TATA box for E. histolytica.
On the other hand, Luna-Arias et al. [25] showed the
homology of EhTBP with human TBP. However,
the presence of EhTBP in complexes formed with
E. histolytica NE and TATTTAAA(1) oligonucleotide
has not been directly demonstrated yet. We rst investigated the presence of EhTBP in the complex formed by
E. histolytica NE and TATTTAAA(1) oligonucleotide
by supershift, cross-linking and Western blot assays.
When incubated with fresh NE, TATTTAAA(1) oligonucleotide migration was retarded, forming a single
band (Fig. 1A, lane 1). The NE-TATTTAAA(1) complex was specically competed by TATTTAAA(1) cold
oligonucleotide (Fig. 1A, lane 2), whereas it remained
when double-stranded poly(dG-dC) or TtTTTttt(7)
oligonucleotide were used as unspecic competitors
(Fig. 1A, lanes 3 and 4, respectively). The presence of
EhTBP in this complex was evidenced in supershift
assays by anti-rEhTBP Igs. Two bands appeared when
1 lL of antibodies was added to the mixture (Fig. 1B,
lane 3). The lower band comigrated with that formed
by NE and TATTTAAA(1) oligonucleotide, whereas
the other band migrated slower, due to the partial
supershift produced by the antibody. When 5 lL
of anti-rEhTBP Igs were added to the mixture, the
complex was completely disrupted (Fig. 1B, lane 4), as
it has been reported for other supershift experiments
[32]. Anti-E. histolytica actin antibodies had no effect
on the complex formed (Fig. 1C, lane 2).
In cross-linking assays, using a UV-irradiated mixture of E. histolytica NE and TATTTAAA(1) oligonucleotide, we distinguished a radioactive DNAprotein
band of 50 kDa (Fig. 1D, lane 5). This band may be
formed by the radioactive probe (11 kDa) bound to
endogenous EhTBP (26 kDa) and other protein crosslinked to the complex. As expected, the 50 kDa radioactive band was competed by TATTTAAA(1) cold
oligonucleotide (Fig. 1D, lane 6), but it remained in
the presence of the poly (dG-dC) unspecic competitor
(Fig. 1D lane 7). No complexes were detected in lanes
with either nonirradiated or irradiated free probe, or
with the nonirradiated oligonucleotide-NE mixture
(Fig. 1D, lanes 24, respectively). In Western blot
assays of UV cross-linked DNAprotein complexes,
anti-rEhTBP Igs recognized the radioactive 50 kDa
band. This conrms that EhTBP is part of the complex
1355

Promiscuous E. histolytica TBP

G. de Dios-Bravo et al.

Fig. 1. Binding of nuclear extracts to TATTTAAA(1) oligonucleotide. (A) NE (25 lg) and [32P]ATP[cP] end-labeled TATTTAAA(1) oligonucleotide
(10 000 c.p.m., 157 pM) were incubated for 15 min at 4
C for EMSA as described in Experimental procedures. Lane 1, no competitor; lane
2, 300-fold molar excess of unlabeled TATTTAAA(1) oligonucleotide as specific competitor (sc); as unspecific competitors we added 300-fold
molar excess of: lane 3, poly(dG-dC) and, lane 4, oligo(dT)18. (B) Supershift gel assay using purified anti-rEhTBP Igs. EMSA were performed
as above, except that before adding the labeled oligonucleotide, the mixture was preincubated with: lane 1, no NE; lane 2, no antibody; lane
3, 1 lL of purified anti-rEhTBP Igs; lane 4, 5 lL of anti-rEhTBP Igs. (C) Supershift gel assay performed as in B, but using anti-E. histolytica
actin Igs. Lane 1, no antibody; lane 2, 5 lL of anti-E. histolytica actin Ig. (D) UV-cross-linking assay of NE (60 lg) and TATTTAAA(1) (50 000
c.p.m., 785 pM). Mixtures for EMSA were UV irradiated at 320 nm for 10 min at 4
C, analyzed by 12% SDS PAGE and radioactivity was
determined as described in Experimental procedures. Lane 1, molecular mass markers; lane 2, nonirradiated free probe; lane 3, irradiated
free probe; lane 4, nonirradiated NE-oligonucleotide mixture; lane 5, irradiated NE-oligonucleotide mixture; lane 6, irradiated NE-oligonucleotide mixture containing 300-fold molar excess of unlabeled TATTTAAA(1) oligonucleotide as specific competitor (sc); lane 7, irradiated
NE-oligonucleotide mixture containing 300-fold molar excess of poly (dG-dC) as unspecific competitor (uc). (E) Western blot assay of UV
cross-linked DNAprotein complexes shown in D, using anti-rEhTBP Igs.

probably associated to another
13 kDa unknown

protein (Fig. 1E, lanes 57). The antibodies also recognized the same band in the lane where TATTTAAA(1)
cold oligonucleotide was used as specic competitor
(Fig. 1E, lane 6). As expected, in this lane the complex
was formed by the irradiated cold oligonucleotide and
NE mixture. Unbound 26 kDa EhTBP comigrated in
the gel with the 25 kDa marker (Fig. 1E, lanes 47).
Data from these experiments altogether demonstrated
the presence of EhTBP in NE-TATTTAAA(1) oligonucleotide complexes.
Recombinant EhTBP binds to TATTTAAA(1)
oligonucleotide
The rEhTBP was expressed in bacteria as a His6tagged 30 kDa polypeptide. rEhTBP was puried by
afnity chromatography and its integrity and identity
were veried by Coomassie blue stained gels
(SDS PAGE) (Fig. 2A) and Western blot assays using
anti-rEhTBP Igs (Fig. 2B). In EMSA, puried rEhTBP
formed a single band with TATTTAAA(1) probe
(Fig. 2C, lane 2). The complex was competed by cold
TATTTAAA(1) oligonucleotide, whereas it remained
in the presence of poly (dG-dC) unspecic competitor
(Fig. 2C, lanes 3 and 4). To discard endogenous
1356

TATA binding activity in bacterial extracts, we tested

by EMSA the capacity of induced and noninduced
bacterial extracts to form complexes with TATTT
AAA(1) probe. Results showed that complex was only
formed with extracts of induced bacteria expressing
rEhTBP (Fig. 2D, lane 3) whereas noninduced bacteria
did not form any complexes with TATTTAAA(1)
oligonucleotide (Fig. 2D, lane 2).
DNA-binding activity of purified rEhTBP
for TATA variants
In humans and other organisms, variants of the canonical TATA box have been reported to be functional
[33,34]. On the other hand, the TATTTAAA sequence
and several variants are found in many E. histolytica
gene promoters at )20 to )40 bp upstream the transcription initiation site [30], although other TATA
variants have been experimentally found at longer
distances in Ehtbp and EhRabB genes (our unpublished
data). We studied the binding activity of rEhTBP for
different TATA sequences present in gene promoters
(oligonucleotides TATTTAAA(1), TAT_ _AAA(4),
TAT_ _AAg(5) and TATTaAAA(6)), and for mutated
versions of TATTTAAA(1) probe [oligonucleotides
TAgTgAAA(2) and TATTggAA(3)] (Table 1). We
FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

G. de Dios-Bravo et al.

Promiscuous E. histolytica TBP

Fig. 2. Immunodetection of rEhTBP, and EMSA of TATTTAAA(1) and rEhTBP. rEhTBP was produced by IPTG induced bacteria transformed
with the full length Ehtbp gene cloned in pRSET A and purified through nickel NTA-agarose columns as described in Experimental procedures. (A) Coomassie blue stained gel (12% SDS PAGE) of purified rEhTBP under native conditions. Lane 1, molecular mass markers; lane
2, purified rEhTBP. (B) Western blot assay of purified rEhTBP using anti-rEhTBP Igs. Lane 1, molecular weight markers; lane 2, stripe
sequentially incubated with anti-rEhTBP Igs and peroxidase-coupled goat anti-rabbit secondary Igs; lane 3, as in lane 2 but anti-rEhTBP Igs
were omitted. (C) EMSA of purified rEhTBP with TATTTAAA(1) oligonucleotide as described in Experimental procedures. Lane 1, free probe;
lane 2, no competitor; lane 3, 300-fold molar excess of unlabeled TATTTAAA(1) probe as specific competitor (sc); lane 4, 300-fold molar
excess of unspecific competitor (uc). (D) EMSA using 15 lg of bacterial extracts. Lane 1, free probe; lane 2, non induced bacteria (nib) carrying pRSET A-Ehtbp plasmid; lane 3, induced bacteria (ib) expressing rEhTBP.

introduced gs in the third, fth and sixth positions of

the TATTTAAA(1) sequence, because these positions
have been reported as important for DNA-binding
activity for human and yeast TBPs [33,34].
DNA-binding activity of rEhTBP for distinct TATA
oligonucleotides was evaluated by EMSA using
433 nm (over-saturating concentration) of puried
rEhTBP and 10 000 c.p.m. (157 pm) of the probes.
Figure 3 displays experiments showing that rEhTBP

specically binds to all oligonucleotides tested. Complexes formed by rEhTBP and TATA box variants
were fully competed by the same probe and by TATTTAAA(1) oligonucleotide (Fig. 3). In these assays,
two complexes were observed with TAT_ _AAA(4)
and TAT_ _AAg(5) probes, which were specically
competed by TATTTAAA(1) oligonucleotide and by
the same probe. The presence of two complexes in
some experiments could be due to conformational

Table 1. Positions of TATTTAAA (1) sequence and putative TATA variants in E. histolytica gene promoters.
TATA variants

Gene promoter

First nucleotide locationb

Reference

EhPgp5
Ehactin
Not found
Not found
Ehtbp
Ehtub1
EhRabB
Ehenol
Ehpfo

(-31)c
(-30)d

[47]
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica)

(-109)c
(-27)d
(-44)c
(-50)d
(-31)c

(Unpublished)
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica)
(Unpublished)
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/E_histolytica)
[48]

(1 2 3 4 5 6 7 8)
5-T A T T T A A A-3 (1)
5-T A g T g A A A-3 (2)
5-T A T T g g A A-3 (3)
5-T A T _ _ A A A-3 (4)

5-T A T _ _ A A g-3 (5)

5-T A T T a A A A-3 (6)
a

Numbers show the base composition in TATA variants. b Nucleotide position is referred to the experimentally c and in silico d determined
transcription initiation sites. Putative TATA boxes are defined as TATA sequences upstream of the ATTCA G, ATCA or ACGC consensus
transcription initiation sites.

