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Les techniques chromatographiques

CHAPITRE VI : Les techniques chromatographiques

Introduction
Pour apprhender lanalyse dun mlange complexe, ltape de sparation des constituants
de ce mlange est primordiale. Cette tape, si elle remplit ces objectifs, permet la distinction
de tous les composs prsents, en retenant diffremment les produits de faon assurer leur
arrive squentielle au niveau du dtecteur.
La chromatographie constitue la technique la plus utilise en matire de sparation. Celleci peut tre mise en uvre sous diffrentes formes, en fonction surtout du type de phase
tudie (liquide ou gazeuse). [5]

1. Gnralits sur les mthodes chromatographiques


La chromatographie est un procd de sparation des constituants dun mlange. Elle est
devenue une mthode analytique de tout premier plan pour identifier et quantifier les
composs dune phase liquide ou gazeuse homogne. Le principe de base repose sur les
quilibres de concentration des composs prsents, entre deux phases non miscibles dont
lune, dite stationnaire, est emprisonne dans une colonne ou fixe sur un support et lautre,
dite mobile, se dplace au contact de la premire. Lentranement des vitesses diffrentes
des composs prsents par la phase mobile conduit leur sparation. De toutes les mthodes
analytiques instrumentales, la chromatographie est celle qui a le plus grand domaine
dapplicabilit et par l elle occupe une position dominante. [24]

1.1 Le processus chromatographique


Lors du processus chromatographique, les composes du mlange analyser (de
pressions de vapeur, de masses molculaires, de solubilits et de chaleurs dadsorption, etc.
varies) se rpartissent entre une phase fixe contenue dans une colonne et une phase mobile
servent transporter les soluts au travers de celle-ci. On suppose quil existe en tout point de
la colonne un quilibre thermodynamique caractris par un coefficient de partage K. les
diffrences daffinit des soluts pour la phase stationnaire conduisent des rtentions
diffrentes, de telle sorte que les composs arrivent individuellement, des temps diffrents,
en sortie de la colonne. La rtention dun solut par la phase stationnaire sera dautant plus
lev que le coefficient de partage sera lev.
La dtection des composs lus est obtenue par connexion de la colonne un appareil
physique ou chimique capable de dtecter les molcules sortant de la colonne en prsence de
la phase mobile. Pour identifier avec succs les composs prsents dans lchantillon, ils
doivent tre spars efficacement et la quantit de matires lue doit tre suffisante pour tre
dtecte par le dtecteur. [5]
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1.2 Lappareillage chromatographique
Lappareillage se compose principalement dun systme dinjection de lchantillon,
dune colonne permettant la sparation des soluts et dun dtecteur assurant la dtection des
espces spares comme le montre la figure 1.

Fluide
vecteur

Injecteur

Injection du mlange

Colonne

Dtecteur

Sparation

Figure 1 : Principales composantes dun systme chromatographique.


Linjecteur
Le systme dinjection peut jouer plusieurs rles, que lchantillon soit solide, liquide ou
gazeux :
Un rle dinterface qui permet dintroduire lchantillon dans le chromatographe,
Un rle de systme de vaporisation dans le cas des liquides et des solides,
Un rle dorgane de transfert dans la colonne chromatographique.
Plus prcisment, un systme dinjection idal devrait possdait les caractristiques
suivantes :
Assurer une rcupration reprsentative de lchantillon, sans discrimination,
Avoir une rptabilit et une justesse suffisantes pour permettre lanalyse
quantitative,
Avoir un volume mort minimum afin dviter llargissement de la bande
dinjection, mais nanmoins une capacit dlution suffisante.
Diffrents types dinjecteurs existent. Certains sont spcifiques alors que dautres sont
dun usage plus gnral.
La colonne
La colonne constitue une partie primordiale du systme chromatographique, car cest
delle dont dpend le succs des sparations. Avec un bon quipement et de bonnes conditions
opratoires, lanalyse ne vaut que ce que valent la colonne et le dtecteur. La sparation
complte dun mlange peut tre obtenue suivant la slectivit et lefficacit de la colonne
utilise.
Le dtecteur
Le dtecteur est un appareil ou dispositif de mesure physicochimique. [5]
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1.3 Les grandeurs fondamentales de la chromatographie
Deux approches, dites thories cintique et thermodynamique, ont t introduites pour
dcrire les processus chromatographiques. Celles-ci donnent lieu deux catgories de
grandeurs fondamentales, les grandeurs thermodynamiques et les grandeurs cintiques.
a) Les grandeurs thermodynamiques
Les grandeurs thermodynamiques caractrisent la rtention des soluts.
Le coefficient (ou constante) de distribution de Nernst (K)
Cest le paramtre physicochimique de base en chromatographie qui quantifie le
rapport de concentration de chaque compos entre les deux phases en prsence.

