Protocolo detallado de trabajo de investigacin

Escalera de la muerte.
En este caso explicare un experimento el cual muchos denominan Escalera de la muerte, donde
al correr el DNA en un gel de Electroforesis se pueden notar bandas, resultado de la accin de las
caspasas al fragmentar el DNA, un proceso que forma parte de la muerte celular programada.
Para poder apreciar esto, se debe hacer una extraccin de DNA, te explicare 2 mtodos, el mtodo
de DNAzol y el mtodo del Trizol.
Te recuerdo que antes de realizar cualquier tipo de trabajo en el laboratorio, debers tener tu rea
de trabajo limpia, tu material listo y sobre todo usa guantes, especialmente en estas tcnicas
donde utilizaras reactivos peligrosos. En primer lugar, te explicare largo y tendido, al final te
agregare un diagrama de flujo a modo de receta, una sntesis de lo que te escribir a continuacin
para que te sea ms fcil seguir el experimento paso por paso. Si en algn momento tienes dudas,
detente y no contines en tu experimento hasta que alguien con ms experiencia las resuelva.
Suerte!
Cmo comienzo mi experimento? Extraccin DNA
El DNAzol es un reactivo que se emplea para el aislamiento de DNA genmica en distintos tipos de
muestras, en este caso nos servir para aislar DNA de lneas celulares de Carcinoma de Cervix, El
mtodo del DNAzol es relativamente sencillo. Durante el aislamiento la muestra biolgica es lisada
con DNAzol y precipitada con Etanol absoluto, seguido de lavados con etanol a 75%, esta tcnica
puede ser fcilmente completada de 2 a 3 horas.
En primer lugar, necesitas clulas, de la lnea celular que vayas a usar, necesitaras al menos 1 milln
de clulas para poder realizar la extraccin (Por experimento). Estas deben estar previamente
sincronizadas. Si necesitas agregar un estmulo, esto debes hacerlo despus de sincronizar.
Recuerda que para cada experimento necesitas un control positivo y uno negativo. Siguiendo el
modelo del experimento de fragmentacin de DNA, el control negativo ser aquel cultivo al cual no
aadiremos nada, el control positivo ser aquel le agregaremos un agente el cual este bien descrito
como fragmentador del DNA, en este caso camptotecina, si no tienes camptotecina puedes
sustituirla con DMSO. En el caso de la camptotecina agregaras 5 ul por ml de medio RPMI a una
concentracin de 5 mg/ml.
Para comenzar la extraccin del DNA, necesitaras despegar tus clulas con verseno, posteriormente
centrifugar y obtener tu botn celular. Por cada milln de clulas necesitaras 0.5 ml de DNAzol. Al
botn celular le agregaras 0.5 ml de DNAzol y resuspenders muy bien. Esto para lisar las clulas y
poder recuperar el DNA.
Una vez que resuspendiste mucho, centrifugaras a 10 000 rpm durante 10 minutos, a 4 C.
Posteriormente le aadirs 1ml de Etanol absoluto, mezclaras por inversin y si te es posible lo
dejaras toda una noche en el REVCO o en el congelador, si tienes prisa, puedes dejarlo 30 minutos
solamente.

Despus, centrifugaras de igual manera 10 000 rpm durante 10 minutos, decantaras el

