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Prctica 10

Reaccin en cadena de la polimerasa


Objetivo: que el estudiante comprenda y aplique los conceptos tericos en
los cuales se basa la reaccin en cadena de la polimerasa.

Fundamento
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en
ingls) fue descrita por primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. Esta
invencin lo hizo acreedor en 1993 del Premio Nobel en Qumica, debido
al gran impacto que ha tenido esta tcnica en el rea de la bioqumica.
Su objetivo y funcin es la de obtener mediante amplificacin in vitro
cantidades masivas de ADN incluso a partir de muestras de ADN muy
pequeas.
Para realizar el PCR ms sencillo, se requiere conocer las secuencias
que rodean la regin a amplificar, luego se producen oligonucletidos
complementarios a estas secuencias mediante sntesis qumica
automatizada y estos son utilizados como cebadores (primers) en una
reaccin de polimerizacin cclica catalizada por la ADN polimerasa.
En primer lugar el ADN que contiene la secuencia que se quiere
amplificar se desnaturaliza mediante calor y luego se alinea con los
cebadores, los cuales se encuentran presentes en exceso (ver Figura 1).
A continuacin, la ADN polimerasa realiza la extensin de la cadena de
ADN a partir de los extremos del cebador, incorporando deoxinucletidos
trifosfato que se aaden a la reaccin. Luego se aplica un segundo ciclo
de desnaturalizacin por calor, alineado y extensin del cebador. Se
utiliza una ADN polimerasa resistente a la temperatura, la Taq
polimerasa, procedente de una bacteria llamada Thermus aquaticus que
vive en aguas termales. Sin embargo esta polimerasa no presenta
actividad 3 exonucleasa de correccin de pruebas, por lo que la sntesis
es relativamente inexacta. Este ciclo se repite unas 30 veces o ms en un
dispositivo de regulacin automtica de temperatura conocido como
termociclador. Despus de 32 ciclos se producen alrededor de 1X 109
copias del ADN molde original, o 2n-1, donde n es el nmero de ciclos.

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Figura 1. Esquema que representa el proceso de reaccin en cadena


de la polimerasa.
Las aplicaciones de esta tcnica son innumerables y su aporte al
avance del conocimiento y manipulacin del material gentico es
invaluable. Dentro de las aplicaciones ms importantes se pueden
mencionar: los anlisis forenses, identificacin de sospechosos con
pequeas muestras de sangre, semen o pelo, identificacin de padres en
litigios de paternidad, en la antropologa molecular, en la arqueologa
molecular, en microbiologa ambiental, en el diagnstico de
enfermedades infecciosas, en el diagnstico prenatal de enfermedades
genticas, diagnstico de cncer, en tcnicas de clonaje y secuenciacin
de ADN genmico entre otros.

Materiales y reactivos
-

Gradilla para tubos de 0.5ml y un tubo de 0.5ml


Muestra que contenga ADN
Micropipetas de 10 l y 100 l con sus respectivas puntas
Mezcla maestra que contenga: amortiguador de reaccin en
cadena de la polimerasa, mezcla de nucletidos (dNTPs), Taq
polimerasa y cebadores.
Agua libre de ADNasas
Termociclador

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Procedimiento
En un tubo de 0.5 ml, agregue las siguientes cantidades en el orden
indicado (volumen final de reaccin: 50 l):
1. Agua libre de ADNasas: 18.9 l
2. Muestra: 5 l (sobrenadante del lisado de colonias de Escherichia
coli).
3. Mezcla maestra (Fermentas buffer + primers): 27l
Con la ayuda de su instructor, programe el termociclador segn las
condiciones requeridas.
Cuando la reaccin haya finalizado, analice el producto obtenido
mediante electroforesis en un gel de agarosa al 2%.

Resultados
Segn los datos que se muestran abajo, calcule el tamao aproximado
del producto de la reaccin. Corrobore que el tamao calculado calza con
el tamao del producto observado en el gel de agarosa.
Datos para el clculo del tamao de producto de PCR esperado:
Cebadores utilizados: 5 ggctgatc tcgcaaagat 3
5c tcaaggaagc caaggacctg g 3

Gen L7/L12 de Brucella abortus (codifica para una protena


ribosomal)
atggctgatc tcgcaaagat cgttgaagac ctttcggccc tgaccgttct ggaagccgct
gagctgtcca agcttctcga agagaagtgg ggcgtttcgg ctgctgctcc ggtcgctgtt
gctgctgccg gtggcgctgc ccctgctgct gccgcagaag aaaagaccga attcgacgtc
gttctcgctg acggcggcgc taacaagatc aacgtgatca aggaagtgcg cgcactcacc
ggtctcggcc tcaaggaagc caaggacctg gtcgaaggcg ctccgaaggc tgtcaaggaa
ggcgcctcga aggacgaagc tgagaagatc aaggcacagc tcgaagctgc tggcgccaag
gttgaactca agtaa

Bibliografa
Mathews, C.K, Van Holde, K.E y Ahern, K.G. Bioqumica. Pearson
Educacin. Tercera edicin, Espaa, 2003.
La redaccin de esta prctica fue realizada con la colaboracin de la
Dra. Roco Gonzlez Barrientos.
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