(1)

Les valeurs de K sont trs variables. Elles sont grandes lorsque la phase mobile est un
gaz, et petites lorsque les deux phases sont ltat condens. Chaque compos noccupant
quun espace limit de la colonne et de plus avec une concentration variable, les valeurs
vraies de C S et de CM ne sont pas accessibles mais leur rapport est constant.
Les grandeurs de rtention
Pour traduire quantitativement la rtention, une des grandeurs suivantes est utilise :
Le temps de rtention : il correspond au temps mis par le compos pour tre
lu par la colonne chromatographique. Plus exactement, il reprsente le temps
coul entre linstant de linjection et celui qui correspond sur le
chromatogramme au maximum du pic qui lui est li. Dans le cas idal
est
indpendant de la quantit injecte. Il se dcompose en deux termes, le temps
mort, (
) temps ncessaire pour parcourir les volumes vides de la colonne
(en pratique, cest le temps de passage dun compos non retenu) et le temps
pass dans la phase stationnaire,
La diffrence entre le temps de rtention et le temps mort est dsigne par le
temps de rtention rduit du compos

(2)

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Le volume de rtention (ou dlution) VR : il correspond au volume de phase
mobile ncessaire pour luer le compos. Sur le chromatogramme, il correspond
au volume de la phase mobile qui sest coul entre linstant de linjection et
celui correspondant au maximum du pic. Si le dbit D de la phase mobile est
stationnaire,

(3)
Le facteur de capacit (ou de rtention) k : cest le temps pass par le solut dans
la phase stationnaire par rapport celui pass dans la phase mobile. Il est dfini
en rgime isocratique. Ce nest pas une constante, bien quil ne varie pas avec le
dbit ou la longueur de la colonne, car il dpend des conditions opratoires.
Dans la mise au point des sparations on fait en sorte que k ne dpasse pas 10,
afin de ne pas trop allonger le temps de passage des composs.

(4)
Avec :
: Volume de la phase i,
: Temps du solut pass dans la phase i,
i : Dsigne la phase S (stationnaire) ou M (mobile).
La slectivit et la rsolution
Ces deux grandeurs
chromatographiques.

dfinissent

la

position

relative

de

deux

piques

La slectivit (ou facteur de sparation) mesure la diffrence dnergie libre


de dissolution des soluts. Il ne peut, par dfinition, tre infrieur 1,

(5)

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La rsolution R caractrise la sparation des pics. Il traduit numriquement la
plus ou moins bonne sparation entre deux composs, il est calcul partir du
chromatogramme.

(6)

1 et 2 tant les largeurs la base des pics 1 et 2,


N : Nombre de plateaux thoriques.
En pratique, une sparation totale est obtenue pour une rsolution de 1.
b) Les grandeurs cintiques
Laspect cintique de la chromatographie concerne la largeur et la finesse des pics
chromatographiques. Le pic tant considr comme ga ussien, la finesse sexprime par le
nombre N de plateaux thoriques de la colonne selon la relation suivante :

(7)

Avec :
L : longueur de la colonne,
H : Hauteur dun plateau thorique (HEPT ; Hauteur quivalente un Plateau Thorique).
Le paramtre influenant la valeur de N concerne essentiellement , en effet, on
constate exprimentalement quun accroissement du temps de rtention
ne modifie que
modrment le nombre de plateaux thoriques.
c) La viscosit et la perte de charge
La perte de charge en colonne est donne en premire approximation par la loi de
Darcy :

(8)