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

1357

Promiscuous E. histolytica TBP

G. de Dios-Bravo et al.

Fig. 3. rEhTBP specifically binds to TATTTAAA(1) oligonucleotide and TATA variants. (AE) Purified rEhTBP (433 nM) was incubated with
[32P]ATP[cP] end-labeled TATA variants (10 000 c.p.m., 157 pM) for EMSA as described in Experimental procedures. Lane 1, free probe; lane
2, no competitor; lane 3, competition with 300-fold molar excess of the same TATA variant as specific competitor (sc); lane 4, competition
with 300-fold molar excess of TATTTAAA(1) oligonucleotide; lane 5, competition with 300-fold molar excess of unspecific competitor (uc).
The TATA oligonucleotide used in each case is shown below each gel. (F) Control binding assay of rEhTBP (433 nM) with 157 pM (10 000
c.p.m.) of TATTTAAA(1) probe. Lane 1, TATTTAAA(1) free probe; lane 2, purified rEhTBP incubated with TATTTAAA(1) probe; lane 3, purified
rEhTBP preincubated with 300-fold molar excess of unlabeled poly (dG-dC) before adding the labeled TATTTAAA(1) probe; lane 4, unlabeled
TTTTTTTT(7) oligonucleotide; lane 5, unlabeled TATATATA(8) oligonucleotide, and lane 6 TTTTAAAA(9) oligonucleotide were used as unspecific competitors. (G) Elution profile of labeled TATTTAAA (1) probe passed through a hydroxyapatite column as described in Experimental
procedures. Fraction 1, unbound single stranded DNA (SS); fractions 26, washes with 2.5 mL of 0.12 M phosphate buffer pH 6.8 (W); fractions 711, elution with 2.5 mL of 0.4 M phosphate buffer pH 6.8 (DS). Volume of each fraction was 0.5 mL. Radioactivity was represented
as percentage of the total radioactivity (30 000 c.p.m.) loaded into the column.

changes of the DNAprotein complex, which may

affect its electrophoretic migration. To discard the possibility that rEhTBP could bind to any AT rich
sequence, we performed a shift assay with rEhTBP
and [32P]ATP[cP] end-labeled double stranded
TtTTTttt(7), TATaTAtA(8) or TtTTaAAA(9) oligonucleotides. rEhTBP did not bind to these sequences
(data not shown), indicating that rEhTBP is not
merely an AT-rich DNA binding protein without discrimination capacity. Obviously, these oligonucleotides
did not compete the complex formed with TATTTAAA(1) and rEhTBP (Fig. 3F). We also veried that
in our experiments, rEhTBP was indeed bound to double-stranded oligonucleotides and not to free labeled
single-stranded probes. Labeled probes were passed
1358

through a hydroxyapatite column and c.p.m. were

counted in the unbound and eluted fractions. In all
cases, more than 99% of the radioactivity was found
bound to the hydroxyapatite column and it was eluted
with 0.4 m phosphate buffer. Figure 3G shows the elution prole for TATTTAAA(1) oligonucleotide as a
representative experiment. All together these results
showed that rEhTBP has an in vitro binding capacity
for distinct TATA elements.
Quantification of rEhTBP DNA-binding activity
for different TATA oligonucleotides
Binding activity of rEhTBP for TATA variants was
quantied (as described in Experimental procedures) at
FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

G. de Dios-Bravo et al.

Promiscuous E. histolytica TBP

distinct total rEhTBP concentrations (Fig. 4AF).

Experimental variations for each gel were normalized
using the total radioactivity in each lane (complex
formed plus free oligonucleotide at the bottom of the
gel).
Quantication of DNAprotein complexes in each
EMSA experiment was performed to calculate KD values of the rEhTBP and each TATA oligonucleotide
using the method described by Coleman and Pugh [35]
(see Experimental procedures). First, we estimated the
c.p.m. present in the shifted protein-TATA oligonucleotide (Sx) for each rEhTBP concentration tested (x).
Then, the natural logarithms of Sx (ln Sx) values were
plotted against a given rEhTBP concentration (x). As
c.p.m. is a discrete variable, we used ln Sx (Eqn 2) to
warrant normal distribution of the residual error E in
the regression analysis [36,37] in order to obtain more
precise and representative data. Thus, these experimental points were tted as a polynomial function of x
(Eqn 2) (Fig. 5). In all cases we obtained a second
degree polynomial function describing the relationship
between ln Sx and x (Table 2). The summary of coefcients, variances, and results of the statistical Students
t-tests obtained are also presented in Table 2.
Once we had dened the mathematical relationship
between ln Sx and x for each experiment, we determined the average amount of radioactivity (Sf) present
in the rEhTBPTATA oligonucleotide complexes when

the reaction reached the titration end point. This was

done rst using Eqn 3 to calculate the x-value at which
the mathematical function has a maximum (xmax).
For oligonucleotides TATTTAAA(1), TAgTgAAA(2),
TATTggAA(3), TAT_ _AAA(4), and TAT_ _AAg(5),
the xmax values were 280, 287, 281, 232 and 270 nm,
which corresponded to Sf values of 324 6, 1038
20, 702 34, 335 10, 431 9 c.p.m., respectively.
In the case of TATTaAAA(6) oligonucleotide, which
formed two specic DNAprotein complexes, the xmax
values were 261 and 307 nm for the slower and faster
bands, respectively, which corresponded to 190 5
and 325 4 c.p.m.
The next step was to obtain F-values using Eqn 1 as
described in Experimental procedures and plot it versus the rEhTBP TATA molar ratio. F-values also tted to a polynomial function of the molar ratio of
rEhTBP TATA oligonucleotide. Figure 6A shows an
example of the F experimental points obtained for
TAT_ _AAg(5) oligonucleotide. Results for all oligonucleotides showed a second degree polynomial function (Table 2). The statistical test gave similar results
to those obtained for Eqn 2. Then, we obtained the
rEhTBP TATA oligonucleotide molar ratios at which
F corresponds to 1 (maximum value). rEhTBP TATA
oligonucleotide molar ratios were 1458, 1959, 1599,
2006 and 2030 for TATTTAAA(1), TAgTgAAA(2),
TATTggAA(3), TAT_ _AAA(4), and TAT_ _AAg(5)

Fig. 4. Affinity quantification of rEhTBP-TATA variant complexes as a function of the rEhTBP concentration by EMSA. (AF) EMSA of [32P]
ATP[cP] end-labeled TATA variants (10 000 c.p.m., 157 pM) incubated with different rEhTBP concentrations as described in Experimental procedures: lane 1, 0 nM; lane 2, 50 nM; lane 3, 97 nM; lane 4, 145 nM; lane 5, 193 nM; lane 6, 242 nM; lane 7, 290 nM, and lane 8, 338 nM.
Arrows show the complexes analyzed. The TATA oligonucleotide used in each case is shown below each gel.

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

1359

Promiscuous E. histolytica TBP

G. de Dios-Bravo et al.

Fig. 5. Graphical representation of data obtained in quantification of rEhTBP-TATA variant complexes. (AF) ln of Sx (the radioactivity present
in DNAprotein complexes) versus x (rEhTBP concentrations). Data were obtained from EMSA experiments as shown in Fig. 4. F-1 and F-2
correspond to the slower and faster DNAprotein complexes formed with TATTaAAA(6) oligonucleotide, respectively. Dots represent experimental data. Continuous line is the graph predicted by the second degree polynomial function (Eqn 2 in Experimental procedures). The TATA
oligonucleotide used in each case is shown below each graph.

Table 2. Mathematical relationships between ln Sx vs. x and ln F vs. rEhTBP TATA molar ratio. a, Coefficients of the equation ln Sx a0 +
a1x + a2x2 + E ) N(0,1) and ln F a0 + a1(rEhTBP TATA) + a2(rEhTBP TATA)2 + E ) N(0,1). Sa is the standard deviation of an coefficients.
I, slower DNA-protein complex; II, faster DNA-protein complex.
ln F vs. rEHTBP TATA molar ratio

ln Sx vs. x

1
2
3
4
5
6I
6II

a0

a1

a2

S2a0

S2a1

S2a2

a0

a1

a2

S2 a 0

S2a1

S2a2

5.85
4.37
5.04
5.48
3.39
4.61
4.76

7.66 x 10)3
1.56 10)2
7.91 10)3
4.34 10)3
1.42 10)2
7.62 10)3
7.28 10)3

)1.34 10)5
)2.77 10)5
)1.16 10)5
)8.03 10)6
)2.73 10)5
)1.24 10)5
)1.30 10)5

1.20 10)1
8.24 10)1
1.68 10)1
1.96 10)1
2.44 10)1
6.54 10)2
1.16 10)1

1.48 10)6
1.25 10)5
2.55 10)6
2.98 10)6
3.71 10)6
9.94 10)7
1.76 10)6

6.01 10)12
6.31 10)11
1.29 10)11
1.50 10)11
1.87 10)11
5.01 10)12
8.85 10)12

)1.10
)2.19
)1.34
)5.87
)1.86
)1.17
)1.02

1.12 10)3
2.74 10)5
1.24 10)3
5.78 10)4
2.23 10)3
1.46 10)3
1.40 10)3

)2.86 10)7
)8.56 10)7
)2.87 10)7
)1.42 10)7
)6.71 10)7
)4.57 10)7
)4.80 10)7

1.20 10)1
8.24 10)1
1.68 10)1
1.96 10)1
2.44 10)1
6.54 10)2
1.16 10)1

3.16 10)8
3.87 10)7
6.29 10)8
5.30 10)8
9.13 10)8
3.67 10)8
6.48 10)8

2.76 10)15
6.03 10)14
7.80 10)15
4.72 10)15
1.13 10)14
6.82 10)15
1.20 10)14

1360

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

G. de Dios-Bravo et al.

Promiscuous E. histolytica TBP

Table 3. Dissociation constants of rEhTBP for TATA variants.

Oligonucleotide

(KD SD) M

5-TATTTAAA-3 (1)
5-TAgTgAAA-3 (2)
5-TATTggAA-3 (3)
5-TAT_ _AAA-3 (4)
5-TAT_ _AAg-3 (5)
5-TATTaAAA-3 (6)

1.96
1.60
3.18
1.04
8.26
4.28
3.94

Upper DNA-protein complex;

Standard deviation.

Fig. 6. Relationships between ln F and rEhTBP TAT_ _AAg(5)

molar ratio, and 1 F and 1 P. (A) Experimental data obtained from
relationships between ln F and rEhTBP TAT_ _AAg(5) molar ratio.
(B) Graphical representation of 1 F and 1 P for the rEhTBP
TAT_ _AAg(5) complexes. The dots represent experimentally
obtained data. The continuous line is the graph predicted by the
second degree polynomial function (A) and linear function for KD
estimation (B).

(
(
(
(
(
(
(

0.58)
0.37)
1.16)
0.39)
2.20)
0.47)
0.44)

10-11
10-10
10-11
10-11
10-11
10-11
10-11

a
b

lower DNA-protein complex; SD,

method is presented for TAT_ _AAg(5) oligonucleotide (Fig. 6B). These calculations were performed for
all TATA oligonucleotides.
KD values and their standard deviations are shown
in Table 3. KD values of rEhTBP for TATA variants
ranged between 1.04 ( 0.39) 10)11 and 1.60
( 0.37) 10)10 m, which corresponded to oligonucleotides TAT_ _AAA(4) and TAgTgAAA(2), respectively.
TATTTAAA(1) and TAT_ _AAA(4) oligonucleotides
had the lowest KD values that did not signicantly differ each other (Table 3). Additionally, oligonucleotides
TATTggAA(3) and the two complexes formed with
TATTaAAA(6) gave similar KD values. The next
larger value corresponded to TAT_ _AAg(5), and the
largest to TAgTgAAA(2). Therefore, we could order
the oligonucleotides according to their TBP afnity as
follows: TATTTAAA(1) TAT_ _AAA(4) > TATTgg
AA(3) TATTaAAA(6) > TAT_ _AAg(5) > TAgTg
AAA(2).

