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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA


CARRERA DE INGENIERA QUMICA

ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA


HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SLIDO.

TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIN DEL TTULO DE INGENIERA


QUMICA

AUTORA: JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO

TUTORA: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA

QUITO

2015

APROBACIN DEL TUTOR

En calidad de Tutora del Trabajo de Grado titulado, ESTUDIO DEL ADECUADO


CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA
HAMATUM EN SUSTRATO SLIDO, me permito certificar que el mismo es original y ha
sido desarrollado por la seorita JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO, bajo mi
direccin y conforme a todas las observaciones realizadas, considero que el trabajo rene los
requisitos necesarios.

En la ciudad de Quito, a los 30 das del mes de Abril del 2015

Ing. Lorena Elizabeth Villareal Villota MSc.


PROFESORA TUTORA

ii

AUTORIZACIN DE LA AUTORA INTELECTUAL

Yo, JUANA MARICELA POALACIN CABASCANGO en calidad de autora del trabajo de


grado realizado sobre el ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO
TRICHODERMA HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SLIDO,
por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos
los contenidos que me pertenecen o de parte de los que contiene esta obra, con fines
estrictamente acadmicos o de investigacin.

Los derechos que como autor me corresponden, con excepcin de la presente autorizacin,
seguirn vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artculos 5, 6, 8, 19 y
dems pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.

Quito, 30 de Abril del 2015

Juana Maricela Poalacin Cabascango


C.C. 1804267977
mary87_j@yahoo.es

iii

A mis queridos padres Manuel y Carmen


por su amor, comprensin y
sacrificio.

iv

AGRADECIMIENTO

A Dios mi gua, y mi fortaleza quien con su amor infinito me dirigi por el camino correcto,
quien me alivi en mis momentos de tristeza y me ayud a superar los obstculos que se me
presentaron.

A mis padres Manuel y Carme quienes con esfuerzo y sacrificio permitieron que yo culminara
con mis estudios universitarios, quienes con su cario y amor forjaron en m una persona de
bien.

A mi hermana querida Myrian Poalacin quien estuvo alentndome da tras da para seguir
adelante y no renunciar a mis sueos, gracias por entenderme, por tus consejos y especialmente
gracias por ser el instrumento que Dios utiliz para que l llegara a mi corazn y encontrara el
lado alegre de la vida.

A mis amigos Luis Asero, Melissa Enrquez, Glenda Andrade, Naty Velasco, Johanna Bonilla y
Anita Peralta que siempre estuvieron cuando los necesitaba brindndome su apoyo y amistad
desinteresada, tambin a mis amigos Diego Pullas, Victoria Ballagn y Margoth Quillupangui
quienes siempre encontraban la forma para hacernos olvidar de los momentos de tristeza.

A la Lic. Celia Velastegu quien siempre confi en mis capacidades, quien me alent y ayud a
que este trabajo se desarrollara.

A mi directora de tesis la Ing. Lorena Villareal quien con sus conocimientos me guio durante
todo el desarrollo de esta investigacin.
Mary.

CONTENIDO

pg

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................... x


LISTA DE GRFICOS ...........................................................................................................xi
LISTA DE TABLAS ..............................................................................................................xii
LISTA DE ANEXOS ............................................................................................................. xiv
SIMBOLOGA ....................................................................................................................... xv
RESUMEN ............................................................................................................................ xvi
ABSTRACT ......................................................................................................................... xvii
INTRODUCCIN .................................................................................................................... 1
1. MARCO TERICO.............................................................................................................. 3
1.1 Los hongos .......................................................................................................................... 3
1.2 Trichoderma spp. ................................................................................................................ 4
1.2.1 Clasificacin Taxonmica. ............................................................................................... 5
1.2.2 Reproduccin.. ................................................................................................................. 6
1.2.3 Morfologa. ...................................................................................................................... 6
1.2.3.1 Caractersticas macroscpicas. ..................................................................................... 6
1.2.3.2 Caractersticas microscpicas. ...................................................................................... 6
1.3 Trichoderma harzianum. ..................................................................................................... 7
1.4 Trichoderma hamatum ........................................................................................................ 8
1.5 Mecanismos de Accin ....................................................................................................... 9
1.5.1 Competencia. .................................................................................................................. 9
1.5.2 Micoparasitismo............................................................................................................... 9
1.5.3 Antibiosis.. ....................................................................................................................... 9
1.6 Factores que influyen en el crecimiento ............................................................................. 10
1.6.1 Temperatura................................................................................................................... 10
1.6.2 Humedad.. ...................................................................................................................... 10
1.6.3 Aireacin. ...................................................................................................................... 10
1.6.4 pH. ................................................................................................................................. 11

vi

1.6.5 Tamao de partcula del sustrato.................................................................................... 11


1.6.6 Exposicin de luz............................................................................................................ 11
1.7 Los hongos en el control biolgico .................................................................................... 11
1.8 Sustratos en la produccin de Trichoderma spp. ................................................................ 12
1.9 Fermentacin .................................................................................................................... 13
1.9.1 Fermentacin en medio lquido. ..................................................................................... 13
1.9.2 Fermentacin en medio slido. ....................................................................................... 14
1.9.3 Comparacin entre la fermentacin en medio slido y en medio lquido.. ....................... 14
1.10 Curva de crecimiento microbiano .................................................................................... 16
1.11 Aplicaciones de Trichoderma spp. ................................................................................... 17

2. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................. 19


2.1 Pruebas preliminares ......................................................................................................... 19
2.2 Diseo experimental .......................................................................................................... 20
2.3 Aplicacin del hongo Trichoderma en plantas ................................................................... 24
2.4 Materiales y equipos ......................................................................................................... 24
2.5 Sustancias y reactivos ........................................................................................................ 25
2.6 Procedimientos.................................................................................................................. 25
2.6.1 Produccin de Trichoderma spp. . .................................................................................. 25
2.6.2 Preparacin del medio de cultivo a base de agar patata dextrosa (PDA) ........................ 27
2.6.3 Procedimiento de resiembra en el medio de cultivo PDA ................................................ 27
2.6.4 Preparacin del sustrato en botellas de vidrio y en fundas de polietileno ........................ 27
2.6.5 Siembra del inculo de Trichoderma spp. en botellas y en fundas.. ................................. 28
2.6.5.1 Recuento celular.. ........................................................................................................ 28
2.6.5.2 Diluciones seriadas. .................................................................................................... 28
2.6.5.3 Cmara de Neubauer................................................................................................... 29
2.6.5.4 Clculo matemtico de la concentracin. .................................................................... 31
2.6.6 Procedimiento de contaje de esporas del sustrato slido................................................. 32

3. DATOS .............................................................................................................................. 33
3.1 Datos preliminares ............................................................................................................ 33
3.1.1 Datos de las sustancias utilizadas. .................................................................................. 33
3.1.2 Preparacin del sustrato en camineras.. ......................................................................... 33
3.1.3 Concentracin del inculo para siembra en camineras. .................................................. 34
3.1.4 Concentracin de esporas producidas en camineras.. ..................................................... 34
3.2 Datos del diseo experimental ........................................................................................... 35

vii

3.2.1 Preparacin del sustrato en fundas................................................................................. 35


3.2.2 Concentracin del inculo para siembra en fundas......................................................... 36
3.2.3 Contaje de esporas producidas en fundas.. ..................................................................... 36
4. CLCULOS ....................................................................................................................... 39
4.1 Clculos de las pruebas preliminares ................................................................................. 39
4.1.1 Clculo para determinar la cantidad de agua absorbida por el sustrato.. ....................... 39
4.1.2 Clculo del volumen total de agua adicionada en la preparacin del sustrato. ............... 39
4.1.3 Clculo de la cantidad de agua total............................................................................... 40
4.1.4 Clculo de la masa del sustrato seco. ............................................................................. 40
4.1.5 Clculo del porcentaje de humedad. ............................................................................... 41
4.1.6 Clculo para determinar la concentracin de esporas. ................................................... 41
4.2 Clculos del diseo experimental....................................................................................... 42
4.2.1 Porcentaje de humedad ptimo.. ..................................................................................... 42
4.2.2 Clculo de la cantidad de agua total. ............................................................................. 42
4.2.3 Construccin de las curvas de crecimiento ..................................................................... 43
4.3 Clculo estadstico ............................................................................................................ 43
4.3.1 Correccin de logaritmo base 10 a logaritmo natural. .................................................... 43
4.3.2 Clculo de la velocidad de crecimiento de las curvas...................................................... 44
4.3.3 Clculo del Coeficiente de variacin.. ............................................................................ 45

5. RESULTADOS .................................................................................................................. 46
5.1 Resultados de las pruebas preliminares .............................................................................. 46
5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparacin del sustrato en camineras......................... 46
5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato.......................................................... 46
5.1.3 Concentracin de esporas obtenida de la propagacin en botellas.................................. 47
5.1.4 Curvas de concentracin versus volumen de agua adicionado al sustrato. ...................... 48
5.1.5 Curvas de concentracin versus porcentaje de humedad................................................. 49
5.2 Resultados del diseo experimental ................................................................................... 50
5.2.1 Volumen de agua ptimo.. .............................................................................................. 50
5.2.2 Resultados de la masa de agua total.. ............................................................................. 51
5.2.3 Resultados de temperatura y % de humedad para propagar Trichoderma. ...................... 51
5.2.4 Construccin de la curva de crecimiento.. ...................................................................... 52
5.3 Curvas de crecimiento obtenidas ....................................................................................... 57
5.4 Resultados estadsticos ...................................................................................................... 60
5.4.1 Resultados de %CV.. ...................................................................................................... 62
5.4.2 Velocidad especfica de crecimiento microbiano.. ........................................................... 63
viii

5.5 Seleccin de las mejores condiciones para producir Trichoderma spp. ............................... 63
5.5.1 Anlisis comparativo del % de humedad.. ....................................................................... 63
5.5.2 Anlisis comparativo de la concentracin.. ..................................................................... 64
5.5.3 Anlisis comparativo del coeficiente de variacin (%CV).. ............................................. 65
5.5.4 Seleccin de las mejores condiciones.. ............................................................................ 66
5.6 Resultados de aplicacin del hongo Trichoderma spp. ....................................................... 66

6. DISCUSIN ....................................................................................................................... 68

7. CONCLUSIONES .............................................................................................................. 70

8. RECOMENDACIONES ..................................................................................................... 72

CITAS BIBLIOGRFICAS ................................................................................................... 73

BIBLIOGRAFA .................................................................................................................... 77

ANEXOS................................................................................................................................ 79

ix

LISTA DE FIGURAS

pg

Figura 1. Hifa mostrando los principales organelos celulares. .................................................... 3


Figura 2. Estructura del 6-pentil--pirona .................................................................................. 5
Figura 3. Caractersticas macroscpicas de Trichoderma spp. .................................................... 6
Figura 4. Caractersticas microscpicas de Trichoderma spp. .................................................... 7
Figura 5. Trichoderma harzianum ............................................................................................. 8
Figura 6. Trichoderma hamatum ............................................................................................... 8
Figura 7. Tipos de sustratos ..................................................................................................... 12
Figura 8. Curva de crecimiento microbiano ............................................................................. 16
Figura 9. Diseo experimental para la produccin de esporas y construccin de la
curva de crecimiento del hongo Trichoderma harzianum (TH) ................................................ 22
Figura 10. Diseo experimental para la produccin de esporas y construccin de la
curva de crecimiento del hongo Trichoderma hamatum (THa)................................................. 23
Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de produccin de Trichoderma spp. ......................... 26
Figura 12. Diluciones seriadas ................................................................................................. 29
Figura 13. Cmara de Neubauer .............................................................................................. 30
Figura 14. Divisiones de la zona de conteo .............................................................................. 30
Figura 15. Recuento con alta concentracin celular ................................................................. 31
Figura 16. Aplicacin en plantas de fresas ............................................................................... 66
Figura 17. Resultados luego de un mes de aplicacin en plantas de fresa ................................. 67
Figura 18. Aplicacin de los microorganismos en plantas de mora........................................... 67
Figura 19. Resultados luego de 50 das de aplicacin en plantas de moras ............................... 67