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Avec :
Perte de charge en pascal (Pa),
Viscosit de la phase mobile (Pa.s) (*),
L : Longueur de la colonne (m),
: Vitesse linaire de la phase mobile (m.s-1 ),
Diamtre des particules de phase stationnaire (m),
Facteur de rsistance lcoulement (nombre sans dimension dont la valeur dpend de la
mthode de remplissage de la colonne et de la sphricit ou de la non-sphricit de la phase
stationnaire).
(*) Dans de nombreuses tables, les viscosits sont donnes en centipoise (cP). On a :
1 cP = 10-3 Pa.s [5] [24] [25] [26]

1.4 Le chromatogramme
Le chromatogramme (figure 2) est une courbe qui traduit la variation au cours du temps
dun paramtre reli la concentration instantane du solut en sortie de la colonne. Le temps
(ou trs rarement le volume dlution) est port en abscisse et la concentration (lintensit du
signal de dtection) en ordonne. La ligne de base correspond au trac obtenu en labsence du
compos lu. La sparation est complte quand le chromatogramme prsente autant de pics
chromatographiques revenant la ligne de base quil y a de composs dans le mlange
analyser. [24]

Figure 2 : Les caractristiques dun chromatogramme. [27]

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1.5 Analyse quantitative par chromatographie
Pour calculer la concentration massique dun compos responsable dun pic sur le
chromatogramme il faut runir deux conditions :
Disposer dun chantillon authentique du compos que lon veut doser, usage de
rfrence, pour dterminer la sensibilit du dtecteur son gard,
Disposer dun moyen logiciel ou autre pour connatre soit les hauteurs soit les aires
des diffrents pics dlution dintrt.
Toutes les mthodes de quantification en chromatographie sont donc des mthodes
comparatives et non pas absolues.
Pour un rglage donn de lappareil, on admet quil existe pour chaque pic du
chromatogramme une relation linaire entre son aire (ou sa hauteur) et la quantit du compos
responsable de ce pic dans lchantillon inject. Cette relation est valable pour une plage de
concentrations qui dpend du dtecteur employ. On traduit cette hypothse par :

(9)
Avec :
: Masse du compos i inject dans la colonne,
: Coefficient de rponse absolu du compos i,
: Aire du pic dlution du compos i.
Le coefficient absolu
( ne pas confondre avec le coefficient de partage), dpend du
rglage du chromatographe. Ce nest pas un paramtre intrinsque du compos.
Pour calculer le coefficient
dun compos i, il faut, daprs cette relation, connatre
laire
et la masse
traversant la colonne. Or cette masse est difficile dterminer avec
prcision, car elle dpend la fois de la seringue et de linjecteur (en CPG) ou de la boucle
dinjection (en CL).
Il existe plusieurs mthodes qui permettent de calculer la concentration

dun solut

spar par la colonne :


Mthode de ltalonnage externe,
Mthode de ltalonnage interne,
Mthode par normalisation interne.

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Dans notre cas on utilisera la mthode de ltalonnage externe.
Mthode de ltalonnage externe

Cette mthode permet de calculer la teneur (en termes de concentration ou de


pourcentage massique) dun ou plusieurs constituants apparaissant spars sur le
chromatogramme, mme en prsence dautres composs donnant des pics non rsolus. Facile
de mise en uvre, elle correspond lapplication dun principe commun beaucoup de
dosages.
Le procd repose sur la comparaison de deux chromatogrammes obtenus
successivement sans changer les conditions de rglage de lappareil. Le premier est un
chromatogramme de rfrence acquis partir dune solution de rfrence (conc. C rf) dans un
solvant, du compos qui fait lobjet du dosage. On injecte un volume V de cette solution et on
repre sur le chromatogramme laire Arf du pic correspondant. Le second rsulte de
linjection dun volume identique V de lchantillon en solution, contenant le compos
doser (conc. C ch ). Soit Ach laire du pic correspondant. Puisque les volumes injects sont
gaux, il y a proportionnalit entre les aires, qui dpendent des masses injectes, et les
concentrations correspondantes (
). La relation (8) applique aux deux
chromatogrammes conduit la relation (9) caractristique de cette mthode :
et