Discussion
oligonucleotides, respectively. For the complexes
formed with TATTaAAA(6) oligonucleotide, the values were 1664 and 1599 for the slower and faster
bands, respectively. The reciprocal of all these values
were then used to calculate the total active rEhTBP
concentrations (PT) (see Experimental procedures) as
reported [35].
KD values of rEhTBP for TATA variants
The reciprocal of F-values gave the following linear
function: (1 F) 1 + KD (1 P). The slope of this linear function corresponds to KD. Therefore, the data
(1 F) and (1 P) were tted using the robust linear
regression method [36,37], which should give an equation of the type (1 F) c0 + c1 (1 P) if the variables
were linearly related. An example of the tness between
these variables using the robust linear regression
FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

In this paper we studied the rEhTBP afnity for several TATA variants present in E. histolytica gene promoters and TATA box versions designed by us
(Table 1). Our data showed that the promiscuity of rEhTBP for TATA variants is higher than those reported
for Homo sapiens, Saccharomyces cerevisiae and Arabidopsis thaliana TBPs [33,38]. Therefore, in addition
to TATTTAAA(1) sequence, we showed here that
TAT_ _AAA(4), TAT_ _AAg(5) and TATTaAAA(6)
are, at least in vitro, EhTBP binding motifs. In addition, rEhTBP can also bind in vitro to TAgTgAAA(2)
and TATTggAA(3) oligonucleotides that are mutated
versions of TATTTAAA(1) sequence. Thus, based on
our in vitro experiments, the E. histolytica TATA
box could be proposed as 5-(1: T)(2: A)(3: T G)(4:
T G A)(5: T G A)(6: A G)(7: A) (8: A)-3 (numbers
indicate the nucleotide position in TATA box). In vitro
transcription assays are needed to accurately establish
1361

Promiscuous E. histolytica TBP

the quantitative value of each base in different position

and in vivo experiments will demonstrate the function
of these TATA elements in the cell.
Based on a systematic X-ray crystallographic study
of the A. thaliana TBP isoform 2, Patikoglou et al. [38]
dened the TATA sequence as an eight bp variable
motif formed by 5-T  c > a g A  t T  a
cA  tT  aA  g > c tA T > g > cG
A > c t-3. Recently, in S. cerevisiae, Basehoar et al.
[39] identied the TATA box element as TAT
A(A T)A(A T)(A G). A. thaliana TBP isoform 2
recognizes 10 variants of the adenovirus major late promoter TATA element that in many organisms is
located at )25 to )40 bp from the transcription initiation site. However, some S. cerevisiae gene promoters
have the TATA box at )40 to )120 bp [13,40] and
the Ehtbp gene presents the TAT_ _ AAA sequence
located at )109 bp from the transcription initiation site
that, accordingly to our unpublished data, might function as TATA element. Additionally, recent results
gave also evidence that the EhRabB gene promoter
TATA box maps at )44 bp (Rodr guez, M.A., personal
communication) (Table 1).
In about 20 E. histolytica genes, the transcription initiation site is known [29] and from these data the TAT
TTAAA sequence has been proposed as the canonical
EhTBP binding motif. However, this is the rst
published report experimentally demonstrating that
rEhTBP binds to TATTTAAA and other related
sequences. Here, we experimentally showed that
EhTBP is in the complex formed in vitro by the consensus TATTTAAA(1) oligonucleotide and NE (Fig. 1)
and that rEhTBP specically binds to this DNA
sequence (Fig. 2). However, E. histolytica genes contain
different TATA elements (Table 1) that could be used
by TFIID transcription factor. We also showed that
rEhTBP forms specic complexes with all TATA variants tested, although with different afnity, showing a
more relaxed DNA-binding specicity of EhTBP than
those described for other systems [33,34,38,41].
DNA-binding activities of H. sapiens [34,38], A. thaliana [38] and S. cerevisiae [33,34] TBPs are severely affected when TATA oligonucleotides contain gs in rst,
second, third, fourth, fth and sixth positions. In contrast, EhTBP formed complexes with TAgTgAAA(2)
and TATTggAA(3) oligonucleotides used here (Fig. 3),
indicating that gs in these positions do not affect
EhTBP DNA-binding activity, and showing that at least
in in vitro assays, EhTBP is even more promiscuous than
other TBPs studied. In vivo studies are needed to dene
whether this also occurs in the trophozoites.
The dip in data at higher titration point in curves of
Figs 5 and 6 can be explained by the dimerization [35]
1362

G. de Dios-Bravo et al.

or oligomerization [42] of TBP molecules at high TBP

concentration. These multimers have no ability to bind
DNA [35,42]. We cannot discard multiple TBP binding
events.
KD values of rEhTBP for TATA variants ranged
from 10)11 to 10)10 m (Table 3). These results indicated that: (1) the rEhTBP has similar afnity for TAT
TTAAA(1) and TAT_ _AAA(4) oligonucleotides (2)
variations of the nucleotide at position 5 slightly
reduce the afnity of rEhTBP for TATA variant
in relation to the TATTTAAA oligonucleotide;
(3) TAT_ _AAg(5) and TAgTgAAA(2) oligonucleotides are bound by rEhTBP with less afnity than
those TATA variants designed by us.
An alignment of EhTBP with the H. sapiens,
A. thaliana and S. cerevisiae TBPs showed that EhTBP
has the residues reported as involved in TATA box
binding in the same positions than other TBPs [27,38].
Thirty of them are identical (Fig. 7, open arrowheads)
and of the remaining seven residues, ve are conserved
and two are nonconserved changes (Fig. 7, lled
arrowheads). Interestingly, EhTBP presents a T in
position 192, which corresponds to V203 in yeast, to
V161 in A. thaliana and to V301 in human TBPs
(Fig. 7, arrow). Strubin and Struhl [34] substituted the
V203 of yeast TBP by T and the resultant mutant TBP
showed an increased DNA-binding activity for the
TGTAAA element of the his3 gene promoter. Thus,
the presence of T192 in EhTBP sequence could inuence its DNA-binding specicity for TATA variants.
However, this is still to be experimentally demonstrated. The promiscuous DNA-binding activity of EhTBP
may have conferred an evolutionary advantage to
E. histolytica, because certain mutations in the TATA
box would not affect gene expression.

Experimental procedures
E. histolytica cultures
Trophozoites of E. histolytica clone A (strain HM1:IMSS)
[1] were axenically cultured in TYI-S-33 medium at 37
C
and harvested during exponential growth phase [43].

Electrophoretic mobility shift assays (EMSA),

competitions and supershift gel assays using
NE and rEhTBP
Aliquots of 25 lg of NE, obtained as described [23], or 30
300 ng (50500 nm) of puried rEhTBP [25] were used for
EMSA. NE or rEhTBP were incubated for 15 min at 4
C
with poly(dG-dC) (1 lglL)1) in binding buffer containing
12 mm Hepes pH 7.9, 60 mm KCl, 10% (v v) glycerol and

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

G. de Dios-Bravo et al.

Promiscuous E. histolytica TBP

Fig. 7. Predicted amino acid residues

involved in EhTBP binding to DNA.
Conserved C-terminal domain sequences of
TBPs from Saccharomycces cerevisiae
(ScTBP) (P13393), Arabidopsis thaliana
(ArathTBP2) (P28148), Homo sapiens (hTBP)
(P20226) and E. histolytica (EhTBP) (P52653)
were aligned using the CLUSTAL W program.
Black boxes indicate identical amino acids in
at least two sequences and grey boxes the
amino acid conserved changes. Unfilled and
filled arrowheads indicate the 37 amino acid
residues involved in DNA binding activity.
Filled arrowheads correspond to the seven
amino acid residues involved in DNA binding
activity that are changed in EhTBP
sequence. Arrow denotes the amino acid
change in EhTBP position 192.

1 mm each dithiothreitol, EDTA, spermidine and MgCl2.

Then, [32P]ATP[cP] end-labeled double-stranded oligonucleotides (10 000 c.p.m., 157 pm): 5-TATTTAAA-3(1),
5-TAgTgAAA-3(2), 5-TATTggAA-3(3), 5-TAT_ _AAA3(4), 5-TAT_ _AAg-3(5), 5-TATTaAAA-3(6) (Table 1),
5-TtTTTttt-3(7), 5-TATaTAtA-3(8) or 5-TtTTaAAA3(9) were added to the mixture. Incubation continued for
other 10 min at 4
C. Mutations introduced in TATTT
AAA box are marked in small letters and deletions are in
dashes in the oligonucleotide sequences. In all cases, anking bases were added to obtain 18 bp length oligonucleotides. Numbers in parenthesis after the sequences identify
each oligonucleotide. For supershift gel assays, before adding oligonucleotides, the mixture was preincubated for
15 min at 4
C with 1 or 5 lL of puried rabbit antirEhTBP Igs [25] or with 5 lL of anti-E. histolytica actin Igs
(kindly given by Manuel Hernandez, CINVESTAV, IPN,
Mexico). In competition experiments, 300-fold molar excess
of tested oligonucleotide, or the TATTTAAA(1) oligonucleotide, or the unspecic competitors poly(dG-dC),
TtTTTttt(7), TATaTAtA(8) or TtTTaAAA(9) were incubated with the mixture 10 min before the probe was added.
Samples were electrophoresed on 6% nondenaturing
polyacrylamide gels (PAGE) in 0.5X TBE. Gels were
vacuum-dried and radioactive complexes were detected in a
Phosphor Imager apparatus (Bio-Rad). Shifted radioactive
bands were quantied by densitometry using the Quantity
One software version 4 (Bio-Rad). All experiments reported
here were carried out at least three times by duplicate with
reproducible results. To discard the presence of single-stranded oligonucleotides, labeled probes (30 000 c.p.m.) were
passed through a hydroxyapatite (Bio-Rad) column (1 cm
in length 0.7 cm in diameter) at 4
C. We collected
0.5 mL fractions. The owthrough contained the unbound
material, which corresponds to single stranded DNA. The

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

column was washed with 2.5 mL of 0.12 m phosphate buffer pH 6.8 and double-stranded DNA was eluted with
2.5 mL of 0.4 m phosphate buffer pH 6.8 [44]. Finally,
radioactivity in each fraction was measured in a Beckman
LS 6500 liquid scintillation counter.

Cross-linking and Western blot assays

Protein concentration of NE was measured by the Bradford
method [45]. For cross-linking assays, 60 lg of proteins
were incubated with radioactive TATTTAAA(1) oligonucleotide (50 000 c.p.m., 785 pm) and UV irradiated at 320 nm
directly on a transilluminator apparatus (UVP Inc., San
Gabriel, CA, USA) for 10 min at 4
C. Complexes formed
after cross-linking assays were resolved through 12%
SDS PAGE. Gels were scanned in a Phosphor Imager
apparatus and were transferred to nitrocellulose membranes
for Western blot assays [46]. Membranes were blocked with
0.05% (v v) Tween 20 and 5% (w v) nonfat milk in
NaCl Pi for 2 h at room temperature and incubated overnight at 4
C with puried anti-rEhTBP Igs (1 : 1000). Immunoreactivity was detected with peroxidase-labeled goat
anti-rabbit Igs (Zymed, San Francisco, CA, USA)
(1 : 2000) and chemiluminescence method, using ECL Plus
Kit (Amersham, Piscataway, NJ, USA).

Expression and purification of rEhTBP and

anti-rEhTBP Igs generation
The full-length Ehtbp gene, cloned in pRSET A [25] was
expressed in Escherichia coli BL21(DE3)pLysS strain
(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as a His6-tagged 30 kDa
polypeptide. Proteins from IPTG (1 mm) induced bacteria
were separated by 12% SDS PAGE and gels were

1363

Promiscuous E. histolytica TBP

G. de Dios-Bravo et al.

Coomassie blue stained. rEhTBP was puried by nickelagarose afnity columns as described by the manufacturer
(Qiagen, Standford, CA, USA). Then, 150 lg of puried
rEhTBP were subcutaneously inoculated three times in
rabbits each 15 days. One week after last immunization,
rabbits were bled. Antibodies were twice precipitated from
serum with 60% (w v) (NH4)2SO4, dialyzed using NaCl Pi
buffer and immunoadsorbed against nitrocellulose-immobilized rEhTBP before using them for supershift and Western
blot assays.

Quantification of DNAprotein complexes

Complexes formed by distinct probes with rEhTPB were
quantied by densitometry measuring pixels in bands by
the quantity one software and normalized against free
probe to correct the total c.p.m. loaded in each lane of the
gel.