LISTA DE GRFICOS

pg

Grfico 1. logC = f (Va) para Trichoderma harzianum ............................................................. 48


Grfico 2. logC = f (Va) para Trichoderma hamatum ............................................................... 49
Grfico 3. logC = f (%H) para Trichoderma harzianum........................................................... 49
Grfico 4. logC = f (%H) para Trichoderma hamatum ............................................................. 50
Grfico 5. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condicin 1................................. 57
Grfico 6. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condicin 2................................. 57
Grfico 7. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condicin 3................................. 58
Grfico 8. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condicin 1................................... 58
Grfico 9. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condicin 2................................... 59
Grfico 10. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condicin 3 ................................. 59
Grfico 11. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condicin 1 ..................... 60
Grfico 12. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condicin 2 ..................... 60
Grfico 13. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condicin 3 ..................... 61
Grfico 14. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condicin 1 ....................... 61
Grfico 15. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condicin 2 ....................... 62
Grfico 16. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condicin 3 ....................... 62
Grfico 17. Anlisis comparativo de la humedad ..................................................................... 64
Grfico 18. Anlisis comparativo de la concentracin de esporas............................................. 65
Grfico 19. Anlisis comparativo del coeficiente de variacin ................................................. 65

xi

LISTA DE TABLAS

pg

Tabla 1. Comparacin entre la fermentacin lquida y slida ................................................... 15


Tabla 2. Volumen de agua adicionada en la preparacin del sustrato ....................................... 19
Tabla 3. Nmero de repeticiones realizadas ............................................................................. 21
Tabla 4. Datos de las sustancias utilizadas ............................................................................... 33
Tabla 5. Datos de preparacin del sustrato para TH en camineras ............................................ 33
Tabla 6. Datos de preparacin del sustrato para THa en camineras .......................................... 33
Tabla 7. Datos de concentracin del inculo para siembra en camineras .................................. 34
Tabla 8. Datos del recuento celular de TH en camineras .......................................................... 34
Tabla 9. Datos del recuento celular de THa en camineras ........................................................ 35
Tabla 10. Datos de preparacin del sustrato para TH en fundas ............................................... 35
Tabla 11. Datos de preparacin del sustrato para THa en fundas .............................................. 36
Tabla 12. Datos de concentracin del inculo para siembra en fundas...................................... 36
Tabla 13. Datos de contaje de esporas para Trichoderma harzianum........................................ 37
Tabla 14. Datos de contaje de esporas para Trichoderma hamatum.......................................... 38
Tabla 15. Funcin estimacin lineal para los dos microorganismos.......................................... 43
Tabla 16. Resultados de preparacin del sustrato para TH en camineras .................................. 46
Tabla 17. Resultados de preparacin del sustrato para THa en camineras ................................. 46
Tabla 18. Resultados de humedad del sustrato para TH ........................................................... 47
Tabla 19. Resultados de humedad del sustrato para THa .......................................................... 47
Tabla 20. Resultados de la concentracin obtenida de TH en camineras................................... 47
Tabla 21. Resultados de la concentracin obtenida de THa en camineras ................................. 48
Tabla 22. Resultados de volumen de agua ptima para TH ...................................................... 50
Tabla 23. Resultados de volumen de agua ptima para THa..................................................... 51
Tabla 24. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de TH ........................................ 51
Tabla 25. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de THa....................................... 51
Tabla 26. Resultados del %H a las diferentes condiciones ....................................................... 52
Tabla 27. Resultados de concentracin de TH ......................................................................... 53
Tabla 28. Resultados de concentracin de THa ........................................................................ 54
xii

Tabla 29. Resultados del logaritmo de la concentracin para TH ............................................. 55


Tabla 30. Resultados del logaritmo de la concentracin para THa............................................ 56
Tabla 31. Resultados estadsticos corregidos ........................................................................... 63
Tabla 32. Resultados de velocidad especfica de crecimiento ................................................... 63
Tabla 33. Promedio de la Concentracin ................................................................................. 64
Tabla 34. Mejores condiciones de crecimiento ........................................................................ 66

xiii

LISTA DE ANEXOS

pg

ANEXO A. Taxonoma de Trichoderma spp. .......................................................................... 80


ANEXO B. Biograma Microbiano .......................................................................................... 81
ANEXO C. Norma INEN 1690 ............................................................................................... 82
ANEXO D. Materiales necesarios ........................................................................................... 83
ANEXO E. Propagacin de Trichoderma en cajas Petri........................................................... 84
ANEXO F. Preparacin del sustrato ........................................................................................ 85
ANEXO G. Esterilizacin del sustrato..................................................................................... 86
ANEXO H. Preparacin del inculo ........................................................................................ 87
ANEXO I. Inoculacin del sustrato ......................................................................................... 88
ANEXO J. Determinacin de la concentracin de esporas ....................................................... 89
ANEXO K. Incubacin de las especies .................................................................................... 90

xiv

SIMBOLOGA

TH

Trichoderma harzianum

THa Trichoderma hamatum


mab

masa de agua absorbida por el sustrato

mH+c masa hmeda ms cedazo


mc

masa del cedazo

ms

masa del sustrato (arrocillo)

Va

volumen de agua adicionado

Vab

volumen de agua absorbido

Vad

volumen de agua adicionado

ma

masa de agua para preparar el sustrato

mat

masa de agua total

mas

masa de agua en el arrocillo

mss

masa del sustrato seco

%H

humedad expresado en porcentaje

concentracin de esporas

Ne

Nmero de esporas contadas

Dilucin

Temperatura

tiempo

velocidad de crecimiento

Desviacin de la pendiente

%CV Coeficiente de variacin


logC logaritmo base 10 de la concentracin

Vop

Concentracin promedio
Volumen ptimo

UFC Unidades formadoras de colonias

xv

ESTUDIO DEL ADECUADO CRECIMIENTO DEL HONGO TRICHODERMA


HARZIANUM Y TRICHODERMA HAMATUM EN SUSTRATO SLIDO

RESUMEN

Se establecieron las mejores condiciones de crecimiento de los hongos Trichoderma harzianum


y Trichoderma hamatum, en arrocillo usado como sustrato slido. Para ello, se utilizaron cepas
nativas del cantn Ambato, aisladas del suelo por el MAGAP-Tungurahua y purificadas por la
empresa Plantsphere Laboratories (PSL). Se trabaj experimentalmente con cuatro
humedades de sustrato, para la primera especie: 39,6%; 37,7%; 35,7% y 33,2%, para la
segunda: 41,3%; 38,2%; 34,8% y 31%. Las esporas se incubaron a tres temperaturas: ambiente
(21C), 25C y 28C, con exposicin natural de luz. Con las mejores humedades obtenidas para
cada especie y temperatura, a partir de las curvas de concentracin de esporas versus humedad,
se procedi a una nueva inoculacin, que permiti determinar la velocidad de desarrollo de
estos microorganismos, mediante las curvas de crecimiento.

Se concluye que a 25C y 41,3% de humedad, se reduce el tiempo de produccin de estos


hongos, obteniendo para las dos especies un valor mximo de 1,5x10 7 UFC/mL a los 12 das de
incubacin.

PALABRAS CLAVES: / CRECIMIENTO / HONGOS / TRICHODERMA HARZIANUM /


TRICHODERMA HAMATUM / SUSTRATO SLIDO / TEMPERATURA DE INCUBACIN/

xvi

STUDY OF THE APPROPRIATE GROWTH OF THE FUNGI TRICHODERMA


HARZIANUM AND TRICHODERMA HAMATUM IN A SOLID SUBSTRATE

ABSTRACT

The best conditions were established for the growth of the Trichoderma harzianum and
Trichoderma hamatum fungi, in jungle-rice used as a solid substrate. To achieve this, native
strains from the area of Ambato were used, isolated in the ground by the MAGAP-Tungurahua
(Ministry of Agriculture, Livestock, Aquaculture and Fishing Tungurahua branch) and
purified by the company Plantsphere Laboratories (PSL). The work was done experimentally
using four levels of substrate moisture, for the first specie: 39,6%; 37,7%; 35,7% and 33,2%; for
the second one: 41,3%; 38,2%; 34,8% and 31%. The spores were incubated at three different
temperatures: environment (21C), 25C and 28C, with natural exposure to light. With the best
moisture for each specie and temperature, and using the curves of spore concentration versus
moisture level, a new inoculation was performed, which allowed the determination of the
growth rate presented by these microorganisms, with the application of growth curves.

The conclusion is that at 25C and 41,3% moisture level, the production rate presented by these
fungi is reduced, obtaining in both species a maximum value of 1,5x107 UFC/mL after 12 days
of incubation.

KEYWORDS: / GROWTH / FUNGI / TRICHODERMA HARZIANUM / TRICHODERMA


HAMATUM / SOLID SUBSTRATE / INCUBATION TEMPERATURE /

xvii

INTRODUCCIN

El Ecuador es considerado un pas netamente agrcola. Grandes extensiones de tierras son


cultivadas para satisfacer la demanda de los consumidores, que da tras da se incrementa por el
constante crecimiento de la poblacin. Los agricultores elevan la productividad del campo,
garantizan sus cosechas utilizando elevadas cantidades de plaguicidas, para controlar las
enfermedades de las plantas, siendo perjudiciales para los consumidores y el medio ambiente.
Adems con el paso del tiempo este uso indiscriminado de productos txicos se ha vuelto
ineficaz, induciendo a la generacin de plagas resistentes y difciles de controlar.

La conciencia social que se ha generado en los ltimos aos ante el enorme deterioro
medioambiental por el uso abusivo de compuestos contaminantes, ha generado un gran inters
en la bsqueda de nuevas estrategias de produccin, que sean ambientalmente sostenibles para
el control de plagas y enfermedades.

Una de las alternativas ms innovadoras para garantizar la seguridad alimentaria, para disminuir
los residuos txicos, los contaminantes del suelo y los recursos hdricos que alteran el equilibrio
ecolgico es la utilizacin del control biolgico, un mtodo que recurre a la ayuda de
microorganismos antagonistas de los agentes infecciosos para controlarlos de forma natural.

En el suelo se encuentran una gran cantidad de microorganismos benficos, entre estos el hongo
Trichoderma. Constituyen un grupo de microorganismos filamentosos, que producen sustancias
antibiticas, metabolitos antifngicos, son competidores por espacio y nutrientes frente a otros
microorganismos. Protegen las races de las plantas, desdoblan la materia orgnica facilitando la
asimilacin de nutrientes, son fciles de aislar, crecen en una amplia gama de sustratos siendo
factible su propagacin masiva. Tambin tiene capacidad de adaptacin y supervivencia en
cultivos de alta contaminacin producida por fungicidas.

El inters actual de disminuir el impacto ambiental con producciones ms limpias para proteger
los recursos naturales ha generado que hace poco tiempo estas especies adquieran un valor
comercial importante. Aunque en el mercado mundial ya se cuentan con formulados a base de
Trichoderma para el control de microorganismos, en el pas existe muy poca informacin. Por

tal razn este proyecto consiste en el estudio de la adecuada produccin masiva de dos especies
endmicas del cantn Ambato, Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum en sustrato
slido, con ayuda de curvas de crecimiento desarrolladas a condiciones controladas.