Soit :

(10)

Ltalonnage est possible avec un seul point de mesure (la droite dtalonnage passe
donc par lorigine). La prcision sera meilleure si les concentrations des solutions de
rfrence et de lchantillon sont du mme ordre de grandeur. Il sentend que les rglages de
lappareil ne doivent pas tre modifis entre les injections.
La prcision du dosage est videmment amliore en calculant la moyenne des aires
obtenues partir de plusieurs injections identiques, mais, quitte faire plusieurs mesures, il
est alors prfrable de procder un talonnage multipoints (multilevel calibration). Pour cela
on injecte des volumes gaux dune srie de solutions talons. Les rsultats danalyse sont
directement obtenus partir de la courbe dtalonnage
. [24]

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1.6 Les diffrents types de chromatographie
Les mthodes chromatographiques se diffrencient dans un premier temps par ltat de la
phase mobile. On parlera de chromatographie en phase gazeuse lorsque la phase mobile sera
un gaz, de chromatographie en phase liquide lorsquelle sera un liquide. Chacun de ces types
de chromatographie se subdivise dans un second temps suivant le processus de rtention mis
en uvre. La chromatographie est dite :
Dadsorption lorsque le mcanisme de rtention est ladsorption sur un support
poreux solide (phase stationnaire),
De partage lorsque le mcanisme de rtention est la dissolution du solut dans une
phase stationnaire liquide,
Ionique lorsque le mcanisme de rtention conduit la sparation dions ou de
molcules ionisables. [5]

2. La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)


La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) sapplique aux composs gazeux ou
susceptibles dtre vaporiss par chauffage sans dcomposition. Elle permet ainsi lanalyse de
mlanges ventuellement trs complexes, de nature et de volatilits diverses. Ses
caractristiques en font la technique sparative la plus utilise pour lanalyse des COV et des
polluants atmosphriques.
On distingue deux types de chromatographie :
La chromatographie gaz- liquide ou de partage, dans laquelle la phase stationnaire est
un liquide non volatil,
La chromatographie gaz-solide ou dadsorption, dans laquelle les phases stationnaires
sont constitues par des solides adsorbants tels que la silice, lalumine ou des
adsorbants polymres. [5]

2.1 Description du chromatographe


Lappareillage se compose principalement dun systme dinjection de lchantillon,
dune colonne permettant la sparation des soluts et dun dtecteur assurant la dtection des
espces spares comme le montre la figure 3.

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Dtecteur

Seringue

Injecteur

Thermostats

Manodtendeur
Vers un
dibimtre

Enregistreur

Manomtre

Bouteille de gaz
comprim

Colonne
Thermostat de colonnne
Four

Intgrateur ou
ordinateur

Ventilateur

Figure 3 : Schma dune installation de CPG.


Un appareil CPG runit dans un bti unique, outre les trois modules classiques, injecteur,
colonne et dtecteur, un four thermostat qui permet de porter, si ncessaire, la colonne une
temprature leve. La phase mobile qui entrane lchantillon dans la colonne est un gaz,
appel gaz vecteur. Les dbits, contrls avec prcision, permettent une grande rptabilit
des temps de rtention.
Lanalyse dbute linstant o on introduit une trs petite quantit de lchantillon, sous
forme liquide ou gazeuse, dans linjecteur, le flux gazeux traversant linjecteur le ramne en
tte de colonne. Celle-ci se prsente comme un tube de faible section enroul sur lui- mme,
de 1 plus de 100 m de longueur suivant les cas et contenant la phase stationnaire. Cette
colonne est place dans une enceinte temprature rgule. Elle peut servir des milliers
dinjections successives. La phase gazeuse qui a traverse la colonne passe dans un dtecteur
avant de sortir lair libre.
Parmi les principaux dtecteurs utiliss, on peut citer : Dtecteur Ionisation de Flamme
(FID), Dtecteur Capture dlectrons (ECD) et le Dtecteur mission
atomique. [5] [24] [28]