Determination of dissociation constants (KD)

of DNAprotein complexes
The KD for EhTBP and each TATA oligonucleotide was
determined by EMSA as described [35] with some modications. Complexes formation with rEhTBP and radiolabeled
oligonucleotides was measured as a function of protein concentration. The fraction (F) of DNA probe bound by proteins was calculated using the Eqn 1
F Sx  S0 =Sf  S0

Eqn 1

where, Sx is the radioactivity present in the shifted proteinDNA complex at protein concentration x. S0 is the corresponding radioactivity present when x 0 (i.e. the absence of
protein). Sf is the average amount of radioactivity present
when F becomes independent of x (i.e. when the reaction reaches the titration end point).
To accurately determine Sf values for each EMSA experiment we plotted the Sx values for each rEhTBP concentration tested (x). Then, we determined the polynomial
function best describing the curve behavior as:
ln Sx a0 a1 x a2 x2    an xn E  N0; 1

Eqn 2

where ln Sx is the natural logarithm of Sx, an is the numerical coefcient, n is the equation degree and E is the residual error in the regression analysis [36,37]. As c.p.m. is a
discrete variable, we used ln Sx (Eqn 2) to warrant normal
distribution of the residual error E in the regression analysis [36,37]. The tness analysis was performed by least
square regression analysis. The degree of Eqn 2 that we
determined in our experiments was n 2, that was the
power of x that corresponded to the last coefcient differing signicantly from zero. We estimated the statistical Students t-test (t) for each an as tn (an )0) Saj, where j
ranges from 0 to n, and San is the standard deviation of the
1364

coefcient an. We took the difference (an ) 0) as signicant

only if the Students t-test probability P(t) was lower than
0.05.
Once we estimated the coefcients of Eqn 2 for each
experiment, we determined the rEhTBP concentration xmax
at which the curve reached a maximum by deriving (d) Eqn
2 and solving it for zero value (Eqn 3).
dln Sx =dx 0

Eqn 3

Then, we used xmax value in Eqn 2 to obtain the Sf value.

Finally, F was calculated with Eqn 1 for each rEhTBP concentration x.

Estimation of the molar ratio of rEhTBP TATA

oligonucleotide when F 1
Following the method described by Coleman and Pugh
[35], we estimated the fraction of active rEhTBP that binds
to TATA oligonucleotides (active unbound plus active
bound rEhTBP), assuming a binding stoichiometry of 1.
Therefore, F was plotted as a function of the molar ratio of
total rEhTBP to TATA oligonucleotides. As for Eqn 2, we
tted ln F as a polynomial function of the molar ratio of
rEhTBP TATA oligonucleotide. The tness was also done
by the least square method and the maximum of the curve
was determined as before. When F 1 (the saturating
point), the reciprocal of the x intercept was multiplied by
total rEhTBP concentration to get the total fraction of active rEhTBP in the mixture. We called it (x TATA)max,
which according to Coleman and Pugh [35] it corresponds
to F 1.

Confidence intervals (CI) of polynomial function

predictions
Condence intervals were estimated using Yp CI, in
which Yp is the predicted value by the function for a
particular x, and CI is dened by Eqn 4
CI 1=t0:975; glfX0 R1 Xr2 1=2

Eqn 4

where t(0.975, gl) is the Students t-test for 0.975 percentile,

and gl the degrees of freedom; X, is the vector of the values raised to the transposed X vector, R)1 is the inverse of
the regression matrix, and r2 is the residual variance.

KD calculation
The KD of proteinDNA complexes was calculated from
Eqn 5 [35]
F P=KD P

Eqn 5

where, P is the uncomplexed active rEhTBP. P is related to

total active rEhTBP concentration PT by Eqn 6

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

G. de Dios-Bravo et al.

Promiscuous E. histolytica TBP

PT P PD

(Eqn 6

where, PD is the rEhTBP concentration in the protein

DNA complex. The apparent association equilibrium constant Ka is the reciprocal of KD.
As Eqn 5 is a hyperbolic function, then 1 F should t to a
linear function of 1 P and therefore KD is the slope of this
line. These two variables were tted by means of a robust
regression method [36,37] that avoided the deleterious effect
of data outliers on KD values. This tness does not assume
normal distribution of residual error. Calculations of coefcients and variances were done by programming iterative
algorithms which used least square estimates as initial values.

Acknowledgements
This work was supported by CONACYT (Mexico)
and by the European Community. We are grateful to
Mr Alfredo Padilla-Barberi for his excellent technical
assistance in the artwork.

References
1 Orozco E, Suarez ME & Sanchez T (1985) Differences
in adhesion, phagocytosis and virulence of clones from
Entamoeba histolytica, strain HM1: IMSS. Int J Parasitol 15, 655660.
2 De Menezes Feitosa L, Salgado LM, Rodr guez MA,
Vargas MA & Orozco E (1997) Phenotype variability
and genetic polymorphism in Entamoeba histolytica clonal populations. Arch Med Res 28, 2729.
3 Padilla-Vaca F, Ankri S, Bracha R, Koole LA & Mirelman D (1999) Down regulation of Entamoeba histolytica
virulence by monoxenic cultivation with Escherichia coli
O55 is related to a decrease in expression of the light
(35-kilodalton) subunit of the Gal GalNAc lectin. Infect
Immun 67, 20962102.
4 Bruchhaus I, Roeder T, Lotter H, Schwerdtfeger M &
Tannich E (2002) Differential gene expression in Entamoeba histolytica isolated from amoebic liver abscess.
Mol Microbiol 44, 10631072.
5 Petri WA Jr, Smith RD, Schlesinger PH, Murphy CF &
Ravdin JI (1987) Isolation of the galactose-binding lectin that mediates the in vitro adherence of Entamoeba
histolytica. J Clin Invest 80, 12381244.
6 Tannich E, Ebert F & Horstman RD (1991) Primary
structure of the 170-kDa surface lectin of pathogenic
Entamoeba histolytica. Proc Natl Acad Sc USA 88,
18491853.
7 Garc a-Rivera G, Rodr guez MA, Ocadiz R, Mart nezLopez MC, Arroyo R, Gonzalez-Robles A & Orozco E
(1999) Entamoeba histolytica: a novel cysteine protease
and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol
Microbiol 33, 556568.

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

8 Que X & Reed SL (2000) Cysteine proteinases and the

pathogenesis of amebiasis. Clin Microbiol Rev 13, 196
206.
9 Bruchhaus I, Loftus BJ, Hall N & Tannich E (2003)
The intestinal protozoan parasite Entamoeba histolytica
contains 20 cysteine protease genes, of which only a
small subset is expressed during in vitro cultivation.
Eukaryot Cell 2, 501509.
10 Zhai Y & Saier MH Jr (2000) The amoebapore superfamily. Biochem Biophys Acta 1469, 8799.
11 Hahn S (1998) The role of TAFs in RNA polymerase II
transcription. Cell 95, 579582.
12 Berk AJ (1999) Activation of RNA polymerase II transcription. Curr Opin Cell Biol 11, 330335.
13 Smale ST & Kadonaga JT (2003) The RNA polymerase
II core promoter. Annu Rev Biochem 72, 449479.
14 Lee TI & Young RA (2000) Transcription of eukaryotic
protein-coding genes. Annu Rev Genet 34, 77137.
15 Levine M & Tjian R (2003) Transcription regulation
and animal diversity. Nature 424, 147151.
16 Burley SK & Roeder RG (1996) Biochemistry and
structural biology of transcription factor IID (TFIID).
Annu Rev Biochem 65, 769799.
17 Hochheimer A & Tjian R (2003) Diversied transcription initiation complexes expand promoter selectivity
and tissue-specic gene expression. Genes Dev 17, 1309
1320.
18 Hernandez N (1993) TBP, a universal eukaryotic transcription factor? Genes Dev 7, 12911308.
19 Imbalzano AN, Zaret KS & Kingston RE (1994) Facilitated binding of TATA-binding protein to nucleosomal
DNA. J Biol Chem 18, 82808286.
20 Bucher P (1990) Weight matrix descriptions of four
eukaryotic RNA polymerase II promoter elements
derived from 502 unrelated promoter sequences. J Mol
Biol 212, 563568.
21 Gilchrist CA, Holm CF, Hughes MA, Schaenman JM,
Mann BJ & Petri WA Jr (2001) Identication and characterization of an Entamoeba histolytica upstream regulatory element 3 sequence-specic DNA-binding protein
containing EF-hand motifs. J Biol Chem 276, 11838
11843.
22 Schaenman JM, Gilchrist CA, Mann BJ & Petri WA Jr
(2001) Identication of two Entamoeba histolytica
sequence-specic URE4 enhancer-binding proteins with
homology to the RNA-binding motif RRM. J Biol
Chem 276, 16021609.
23 Gomez C, Perez DG, Lopez-Bayghen E & Orozco E
(1998) Transcriptional analysis of the EhPgp1 promoter
of Entamoeba histolytica multidrug-resistant mutant.
J Biol Chem 273, 72777284.
24 Marchat LA, Gomez C, Perez DG, Paz F, Mendoza L
& Orozco E (2002) Two CCAAT enhancer binding
protein sites are cis-activator elements of the Entamoeba

1365

Promiscuous E. histolytica TBP

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

36

histolytica EhPgp1 (mdr-like) gene expression. Cell

Microbiol 4, 725737.
Luna-Arias JP, Hernandez-Rivas R, de Dios-Bravo G,
Garc a J, Mendoza L & Orozco E (1999) The TATA-box
binding protein of Entamoeba histolytica: cloning of the
gene and location of the protein by immunouorescence
and confocal microscopy. Microbiol 145, 3340.
Mendoza L, Orozco E, Rodr guez MA, Garc a-Rivera
G, Sanchez T, Garc a E & Gariglio P (2003) Ehp53, an
Entamoeba histolytica protein, ancestor of the mammalian tumour suppressor p53. Microbiol 149, 885893.
Nikolov DB, Chen H, Halay ED, Hoffmann A, Roeder
RG & Burley SK (1996) Crystal structure of a human
TATA box-binding protein TATA element complex.
Proc Natl Acad Sci USA 93, 48624867.
De Dios-Bravo G, Lopez C, Luna-Arias JP & Orozco E
(2000) DNA binding activity and predicted tertiary
structure of the TATA binding protein of Entamoeba
histolytica. Arch Med Res 31, S299S300.
Bruchhaus I, Leippe M, Lioutas C & Tannich E (1993)
Unusual gene organization in the protozoan parasite
Entamoeba histolytica. DNA Cell Biol 12, 925933.
Purdy JE, Pho LT, Mann BJ & Petri WA Jr (1996)
Upstream regulatory elements controlling expression of
the Entamoeba histolytica lectin. Mol Biochem Parasitol
78, 91103.
Singh U, Gilchrist CA, Schaenman JM, Rogers JB,
Hockensmith JW, Mann BJ & Petri WA Jr (2002) Context-dependent roles of the Entamoeba histolytica core
promoter element GAAC in transcriptional activation
and protein complex assembly. Mol Biochem Parasitol
120, 107116.
Bidder M, Shao JS, Charlton-Kachigian N, Loewy AP,
Semenkovich CF & Towler DA (2002) Osteopontin
transcription in aortic vascular smooth muscle cells is
controlled by glucose-regulated upstream stimulatory
factor and activator protein-1 activities. J Biol Chem
277, 4448544496.
Wobbe CR & Struhl K (1990) Yeast and human
TATA-binding proteins have nearly identical DNA
sequence requirements for transcription in vitro. Mol
Cell Biol 10, 38593867.
Strubin M & Struhl K (1992) Yeast and human TFIID
with altered DNA-binding specicity for TATA elements. Cell 68, 721730.
Coleman RA & Pugh BF (1995) Evidence for functional binding and stable sliding of the TATA binding
protein on nonspecic DNA. J Biol Chem 270,
1385013859.
Atkinson AC (1985) The algebra of deletion. In Plots,
Transformations and Regression: an Introduction to
Graphical Methods of Diagnostic Regression Analysis
(Copas, JB, Dawid, AP, Eagleson, GK, Pierce, DA &