En el crecimiento de estos hongos se estudiaron dos variables esenciales que son; la cantidad de
agua para la preparacin del sustrato y la temperatura de incubacin, permitiendo generar mayor
produccin de esporas en un menor tiempo. Como primer punto se replic las especies en cajas
Petri, luego se multiplic en botellas de vidrio camineras y finalmente en fundas de
polietileno.

Se realiz ensayos de humedad del sustrato para determinar el mejor valor, adems para generar
comparaciones las especies fueron sometidas a tres temperaturas: al ambiente (21C), 25C y
28C, dando como resultado una mxima concentracin de esporas a la humedad del 41,3% y
temperatura de 25C a los doce das de tratamiento.

Como etapa final los biofungicidas obtenidos, fueron aplicados en plantas de moras y fresas
dando como resultado mayor rapidez de desarrollo, mejor intensidad del color y brillo,
indicativos de que plantas se encuentran sanas y que los microorganismos estudiados si ejercen
un efecto positivo en ellas.

Este anlisis adems de generar informacin propia y vital para el laboratorio, permiti conocer
el comportamiento de los microorganismos frente a los tratamientos realizados y optimizar dos
variables del proceso productivo, obteniendo un bio fungicida que ejercer una accin efectiva
en los diferentes cultivos donde sean aplicados, logrando cosechas ms sanas.

1. MARCO TERICO

1.1 Los hongos

Son microorganismos eucariticos, hetertrofos, que requieren de compuestos orgnicos para su


nutricin. Secretan enzimas hidrolticas, como lipasas, pectinasas y proteinasas que ayudan a
descomponer una gran variedad de sustratos, para absorber los nutrientes que hay en las hojas
muertas y otros materiales orgnicos del suelo.

Se alimentan de materia orgnica muerta, por lo que se les conoce como saprofitos, estos
generalmente no causan enfermedades. Solo descomponen restos complejos de vegetales y
animales, degradndolos a sustancias qumicas ms sencillas que son devueltas al suelo,
aumentando as su fertilidad. [1]

Algunos hongos pueden prosperar como parsitos invadiendo a sus hospedadores vivos
causando enfermedades (hongos patgenos) en plantas, animales y seres humanos. Los hongos
fitopatgenos ejercen un gran impacto econmico en la industria agrcola debido a las
enfermedades que les pueden causar a los cultivos.

Poseen una pared celular que contiene quitina, estn formados por largas fibras ramificadas,
llamadas hifas, las cuales forman el cuerpo principal del hongo o micelio. En la figura 1 se
indica una hifa con los principales organelos celulares. [2]

Figura 1. Hifa mostrando los principales organelos celulares.


3

Las hifas estn rodeadas de una pared celular en forma de tubo que rodea una cavidad central o
lumen, donde se encuentra el protoplasma. La pared es de consistencia rgida y est compuesta,
principalmente, de hemicelulosa y quitina (dos polmeros fibrilares, el primero de Nacetilglucosamina y el segundo de glucosa). [3]
La reproduccin puede ser: [4]

1) Asexual, por fisin binaria, gemacin o formacin de esporas


2) Sexual, por fusin de los ncleos de dos clulas afines.

Se desarrollan prcticamente sobre cualquier sustrato pero necesitan de humedad, la cual la


obtienen de la atmsfera o del medio sobre el cual estn creciendo. Si las condiciones son
adversas y el hbitat se vuelve muy seco, estos sobreviven entrando en una fase latente o
produciendo esporas resistentes a la deshidratacin.

Los hongos alcanzan un ptimo desarrollo en ambientes oscuros y hmedos con temperaturas
entre 22 y 30C aunque algunos pueden crecer a temperaturas tan altas como 62 C, tan bajas
como 0 C o menos y toleran amplios rangos de pH de 2 a 9 pero casi todos crecen mejor en un
pH cido. [5]

Son importantes porque permiten la elaboracin de pan, cerveza, quesos maduros, bebidas
espirituosas (vinos, champaas), son la base de medicinas como la penicilina, se utilizan en la
biorremediacin, en la agricultura, la horticultura y la silvicultura. Pero pueden ser dainos
cuando pudren madera, textiles, papel, alimentos, etc.

[6]

1.2 Trichoderma spp.

Las especies de este gnero se encuentran ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se
presentan naturalmente en diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen
materia orgnica o desechos vegetales en descomposicin. [7]

Este beneficioso hongo es filamentoso, hetertrofo, aerobio, su pared celular est compuesta de
quitina, coloniza fcilmente las races de las plantas, las mejora e impide que nuevos hongos
colonicen la zona donde ste se desarrolla. Son los antagonistas ms utilizados para el control
biolgico debido a su facilidad para ser aisladas y cultivadas en un gran nmero de sustratos.
Adems no son patgenos de plantas, ni peligrosos para los humanos o animales.

Su presencia puede ser detectada por un ligero olor a coco en el sustrato, as como por su color
verde y blanquecino. Producen enzimas y vitaminas, antibiticos que al ser absorbidos por las
races de las plantas generan un crecimiento ms rpido. En ciertos casos el antibitico formado
es especfico contra el patgeno de las plantas, garantizando as su eficacia.

La poblacin de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente


desciende por largos perodos de tiempo. Otros estudios han determinado que el pH, la
concentracin de CO2, HCO3, sales y el contenido de materia orgnica son factores fsicos y
qumicos determinantes para la variacin de la cantidad de estas especies, adems de la
presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente.

[8]

Trichoderma spp. durante su proceso de produccin genera metabolitos voltiles antifngicos


como la lactona 6-pentil --pirona (6PAP) con aroma a coco, que es un lquido de color amarillo
a naranja, tiene la frmula molecular C10H14O2. La figura 2 presenta la estructura del 6PAP. [9]

CH3(CH2)3CH2

Figura 2. Estructura del 6-pentil--pirona

1.2.1 Clasificacin Taxonmica. Las especies del gnero Trichoderma spp. pertenecen a un
grupo de hongos filamentosos que han sido caracterizados por sus aplicaciones en el sector
agrcola como controladores biolgicos de una amplia gama de organismos patgenos.
La clasificacin taxonmica del gnero Trichoderma es: [10]

Reino:

Fungi

Divisin

Ascomycota

Subdivisin:

Pezizomycota

Clase:

Sordariomycetes

Orden:

Hypocreales

Familia:

Hypocreaceae

Gnero:

Trichoderma
5

1.2.2 Reproduccin. Las especies Trichoderma spp. se reproduce asexualmente, pueden utilizar
una gran variedad de sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidn como fuente
de carbono. Muchas cepas crecen eficientemente en medios slidos o lquidos y en un amplio
rango de temperaturas, son relativamente tolerantes a humedades bajas y crecen en suelos
ligeramente cidos.

1.2.3 Morfologa.

1.2.3.1 Caractersticas macroscpicas. Las colonias se reconocen fcilmente por su rpido


crecimiento y sus coloraciones son: blancas verdes o amarillo verdosas; las reas con
colonias se presentan con anillos concntricos. El revs de las colonias son usualmente de
colores, amarillo, mbar o amarillo verde. En la figura 3 se observan las caractersticas que
presenta Trichoderma. [11]

Figura 3. Caractersticas macroscpicas de Trichoderma spp.

1.2.3.2 Caractersticas microscpicas.

Conidiforos. Son erectos, hialinos, no verticilados, en su mayora ramificados, parecen un


rbol pequeo con un sistema de ramas irregulares de manera piramidal y pueden estar
solitarios o en grupos (figura 4). [12]

Filides. Son en forma de botella, pueden estar solas o en grupos, hinchada en la regin
central pero delgada hacia el pice: son hialinas y en ngulo recto con respecto a los

conidiforos. Es donde se forman las esporas asexuales o conidios, de gran importancia para
la identificacin taxonmica a nivel de especies. [13]

Conidios. Son esporas asexuales de color verde amarillo blanco, con esporulacin densa
que aseguran la generacin del hongo durante gran parte del perodo vegetativo de las
plantas. Su pared est compuesta por quitina y glucanos. Su funcin es la reproduccin
rpida, dispersin y supervivencia. [14]

Figura 4. Caractersticas microscpicas de Trichoderma spp.

La mayora de las especies de Trichoderma tienen la capacidad de producir clamidosporas en


sustratos naturales, estructuras de vital importancia para la sobrevivencia del gnero en el suelo
ya que soportan condiciones ambientales adversas.

1.3 Trichoderma harzianum.

Sus colonias son de color amarillo verdoso (Figura 5). Interviene como digestor del nitrgeno
orgnico. Es tolerante a la tensin impuesta por escasez de nutrientes, se utiliza en el control
biolgico como fungicida, en aplicacin foliar, tratamiento de semillas y el tratamiento del suelo
para la supresin de diversos patgenos que provocan enfermedades fngicas. Tambin controla
el marchitamiento (una enfermedad que mata las plantas jvenes, ennegreciendo y encogiendo
los tallos). [15]
7

Figura 5. Trichoderma harzianum

Penetra las races de las plantas sin causar daos, provocando cambios bioqumicos y formacin
de barreras fsicas. Los metabolitos que produce esta especie se encuentran relacionados con la
composicin del medio en el que se encuentra, es decir los nutrientes que tiene disponible.
Disminuye su poblacin conforme aumenta la altura sobre el nivel del mar. Su ambiente ptimo
son climas templados. [16]

1.4 Trichoderma hamatum

Al ser incorporada en el suelo adquiere un potencial como agente de biocontrol, regulando


poblaciones de nemtodos que generan un especie de marchitamiento de las plantas daando las
races e impidiendo la absorcin de los nutrientes. Por tal motivo mejora la supervivencia de las
plantas de caa de azcar, de tomate de rbol, de pltano, de papa, etc. En la figura 6 se observa
a esta especie. [17]

Figura 6. Trichoderma hamatum


8

1.5 Mecanismos de Accin

El hongo Trichoderma presenta distintos mecanismos de accin para ejercer su antagonismo,


dependiendo de las caractersticas de la cepa de Trichoderma, del patgeno y las condiciones
ambientales, entre estos tenemos competencia, parasitismo y antibiosis.

1.5.1 Competencia. Para que exista competencia es necesario la escasez o limitacin de un


requerimiento (espacio y/o nutrientes), por lo que la competencia puede definirse como el
comportamiento desigual de dos o ms organismos ante un mismo requerimiento, siempre y
cuando la utilizacin por uno de ellos, reduzca la cantidad necesaria para los dems.

[18]

La presencia natural de Trichoderma en diferentes ambientes demuestra que son excelentes


competidores por espacio y recursos nutricionales. Este modo de accin se ve favorecido por la
velocidad de crecimiento que presentan la mayora de estas especies que frenan el desarrollo a
los competidores.

1.5.2 Micoparasitismo. Se refiere al hecho de que un microorganismo parasita a otro, en este


caso a un patgeno de plantas. Consiste en la utilizacin del patgeno como alimento por su
antagonista. [19]

Trichoderma es un hongo muy favorable porque no ataca a los seres vivos. Producen enzimas
como la -1,3-glucanasa que ayudan a degradar las paredes celulares de las hifas del hongo a
destruir (husped), consiguiendo as absorber los nutrientes del interior del hongo atacado.
En Biocontrol (2004) se indica que el proceso micoparastico incluye las siguientes etapas: [20]

Crecimiento de Trichoderma.

Reconocimiento superficial del husped.

Secrecin de enzimas.

Penetracin de las hifas.

Lisis del husped.

1.5.3 Antibiosis. Se define como la inhibicin del crecimiento de un microorganismo por


sustancias producidas y liberadas por otro microorganismo.