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2.2 Le four
Il est destin recevoir les colonnes et les porter la temprature dsire qui peut tre
ajuste au degr prs. Pour que celle-ci soit parfaitement homogne, le four possde un
volume important et son atmosphre est brasse par un systme de ventilation.
Trs frquemment on lui adjoint un dispositif de programmation qui pendant une
chromatographie permet daugmenter progressivement la temprature en fonction du temps,
amliorant ainsi de manire trs efficace les sparations. [27]

3. La Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)


3.1 Aspect gnral de lHPLC
Dans la chromatographie haute performance la phase mobile parcourt la colonne qui peut
contenir des granuls poreux (colonne remplie) ou recouverte l'intrieur d'un film mince
(colonne capillaire) - phase stationnaire -.
A l'instant initial, le mlange sparer est inject l'entre de la colonne o il se dilue
dans la phase mobile qui l'entrane travers la colonne. Les constituants du mlange inject se
dplacent tous moins vite que la phase mobile et leurs vitesses de dplacement sont
diffrentes. Ils sont ainsi lus de la colonne les uns aprs les autres et donc spars.
Un dtecteur plac la sortie de la colonne coupl un enregistreur permet d'obtenir un
trac appel chromatogramme. L'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limite par ces pics et
la prolongation de la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque solut dans
le mlange inject.
Son champ dapplication recouvre une grande partie du doma ine de la chromatographie
en phase gazeuse auquel sajoute celui de lanalyse des composs thermosensibles ou de
masses molculaires la fois trs grandes et mme polaires. Son succs est d la possibilit
dagir de manire trs prcise sur la slectivit entre les composs par le choix de la colonne
et de la composition de lluant, c'est--dire en exploitant les interactions solut/phase
mobile/phase stationnaire. Lefficacit des colonnes est moindre quen CPG, mais lutilisation
de phases chirales ou des nouvelles phases stationnaires oprant suivant plusieurs modes, les
techniques par appariement dions ainsi que dinteraction hydrophobe accroissent encore plus
les possibilits de la HPLC. Les pressions de pompage leves, ainsi lutilisation de colo nnes
de microparticules qui minimisent le temps des cintiques dadsorption, de partage,
dexclusion ou daffinit des molcules tout en augmentant la vitesse de flux de la phase
mobile.
Ces phases, constitues de la runion de microparticules sphriques dont le diamtre est
compris entre 2 et 5 micromtres ou de matriaux monolithiques poreux conduisent une
perte de charge importante dans la colonne. Il faut donc exercer sur la phase mobile une forte

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pression pour obtenir un dbit convenable. Pour marquer cette particularit de la technique, la
lettre P du sigle HPLC a pendant longtemps correspondu au mot pression.
La migration force dune phase liquide au contact dune phase stationnaire se retrouve
dans plusieurs techniques chromatographiques. La particularit de la HPLC est de faire
intervenir des mcanismes dchange solut/phase mobile/phase stationnaire bass sur les
coefficients dadsorption ou de partage. [25] [29] [30]

3.2 Conception gnrale dun appareil dHPLC


Une installation dHPLC (figure 4) comporte divers modules spcialiss, ces modules
sont relis entre eux par lintermdiaire de canalisations de trs faible diamtre interne (0,1
mm) pour assurer la circulation de la phase mobile.

Figure 4 : Schma dune installation dHPLC.

3.2.1 Le rservoir de solvant (luant)


Il contient la phase mobile en quantit suffisante. Plusieurs flacons d'luant (solvants
de polarits diffrentes) sont disponibles pour pouvoir raliser des gradients d'lution
(mlange de plusieurs solvants des concentrations variables) l'aide de la pompe doseuse

3.2.2 Le dgazage
La prsence, dans les solvants, des gaz ambiants (N 2 , O 2 , CO2 ...), dissous en quantit
non ngligeable, peut perturber les sparations par modification de la compressibilit des
luants et formation ventuelle de bulles. En outre le dioxygne abrge la vie des colonnes et
est gnant pour les dtecteurs lectrochimiques ou photomtriques UV. Il est donc prfrable
de dgazer les solvants, soit avec des ultrasons soit par barbotage dhlium, soit par diffusion
en les faisant passer dans un long tube de petit diamtre en polymre permable aux gaz.
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3.2.3 La pompe pour luants
Toute installation de HPLC comporte au moins une pompe pour forcer le passage de la
phase mobile travers la colonne dont le remplissage est trs compact. Il en rsulte une
pression importante au niveau de linjecteur. Celle-ci peut atteindre 20 MPa selon le dbit
impos la phase mobile ou sa viscosit ainsi que selon la nature de la phase stationnaire. Ces
pompes dbitmtriques comportent gnralement deux pistons en srie fonctionnant en
opposition pour viter les interruptions de dbit dues au remplissage du cylindre.