1366

G. de Dios-Bravo et al.

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

Silverman, BW, eds), pp. 1315. Oxford University

Press, Oxford, UK.
Lopez-Canovas L, Biscay R, Noa MD, PerezPerez G,
Herrera JA, Orozco E & Riveron AM (1998) Comparison of DNA migration in two CHEF chambers of different sizes. J Chromat 806, 187197.
Patikoglou GA, Kim JL, Sun L, Yang SH, Kodadek T
& Burley SK (1999) TATA element recognition by the
TATA box-binding protein has been conserved throughout evolution. Genes Dev 13, 32173230.
Basehoar AD, Zanton SA & Pugh F (2004) Identication and distinct regulation of yeast TATA box-containing genes. Cell 116, 699700.
Chen W & Struhl K (1988) Saturation mutagenesis of a
yeast his3 TATA element: genetic evidence for a specic TATA-binding protein. Proc Natl Acad Sci USA 85,
26912695.
Hoopes BC, LeBlanc JF & Hawley DK (1992) Kinetic
analysis of yeast TFIID-TATA box complex formation
suggests a multi-step pathway. J Biol Chem 16, 11539
11547.
Perez-Howard GM, Weil PA & Beechem JM (1995)
Yeast TATA binding protein interaction with DNA:
Fluorescence determination of oligomeric state,
equilibrium binding, on-rate, and dissociation kinetics.
Biochemistry 34, 80058017.
Diamond LS, Harlow R & Cunnick C (1978) A new
medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg
72, 431432.
Richard EJ (1994) Separation of double- and
single-stranded nucleic acids using hydroxylapaytite
chromatography. In Current Protocols in Molecular
Biology (Ausubel, FM, Brent, R, Kingston, RE, Moore,
DD, Sheidman, JG, Smith, JA & Struhl, K, eds),
pp. 2.13.12.13.3. John Wiley & Sons, Inc., Chichester,
UK.
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for
the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem
72, 248254.
Towbin H, Staehelin T & Gordon J (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to
nitrocellulose sheets: procedure and some applications.
Proc Natl Acad Sci USA 76, 43504356.
Perez DG, Gomez C, Lopez-Bayghen E, Tannich E &
Orozco E (1998) Transcriptional analysis of the EhPgp5
promoter of Entamoeba histolytica multidrug-resistant
mutant. J Biol Chem 273, 72857292.
Rodr guez MA, Hidalgo ME, Sanchez T & Orozco E
(1996) Cloning and characterization of the Entamoeba
histolytica pyruvate: ferredoxin oxidoreductase gene.
Mol Biochem Parasitol 78, 273277.

FEBS Journal 272 (2005) 13541366 2005 FEBS

Archives of Medical Research 31 (2000) S299S300

DNA Binding Activity and Predicted Tertiary Structure of the

TATA Binding Protein of Entamoeba histolytica
Guadalupe de Dios-Bravo,** Csar Lpez,** Juan Pedro Luna-Arias**,*** and Esther Orozco*,**
*Departamento de Patologa Experimental, Centro de Investigacin y de Estudios Avanzados del I.P.N. (Cinvestav), Mexico City, Mexico
**Posgrado en Biomedicina Molecular, Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa Avanzada del I.P.N.
(CICATA-IPN), Mexico City, Mexico
***Departamento de Biomedicina Molecular, Cinvestav, Mexico City, Mexico

Key Words: Entamoeba histolytica, TATA-binding protein, Gel mobility shift assay,
Tertiary structure prediction.

Introduction

Materials and Methods

The initiation of RNA polymerase II-directed transcription

is a multistep process requiring the coordinated interaction
of many proteins including the following: (i) basal factors
assembled proximal to the transcription start site; (ii) activators bound to more distal enhancer sequences, and (iii) coactivators that function to bridge these two groups. The
transcription factor TFIID recognizes and binds the core
promoter through interactions with the TATA box, the initiator sequence, and the downstream promoter element.
TFIID is formed by the TATA-binding protein (TBP) and
several TBP-associated factors (TAFs), whose primary sequences are well conserved from yeast to humans. TBP
plays a central role in transcription regulation, and could replace TFIID as the nucleating factor for the preinitiation
complex assembly (1).
Recently, we have reported the cloning and expression of
the Entamoeba histolytica tbp gene. The predicted amino
acid sequence of the EhTBP showed 55% sequence identity
to the Homo sapiens TBP, 54% to the A. castellanii TBP,
and 37% to the TBP of P. falciparum. The EhTBP C-terminal domain contains all the structural elements identified in
other TBPs (2).
In this paper, we demonstrate the functional activity of
the recombinant EhTBP expressed in bacteria. Based on the
protein sequence, we predicted the tertiary structure of
EhTBP, using a method for protein folding that involves the
modeling of protein structures using a given sequence, the
frameworks of known protein folding, and crystalline structures (3,4). We also analyzed the relevant features of this
predicted structure in comparison with other TBPs.

Sequence. The Ehtbp gene sequence was obtained from a

plasmid previously isolated from an E. histolytica genomic
DNA library constructed in ZapII. The predicted amino
acid sequence of EhTBP was compared with other TBP sequences in GeneBank using the algorithm of Altschul et al.
(1990) (5).
Gel mobility shift assay. E. coli BL21(DE3) cells were transformed with the plasmid pRSETA-TBP. Extracts from uninduced and induced bacteria were incubated on ice with a
double-stranded 3 end-labeled DNA fragment carrying the
TATA motif of EhPgp5 promoter. Reactions were done in
20 L of buffer containing 12 mM HEPES (pH 7.9), 12
mM Tris-HCl (pH 7.9), 12 mM KCl, 7.5 mM MgCl2, and
0.6 mM DTT. After 10 min of interaction, the samples were
subjected to electrophoresis on a native 6% polyacrylamide
gel and visualized by autoradiography.
Computer modeling. We used the SWISS-MODEL version
3.5 algorithm to predict protein folding and tertiary structure. This program functions as an automated modeling procedure that consists of the extrapolation of the structure for
a new (target) sequence from the known 3D structure of related family members (templates). The 3D match is carried
out by superimposing the corresponding C atom pairs selected automatically from the highest scoring local sequence
alignment. Possible structural mistakes obtained for the 3D
structure were revised with the IFCHECK program (6).

Results and Discussion

Address reprint requests to: Esther Orozco, Departamento de Patologa
Experimental, Cinvestav, Apdo. Postal 14-470, 07000 Mxico, D.F.,
Mxico. Tel.: (525) 747-3800, ext. 5650; FAX (525) 747-7108; E-mail:
eorozco@mail.cinvestav.mx
Presenting author: Guadalupe de Dios-Bravo.

Functionality of the recombinant TBP. We examined whether

recombinant protein binds to DNA. A complex was detected
(Figure 1b, lane 3) when the probe was incubated with the induced BL21(DE3) extracts, which express the recombinant

0188-4409/00 $see front matter. Copyright 2000 IMSS. Published by Elsevier Science Inc.
PII S0188-4409(00)00 1 2 6 - 0

S300

de Dios-Bravo et al./ Archives of Medical Research 31 (2000) S299S300

EhTBP observed by SDS-PAGE (Figure 1a, lane 3). An interaction was not observed in the gel mobility shift assay when the
uninduced BL21(DE3) extracts not expressing the recombinant
EhTBP (Figure 1a, lane 2) were incubated with the TATADNA motif, as shown in Figure 1b, lane 2. These preliminary
findings confirmed that the EhTBP is a protein that has binding
activity to the TATA box. However, in vitro transcription assays are necessary to characterize the functionality of the recombinant protein.
Structure description. The EhTBP C-terminal domain (residues 48229) comprises 182 residues. It has two direct repeats (DR1, residues 57116 and DR2, residues 147207)
described in other organisms as responsible for protein
DNA binding. The overall backbone structure of EhTBP
has been shown to be basically identical to those of their
bacterial and eukaryotic counterparts (Figure 1c).
The predicted EhTBP is folded into a symmetrical /
structure resembling a molecular saddle with two structural
domains of 5960 amino acids related by approximate intramolecular two-fold symmetry. Each domain or structural
repeat comprises approximately one-half of the phylogenetically conserved C-terminus of TBP, consisting of a fivestrand, curved antiparallel -sheet and two -helices. The

two helices lie approximately perpendicular to each other, at

about the convex side of the sheet forming the hydrophobic
core of each domain. The concave underside of the saddle is
lined with the central strands of the antiparallel -sheet,
which contain all amino acids implicated in DNA binding.
Even when the gel mobility shift assay demonstrates that
the recombinant EhTBP (in native condition without being
purified) can bind to the TATA-DNA motif, which correlated with the predicted structure, the method to predict protein folding described here provides a new approach if a sequence requires identification with one of the templates
derived from known three-dimensional structures.
In conclusion, while the high-precision structures required for detailed studies of proteinligand interaction can
be obtained experimentally, theoretical protein modeling
provides the molecular biologist with models that possess
enough essential information about the spatial arrangement
of important residues to guide the design of experiments.
Methods such as that described here should play a valuable
role not only in suggesting three-dimensional structures of
gene products, but also in suggesting biological functions.
Acknowledgments
E.O. is an international fellow of the Howard Hughes Medical Institute (USA). This work was also supported by Conacyt (Mexico)
and by a research scholarship from CICATA-IPN (Mexico).

References

Figure 1. (a) SDS-PAGE of uninduced BL21 extracts (lane 2) and induced

extracts (lane 3). Molecular markers are shown in lane 1. (b) Gel mobility
shift assay. Lane 1, free probe; lane 2, probe incubated with uninduced
BL21(DE3) extracts, and lane 3, same probe incubated with induced
BL21(DE3) extracts. The position of the TBPDNA complex is shown by
an arrow. (c) 3D predicted structure of the EhTBP using the Guex algorithm. (DR1) direct repeat 1, and (DR2) direct repeat 2.