Los metabolitos con actividad antifngica secretados por Trichoderma constituyen un grupo de
compuestos voltiles y no voltiles, muy diverso en cuanto a estructura y funcin. Muchas cepas
de Trichoderma producen estos metabolitos secundarios, algunos de los cuales inhiben otros
microorganismos, con los que no se establece contacto fsico, estas sustancias inhibitorias son
consideradas como antibiticos. [21]

1.6 Factores que influyen en el crecimiento

1.6.1 Temperatura. La temperatura influye notablemente en el crecimiento fngico y en la


formacin y germinacin de conidios. El rango de temperatura para el crecimiento de
Trichoderma se encuentra entre 10 - 40C y tiene su ptimo de crecimiento alrededor de los 25
y 30C. Pueden soportar temperaturas extremas y, aunque no pueden crecer, sus conidios se
mantienen viables y germinarn cuando recuperen las condiciones apropiadas. El descenso de la
temperatura provoca una ralentizacin del metabolismo, y es una medida que se utiliza para
frenar, en general, el deterioro de productos almacenados.

[22]

1.6.2 Humedad. La actividad metablica del hongo depende estrechamente de la humedad del
medio (sustrato), ya que esta variable influye significativamente en el crecimiento microbiano,
en la biosntesis y la secrecin de diferentes metabolitos.

Un bajo contenido de humedad limita la difusin de los nutrientes y la degradacin del sustrato,
dando como resultado un bajo crecimiento microbiano. Mientras que, altos valores de humedad
en la matriz slida disminuye la porosidad del sustrato dificultando la transferencia de oxgeno.
Por este motivo, es conveniente buscar el nivel ptimo de humedad con el objeto de optimizar el
crecimiento del microorganismo o, en su caso, obtener una mayor produccin de metabolitos
(enzimas, cidos orgnicos, etc.). [23]

En general, los contenidos de humedad encontrados en los procesos de fermentacin slida se


encuentran entre el 30% y 85%. Para cultivos bacterianos, la humedad del sustrato debe ser
superior al 70%, mientras que en el caso de los hongos filamentosos, sta podra encontrarse en
un rango que oscila entre el 20% y el 70%. [24]

1.6.3 Aireacin. Dos componentes del aire son esenciales para los hongos: el oxgeno y el
dixido de carbono, sin embargo es necesario tener en cuenta que altas concentraciones de CO 2

10

como resultado de la respiracin celular se puede acumular en ambientes cerrados, inhibiendo el


crecimiento de este microorganismo. [25]

1.6.4 pH. El hongo Trichoderma soporta un rango de pH relativamente amplio para su


crecimiento. Presenta crecimiento a valores de pH comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un
intervalo de pH ptimo que se encuentra entre 4.0 y 7.0. A pH cido, la asimilacin de
nutrientes como glucosa ejerce una influencia importante sobre el crecimiento del hongo y su
posterior esporulacin. Adems, procesos como la germinacin, se ven afectados por la escasez
de nutrientes y por niveles de pH por encima de 9.0. [26]

1.6.5 Tamao de partcula del sustrato. El tamao de partcula es un factor importante a tener
en cuenta. Los sustratos de partculas pequeas proporcionan una gran rea especfica, lo que
afecta de manera positiva al desarrollo del microorganismo. Sin embargo, un tamao de
partcula demasiado pequeo, que genere a su vez un espacio interarticular reducido, disminuye
la eficiencia de la respiracin/aireacin dificultando el crecimiento microbiano.

[27]

1.6.6 Exposicin de luz. La mayora de especies del gnero Trichoderma son fotosensibles,
puesto que se presentan una mayor esporulacin al ser expuestas a la luz. Sin embargo, cuando
se someten a perodos alternados de luz y oscuridad, se favorece la colonizacin del hongo
sobre diferentes sustratos slidos. [28]

1.7 Los hongos en el control biolgico

El control biolgico puede definirse como un mtodo de control de plagas, enfermedades y


malezas que consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de
otros organismos. Tienen una serie de ventajas como: son ms seguros, pueden persistir durante
ms tiempo, producen un balance ecolgico.

El control biolgico se produce de forma natural sin intervencin del hombre, permite modificar
el equilibrio entre las poblaciones microbianas gracias a los mecanismos de accin entre los
patgenos y los microorganismos antagonistas. Los hongos poseen un conjunto de
caractersticas que los hacen agentes de biocontrol potencialmente ideales.

[29]

1. Muchas de las especies saprofitas antagonizan a la mayora de los organismos de las plagas.

11

2. Se desarrollan fcilmente en medios de cultivo pudiendo producirse en grandes cantidades y


ser liberados al medio ambiente como esporas o fragmentos de micelio.
3. Los inculos liberados crecern y producirn un nuevo micelio que parasitar o inhibir la
plaga sin causar dao a las plantas.
4. Tienen la facilidad de sobrevivir durante perodos de tiempo relativamente largos.
5. Los compuestos biolgicamente activos no causan dao al medio ambiente.

1.8 Sustratos en la produccin de Trichoderma spp.

Los sustratos empleados para la produccin de microorganismos, en lo posible deben contener


todos los elementos necesarios para una adecuada sntesis del material celular y para la
produccin de metabolitos, cuando son requeridos. [30]

En el proceso de esporulacin de Trichoderma spp. la fuente de carbono (C) presente en el


sustrato es el reactivo en exceso, mientras que el contenido de nitrgeno (N) es el factor
limitante de crecimiento. La relacin carbono: nitrgeno es esencial ya que de este balance
depender la formacin de las esporas deseadas. [31]

Generalmente se utilizan compuestos procedentes de la agricultura, subproductos de la


agroindustria aunque se prefiere el desecho de compuestos orgnicos debido a que suplen la
demanda de nutrientes requeridos por los microorganismos a un bajo costo. En la figura 7 se
indican algunos tipos de sustratos. [32]

Figura 7. Tipos de sustratos

12

Arroz. Es el cereal ms rico en almidn y la estructura qumica de este es relativamente


sencillo comparado con otros sustratos.

Esencialmente el almidn est compuesto de dos polmeros relacionados en diferentes


proporciones: amilosa (16 30%) y amilopectina (68 85%). La amilosa es un polmero de
glucosa unido por enlaces -1,4 glucosdicos principalmente cadenas lineales. La
amilopectina es un polmero de glucosa altamente ramificado incluyendo tambin enlaces
-1,6 glucosdicos en los puntos de ramificacin. De esta manera el hongo Trichoderma
spp., hidroliza el polmero del almidn mediante enzimas como glucoamilasas,
amilasas, amilasas, [33] permitiendo el crecimiento micelial y la produccin de esporas.

1.9 Fermentacin

Desde el punto de vista microbiolgico, se entiende por fermentacin aquel proceso en el que
los microorganismos producen metabolitos o biomasa, a partir de la utilizacin de sustancias
orgnicas, en ausencia o presencia de oxgeno. La descomposicin de los sustratos se lleva a
cabo por enzimas producidas por los microorganismos. [34]

Los microorganismos implicados en los procesos fermentativos pueden obtener su energa y su


fuente de carbono por la degradacin de los compuestos orgnicos. La produccin comercial de
productos de fermentacin ha empleado principalmente diversas especies de bacterias,
levaduras y hongos. En general, la produccin masiva de microorganismos biocontroladores
puede llevarse a cabo mediante dos tcnicas: fermentacin lquida o sumergida y fermentacin
slida o en superficie. [35]

1.9.1 Fermentacin en medio lquido. Tambin es conocida como fermentacin sumergida. En


este proceso se da la produccin de microorganismos en medio lquido donde todos los
nutrientes estn disueltos en el medio de cultivo y se desarrolla por medio de condiciones
fisicoqumicas. [36]

Este mtodo es el ms usado por la industria biotecnolgica gracias a las siguientes ventajas: se
obtiene un producto ms homogneo, es ms sencillo el control de la temperatura, aireacin,
agitacin, y pH, adems se puede llevar a cabo la medicin directa de la biomasa. [37]

13

1.9.2 Fermentacin en medio slido. Las fermentaciones en sustratos slidos, utilizadas para el
cultivo de microorganismos en materiales slidos que contienen o no una cantidad limitada de
agua libre, se emplea en la obtencin de enzimas fngicos por cultivo en superficie. En este
proceso el sustrato sirve como soporte para que los microorganismos crezcan sobre l. Presenta
algunas ventajas como un menor costo de inversin, la reduccin del costo energtico y un
menor volumen de aguas residuales producidas. [38]
La tcnica de fermentacin en medio slido consiste de las siguientes etapas: [39]

1. Preparacin de la mezcla slida


2. Reduccin de la carga microbiana del sustrato mediante la inyeccin directa de vapor de
agua o por esterilizacin en autoclave
3. Inoculacin de la matriz slida con un inculo lquido
4. Ajuste de la humedad y pH
5. Puesta del medio en el fermentador
6. Inyeccin continua o intermitente de aire a temperatura y humedad controladas
7. Secado hasta obtener la humedad residual
8. Molienda o adecuacin de tamao de partcula
9. Obtencin del ingrediente activo.

Los hongos filamentosos son los microorganismos ms adaptados para crecer en sustratos
slidos con un bajo contenido de agua libre, reduciendo la probabilidad de contaminacin por
bacterias o levaduras: adems tienen la capacidad de utilizar polisacridos como fuentes de
carbono.

1.9.3 Comparacin entre la fermentacin en medio slido y en medio lquido. En la tabla 1 se


observan las diferencias que presenta estas fermentaciones. [40]

14

Tabla 1. Comparacin entre la fermentacin lquida y slida


Factor

Fermentacin lquida

Fermentacin slida
Sustratos econmicos de carcter

Sustratos

Sustratos solubles (azcares)

agroindustrial
insolubles

biopolmeros

(almidn,

celulosa,

pectina, lignina)
Agua

Consumo limitado de agua y baja

Elevado consumo de agua

actividad de agua

Fcil control de la temperatura, Capacidad de transferencia de calor

Temperatura

alta transferencia de calor

bajo

Se requiere la inyeccin de altos


Aireacin

volmenes de aire, el oxgeno


soluble es limitado
Fcil control de pH por la

Control de pH

homogeneidad del sistema

de intercambio de aire / sustrato


Difcil control de pH. Se deben
emplear sustancias o sustratos con
propiedades amortiguadoras

Agitacin

Se requiere para lograr una buena

Mecnica

homogenizacin

Se opera bajo condiciones estticas

Disponibilidad de equipos a nivel Necesita el diseo de nuevos equipos

Escalamiento

industrial
Fcil

Inoculacin

y de un desarrollo ingenieril
inoculacin,

proceso

continuo
Alto riesgo de contaminacin

Contaminacin

bacteriana
Genera

Gasto Energtico

un

del equipo

elevado

El bajo contenido de humedad hace


menos probable la contaminacin por

consumo Los requerimientos de energa son


bajos

Se manejan altos volmenes y la


inversin en equipos y tecnologa
es elevada

La inoculacin de esporas es por lote

bacterias

energtico

Tamao y volumen

Efluentes

Fcil aireacin y elevada superficie

Se manejan volmenes ms bajos y


el costo de los equipos es menor

Altos volmenes de efluentes y Bajos volmenes de efluentes y

contaminacin

contaminacin

contaminantes

Concentracin del

Dependiendo del producto de Fcil produccin de propgulos y

producto

inters

esporas fngicas

15

1.10 Curva de crecimiento microbiano

Esta curva representa el comportamiento del crecimiento del microorganismo a travs del
tiempo. En la figura 8, se muestran las fases de crecimiento de los microorganismos. [41]

Figura 8. Curva de crecimiento microbiano

En la curva de crecimiento se diferencian cuatro fases, la fase de latencia, la fase de crecimiento


exponencial o logartmico, la fase estacionaria y la fase de muerte celular. Aunque el tiempo de
duracin de cada una de estas etapas, puede variar segn el tipo de microorganismo, la familia a
la cual pertenece, entre otras caractersticas.