sobrenadante y agregaras etanol al 75%, agitaras por inversin, y de nuevo centrifugaras durante
10 min a 10 000 rpm. Repetir, En este paso lavamos nuestro DNA de protenas, debes de tener
mucho cuidado!, En cada lavado es posible que te lleves un poco de DNA, as que quita el
sobrenadante con una pipeta de 200 ul con mucho cuidado.
Ya que hiciste tus lavados con etanol, dejaras que se seque, puedes poner tus tubos Eppendorff en
una sanita dentro de la campana, con mucho cuidado de que no los muevan, ni les pase nada, espera
de 10 a 15 minutos y despus agrega agua libre de RNAsas para realizar la cuantificacin en el
biofotometro, la cantidad de agua libre que le vas a poner a cada tubo depender del tamao de tu
botn, si es uno muy pequeo agrega 10ul, si es un botn ENORME puedes agregar hasta 50ul.
Otro mtodo de extraccin: Extrayendo DNA con Trizol.
Existe otra forma de realizar la extraccin y esta es con Trizol, S!, con el Trizol tambin podemos
extraer DNA. Y a continuacin te explicare de qu manera.
Para la extraccin con Trizol, puedes despegar tus clulas (Previamente sincronizadas y tratadas con
estimulo segn el caso) directamente con el Trizol (1ml por milln de clulas), solamente ten
cuidado al resuspender porque se vuelve un poquito denso, psalo a un tubo Eppendorf e incuba
en el REVCO una noche si es posible, si no con 30 minutos es suficiente.
Despus de incubar, descgela tu muestra de manera gradual si se ha congelado (mantenla fra) y
agrega 200ul de Cloroformo grado molecular, vortexea o agita fuerte hasta que sea de un rosa
pepto.
Ya que esta de ese rosita pastel, centrifuga a 4 (Mete la centrifuga al refrigerador antes de usarla)
12 000 rpm durante 15 minutos.
Saca los Eppendorff con mucho cuidado, y notaras que se han formado 3 fases, quita la fase acuosa
con ayuda de una micropipeta y deschala, nos quedaremos con la fase orgnica.
A esta fase orgnica le agregaras 1ml de etanol absoluto frio, lo cual provocara que el DNA se separe,
despus mezcla por inversin 6 veces para recuperar el mximo DNA posible. Centrifuga a 12 000
durante 10 minutos. Una vez hecho esto, de igual manera que con el protocolo del DNAzol, seguirn
2 lavados con etanol al 75%.
A partir de aqu el protocolo continua de la misma manera, (Secar, rehidratar, cuantificar)
Cuantificacin en biofotometro Cundo DNA tienes? Vale la pena correr un gel?
Antes de correr el gel, es recomendable cuantificar el DNA que extrajimos en el biofotometro,
para saber si tenemos y si vale la pena correr el gel. Es importante que tengas tus muestras
siempre en frio para evitar su degradacin.
Debes encender el biofotometro 10 min antes de utilizarlo, para que caliente bien.
Prepara un blanco para calibrar el biofotometro, puedes utilizar agua destilada, recuerda que
debes tomar las celdas con guantes, de los lados opacos y deben estar bien limpias para una
lectura correcta.

Para poder leer tu muestra debers realizar una dilucin de la siguiente manera: 4ul de muestra,
196 ul de Agua destilada.
Una vez que el biofotometro haya calentado, debers seleccionar el programa para cuantificar
DNA, y calibrar con el blanco, la lectura deber dar 0, despus de calibrar ya podrs meter tu
muestra, el biofotometro ya te dar la concentracin de tu muestra, esto te servir ms que nada
para saber si tienes DNA en tu muestra.
Si tienes DNA en tu muestra, Bien!, Ahora ya podrs correr tu gel de integridad.
Correr el gel de agarosa! Electroforesis en gel de Agarosa.
Antes de preparar el gel, debes preparar la cmara de electroforesis, en el L4 tenemos 2 cmaras
de electroforesis, una grande con capacidad de 100 ml y una pequea de 50ml, si tienes pocas
muestras lo mejor es usar la pequea.
Tomaras la cmara de electroforesis y la calibraras con la bolita de nivel para asegurarte que tu
cmara este alineada, puedes ayudarte con una sanita o con puntas.
Despus tomaras el molde para hacer el gel y lo colocaras como lo indica en la imagen, de tal
manera de que las gomas que tienen a los lados sellen bien y no haya derrames cuando le pongas
el gel, ya alineado el molde pondrs el peine para poder tener los pocillos donde se depositara la
muestra.
Ya que tienes preparada tu cmara, es hora de preparar el gel. Para esto necesitaras 0.75 gramos
de agarosa de INVITROGEN y 50 ml de TBE 1x, este lo puedes encontrar donde estn las cmaras,
Si no hay tomaras el TBE 10X y lo diluirs 10 veces.
Mezcla la agarosa con el TBE 1x en un Matraz Erlenmeyer para su fcil manipulacin, (Si, debe ser
en un matraz, ni se te ocurra hacerlo en un vaso de precipitado u otra cosa). Ya que agregaste la
agarosa al TBE 1x llvatela al cuarto de molecular, y calintala en el microondas, ten cuidado de
que no llegue a su punto de ebullicin ya que puede salpicar, calintala y mueve el matraz con
mucho cuidado (Aydate de una sanita) hasta que tu mezcla sea clara y uniforme. Ya que tu
mezcla este lista agrega 1.5 ul de Bromuro de Etidio (Lo encuentras en el cajn donde estn las
cmaras de electroforesis) y mezcla de nuevo. Este gel es el que vas a agregar en el molde del gel.
Ya que agregaste tu gel (CON CUIDADO, NO DERRAMES, NO BURBUJAS, Si haces burbujas qutalas
con una punta nueva y estril) Espera a que solidifique, una vez que este solido podrs cargar tus
muestras.
Carga de las muestras.
Ya que esta solido el gel, voltea el molde para que quede de la manera en la que se ve en la
imagen, Ya volteado llenaras la cmara con TBE 0.5x (hasta donde dice Fill line) y una vez lleno
es hora de quitar el peine que forma los pocillos, hazlo con mucho cuidado para que todos los
pocillos te queden iguales y no daes tu gel. Ahora estn listos los pocillos para que cargues tus
muestras
Para preparar tus muestras, puedes ayudarte de un parafilm. Pon el parafilm en una superficie
plana, y en l, con ayuda de una micropipeta de 10ul pon 3 ul de Buffer Green, El buffer Green se