1. Kim, JL, Burley SK. 1.9 resolution refined structure of TBP recognizing the minor groove of TATAAAAG. Struct Biol 1994;1:638.
2. Luna-Arias, JP, Hernndez-Rivas R, de Dios-Bravo G, Garca J, Mendoza L, Orozco E. The TATA-box binding protein of Entamoeba histolytica: cloning of the gene and location of the protein by immunofluorescence and confocal microscopy. Microbiology 1999;145:33.
3. Guex N, Peitsch MC. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: an
environment for comparative protein modelling. Electrophoresis 1997;
18:2714.
4. Johnson MS, Overington JP, Blundell TL. Alignment and searching for
common protein folds using a data bank of structural templates. J Mol
Biol 1993;231:735.
5. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local
alignment search tool. J Mol Biol 1990;215:403.
6. Peitsch M.C. ProMod and Swiss-Model: internet-based tools for automated comparative protein modelling. Biochem Soc Trans 1996;24:274

Microbiology (1999), 145, 3340

Printed in Great Britain

The TATA-box binding protein of Entamoeba

histolytica : cloning of the gene and location of
the protein by immunofluorescence and
confocal microscopy
Juan P. Luna-Arias,1,3 Rosaura Hernandez-Rivas,1
Guadalupe de Dios-Bravo,3 Job Garcia1, Leobardo Mendoza3
and Esther Orozco2,3
Author for correspondence : Esther Orozco. Tel : j52 5 747 7000 ext. 5642. Fax : j52 5 747 7108.
e-mail : esther!mail.cinvestav.mx

1,2

Program of Molecular
Biomedicine1, and
Department of
Experimental Pathology2,
CINVESTAV, IPN, A.P.
14-740, Mexico 07300 DF,
Mexico

CICATA, IPN, Legaria 694,

Mexico 11590 DF, Mexico

A 309 bp DNA fragment from Entamoeba histolytica was amplified by PCR

using primers derived from the Acanthamoeba castellanii consensus TATA-box
binding protein amino acid sequence. The amplified fragment was used to
isolate cDNA and genomic DNA clones containing an ORF encoding the
complete E. histolytica TATA-box binding protein (Ehtbp, 702 bp, 234 aa,
molecular mass 26 kDa). The EhTBP functional domain showed 55 % sequence
identity to that of Homo sapiens, 54 % to A. castellanii and 37 % to Plasmodium
falciparum TBPs. In Southern blot experiments we detected a single Ehtbp
band, which was transcribed as a 13 kb mRNA containing a 420 nt 5'
untranslated region. However, the probe hybridized with the 08 and 15 Mb
chromosomes, suggesting that this sequence is diploid. In situ PCR assays
showed two signals in 95 % of trophozoites, one located in the nucleus and
another in EhkO, the novel DNA-containing organelle recently reported. The
recombinant E. histolytica TATA-box binding protein was expressed in
Escherichia coli. Antibodies against it recognized two proteins of 26 and
29 kDa in E. histolytica nuclear extracts. Confocal microscopy
immunofluorescence analysis located the protein in both the nucleus and
EhkO.

Keywords : Entamoeba histolytica, TATA-box binding protein, tbp gene expression

INTRODUCTION

Entamoeba histolytica is a protozoon responsible for

human amoebiasis. Knowing its DNA structure and its
mechanisms for regulating gene transcription is a step
toward understanding virulence. E. histolytica has an
AjT rich genome (67 mol %) (Sa!nchez et al., 1994 ;
Tannich & Horstmann, 1992) and its codon usage is
unusual, with 85 % AjU in the third codon position
(Bruchhaus et al., 1993). Putative TATA boxes with
TATTAAA, TATAAA (Sa!nchez et al., 1994) and
TATTTAAA sequences (Bruchhaus et al., 1993 ; Li et
al., 1992) have been located 27 to 50 bp upstream from
.................................................................................................................................................

Abbreviations : TAFE, transverse alternating field electrophoresis; TBP,

TATA-box binding protein ; UTR, untranslated region.
The EMBL accession number for the sequence reported in this paper is
Z48307.
0002-2676 # 1999 SGM

the ATG start codon. The ATTCA and ATCA sequences have been described as consensus transcription
start sites (Bruchhaus et al., 1993). Remarkably, proteinencoding gene transcription is insensitive in vitro to
1 mg -amanitin ml", suggesting that the RNA polymerase differs from those of other eukaryotic organisms
(Lioutas & Tannich, 1995), but little is known about the
transcription machinery.
Studies of promoter structure and function began
recently with the characterization of the hgl2 and hgl5
gene promoters, which encode the slightly different
170 kDa heavy subunits of the galactose-inhibitable
lectin (Bu et al., 1995 ; Purdy et al., 1996 ; Singh et al.,
1997). The TATA box, the CCAAT box (hgl2) and the
GAAC element (hgl5) were identified as regulators for
full promoter activity in vivo. We have studied factors
involved in expression of the EhPgp1 and EhPgp5 genes,
both responsible for the multidrug resistance phenotype
33

J. P. L U N A-A R I A S a n d O T H E R S

in E. histolytica (Orozco et al., 1995). The EhPgp5 gene

is induced by the presence of emetine in the medium and
has a typical TATA box element that was not found in
the promoter of the constitutively expressed EhPgp1
gene (Go!mez et al., 1998 ; Pe!rez et al., 1998).
The TATA-box binding protein (TBP) is associated
with several transcription factors to make up the
multiprotein complexes SL1 (Comai et al., 1992), TFIID
(Dynlacht et al., 1991) and TFIIIB (Kassavetis et al.,
1992 ; Taggart et al., 1992), which are used by a specific
RNA polymerase (White & Jackson, 1992). TBP is the
first molecule in the assembly of TFIID, indicating its
central role in transcription (Chen et al., 1994). Its
functional domain, a 180 aa sequence located at the Cterminus, is highly conserved in most tbp genes
(Horikoshi et al., 1989 ; Nikolov et al., 1992 ; Struhl,
1994). However, the Plasmodium falciparum tbp sequence diverges significantly from other tbp genes. Due
to the unusual AjT richness of the P. falciparum and E.
histolytica genomes (Pollack et al., 1982 ; Bruchhaus et
al., 1993 ; McAndrew et al., 1993), the transcription

factors in these parasites may differ from those reported

in humans, making them a good target for drug design.
In this paper we report the cloning, molecular characterization and expression of the E. histolytica tbp gene
(Ehtbp). The localization of the protein by immunofluorescence and confocal microscopy was also performed.
METHODS
E. histolytica cultures. Trophozoites of E. histolytica clone A,
strain HM1 : IMSS were cultured in TYI-S-33 medium and
harvested during the exponential growth phase (Diamond et
al., 1978).
Cloning and sequencing of the Ehtbp gene. Two oligo-

nucleotide primers (sense : 5h GCTTTACATGCTAGAAATGCT 3h and antisense : 5h TGGAAATAATTCTGGTTCATA

3h) corresponding to the nucleotide sequence in conserved
regions in the C-terminal domain of A. castellanii TBP (Actbp,
bp 354374 and 651671) (Wong et al., 1992a) were
synthesized (model 381A, Applied Biosystems) using E.
histolytica codon preferences (Tannich & Hortsmann, 1992).

(a)

.....................................................................................................

(b)

DR1

48 57

116

147

145

109
B domain

DR2

207

234

170
201
r region

Fig. 1. (a) Comparison of the E. histolytica,

A. castellanii, P. falciparum and H. sapiens
TBP amino acid sequences. Direct repeats
are boxed ; the basic domain is double
underlined ; :, identical amino acids ; k,
gaps introduced during the comparison ; j,
basic residues in conserved position within
the basic domain. Numbers correspond to
the residue number for each TBP. (b)
Diagram of the complete Ehtbp ORF with
the elements found in other TBPs: DR1,
direct repeat 1 (residues 57116); DR2, direct
repeat 2 (residues 147207); B domain, basic
domain (residues 109145); region, factor homology region (residues 170201).

Table 1. Percentage amino acid identities in the C-terminal domain of EhTBP and other
TBPs

A. castellanii
P. falciparum
H. sapiens

C terminus*

DR1

DR2

B domain

54
37
55

65
43
63

62
41
64

47
40
44

region
59
50
59

* C terminus is the functional domain for each TBP (residues 48234 in EhTBP).
DR1 and DR2 correspond to direct repeats 1 (residues 57116 in EhTBP) and 2 (residues 147207 in
EhTBP), respectively.
B domain is the basic domain (residues 109145 in EhTBP).
factor region (residues 170201 in EhTBP).
34

TATA-box binding protein of Entamoeba histolytica

Production, purification of anti-EhTBP rabbit polyclonal

antibodies and Western blot analysis. Recombinant EhTBP

(100 g) was electroeluted from a 12 % SDS-polyacrylamide

gel and subcutaneously injected with 500 l Freunds complete
adjuvant into a New Zealand rabbit (24 months old). Before
the serum was obtained, three additional immunizations were
done at 23 week intervals using Freunds incomplete adjuvant. Anti-EhTBP-specific antibodies were affinity purified
using the recombinant EhTBP immobilized on a nitrocellulose
membrane (Ausubel et al., 1994). Western blot assays were
done using the purified recombinant TBP and nuclear extracts
(Go!mez et al., 1998 ; Pe!rez et al., 1998) and the ECL detection
system (Amersham).
Confocal and immunofluorescence microscopy. Trophozoites

were grown overnight on sterile coverslips, fixed with 3n8 %

(v\v) paraformaldehyde, permeabilized with 0n1 % (v\v)
Triton X-100 and blocked with 1 % (w\v) BSA. The fixed
trophozoites were incubated with a 1 : 10 dilution of rabbit
anti-EhTBP polyclonal antibody and then with a 1 : 1000
dilution of goat anti-rabbit polyclonal antibody labelled with
Cy2 Dye (Amersham). Finally, cells were counterstained with
0n5 mg propidium iodide ml" in PBS for 5 min and examined
through a Nikon microscope attached to a laser confocal
scanning system MRC 1024 (Bio-Rad).

RESULTS AND DISCUSSION

Cloning the Ehtbp gene

kb

(b)

( c)
Mb

Poly(A)+

(a)

AccI

A 309 bp fragment of E. histolytica DNA was amplified

by PCR using primers from bp 354374 and 651671 of
the A. castellanii tbp gene (not shown). This fragment
was used to isolate two identical genomic DNA and
cDNA clones, indicating the absence of introns in the
Ehtbp gene, as also reported for other E. histolytica
genes (Descoteaux et al., 1992 ; Sa!nchez et al., 1994). The
genomic DNA clone contained a 2190 bp insert with a

EcoRI

For PCR, 100 ng E. histolytica genomic DNA was used as the

template. Denaturation was carried out at 94 mC for 1 min,
annealing at 45 mC for 1 min and extension at 72 mC for 2 min,
for a total of 35 cycles. The 309 bp PCR-amplified fragment
was sequenced with Sequenase version 2.0 (US Biochemicals).
After labelling with [-$#P]dATP and a Random Primed DNA
Labelling Kit (Boehringer), the fragment was used to screen E.
histolytica cDNA and genomic DNA libraries constructed inZAPII (Descoteaux et al., 1992 ; Sa!nchez et al., 1994). Both
strands of cDNA and DNA clones containing the full length
Ehtbp gene were sequenced. The predicted amino acid
sequence of EhTBP was compared with other TBP sequences
in GenBank using the algorithm of Altschul et al. (1990). For
hydropathy analyses of EhTBP, the algorithm of Kyte &
Doolittle (1982) was used.
Southern and Northern blot analysis. Total DNA from E.
histolytica was isolated by discontinuous caesium chloride
gradients (Sa!nchez et al., 1994) and digested with various
endonucleases. The digested DNA (5 g) was electrophoresed
through 0n8 % (w\v) agarose gels and transferred to nylon
membranes (DuPont NEN). On the other hand, E. histolytica
DNA was separated by transverse alternating field electrophoresis (TAFE) in 1 % (w\v) agarose gels and transferred to
nylon membranes (Orozco et al., 1993). Hybridization was
performed at 42 mC and filters washed at 65 mC (Orozco et al.,
1993). For Northern blot experiments, total RNA from E.
histolytica was isolated using 4 M guanidine isothiocyanate
and caesium chloride centrifugation as described (Ausubel et
al., 1994 ; Sa!nchez et al., 1994). Poly(A)+ RNA was purified
through poly(U)-Sephadex columns (Gibco-BRL) according
to the manufacturers instructions. Poly(A)+ RNA (36 g)
was electrophoresed through formaldehyde 1 % (w\v) agarose
gels, transferred to nylon membranes and hybridized with
Ehtbp DNA using the conditions described above.
In situ PCR. This was performed using a GeneAmp In situ PCR
System 1000 (Perkin Elmer), following the manufacturers
instructions. As primers we used the TBP1 (5h CGGGGATCCATGTCAACACCTGGAGA 3h) and TBP2 (5h CCGGAATTCTTATTGATTTGATATATCTTC 3h) oligonucleotides.
Determination of the Ehtbp transcription start site. Primer
extension experiments were performed as described by Go!mez
et al. (1998) and Pe!rez et al. (1998) with some modifications.
Total RNA (50 g) was used to extend the pexttbp (5h
ACTCAGTTGAAGTTGACATA 3h) or ptbpn-01 (5h TGTCTTTTCATTTAAGGCTCA 3h) primers. 100 U SuperScript
II (Gibco BRL) were used per reaction ; the conditions used
were 94 mC for 1 min, 42 mC for 10 min and 37 mC for 10 min.
Expression and purification of EhTBP. The full length Ehtbp
was cloned in-frame into the pRSETA expression vector
(Invitrogen) after PCR amplification of the E. histolytica
genomic clone with the oligonucleotides TBP1 and TBP2. A
recombinant plasmid was isolated and used to transform E.
coli BL21(DE3) allowing expression of the recombinant
EhTBP as a fusion polypeptide at the N-terminus, containing
4 aa (MRGS) followed by a 6 H tag and the sequence
GMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGS, in which
there is an enterokinase recognition sequence. Expression of
recombinant EhTBP was induced by 1 mM IPTG for 1n5 h.
Cells were harvested by centrifugation and the recombinant
EhTBP was partially purified under denaturing conditions
through a Ni#+-NTA affinity column (QIAGEN). Further
purification was obtained by 12 % SDS-PAGE and electroelution of the protein (Ausubel et al., 1994).

kb

20
15
7
13
08

.................................................................................................................................................