A)

Fase de latencia.

Tambin es conocida como fase lag; coincide con el perodo de adaptacin del microorganismo
a las nuevas condiciones nutricionales y ambientales. Se presenta inmediatamente despus de la
inoculacin y su duracin depende del estado fisiolgico de la clula inoculada y de las
condiciones ambientales. Durante este periodo, el nmero de clulas no se incrementa, pues el
microorganismo utiliza la energa disponible con el fin de sintetizar las enzimas que requiere
para su desarrollo en el nuevo medio.

B)

Fase logartmica.

Esta fase presenta mayor inters por ser la etapa donde las clulas se multiplican a la mxima
velocidad, su crecimiento puede ser cuantificado con base en el nmero de clulas que se
producen por unidad de tiempo (para levaduras y bacterias) o por el aumento en la biomasa por
16

unidad de tiempo (para hongos filamentosos). La velocidad de crecimiento durante este periodo
permanece constante y es independiente de la concentracin del sustrato, siempre y cuando esta
sustancia se encuentre en exceso.

C)

Fase estacionaria.

En esta etapa, la velocidad de crecimiento (reproduccin) del microorganismo es igual a la


velocidad de mortalidad. Si la poblacin no se reproduce ni muere, el nmero de clulas
permanece constante y la longitud de la fase vara y depende del balance que logren las clulas
con el medio ambiente. Se llega a un perodo de equilibrio celular.

La fase estacionaria termina cuando se produce alguna de estas tres situaciones: los nutrientes se
agotan, las condiciones ambientales indispensables para la clula se modifican o cuando las
clulas produce metabolitos txicos que inhiben su reproduccin.

D)

Fase de muerte.

Se inicia cuando los nutrientes que estn en el medio de cultivo no son suficientes para que el
microorganismo pueda producirse y aunque quedan clulas vivas, su nmero es superado por el
de las clulas muertas. Tambin se debe a la acumulacin de sustancias txicas generadas por el
metabolismo del microorganismo.

1.11 Aplicaciones de Trichoderma spp.

El hongo Trichoderma es utilizado en la industria alimenticia ya que produce enzimas


hidrolticas tales como glucanasas, quitinasas, proteasas, y xilanasas, que son usadas como
aditivos en la elaboracin de alimentos para el ganado, aves y mascotas.

El hongo Trichoderma spp. tambin se usa ampliamente en la produccin de aditivos


alimentarios y productos relacionados. Actualmente varias enzimas de este gnero son utilizadas
para mejorar el proceso de elaboracin de la cerveza (-glucanasa), y en la produccin de zumos
de frutas (pectinasas, celulasas, hemicelulasas). Las celulasas son aplicadas principalmente en la
coccin, el malteado, y la produccin de alcohol de grano.

[42]

Las celulasas producidas por el hongo Trichoderma son utilizadas en la industria textil para
suavizar y acondicionar los textiles, as como para producir polvos de lavado de alta calidad.
17

Las enzimas obtenidas a partir de estos microorganismos tambin son usadas en la industria del
papel para modificar las propiedades de la fibra y para reducir el contenido de lignina. [43]

Se ha demostrado que algunas especies de Trichoderma tienen potencial para ser aplicadas en la
biorremediacin de sitios contaminados con sustancias de origen orgnico (hidrocarburos del
petrleo, explosivos y plaguicidas) e inorgnico (metales pesados y cianuro). [44]
Tambin existen reportes de T. polysporum, T.koningii, T. pseudokoningii y T. harzianum con
la capacidad para degradar hidrocarburos saturados y aromticos presentes en aceites
combustibles. As mismo, Trichoderma sp. se ha empleado para la detoxificacin de cianuro
usando dos enzimas (rodanasa y cianuro hidratasa) capaces de degradarlo.

[45]

La lanctona 6PAP con aroma a coco es considerada como un agente saborizante no txico
utilizado para la aromatizacin de artculos alimenticios, lo que le confiere importante inters
comercial en la industria de alimentos y aroma. Adems tiene funcin antifngica.

18

2. PARTE EXPERIMENTAL

2.1 Pruebas preliminares

Para el desarrollo de esta investigacin se utilizaron cepas nativas de la provincia de


Tungurahua Cantn Ambato, aisladas del suelo por el Ministerio de Agricultura Ganadera
Acuacultura y Pesca (MAGAP), identificadas y purificadas por Plantsphere Laboratories. Las
especies a estudiar fueron: Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum. (Ver anexo A y
B).

Como medios de propagacin se emplearon: Agar Patata Dextrosa (PDA) y arrocillo, El


primero usado para reproducir las especies en cajas Petri, como respaldo de la materia prima y
el segundo empleado en la produccin masiva de estos microorganismos, esta etapa fue
enfocada en la preparacin de sustrato (arrocillo).

El arrocillo fue sometido a cuatro tratamientos diferentes durante la preparacin (Ver tabla 2),
los criterios considerados fueron: la baja cantidad de agua en el sustrato limita la accesibilidad
de nutrientes obtenindose un mnimo crecimiento y el exceso de humedad disminuye la
porosidad del sustrato dificultando la oxigenacin.

Tabla 2. Volumen de agua adicionada en la preparacin del sustrato


Especie

Volumen de agua adicionado (Va), mL


1

Trichoderma harzianum (TH)

367

330

295

255

Trichoderma hamatum (THa)

400

340

280

220

Primero se trabaj con Trichoderma harzianum para observar cmo se desarrolla a las
condiciones planteadas y finalmente se procedi con Trichoderma hamatum, incrementndose
el rango de volumen de agua adicionado al sustrato es su preparacin, para determinar hasta qu
punto es fcilmente manipulable.
19

La siembra de los microorganismos en esta fase se realiz en botellas de vidrio (camineras)


conteniendo 80 gramos de sustrato cada una, con una concentracin inicial de esporas (Ci). En
la tabla 3 se muestra un resumen de las repeticiones realizadas en esta etapa.

La etapa de prueba inicial es indispensable en este proyecto. A partir de los datos obtenidos se
elaboraron curvas de concentracin de esporas (logC) versus cantidad de agua adicionada al
arrocillo (Va) (Ver grfico 1 y 2) para cada temperatura de incubacin (T), importante en la
obtencin de la mayor cantidad de esporas de los hongos a estudiar.

La incubacin de los microorganismos se efectu en vitrinas de vidrio, con la finalidad de


proveer luz natural al cultivo, en su base se acondicion un foco para generar calor, este lugar se
cubri con papel aluminio, creando un ambiente de periodos alternados de luz y obscuridad,
tambin se adecu un sensor de temperatura para fijar esta variable de 25C, 28C y para la
temperatura a condicin ambiental 21C no se le suministr calor.

2.2 Diseo experimental

La investigacin experimental est orientada al estudio del adecuado crecimiento de los


microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum, en la cual se propone
modificar variables fundamentales como: cantidad de agua presente en la preparacin del
sustrato y temperatura.

Las curvas obtenidas en las pruebas preliminares proporcionan datos ptimos de agua (Vop), los
cuales permitieron preparar el sustrato a una humedad establecida y generar un excelente
crecimiento las dos especies de Trichoderma. En la determinacin del porcentaje de humedad
(%H), se incluy tambin la humedad del arrocillo que establece la Norma INEN 1690 para su
comercializacin.

En esta etapa se elaboraron las curvas de crecimiento para cada microorganismo, a las distintas
temperaturas planteadas, el proceso de propagacin se efectu en fundas de polietileno con 160g
de sustrato cada una, realizando varias repeticiones por precaucin ante la contaminacin de
microrganismos del ambiente y para verificar la repetibilidad del proceso. (Ver tabla 3).

20

Tabla 3. Nmero de repeticiones realizadas

Especie

Temperatura,
C

Volumen de

Pruebas

Diseo

agua,

preliminares

experimental

mL

# botellas

#fundas

36

10

36

10

36

10

96

30

Trichoderma

21

harzianum

2
3
4
1

25

2
3
4

Trichoderma
hamatum

1
28

2
3
4

Total

En las figuras 9 y 10 para Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum respectivamente, se


muestra el diseo experimental utilizado en la produccin de la mayor cantidad de esporas
(logC) de los microorganismos en un menor tiempo (t).

21

V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)

T1

Vop

V3, Ci

logC = f(t)
Curva de
crecimiento

V4, Ci

V1, Ci
V2, Ci
TH

T2

logC = f(Va)

Vop

V3, Ci

logC = f(t)

22

Curva de
crecimiento

V4, Ci

V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)

T3
V3, Ci

Vop

logC = f(t)
Curva de
crecimiento

V4, Ci

Figura 9. Diseo experimental para la produccin de esporas y construccin de la curva de crecimiento del hongo Trichoderma harzianum (TH)

V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)

T1

Vop

V3, Ci

logC = f(t)
Curva de
crecimiento

V4, Ci

V1, Ci
V2, Ci
THa

T2

logC = f(Va)

Vop

V3, Ci

logC = f(t)

23

Curva de
crecimiento

V4, Ci

V1, Ci
V2, Ci
logC = f(Va)

T3
V3, Ci

Vop

logC = f(t)
Curva de
crecimiento

V4, Ci

Figura 10. Diseo experimental para la produccin de esporas y construccin de la curva de crecimiento del hongo Trichoderma hamatum
(THa).

2.3 Aplicacin del hongo Trichoderma en plantas

Los mejores productos obtenidos de cada especie fueron aplicados en matas de fresas y moras,
teniendo en cuenta un testigo para observar las diferencias que presentan luego de un tiempo de
aplicacin, proceso necesario para verificar que los microorganismos generados, s, mantienen
sus caractersticas esenciales, de proteccin e induccin a un rpido crecimiento de las plantas.

Se utilizaron cinco plantas de fresas del mismo tamao. A tres de ellas se aplicaron una mezcla
de las especies estudiadas, las dos restantes se las estableci como testigos. Para la aplicacin en
plantas de moras se usaron tres plantas las cuales no fueron del mismo tamao (Ver figura 18).
Sin embargo se consider escoger a la planta ms grande como testigo y a las restantes
adicionarles las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum individualmente.

A las plantas utilizadas no se les adicion ningn componente extra, a parte de los
microorganismos y tierra que contena abono orgnico al momento de ser trasplantadas.