3.2.4 Linjecteur
Linjection dun volume prcis de lchantillon en tte de colonne doit se faire en temps
bref afin de perturber le moins possible le rgime de circulation de la phase mobile qui doit
tre stable de la colonne au dtecteur. On utilise pour ce faire, une vanne haute pression
plusieurs voies, manuelle ou motorise dans le cas des injecteurs automatiques, place juste
avant la colonne. Il sagit dune pice de prcision (figure 5) qui doit rsister des pressions
pouvant dpasser 30 MPa. Elle fonctionne en deux temps :
Dans la position chargement, o seule la communication entre pompe et colonne est
assure, lchantillon est introduit pression atmosphrique laide dune seringue
dans un petit volume tubulaire appel boucle. Celle-ci, dont il existe tout un choix
de volumes, est soit extrieure, soit intgre dans le corps de la vanne,
Dans la position injection, lchantillon est insr dans le flux de phase mobile par
rotation de 60 dun levier qui permet dinverser le sens de circulation dans la
boucle. Une reproductibilit des volumes nest atteinte que si la boucle a t
totalement remplie par lchantillon. Le volume prlev avec la seringue est donc
toujours largement suprieur celui de la boucle.

Figure 5 : Schma dun injecteur boucle.

3.2.5 La colonne
La colonne se prsente comme un tube, le plus souvent en acier, dont la longueur et le
diamtre prsentent des diffrences selon les modles. Les colonnes standard ont un
diamtre interne (DI) denviron 4,5 mm et la longueur de 100 mm.
La colonne doit avoir une efficacit suffisante ; une colonne courte permettra daller
plus vite et une colonne troite se traduira par une conomie de phase mobile. Ainsi pour une
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colonne standard, le dbit est de lordre de 1 ml/min, quelques goutes suffisent pour luer tous
les composs.
La colonne est souvent prcde dune prcolonne, dite colonne de garde, courte (0,4
cm 1 cm), remplie de la mme phase stationnaire, ce qui sert retenir certaines impurets.
On augmente ainsi la dure de vie de la colonne principale en prservant ses performances.
Les colonnes utilises en HPLC se caractrisent par leur gomtrie et par la nature des
phases quelles contiennent. Elles sont remplies par voie humide sous pression.
Elles sont en gnral courtes et droites. Les colonnes analytiques ont des longueurs
moyennes de 10 25 cm (lutilisation de colonnes courtes de 10 cm est justifie par un
remplissage par des particules de 3 m qui amliorent lefficacit mais augmentent la perte de
charge). Les diamtres sont de 1 ; 4,6 et 8 mm selon le mode de chromatographie utilis :
1 mm : Chromatographie microdbit ( vitesse linaire constante, la diminution
du diamtre de la colonne rduit la valeur du dbit ncessaire) ;
4,6 mm : Correspond au diamtre de la chromatographie analytique classique ;
8 mm : Correspond au domaine de la chromatographie semi-prparative.
Ces colonnes sont en acier inoxydable capable de rsister aux fortes pressions. Afin
dviter lapparition de parcours prfrentiels de la phase mobile dans la colonne, celles-ci
peuvent tre en matriau souple (polythylne) et soumises une compression radiale
mcanique externe.
Le choix dune colonne doit tre fait en fonction de la nature chimique de la phase
stationnaire, de sa rtentivit, de la taille des particules de la silice et de ses dimensions. Le
choix de la phase stationnaire est ltape la plus importante et doit tenir compte de la
solubilit de lchantillon et des proprits chimiques des analytes viss.