Fig. 2. Southern and Northern blot analysis of the E. histolytica

tbp gene. (a) Southern blot of E. histolytica genomic DNA
digested with EcoRI and AccI enzymes. (b) Southern blot of
high molecular mass DNA separated by TAFE. (c) Northern blot
of poly(A)+ RNA.

35

J. P. L U N A-A R I A S a n d O T H E R S

(a)

(b)

N
EhkO

EhkO

EhkO

EhkO
(c)

(d)

.....................................................................................................

Fig. 3. Confocal microscopy of trophozoites.

(a) Exponentially growing cells were used to
amplify the full length Ehtbp gene by in
situ PCR with the oligonucleotides TBP1 and
TBP2, and Cy5-dCTP. Cells were observed in
the blue channel. (b) Cells counterstained
with propidium iodide and observed in the
red channel. (c) Transmission microscopy of
the cells observed in (a) and (b). (d). Cells
treated as in (a), but no AmpliTaq was used
in the in situ PCR reaction. N, nucleus ; EhkO,
EhkO organelle.

702 bp ORF encoding a predicted 234 aa (26 kDa)

polypeptide with a pI of 9n27. The predicted amino acid
sequence of this ORF showed 55 % identity to the H.
sapiens TBP, 54 % to the A. castellanii TBP and 37 % to
the TBP of P. falciparum (Fig. 1a). Ehtbp contained an
ATCA consensus sequence 8 bp upstream of the ATG
start codon, which is similar to the sequence described
as a transcription start site (Bruchhaus et al., 1993). In
addition, downstream of the stop codon we located
three TAATT sequences at 48, 75 and 180 nt, proposed
as the polyadenylation signal for several genes
(Bruchhaus et al., 1993), and at 76 nt an AATTAA
sequence proposed as the polyadenylation signal for the
Ehtub1 gene (Sa!nchez et al., 1994). As reported for
other genes (Tannich & Horstmann, 1992), the Ehtbp
gene has 68 % AjU base preference in the coding
regions.
Characterization of the EhTBP sequence

The EhTBP C-terminal domain (residues 48229) comprises 182 residues and its alignment with other TBP
functional domains showed 55 % and 54 % identity with
the H. sapiens and A. castellanii TBPs, respectively, and
only 37 % identity with the TBP from P. falciparum (Fig.
1a ; Table 1), which is a protozoon with a similar AjT
content in its genome.
The EhTBP C-terminal domain (Fig. 1b) contains all the
structural elements identified in other TBPs. It has two
36

A C G T

A
A
A
C
A
G
T
G
C
G
T
T
G
A
A

.................................................................................................................................................

Fig. 4. Determination of the transcription start site for the

Ehtbp mRNA. Primer extension experiments were performed
with the oligonucleotide ptbpn-01 and total E. histolytica RNA
(50 g). The arrow shows the primer extension product that
mapped to the ACGC sequence (coding strand). X, primer
extension lane.

TATA-box binding protein of Entamoeba histolytica

(a)

kDa
200

(b) kDa
974
1

4
68

974
68

43

43
29

29

184
.................................................................................................................................................

Fig. 5. Purification and immunodetection of the recombinant

EhTBP. (a) 12 % SDS-PAGE. Lanes : 1, molecular mass markers; 2
and 3, E. coli BL21(DE3) cells transformed with pRSETA (lane 2)
or pRSETA/Ehtbp plasmids (lane 3), induced with 1 mM IPTG as
described in Methods ; 4, recombinant EhTBP purified by Ni2+NTA affinity chromatography. (b). Western blot analysis of
molecular mass markers (lane 1), 100 g E. histolytica nuclear
extracts (lane 2) and 500 ng purified recombinant EhTBP (lane 3).

(a)

direct repeats (DR1 and DR2, residues 57116 and

147207, respectively ; Fig. 1b) described in other
organisms as responsible for proteinDNA binding
(Nikolov et al., 1992). The EhTBP repeats show 4165 %
identity to those of A. castellanii, P. falciparum and H.
sapiens TBPs (Table 1). A region with homology to the
sigma factor ( factor 2.3 and 2.4 domains) (Horikoshi et
al., 1989), located at residues 170201, is contained in
DR2 (Fig. 1b). A highly basic region (residues 109145)
connects the two direct repeats in EhTBP (Fig. 1b). This
core has eight basic residues, seven of which are
conserved in all TBPs studied (Fig. 1a). We found
4047 % identity with the A. castellanii, P. falciparum
and H. sapiens TBPs in this region of EhTBP (Table 1).
The Arabidopsis thaliana TBP2 basic domain forms an
-helix that is involved in TFIIATBP interactions
(Nikolov et al., 1992).
The EhTBP N-terminal domain is 47 aa long and rich in
hydrophobic residues (Fig. 1a). In contrast, the human
TBP N-terminus is 158 aa long, but is also rich in
hydrophobic residues, with a segment of 38 consecutive
glutamines (Q-run) (Peterson et al., 1990) that was not

(b)

N
EhkO
N

N
N

(c)

EhkO

(d)

N
EhkO

EhkO

N
N

N
N

EhkO

EhkO

.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................

Fig. 6. Confocal immunofluorescence microscopy of EhTBP. E. histolytica trophozoites were exponentially grown and
treated with anti-EhTBP rabbit polyclonal antibodies and counterstained with propidium iodide. (a) Control cells treated
only with the goat anti-rabbit polyclonal antibodies coupled to Cy2 Dye and observed in the green channel. (b) Cells
stained with propidium iodide and observed in the red channel. (c) Cells treated with anti-EhTBP rabbit polyclonal
antibodies and goat anti-rabbit polyclonal antibodies coupled to Cy2 Dye and observed in the green channel. (d) Cells
treated as in (b) and (c) observed simultaneously in both channels. N, nucleus ; EhkO, EhkO organelle.

37

J. P. L U N A-A R I A S a n d O T H E R S

found in the EhTBP N-terminal domain. One of the

challenges in the study of human parasites is to find
differences between host and parasite molecules that can
be used as drug targets, and to design vaccine targets.
Differences in the TBP N-terminal domains could be
useful to identify E. histolytica-specific transcription
factors or other molecules involved in gene-expression
regulation, like the DNA-dependent protein kinase that
hyperphosphorylates the N-terminal domain of
Xenopus TBP (Labhart, 1996). This phosphorylation
was seen to be fully dependent on the presence of the Cterminal core domain.
Copy number of the Ehtpb gene

To assess the copy number of the Ehtbp gene, we carried

out Southern blot experiments using both DNA digested
with several restriction enzymes and high molecular
mass DNA separated by TAFE (Orozco et al., 1993). We
used the full-length gene as a probe. Single bands of 7
and 20 kb were observed in DNA digested with EcoRI
and AccI, respectively, enzymes that cut outside the
ORF (Fig. 2a). Analysis with DNA digested with several
other enzymes also revealed a single band (data not
shown), suggesting that there is a single copy of the
Ehtbp gene in the genome. The PCR fragments, and the
cDNA and genomic DNA clones contained the same
sequence, also suggesting the presence of a unique gene.
However, in TAFE-separated DNA, Ehtbp hybridized
with 0n8 and 1n5 Mb chromosomes (Fig. 2b). These two
bands, reproducibly obtained in TAFE, could correspond to two copies of the same gene located on
different chromosomes, suggesting diploidy of Ehtbp or
cross-hybridization with other sequences in the genome.
In situ PCR

To investigate the cellular location of the Ehtbp gene we

carried out in situ PCR experiments. The TBP1 (sense)
and TBP2 (antisense) oligonucleotides used for the in
situ PCR amplified the 702 bp full length tbp gene. In
100 % of the cells the Cy5 fluorochrome detected the tbp
gene in the nuclei (Fig. 3). In contrast, 95 % of the
trophozoites also presented small fluorescent spots
outside the nucleus, probably corresponding to the
EhkO organelle. This strongly suggests that there is
more than one copy of the tbp gene in trophozoites. The
two copies of the tbp gene must show similar sequence,
because a single restriction band was found in Southern
blot experiments (Fig. 2a) using the full length gene as a
probe, total DNA and enzymes cutting outside the gene.
Thus, the two DNA bands detected in TAFE experiments using whole trophozoites may correspond to
similar tbp genes located on different DNA molecules,
one in the nucleus and another in EhkO. However, some
reports indicate that there is a TBP-related factor in
Drosophila that is capable of replacing TBP for in vitro
transcription (Buratowski, 1997 ; Hansen et al., 1997).
We have not yet investigated the presence of a TBPrelated factor in E. histolytica, whose gene could crosshybridize with Ehtbp.
38

Transcription of the Ehtpb gene

Northern blot experiments revealed a 1n3 kb transcript

in poly(A)+ RNA (Fig. 2c). This mRNA is larger than
the Ehtbp ORF, which is 702 bp long. These results
agree with other reports indicating that several tbp genes
are transcribed as larger mRNAs than their ORFs. The
ORFs of the Drosophila (Hoey et al., 1990), human
(Peterson et al., 1990) and Plasmodium (McAndrew et
al., 1993) tbp genes are 1059, 1017 and 684 bp long,
respectively, while their transcripts are 1n6, 1n82 and
1n8 kb, respectively. As in other organisms, Ehtbp
mRNA contains untranslated regions (UTRs), probably
important for its stability or localization. Human and
Drosophila tbp genes have long 5h UTRs (241 and
173 nt, respectively) (Peterson et al., 1990 ; Hoey et al.,
1990), while A. castellanii tbp contains a 67 nt 5h UTR
(Wong et al., 1992b).
To confirm that the tbp gene has a long 5h UTR and that
it was transcribed in a single transcript, we carried out
primer extension experiments using the pexttbp oligonucleotide located 100 bases downstream of the ATG
start codon (not shown) or the ptbpn-01 oligonucleotide
located at 150 bases upstream of the ATG. In all cases,
primer extension results showed a single transcription
start site for the tbp gene at the ACGC sequence located
420 bases upstream of the ATG codon (Fig. 4). The
Ehtbp mRNA 3h UTR may be 180 bases long to give the
1n3 kb transcript. Most E. histolytica genes have short 5h
UTRs (Bruchhaus et al., 1993), although the EhPAK and
EhMCM3 mRNAs have 265 and 126 nt 5h UTRs
(Gangopadhyay et al., 1997). The Ehtbp 5h UTR is the
longest reported for amoebic genes. In these three cases,
the transcription start site sequences (CAATT, TTAA
and ACGC for EhPAK, EhMCM3 and Ehtbp mRNA,
respectively) differed from the ATTCA or ATCA
sequences reported as the consensus start sites
(Bruchhaus et al., 1993). A putative TATA box
(ATTAATT) was located at 28 bp upstream of the
transcription start site.
Expression of EhTBP