2.4 Materiales y equipos


Balanza

R;(0 - 500)g

Ap0,1g

Vasos de precipitacin

V = 500mL

Ap100mL

Vasos de precipitacin

V = 100mL

Ap10mL

Frascos con tapa rosca

V = 500mL

Ap100mL

Probeta graduada

V = 100mL

Ap1mL

Pipeta graduada

V = 25mL

Ap1mL

Pipeta Pasteur

V = 3mL

Ap0,5mL

Pisetas

V = 500mL

Ap100mL

Cintas de pH

R;(0 - 14)

Ap0,5mL

Autoclave

R;(100 - 133) C Ap 2,4 C

Pera de succin

Termohigrometro

R;(0 - 30)psi

Ap0,5psi

R;( 0 - 50 ) C

Ap0,1C

R;(30 - 90) %HR Ap1%


Tubos de ensayo
Atomizadores

V = 500mL

Gradilla de plstico
Porta y cubre objetos
Microscopio ptico

Aumento: 40X
24

Cmara de Neubauer
Cmara de Siembra
Asa bacteriolgica
Equipo de diseccin
Cajas Petri
Botellas de vidrio (camineras)

V = 375mL

Mecheros de alcohol
Olla arrocera

V = 1800mL

Embudo plstico mediano


Colador de cocina
Fundas de polietileno, 15 x 25 cm
Tapones de gasa y algodn
Incubadoras de vidrio (Ver anexo K)
Guantes de nitrilo
Guantes de cuero
Grapadora
Marcador para vidrio
Papel parafilm M
Papel toalla

2.5 Sustancias y reactivos


Agua destilada

H2O(l)

Alcohol industrial (Metanol) 99,9%

CH3OH

Alcohol antisptico 70%

C2H5OH

Hidrxido de sodio 0.1N

NaOH(sol)

cido clorhdrico 0.1N

HCl(sol)

Hipoclorito de sodio 4,5 p/v

NaClO (sol)

Cepa de Trichoderma harzianum


Cepa de Trichoderma hamatum
Agar Patata Dextrosa (PDA)
Arrocillo

2.6 Procedimientos

2.6.1 Produccin de Trichoderma spp. En la figura 11 se muestra el proceso de produccin de


esporas de los hongos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum planteados en esta
25

investigacin. Consta de algunos subprocesos como: preparacin del medio de cultivo a


condiciones donde los microorganismos puedan desarrollarse con facilidad, la esterilizacin que
permite disminuir la carga microbiana contaminante, la inoculacin donde se provee del
material gentico al medio de crecimiento, y en la incubacin se condiciona al microorganismo
para observar cmo se desarrolla al tratamiento dado. Si estos se adaptan se tendr un buen
crecimiento caso contrario no propagarn. Luego de un tiempo prudente se tiene la cosecha,
proceso en el cual se determinar la concentracin con la tcnica de contaje de esporas,
finalmente se almacena a temperaturas bajas para preservan el bioformulado.

Tambin se debe tener presente la inspeccin constante para observar si existe contaminacin.
De as serlo se esteriliza en autoclave a 1 atm y 121C por un tiempo de 20 min para garantizar
la muerte del o los agentes contaminantes presente y as proceder a su descarte.

TRICHODERMA SPP.

PREPARACIN DEL
SUSTRATO

ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIN DEL
SUSTRATO

INOCULACIN

INCUBACIN

COSECHA

CONTAMINACIN

ESTERILIZACIN

DESCARTE

DILUCIONES
SERIADAS

ALMACENAMIENTO

Figura 11. Diagrama de flujo del proceso de produccin de Trichoderma spp.


26

2.6.2 Preparacin del medio de cultivo a base de agar patata dextrosa (PDA)
Pesar una cantidad determinada de PDA y diluirlo en agua segn las especificaciones del
fabricante que son: 39 g del medio en 1000 mL de agua destilada
Ajustar el pH a 7 adicionando hidrxido de sodio 0.1 N cuando la mezcla es cida o con
cido clorhdrico 0.1 N si la mezcla es bsica.
Calentar la mezcla hasta el punto de ebullicin para que se disuelva por completo, agitar
levemente para evitar que el medio se queme o se chorree.
Esterilizar por 20 min a 121C y 1 atm de presin
Esperar a que el envase contenedor del medio de cultivo se enfre hasta que sea manipulable
para evitar quemaduras
Dispensar el medio en cajas Petri evitando la formacin de burbujas de aire.
Esperar a que el medio se solidifique.

Nota: Evitar que el medio de cultivo en el envase alcance la temperatura ambiente, porque se
solidificar e impedir la dosificacin en las cajas Petri.

2.6.3 Procedimiento de resiembra en el medio de cultivo PDA


Tomar una caja con medio y otra con la cepa a utilizar
Coger una pequea parte del microorganismo con el asa bacteriolgica y colocarlo en el
nuevo medio donde se propagar
Rotular y sellar con papel parafilm para evitar que se contamine con microorganismos del
ambiente.
Esperar hasta que el microorganismo se desarrolle en toda la caja Petri antes de utilizarlo.

2.6.4 Preparacin del sustrato en botellas de vidrio y en fundas de polietileno


Pesar 800 g de arrocillo y lavarlo hasta que el agua salga transparente, durante 5 min
aproximadamente. Escurrir el agua por el alrededor de 1 min.
Pesar el arrocillo mojado para determinar la cantidad de agua absorbida por este.
Poner el arrocillo lavado en la arrocera luego aadir la cantidad de agua necesaria para la
coccin.
Mezclar continuamente para que toda la coccin sea uniforme.
Depositar la preparacin en un recipiente limpio y seco hasta que se enfre.
Colocar una cantidad fija de sustrato en las camineras con la ayuda de un embudo.
Sellar con un tapn de algodn, previamente esterilizado.
27

Adicionar 160 g de sustrato en cada una de las fundas y sellar con dos dobleces pequeos
para evitar la contaminacin con microorganismos del ambiente.
Grapar las esquinas de la funda para evitar que se riegue en el proceso de esterilizacin
Esterilizar en autoclave a 121C y 1 atm de presin por un perodo de 20 min.
Agitar efusivamente las botellas esterilizadas para que el sustrato quede lo ms suelto
posible.

2.6.5 Siembra del inculo de Trichoderma spp. en botellas y en fundas. En este proceso es
necesario recurrir a la ayuda del recuento celular con la cmara de Neubauer para determinar la
concentracin de esporas presente en un volumen determinado.

Procedimiento
Tomar la cepa a utilizar y aadir una pequea cantidad de agua destilada esterilizada.
Separar las esporas con una asa bacteriolgica y diluirlo a 100 mL
Determinar la concentracin de UFC/mL con la tcnica del recuento celular y la cmara de
Neubauer, realizando varias repeticiones para tener un valor ms exacto.
Colocar las botellas de vidrio con el sustrato previamente esterilizadas en la cmara de
siembra
Rotular para evitar confusiones de cepa, humedad y temperatura.
Poner 2 mL de la solucin madre en cada caminera y agitarlo suavemente para que las
esporas se dispersen por el sustrato.
Finalmente colocarlas en las incubadoras que se encuentran a temperatura fija.

2.6.5.1 Recuento celular. El recuento celular es una tcnica que tiene por objeto determinar el
nmero de clulas que estn comprendidos en una unidad de volumen de muestra.
Todos los recuentos celulares constan de 3 fases que son:

1. Dilucin de la muestra (Diluciones seriadas)


2. Determinacin del nmero de clulas
3. Clculo matemtico del nmero de clulas presentes en 1 mL de muestra

2.6.5.2 Diluciones seriadas. Es la dilucin repetida de una solucin para reducir la


concentracin de una sustancia de una solucin original. Frecuentemente se realiza en
experimentos que requieran soluciones altamente diluidas con gran exactitud, tales como
aquellas que impliquen curvas de concentracin en una escala logartmica. (Ver figura 12)
28

Figura 12. Diluciones seriadas


Procedimiento
Poner 9 mL de agua destilada en cada uno de los tubos de ensayo y rotularlos de la siguiente
manera 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 ,10-5, etc.
Coger 1 ml de la solucin madre y colocarlo en el primer tubo, agitarlo para que la mezcla
se homogenice. La dilucin ser de 10-1.
Tomar 1 ml del tubo 10 -1 y colocar en el segundo tubo de dilucin 10-2 y as sucesivamente
hasta que los microorganismos puedan ser contados.
Determinar la concentracin en Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por mL con la
ayuda de la cmara de Neubauer.

2.6.5.3 Cmara de Neubauer. Tambin conocida como hematocitmetro, es una cmara de


contaje, se utiliza para contar clulas u otras partculas en suspensin bajo el microscopio.
Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de portaobjetos de unos 30 x 70 mm y unos 4
mm de grosor y un cubre objetos que suele ser un poco ms grueso que los normalmente
utilizados.

29

Las ms comunes son las cmaras dobles, donde existen 2 zonas de conteo, una superior y la
otra inferior, (hemisferio superior e inferior) en su parte central se encuentra grabada una
retcula cuadrangular (figura 13).

Hemisferio
superior

Hemisferio
inferior
Figura 13. Cmara de Neubauer

Cada zona de conteo es un cuadrado de 3 x 3 mm como se observa en la figura 14. La depresin


central del cubreobjetos est hundida 0,1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0,1 milmetro.

Figura 14. Divisiones de la zona de conteo

El cuadrado central se divide en 25 cuadros medianos de 0,2 mm dando un rea individual de


0,04mm2, si se considera los dos hemisferios se obtiene un rea total de 2mm2. Tambin se

30

especifica que los cuadros medianos se subdividen en 16 cuadros pequeos, dando un total de
400 cuadrados en cada hemisferio.

En el caso que la concentracin celular sea muy alta, y sea fcil perderse en el recuento se debe
utilizar un orden de conteo en forma de zig - zag. En la figura 15 se muestra el proceso de
contaje de esporas en forma de zig - zag. [46]

Figura 15. Recuento con alta concentracin celular

2.6.5.4 Clculo matemtico de la concentracin. El clculo de la concentracin celular permite


determinar el nmero de clulas viables presentes en 1 mL de muestra, para ello aplicamos la
siguiente ecuacin:

Ne
St A D

(1)

Dnde: C es la concentracin de esporas, Ne es el nmero de esporas contadas, St es la


superficie recontada de la cmara, A es la profundidad de la cmara y D es la dilucin.

31

2.6.6 Procedimiento de contaje de esporas del sustrato slido


Pesar 1 gramo de sustrato poblado por Trichoderma spp. y colocarlo en 100 mL de agua
destilada esterilizada.
Agitar efusivamente para que la mayor cantidad de esporas se desprendan del arrocillo, esta
ser la solucin madre.
Realizar diluciones sucesivas para cuantificar las esporas en cmara de Neubauer.
Efectuar varios contajes para obtener un resultado ms confiable.
Utilizar la ecuacin respectiva para determinar la concentracin de conidios (UFC/ml).

32

3. DATOS

3.1 Datos preliminares

3.1.1 Datos de las sustancias utilizadas.

Tabla 4. Datos de las sustancias utilizadas


Sustancia

Variable

Valor

Densidad, g/ml
T = 21C
% Humedad

H2O
Arrocillo

0,9980
12

Fuente: Perry John, Manual del Ingeniero Qumico. McGraw-Hill. pg 3-98


Norma INEN 1690

3.1.2 Preparacin del sustrato en camineras. En las tabla 5 y 6 se muestra el tratamiento dado
al arrocillo con cuatro valores diferentes de agua adicionada para cada una de las especies,
Trichoderma harzianum (TH) y Trichoderma hamatum (THa).

Tabla 5. Datos de preparacin del sustrato para TH en camineras


N

ms, (g)

mH+c, (g)

mc, (g)

Vad, (mL)

800

969

60

258

800

970

60

220

800

970

60

185

800

969

59

145

Tabla 6. Datos de preparacin del sustrato para THa en camineras


N

ms, (g)

mH+c, (g)

mc, (g)

Vad, (mL)

800

970

60

290

800

963

59

236

800

971

60

169

800

966

60

114

33

3.1.3 Concentracin del inculo para siembra en camineras. La tabla 7 muestra la


concentracin de TH y THa generadas de la liberacin de esporas del PDA con la cual se
sembr cada botella para generar la produccin de esporas en el nuevo sustrato (arrocillo).

Tabla 7. Datos de concentracin del inculo para siembra en camineras


Concentracin,

Especie

(UFC/mL)

Trichoderma harzianum

2,1E+06

(TH)
Trichoderma hamatum

3,1E+06

(THa)

3.1.4 Concentracin de esporas producidas en camineras. Las tablas 8 y 9, muestran la


cantidad de esporas contadas (Ne), luego del darle cuatro tratamientos al sustrato y 15 das de
incubacin a diferentes temperaturas, para cada dilucin se realizaron 2 lecturas.