asentar como una gotita en el parafilm, lo cual permitir una fcil manipulacin, despus de esto,
toma 2 ul de tu muestra (no olvides resuspender bien) y agrgalo justo donde este tu gotita de
buffer Green. Lleva tu pipeta a 5ul y resuspende bien el buffer Green con tu muestra, ahora ya
puedes cargar tu muestra.
Tendrs que poner la muestra con mucho cuidado en el pocillo, antes de meter la punta puedes
mojarla con el mismo TBE de la cmara para evitar la tensin superficial del agua y te sea ms fcil
meter la punta, no te pongas nervioso, hazlo despacio, con cuidado y si es necesario apyate en
tus 2 manos. Repite esto para todas las muestras.
Encendiendo el aparato, ahora s, corremos el gel :D
Ya que cargaste todas tus muestras, tapas la cmara de electroforesis y la conectas, corre el gel a
70 Volts y espera de 30 a 45 minutos. Para conectarla recuerda que los cables rojos van con el pin
rojo y los cables negros con el pin negro. Asegrate que se forman burbujitas, estas nos indican
que ya hay corriente elctrica.
Observacin del gel en Transiluminador.
Ya que paso el tiempo, revisa que el gel se vea ms o menos as para asegurarte que est listo, y
antes de hacer nada, apaga la fuente de poder (No te querrs electrocutar) y destapa tu cmara,
toma tu gel y ponlo en un trozo de papel estraza para llevarlo al cuarto de molecular donde est el
Transiluminador, Lo metes en la cmara inferior del Transiluminador, lo tapas y ya puedes
encender el transiluminador, si lo hiciste de manera correcta podrs ver tu DNA de la siguiente
manera.
No se te olvide limpiar!
Ya que viste tu gel, debers meterlo en la cajita que dice geles de bromuro. El TBE de la cmara
se puede recuperar y reutilizar, lava y seca la cmara y ponla en su lugar, tus muestras puedes
guardarlas en el REVCO. No se te olvide anotarte en la bitcora.

Sntesis Experimental.

Mantenimiento
linea celular

Antes de comenzar el experimento tus celulas deben estar en optimas condiciones y debes
estimular despues de sincronizar. No olvides tener un control positivo y uno negativo.

Recupera el boton celular, agregar 0.5ml de DNAzol, resuspender bien, agregar 1 ml de Etanol,
agitar por inversin 6 veces, centrifugar a 10 000 rpm x 10 min y realizar 2 lavados con Etanol al
Extracion DNA con 75%, dejar secar y rehidratar con agua libre de RNAsas. Mantener frio
DNAzol

Lisar las celulas con Trizol, resuspender bien e incubar en frio. Despues agregar 200 ul de
Cloroformo, vortexear hasta rosa pepto, centrifugar durante 10 min a 10 000, desechar fase
acuosa, agregar 1 ml de Etanol absoluto, agitar por inversion, centrifugar a 10 000 durante 10
Extraccion DNA con min, desechar sobrenadante, realizar 2 lavados con Etanol al 75%, dejar secar y rehidratar con
agua libre de RNAsas. Mantener frio
Trizol

Cuantificacion en
Biofotometro.

Preparacion de
Camara de
electroforesis.

Encender el biofotometro, calibrar el blanco, realizar una dilucion con 4 ul de muestra, 196 de
agua, leer absorbancia para DNA.

Nivela la camara de electroforesis con ayuda de un nivel y coloca el molde del gel de manera
que el gel no se derrame, pon el peine para los pocillos, agrega el gel de agarosa (0.75 agarosa
en 50 ml TBE 1x + 1.5 ul de Bromuro de Etidio). Una vez solidificado, voltea el molde del gel,
llena la camara con TBE 0.5x, retira el peine y carga las muestras en los pocillos (2ul de Muestra
+ 3 ul de Buffer Green). Enciende el aparato y espera 30 a 45 min.

Apaga el aparato de electroforesis, con guantes retira el gel y llevalo con cuidado que no se
rompa al Transiluminador, enciendelo y observa tus muestras.
Transiluminador