We cloned the Ehtbp ORF in-frame into the pRSETA

expression vector and its expression was IPTG induced.
Transformed bacteria produced a 30 kDa polypeptide
(Fig. 5a), 4 kDa larger than the molecular mass deduced
from the Ehtbp ORF. This was due to the small fusion
polypeptide encoded by the expression vector (described
in Methods). Rabbit polyclonal antibodies against the
recombinant EhTBP were generated and they detected
two 26 and 29 kDa polypeptides in nuclear extracts (Fig.
5b). The 29 kDa protein could be the phosphorylated
form of the 26 kDa TBP, as has been reported for other
TBPs (White et al., 1995 ; Ghavidel & Schultz, 1997 ;
Chibazakura et al., 1997), although protein degradation
can not be disregarded.
Intracellular location of EhTBP

Confocal microscopy and immunofluorescence analysis

revealed that EhTBP is located in the nucleus and in

TATA-box binding protein of Entamoeba histolytica

subcellular structures corresponding to EhkO, the novel

organelle recently reported (Orozco et al., 1997). In
agreement with our in situ PCR experiments (Fig. 3),
EhTBP colocalized with propidium-iodide-stained material in EhkO and in the nucleus, confirming that this
novel organelle contains genetic material, which may be
transcriptionally active. As reported, the diameter of
EhkO varied from 0n5 to 5 m (Orozco et al., 1997). We
are currently studying EhkO function and the nature of
its genetic material.
In summary, Ehtbp encodes a 234 aa protein with a
molecular mass of 26 kDa. It contains a 182 aa conserved C-terminal domain with all the structural
elements that have been found in other TBPs (two direct
repeats, a basic domain and a -factor homology
domain). As in other organisms, the 47 aa N-terminal
domain is rich in hydrophobic residues and is not
conserved, differing totally from human TBP. Antibodies against the recombinant protein detected two
polypeptides of 26 and 29 kDa in nuclear extracts and
immunostained both the nucleus and EhkO. In situ PCR
also revealed that these organelles contained at least one
copy of Ehtbp.
ACKNOWLEDGEMENTS
Dr E. Orozco is an International Research Scholar from the
Howard Hughes Medical Institute (USA). This work was also
supported by CONACyT (Mexico).

REFERENCES
Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J.
(1990). Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215, 403410.
Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D., Seidman,
J. G., Smith, J. A. & Struhl, K. (1994). Current Protocols in Mol-

ecular Biology. New York : Wiley.

Bruchhaus, I., Leippe, M., Lioutas, C. & Tannich, E. (1993).

Unusual gene organization in the protozoan parasite Entamoeba

histolytica. DNA Cell Biol 12, 925933.
Bu, H., Lioutas, C., Dobinsky, S., Nickel, R. & Tannich, E. (1995).

Analysis of the 170 kDa lectin gene promoter of Entamoeba

histolytica. Mol Biochem Parasitol 72, 110.
Buratowski, S. (1997). Multiple TATA-binding factors come into
style. Cell 91, 1315.
Chen, J.-L., Attardi, L. D., Verrijzer, C. P., Yokomori, K. & Tjian, R.
(1994). Assembly of recombinant TFIID reveals differential

coactivators requirements for distinct transcriptional activators.

Cell 79, 93105.
Chibazakura, T., Watanabe, F., Kitajima, S., Tsukada, K.,
Yasukochi, Y. & Teraoka, H. (1997). Phosphorylation of human

general transcription factors, TATA-binding protein and transcription factor IIB by DNA-dependent protein kinase synergistic
stimulation of RNA polymerase II basal transcription in vitro.
Eur J Biochem 247, 11661173.
Comai, L., Tanese, N. & Tjian, R. (1992). The TATA-binding
protein and associated factors are integral components of the
RNA polymerase I transcription factor SL1. Cell 68, 965976.

Diamond, L. S., Harlow, D. R. & Cunnick, C. C. (1978). A new

medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and

another Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg 72, 431432.
Dynlacht, B. D., Hoey, T. & Tjian, R. (1991). Isolation of
coactivators associated with the TATA-binding protein that
mediate transcriptional activation. Cell 66, 563576.
Gangopadhyay, S. S., Ray, S. S., Sinha, P. & Lohia, A. (1997).

Unusual genome organisation in Entamoeba histolytica leads to

two overlapping transcripts. Mol Biochem Parasitol 89, 7383.
Ghavidel, A. & Schultz, M. C. (1997). Casein kinase II regulation of
yeast TFIIIB is mediated by the TATA-binding protein. Genes
Dev 11, 27802789.
Go! mez, C., Pe! rez, D. G., Lo! pez-Bayghen, E. & Orozco, E. (1998).

Transcriptional analysis of the EhPgp1 promoter of Entamoeba

histolytica multidrug-resistant mutant. J Biol Chem 273,
72777284.
Hansen, S. K., Takada, S., Jacobson, R. H., Lis, J. T. & Tjian, R.
(1997). Transcription properties of a cell type-specific TATA-

binding protein, TRF. Cell 91, 7183.

Hoey, T., Dynlacht, B. D., Peterson, M. G., Pugh, B. F. & Tjian, R.
(1990). Isolation and characterization of the Drosophila gene

encoding the TATA box binding protein, TFIID. Cell 61,

11791186.
Horikoshi, M., Wang, C. K., Fujii, H., Cromlish, J. A., Weil, P. A. &
Roeder, R. G. (1989). Cloning and structure of a yeast gene

encoding a general transcription initiation factor TFIID that

binds to the TATA box. Nature 341, 299303.
Kassavetis, G. A., Joazeiro, C. A. P., Pisano, M., Geiduschek, E. P.,
Colbert, T., Hahn, S. & Blanco, J. A. (1992). The role of the TATA-

binding protein in the assembly and function of the multisubunit

yeast RNA polymerase III transcription factor, TFIIIB. Cell 71,
10551064.
Kyte, J. & Doolittle, R. F. (1982). A simple method for displaying
the hydropathic character of a protein. J Mol Biol 157, 105132.
Labhart, P. (1996). Phosphorylation of the N-terminal domain of
Xenopus TATA-box binding protein by DNA-dependent protein
kinase depends on the C-terminal core domain. FEBS Lett 386,
110114.
Li, E., Kunz-Jenkins, C. & Stanley, S. L., Jr (1992). Isolation and
characterization of genomic clones encoding a serine-rich
Entamoeba histolytica protein. Mol Biochem Parasitol 50,
355358.
Lioutas, C. & Tannich, E. (1995). Transcription of protein-coding
genes in Entamoeba histolytica is insensitive to high concentrations of -amanitin. Mol Biochem Parasitol 73, 259261.
McAndrew, M. B., Read, M., Sims, P. F. G. & Hyde, J. E. (1993).

Characterization of the gene encoding an unusually divergent

TATA-binding protein (TBP) from the extremely AjT-rich
human malaria parasite Plasmodium falciparum. Gene 124,
165171.
Nikolov, D. B., Hu, S.-H., Lin, J., Gasch, A., Hoffman, A., Horikoshi,
M., Chua, N.-H., Roeder, R. G. & Burley, S. (1992). Crystal structure

of TFIID TATA-box binding protein. Nature 360, 4046.

Orozco, E., Ba! ez-Camargo, M., Gamboa, L., Flores, E., Valde! s, J. &
Herna! ndez, F. (1993). Molecular karyotype of related clones of

Entamoeba histolytica. Mol Biochem Parasitol 59, 2940.

Orozco, E., Pe! rez, D. G., Go! mez, M. C. & Ayala, P. (1995).

Descoteaux, S., Ayala, P., Orozco, E. & Samuelson, J. (1992).

Multidrug resistance in Entamoeba histolytica. Parasitol Today

11, 473475.

Primary sequences of two P-glycoprotein genes of Entamoeba

histolytica. Mol Biochem Parasitol 54, 201212.

Orozco, E., Gharaibeh, R., Riveron, A. M., Delgadillo, D. M.,

Mercado, M., Sanchez, T., Gomez-Conde, E., Vargas, M. A. &

39

J. P. L U N A-A R I A S a n d O T H E R S

Lopez-Revilla, R. (1997). A novel cytoplasmic structure containing

DNA networks in Entamoeba histolytica trophozoites. Mol Gen
Genet 254, 250257.
Pe! rez, D. G., Go! mez, C., Lo! pez-Bayghen, E., Tannich, E. & Orozco,
E. (1998). Transcriptional analysis of the EhPgp5 promoter of
Entamoeba histolytica multidrug-resistant mutant. J Biol Chem
273, 72777284.
Peterson, M. G., Tanese, N., Pugh, B. F. & Tjian, R. (1990).

Functional domains and upstream activation properties of cloned

human TATA binding factor. Science 248, 16251630.
Pollack, Y., Katzen, A. L. & Golenser, J. (1982). The genome of
Plasmodium falciparum. I : DNA base composition. Nucleic
Acids Res 10, 539546.
Purdy, J. E., Lana, T. P., Mann, B. J. & Petri, W. A., Jr (1996).

Upstream regulatory elements controlling expression of the

Entamoeba histolytica lectin. Mol Biochem Parasitol 78, 91103.
Sa! nchez, M. A., Peattie, D. A., Wirth, D. & Orozco, E. (1994).
Cloning, genomic organization and transcription of the
Entamoeba histolytica -tubulin-encoding gene. Gene 146,
239244.

Struhl, K. (1994). Duality of TBP, the universal transcription

factor. Science 263, 11031104.
Taggart, A. K. P., Fisher, T. S. & Pugh, B. F. (1992). The TATAbinding protein and associated factors are components of Pol III
transcription factor TFIIIB. Cell 71, 10151028.
Tannich, E. & Horstmann, R. D. (1992). Codon usage in pathogenic
Entamoeba histolytica. J Mol Evol 34, 272273.
White, R. J. & Jackson, S. P. (1992). The TATA-binding protein :
a central role in transcription by RNA polymerases I, II and III.
Trends Genet 8, 284288.
White, R. J., Gottlieb, T. M., Downes, C. S. & Jackson, S. P. (1995).

Mitotic regulation of a TATA-binding-protein containing complex. Mol Cell Biol 15, 19831992.
Wong, J.-M., Liu, F. & Bateman, E. (1992a). Cloning and expression
of the Acanthamoeba castellanii gene encoding transcription
factor TFIID. Gene 117, 9197.
Wong, J.-M., Liu, F. & Bateman, E. (1992b). Isolation of genomic
DNA encoding transcription factor TFIID from Acanthamoeba
castellanii : characterization of the promoter. Nucleic Acids Res
20, 48174824.

Singh, U., Rogers, J. B., Mann, B. J. & Petri, W. A., Jr (1997).

Transcription initiation is controlled by three core promoter

elements in the hgl5 gene of the protozoan parasite Entamoeba
histolytica. Proc Natl Acad Sci USA 94, 88128817.

40

.................................................................................................................................................

Received 12 May 1998; revised 20 August 1998; accepted

28 August 1998.