Tabla 8. Datos del recuento celular de TH en camineras


Temperatura,
C

21

25

28

Dilucin

Ne, UFC
Lectura 1

Lectura 2

1:100

16

15

1:100

14

13

1:100

11

10

1:100

1:100

31

31

1:100

26

25

1:100

22

20

1:100

11

16

1:100

22

21

1:100

17

16

1:100

11

12

1:100

34

Tabla 9. Datos del recuento celular de THa en camineras


Temperatura,
C

21

25

28

Dilucin

Ne, UFC
Lectura 1

Lectura 2

1:100

13

15

1:100

1:10

42

34

1:10

10

1:100

33

26

1:100

22

24

1:10

173

165

1:10

92

83

1:100

13

14

1:100

15

13

1:10

135

130

1:10

110

101

3.2 Datos del diseo experimental


Con ayuda de las tablas 5, 6, 8 y 9 se construyen curvas de logC = f (Va) que permiten obtener
los punto mximos de concentracin segn el volumen de agua aadido al arrocillo, estos
valores son necesarios para preparar un nuevo sustrato que ser propagado en fundas de
polietileno y cuyos resultados permitirn construir curvas de crecimiento de las especies del
hongo Trichoderma estudiadas en esta investigacin.

3.2.1 Preparacin del sustrato en fundas. Las tablas 10 y 11 exponen los valores de masa del
sustrato utilizados y el volumen de agua adicionado a la preparacin del sustrato.

Tabla 10. Datos de preparacin del sustrato para TH en fundas


T, (C)

ms, (g)

mH+c, (g)

mc, (g)

Vad, mL

21

800

1005

59

244

25

800

989

57

268

28

800

996

59

248

35

Tabla 11. Datos de preparacin del sustrato para THa en fundas


T, (C)

ms, (g)

mH+c, (g)

mc, (g)

Vad, mL

21

800

981

58

277

25

800

993

58

265

28

800

988

58

230

3.2.2 Concentracin del inculo para siembra en fundas. La tabla 12 muestra la cantidad de
esporas por mL, obtenidas de la cosecha de los mejores resultados de concentracin de las
pruebas preliminares y utilizadas para inocular el nuevo sustrato.

Tabla 12. Datos de concentracin del inculo para siembra en fundas


Concentracin,

Especie

(UFC/ml)

Trichoderma harzianum (TH)

6,31E+05

Trichoderma hamatum (THa)

2,50E+05

3.2.3 Contaje de esporas producidas en fundas. En las tablas 13 y 14 se muestran las


cantidades de esporas producidas luego de 15 das de incubacin. En cada da establecido se
realizaron cuatro lecturas para obtener datos ms confiables.

36

Tabla 13. Datos de contaje de esporas para Trichoderma harzianum


T1 = 21C

T2 = 25C

T3 = 28C

Tiempo,
Das

Lectura, UFC

Dilucin

Lectura, UFC

Dilucin

Lectura, UFC

Dilucin

37

1:10

17

19

21

24

1:10

22

24

26

18

1:10

22

26

28

22

1:10

113

101

82

122

1:10

122

122

101

92

1:100

16

15

11

13

1:100

18

14

14

1:100

12

16

17

24

1:100

24

16

15

20

1:100

22

25

23

19

1:100

35

23

22

27

1:100

20

22

21

27

12

1:100

20

27

24

34

1:100

32

30

27

30

1:100

30

23

24

26

14

1:100

38

24

19

29

1:100

27

32

26

30

1:100

23

31

25

27

17

1:100

27

28

26

30

1:100

26

29

28

32

1:100

26

27

26

28

20

1:100

21

24

31

27

1:100

22

21

25

23

1:100

24

28

26

26

24

1:100

24

22

19

20

1:100

20

23

18

17

1:100

16

14

18

15

27

1:100

17

15

16

15

1:100

15

18

17

15

1:100

14

13

12

13

30

1:100

13

10

14

13

1:100

12

12

13

11

1:100

10

Tabla 14. Datos de contaje de esporas para Trichoderma hamatum


T1 = 21C

Tiempo,
Das

T2 = 25C

Lectura, UFC

T3 = 28C

Lectura, UFC

Dilucin

Lectura, UFC

Dilucin
1

Dilucin
1

38

1:10

11

10

12

1:10

13

16

14

15

1:10

15

15

14

1:10

94

121

119

109

1:10

129

117

109

124

1:10

59

71

68

68

1:100

11

13

15

15

1:10

18

16

19

18

1:100

11

13

10

12

1:100

15

16

23

15

1:100

25

23

24

23

1:100

18

25

16

16

12

1:100

25

23

26

24

1:100

22

37

30

28

1:100

21

22

20

27

14

1:100

25

23

28

24

1:100

27

30

27

33

1:100

21

18

25

25

17

1:100

23

28

27

22

1:100

30

29

28

31

1:100

22

25

19

24

20

1:100

22

25

27

27

1:100

25

27

25

35

1:100

18

23

20

22

24

1:100

24

23

27

25

1:100

27

28

27

26

1:100

12

14

13

12

27

1:100

17

19

20

19

1:100

19

23

21

21

1:100

11

10

30

1:100

10

11

12

12

1:100

11

13

10

1:10

56

48

51

52

4. CLCULOS

4.1 Clculos de las pruebas preliminares

4.1.1 Clculo para determinar la cantidad de agua absorbida por el sustrato. El sustrato
(arrocillo) debe ser lavado para eliminar residuos no deseados y suciedad, pero durante este
proceso absorbe agua debido a su porosidad. Por tal razn se debe determinar la cantidad de
agua retenida.

(2)

Donde:

mab = masa absorbida


mH+c = masa del sustrato hmedo + cedazo
mc = masa del cedazo
ms = masa del sustrato

4.1.2 Clculo del volumen total de agua adicionada en la preparacin del sustrato.

(3)

Donde:

Va = Volumen de agua para preparar el sustrato


Vab = Volumen de agua absorbido
Vad = Volumen de agua adicionado

39

4.1.3 Clculo de la cantidad de agua total. Es la cantidad de agua presente al momento de


preparar el sustrato. Para este clculo se necesita la humedad que contiene el arrocillo, la cual
fue tomada de la norma INEN 1690 (Ver tabla 6).

(4)

Donde:

mat = masa de agua total


ma = masa de agua para preparar el sustrato
mas = masa de agua en el arrocillo seco

4.1.4 Clculo de la masa del sustrato seco. Es la masa del arrocillo utilizado restndole el 12 %
de agua que contiene el sustrato.

(5)

40

Donde:

mss = masa del sustrato seco


ms = masa del sustrato
mas = masa de agua presente en el arrocillo

4.1.5 Clculo del porcentaje de humedad. Este clculo determina la cantidad de agua que
contiene el medio de propagacin expresado en porcentaje.

%H

mat
m ss mat

(6)

Donde

%H = porcentaje de humedad
mat = masa de agua total
maa = masa del sustrato seco

4.1.6 Clculo para determinar la concentracin de esporas. Para determinar la concentracin


de esporas se utiliz la ecuacin (1).

Donde:

Nc = Nmero de clulas contadas


41

St = Superficie recontada de la cmara


A = Profundidad de la cmara
D = Dilucin

4.2 Clculos del diseo experimental

4.2.1 Porcentaje de humedad ptimo. Con los datos obtenidos de las pruebas preliminares se
construye los grficos 1 y 2 las cuales mediante interpolacin y extrapolacin permiten conocer
la cantidad de agua necesaria para preparar el sustrato, segn el microorganismo y la
temperatura utilizada en el proceso de propagacin.

4.2.2 Clculo de la cantidad de agua total.

(7)

42

4.2.3 Construccin de las curvas de crecimiento

Las curvas de crecimiento de los microorganismos se construyeron a las diferentes temperaturas


y gracias a las pruebas preliminares, ya que en estas se determinan la mejor cantidad de agua
adicionada al sustrato para producir las especies. Los datos para los grficos 5, 6, 7, 8, 9 y 10 se
generaron con la tcnica del recuento celular en tiempos establecidos.

4.3 Clculo estadstico

Los clculos estadsticos se realizaron con los resultados generados para construir las curvas de
crecimiento, especficamente se utiliz la fase de latencia y la fase logartmica de cada una de
las grficas de las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

Uso de Microsoft Excel

Con la ayuda de la funcin Estimacin lineal de la hoja de clculo Excel, se calcula la


pendiente (m), el intercepto (b), el coeficiente de determinacin (R2) y sus respectivas
desviaciones o errores tpicos (Ver tabla 15). La pendiente, el intercepto y el ajuste tambin
pueden calcularse con la funcin regresin lineal realizndolo en cada una de las curvas.

Tabla 15. Funcin estimacin lineal para los dos microorganismos


TH

THa

T1 = 21C

T2 = 25C

T3 = 28C

T1 = 21C

T2 = 25C

T3 = 28C

0,1557

0,1644

0,1523

0,1877

0,1968

0,1850

Sm

0,0160

0,0152

0,0182

0,0252

0,0209

0,0145

5,7171

5,7238

5,8179

5,4252

5,4788

5,4037

Sb

0,0993

0,0947

0,1130

0,1565

0,1296

0,0903

R2

0,8635

0,8858

0,8238

0,7873

0,8556

0,9151

SLc

0,1706

0,1627

0,1941

0,2689

0,2227

0,1552

4.3.1 Correccin de logaritmo base 10 a logaritmo natural. Se requiere una correccin, puesto
que los resultados obtenidos para la construccin de las curvas de crecimiento estn trabajados
43

con log(x) pero deben ser expresados en funcin de ln(x), Por tal motivo los resultados de la
tabla 17 deben ser corregidos, a excepcin del ajuste de las curvas ya que ste es independiente.

Clculo modelo para la curva de Trichoderma hamatum a 21C

Para esta correccin se utilizan valores de pendiente e intercepto presentes en la tabla 15 o


directamente de la linealizacin, en los grficos estadsticos (Ver grficos 11, 12, 13, 14, 15 y
16)

(8)
(

)
(9)

4.3.2 Clculo de la velocidad de crecimiento de las curvas. Las ecuaciones exponenciales son
difciles de manejar. Por tal motivo se las debe modificar en otras ms sencillas como una recta.
La transformacin se realiza aplicando logaritmos en los dos trminos a la ecuacin 10.

(10)

Donde:

X = nmero de clulas
Xo = nmero de clulas iniciales
= velocidad de crecimiento
t = tiempo de incubacin

(11)

44

Comparando la ecuacin 9 y 11 se aprecia que la pendiente es igual a la velocidad de


crecimiento

4.3.3 Clculo del Coeficiente de variacin. Permite comprobar la variabilidad de los datos,
utilizando la pendiente y su desviacin.

%CV

(12)

* 100

Donde:

%CV = coeficiente de variacin


S = desviacin de la pendiente
= pendiente

45

5. RESULTADOS

5.1 Resultados de las pruebas preliminares

5.1.1 Cantidad de agua presente en la preparacin del sustrato en camineras. Las tablas 16 y
17 muestra la cantidad de agua total utilizada en la preparacin del sustrato de los dos
microorganismos propagados en las camineras.

Tabla 16. Resultados de preparacin del sustrato para TH en camineras


ms,

mH+c,

mc,

mab,

Vab,

Vad,

Va,

(g)

(g)

(g)

(g)

(g)

(mL)

(mL)

800

969

60

109

109,2

258

367

800

970

60

110

110,2

220

330

800

970

60

110

110,2

185

295

800

969

59

110

110,2

145

255

Tabla 17. Resultados de preparacin del sustrato para THa en camineras


ms,

mH+c,

mc,

mab,

Vab,

Vad,

Va,

(g)

(g)

(g)

(g)

(g)

(mL)

(mL)

800

970

60

110

110,2

290

400

800

963

59

104

104,1

236

340

800

971

60

111

111,2

169

280

800

966

60

106

106,1

114

220

5.1.2 Resultados de porcentaje de humedad del sustrato. Las tablas 18 y 19 muestran las
humedades con las que se trabaj en la preparacin del medio de cultivo para estas especies.