3.2.6 Le dtecteur
Le dtecteur utilis doit runir un certain nombre de qualits : donner pour chaque
compos dtect une rponse proportionnelle sa concentration instantane, tre sensible et
avoir peut de bruit de fond, tre stable dans le temps.
Les modes de dtection les plus courants reposent sur les proprits optiques des
composs : absorption, fluorescence et indice de rfraction.
Dans notre prsent travail, on utilisera le dtecteur ultraviolet-visible.

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Le dtecteur UV-visible
La dtection est base sur la loi de Lambert-Beer :

(11)

Avec :
: Absorptivit molaire,
l : paisseur de solution traverse,
C : Concentration du solut dans leffluant.
Labsorbance A de la phase mobile est mesure en sortie de la colonne, la longueur
donde ou plusieurs longueurs donde dans lUV ou le visible. La phase mobile ne doit pas,
ou trs peut, absorber par elle- mme. Lintensit de labsorption dpend du coefficient
dabsorption molaire , ce qui rend impossible, par la simple observation dun
chromatogramme, de se faire une ide de la concentration des espces repres, mme de
manire trs approximative.
La dtection UV correspond donc une dtection slective. Selon la longueur donde
utilise, on distingue :
La dtection monochromatique (celle utilise dans notre cas),
La dtection polychromatique.
Pour la dtection monochromatique, le modle de base se compose dune source au
deutrium ou vapeur de mercure, dun monochromateur pour isoler une bande passante
troite (10 nm) ou une raie, dune cellule circulation dun volume de quelques l et dun
moyen de dtection optique. [24][25] [27] [30]

3.3 La phase mobile


Le solvant (phase mobile) joue un rle trs important dans la chromatographie liquide,
car il accrot les performances de cette technique ; chaque application particulire exige que
soit slectionn un solvant adquat.
Il existe deux types de qualits requises du solvant en chromatographie en phase liquide :
ils concernent les aspects pratiques et loptimisation de la rsolution ; par aspects pratiques,
nous entendons les facteurs qui dterminent la convenance de tel solvant une application
donne ; par optimisation de la rsolution, nous voulons parler de lobtention dune sparation
adquate dun chantillon en un temps acceptable.
Un solvant doit ncessairement maintenir la stabilit de la colonne, tre compatible avec
le dtecteur, solubiliser suffisamment lchantillon et ne pas gner sa rcupration.

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Daprs lquation (6), la rsolution dpend du facteur de sparation , le nombre de
plateaux de la colonne N et du facteur de capacit . Le solvant a une influence importante
sur chacun de ces facteurs. Le nombre de plateaux, N, varie avec la viscosit du solvant,
tandis que et
sont des fonctions de ses proprits thermodynamiques. Les variations de la
vitesse moyenne de migration dun pic avec la composition du solvant dpendent de sa force
dlution : aux solvants trs lutifs correspondent de faibles valeurs de , alors que des
solvants peu lutifs donnent des valeurs plus leves. La slectivit , quant elle, varie avec
la composition du solvant de faon plus complexe.
Dans la chromatographie inverse, chaque sparation ncessite une polarit de la phase
mobile qui lui est propre. Chaque solvant ayant une polarit donne, on ajuste la polarit
globale de la phase mobile en mlangeant plusieurs solvants miscibles. A cette composition
de phase mobile correspond une force luante qui caractrise le pouvoir dentraner les
soluts. Il faut ajuster la force luante en fonction des soluts sparer. Po ur cela, on peut
utiliser un solvant pur ou un mlange de solvants.
Dans certains cas il est utile de faire varier la force luante au cours de lanalyse. Si le
mlange de diffrents solvants varie au cours de la sparation, on ralise alors un grad ient
dlution, car la meilleure force luante pour le dbut de lanalyse nest pas forcment adapte
pour une bonne sparation des soluts sortant en fin de chromatogramme.
Ces deux modes sont utiliss pour des analyses en chromatographie polarit de phase
normale ou inverse. Dans la pratique on prfre, si cest possible, travailler en mode
isocratique. Cest un compromis entre le temps danalyse, qui est plus long dans le mode
isocratique et le temps dquilibre obligatoire, en utilisant un gradient dlution. Cet quilibre
est ncessaire avant chaque nouvelle injection pour obtenir un chromatogramme
reproductible.
En dbut danalyse, la force luante doit tre suffisamment faible pour retarder quelques
temps les composs peu retenus. Puis progressivement, en changeant la composition de la
phase mobile, on augmente la force luante pour entraner les soluts ayant plus daffinit
avec la phase stationnaire. Pour faire varier la force luante, on utilise des pompes capables de
crer un mlange de solvant automatiquement. [26] [29] [30]

3.4 La phase stationnaire


Ces phases sont essentiellement constitues par de trs fines particules poreuses (silice ou
alumine), de forme irrgulire ou homogne. Elles peuvent galement tre recouvertes par
imprnation ou greffage.
La phase stationnaire est retenue lintrieur de la colonne par un disque poreux en acier
inoxydable fritt, dont la porosit est suffisamment faible pour retenir les plus fines particules.
Outre sa nature, sa caractristique essentielle est sa granulomtrie exprime par le diamtre
moyen des grains en micromtres.

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Les techniques chromatographiques


On peut utiliser trois types de phases stationnaires : les supports microporeux, les
supports pelliculaires qui sont superficiellement poreux et les phases greffes par des chaines
hydrocarbones en C 18 (colonnes C 18 ) qui correspondent une phase stationnaire lie un
matriau inerte comme la silice qui est peu rsistant aux pH basiques. De ce fait, il est
recommand de nutiliser ces colonnes de silice greffe que dans des limites de pH de lordre
de pH 2 pH 8. Enfin, des rtentions parasites de composs basiques conduisent augmenter
la traine des pics. [24] [25]

3.5 Avantages et inconvnients de lHPLC


Les avantages prsents par lHPLC compar la chromatographie basse pression sont :
Temps danalyse devis par 10 50,
Reproductibilit leve,
Quantification simplifie,
Dgradation ngligeable des produits biologiques,
Rsolution leve en accord avec le nombre de plateaux thoriques de la colonne,
Faible besoin en chantillon par analyse (10 - 100 l),
Les capacits dautomatisation de ces systmes.
Nanmoins il subsiste quelques inconvnients comme :
Dure de vie des colonnes,
Obligation dutiliser des solvants de qualit HPLC,
Cots du systme, du consommable (colonne, solvants, ) et de son exploitation.
[25]

3.6 Diffrence CPG / HPLC


LHPLC peut sappliquer tous les produits solubles, contrairement la chromatographie
en phase gazeuse (CPG), en liquide, une interaction est possible entre le solut et la phase
mobile. Cette interaction peut modifier les valeurs du coefficient de partage K et du facteur de
capacit k.
Les diffrences importantes entre la CPG et lHPLC sont lies des paramtres
physiques qui interviennent dans la sparation :
Les liquides sont incompressibles, le volume dun liquide peut tre considrer ne
variant pas avec la pression,
La viscosit des liquides est environ 100 fois plus grande que celle de s gaz,
Les coefficients de diffusion molaire du solut dans la phase mobile sont 10 000
100 000 fois plus petits dans les liquides que dans les gaz.

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Consquence des diffrences CPG / HPLC
En HPLC, la vitesse de la phase mobile est constante en tout point de la colonne. Il ny a
pas de variation defficacit le long de la colonne, comme en CPG. La hauteur thorique dun
plateau est la mme lentre ou la sortie de la colonne. [26] [29]
Tableau 1 : Quelques caractristiques des chromatographies CPG & HPLC.
CPG remplie

CPG capillaire

HPLC

Longueur de la colonne

25m

10 50 m

0,05 0,3 m

Diamtre interne de la colonne

2 mm

0,10 0,53 mm

4,6 mm

Dbit de la phase mobile

20 30 cm3 /min

1 2 cm3 /min

1 5 cm3 /min

Pression en tte de la colonne

1 5.10 5 Pa

0,5 1.10 5 Pa

50.105 150.10 5 Pa

Granulomtrie du remplissage

100 600 m

vide

3 10 m

Nombre de plateaux thoriques par


mtre de colonne

1 000 2 000

500 2 000

10 000 50 000

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