46

Tabla 18. Resultados de humedad del sustrato para TH


N

ma, (g)

mas, (g)

mat, (g)

mss,(g)

%H

366,4

96

462,4

704

39,6

329,5

96

425,5

704

37,7

294,6

96

390,6

704

35,7

254,6

96

350,6

704

33,2

Tabla 19. Resultados de humedad del sustrato para THa


N

ma, (g)

mas, (g)

mat, (g)

mss,(g)

%H

399,4

96

495,4

704

41,3

339,5

96

435,5

704

38,2

279,6

96

375,6

704

34,8

219,7

96

315,7

704

31,0

5.1.3 Concentracin de esporas obtenida de la propagacin en botellas. Las tablas 20 y 21


muestran la cantidad de UFC por mL obtenidas a las diferentes temperaturas de incubacin y a
la cantidad de agua total utilizada en la preparacin del sustrato.

Tabla 20. Resultados de la concentracin obtenida de TH en camineras


T, C

21

25

28

Va, mL

Dilucin

367

C, UFC/ml

log

C1

C2

UFC/mL

1:100

8,00E+06

7,50E+06

7,75E+06

6,89

330

1:100

7,00E+06

6,50E+06

6,75E+06

6,83

295

1:100

5,50E+06

5,00E+06

5,25E+06

6,72

255

1:100

3,50E+06

3,50E+06

3,50E+06

6,54

367

1:100

1,55E+07

1,55E+07

1,55E+07

7,19

330

1:100

1,30E+07

1,25E+07

1,28E+07

7,11

295

1:100

1,10E+07

1,00E+07

1,05E+07

7,02

255

1:100

5,50E+06

8,00E+06

6,75E+06

6,83

367

1:100

1,10E+07

1,05E+07

1,08E+07

7,03

330

1:100

8,50E+06

8,00E+06

8,25E+06

6,92

295

1:100

5,50E+06

6,00E+06

5,75E+06

6,76

255

1:100

3,50E+06

4,50E+06

4,00E+06

6,60

47

Tabla 21. Resultados de la concentracin obtenida de THa en camineras


T, C

21

25

28

Va, ml

Dilucin

400

C, UFC/ml

log

C1

C2

UFC/mL

1:100

6,50E+06

7,50E+06

7,00E+06

6,85

340

1:100

3,50E+06

4,00E+06

3,75E+06

6,57

280

1:10

2,10E+06

1,70E+06

1,90E+06

6,28

220

1:10

4,50E+05

5,00E+05

4,75E+05

5,68

400

1:100

1,65E+07

1,30E+07

1,48E+07

7,17

340

1:100

1,10E+07

1,20E+07

1,15E+07

7,06

280

1:10

8,65E+06

8,25E+06

8,45E+06

6,93

220

1:10

4,60E+06

4,15E+06

4,38E+06

6,64

400

1:100

6,50E+06

7,00E+06

6,75E+06

6,83

340

1:100

7,50E+06

6,50E+06

7,00E+06

6,85

280

1:10

6,75E+06

6,50E+06

6,63E+06

6,82

220

1:10

5,50E+06

5,05E+06

5,28E+06

6,72

5.1.4 Curvas de concentracin versus volumen de agua adicionado al sustrato. Los grficos 1
y 2 indican la cantidad de agua que se adiciona al sustrato en su preparacin, para obtener una
mxima concentracin de esporas a las diferentes temperaturas de incubacin.

7,30
7,20

T1 = 21C
T2 = 25C

7,10

T3 = 28C

logC

7,00
6,90

logC = -2E-05Va2 + 0,0148Va + 3,9895


R = 0,9999

6,80

logC = -2E-05Va2 + 0,014Va + 4,3981


R = 0,9955

6,70
6,60

logC = -2E-07Va3 + 0,0002Va2 - 0,0602Va + 11,958

R = 1

6,50
250

300

350

400

Va, mL

Grfico 1. logC = f (Va) para Trichoderma harzianum


48

7,40
7,20

T1 = 21C

7,00

T2 = 25C
T3 = 28C

logC

6,80
6,60

logc = -5E-05Va2 + 0,0435Va - 1,937


R = 0,9975

6,40
6,20

logC = -3E-05Va2 + 0,0228Va + 2,7338


R = 0,9977

6,00
5,80

logC = -2E-05Va2 + 0,0133Va + 4,6275


R = 0,9973

5,60
200

250

300

350

400

Va, mL

Grfico 2. logC = f (Va) para Trichoderma hamatum

5.1.5 Curvas de concentracin versus porcentaje de humedad. En los grficos 3 y 4 se aprecia


la concentracin y el volumen de agua que contiene el sustrato expresado en porcentaje.

7,30
7,20
7,10

logC

7,00
T1 = 21C

6,90

T2 = 25C

6,80

T3 = 28C
6,70
6,60
6,50
32

34

36

38

40

42

%H

Grfico 3. logC = f (%H) para Trichoderma harzianum


49

7,40
7,20
7,00

logC

6,80
6,60
T1 = 21C
6,40

T2 = 25C
T3 = 28C

6,20
6,00
5,80
5,60
30,0

32,0

34,0

36,0

38,0

40,0

42,0

%H

Grfico 4. logC = f (%H) para Trichoderma hamatum

5.2 Resultados del diseo experimental

5.2.1 Volumen de agua ptimo. En las tablas 22 y 23, se muestran los resultados obtenidos por
extrapolacin e interpolacin de las curvas de concentracin versus el volumen total de agua
(Ver grficos 1 y 2), los valores representan las mejores condiciones para preparar el sustrato de
las especies Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum a las tres temperaturas.

Tabla 22. Resultados de volumen de agua ptima para TH


Temperatura,

logC,

Vop,

(C)

(UFC/mL)

mL

21

6,90

390

25

7,20

400

28

7,04

385

50

Tabla 23. Resultados de volumen de agua ptima para THa


Temperatura,

logC,

Vop,

(C)

(UFC/mL)

mL

21

6,80

400

25

7,16

400

28

6,83

360

5.2.2 Resultados de la masa de agua total. Las tablas 24 y 25 indican la cantidad de agua total
utilizada para preparar el sustrato de los microorganismos.

Tabla 24. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de TH


Temperatura,

ms,

mH+c,

mc,

Vad,

mad,

mat,

(g)

(g)

(g)

(mL)

g)

(g)

21

800

1005

59

244

243,7

485,7

25

800

989

57

268

267,6

495,6

28

800

996

59

248

247,7

480,7

Tabla 25. Resultados de cantidad de agua total en el sustrato de THa


Temperatura,

ms,

mH+c,

mc,

Vad,

mad,

mat,

(g)

(g)

(g)

(mL)

g)

(g)

21

800

981

58

277

276,6

495,6

25

800

993

58

265

264,6

495,6

28

800

988

58

230

229,7

455,7

5.2.3 Resultados de temperatura y % de humedad para propagar Trichoderma. En la tabla 26


se muestra el porcentaje de humedad en la preparacin del sustrato a las diferentes temperaturas
y el nombre que se design para englobar a los resultados finales de las variables utilizadas en la
propagacin de Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

51

Tabla 26. Resultados del %H a las diferentes condiciones

Condicin

Temperatura,
C

% Humedad
Trichoderma

Trichoderma

harzianum

hamatum

21

40,82

41,31

25

41,31

41,32

28

40,57

39,29

5.2.4 Construccin de la curva de crecimiento. En las tablas 27 y 28 se expone la


concentracin obtenida en los diferentes das de incubacin a las temperaturas establecidas,
mientras que en las tablas 29 y 30 se muestran los datos para construir las curvas de crecimiento
de los microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

52

Tabla 27. Resultados de concentracin de TH


Condicin 1

Condicin 2

Condicin 3

Concentracin, UFC/mL

Concentracin, UFC/mL

Concentracin, UFC/mL

Tiempo,
Das
C1
0

C2

C3

6,31E+05

C4

C1

C2

C3

6,31E+05

C4

C1

C2

C3

C4

6,31E+05

53

8,50E+05 9,50E+05 1,05E+06 1,20E+06 1,10E+06 1,20E+06 1,30E+06 9,00E+05 1,10E+06 1,30E+06 1,40E+06 1,10E+06

5,65E+06 5,05E+06 4,10E+06 6,10E+06 6,10E+06 6,10E+06 5,05E+06 4,60E+06 8,00E+06 7,50E+06 5,50E+06 6,50E+06

9,00E+06 7,00E+06 4,50E+06 7,00E+06 6,00E+06 8,00E+06 8,50E+06 1,20E+07 1,20E+07 8,00E+06 7,50E+06 1,00E+07

1,10E+07 1,25E+07 1,15E+07 9,50E+06 1,75E+07 1,15E+07 1,10E+07 1,35E+07 1,00E+07 1,10E+07 1,05E+07 1,35E+07

12

1,00E+07 1,35E+07 1,20E+07 1,70E+07 1,60E+07 1,50E+07 1,35E+07 1,50E+07 1,50E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,30E+07

14

1,90E+07 1,20E+07 9,50E+06 1,45E+07 1,35E+07 1,60E+07 1,30E+07 1,50E+07 1,15E+07 1,55E+07 1,25E+07 1,35E+07

17

1,35E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,50E+07 1,30E+07 1,45E+07 1,40E+07 1,60E+07 1,30E+07 1,35E+07 1,30E+07 1,40E+07

20

1,05E+07 1,20E+07 1,55E+07 1,35E+07 1,10E+07 1,05E+07 1,25E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,40E+07 1,30E+07 1,30E+07

24

1,20E+07 1,10E+07 9,50E+06 1,00E+07 1,00E+07 1,15E+07 9,00E+06 8,50E+06 8,00E+06 7,00E+06 9,00E+06 7,50E+06

27

8,50E+06 7,50E+06 8,00E+06 7,50E+06 7,50E+06 9,00E+06 8,50E+06 7,50E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06 6,50E+06

30

6,50E+06 5,00E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06 6,00E+06 6,50E+06 5,50E+06 4,50E+06 4,50E+06 4,00E+06 5,00E+06

Tabla 28. Resultados de concentracin de THa


Tiempo,
Das
C1
0

Condicin 1

Condicin 2

Condicin 3

Concentracin, UFC/mL

Concentracin, UFC/mL

Concentracin, UFC/mL

C2

C3

2,50E+05

C4

C1

C2

C3

2,50E+05

C4

C1

C2

C3

C4

2,50E+05

54

5,50E+05 4,50E+05 5,00E+05 6,00E+05 6,50E+05 8,00E+05 7,00E+05 7,50E+05 7,50E+05 7,50E+05 7,00E+05 4,50E+05

4,70E+06 6,05E+06 5,95E+06 5,45E+06 6,45E+06 5,85E+06 5,45E+06 6,20E+06 2,95E+06 3,55E+06 3,40E+06 3,40E+06

5,50E+06 6,50E+06 7,50E+06 7,50E+06 9,00E+06 8,00E+06 9,50E+06 9,00E+06 5,50E+06 6,50E+06 5,00E+06 6,00E+06

7,50E+06 8,00E+06 1,15E+07 7,50E+06 1,25E+07 1,15E+07 1,20E+07 1,15E+07 9,00E+06 1,25E+07 8,00E+06 8,00E+06

12

1,25E+07 1,15E+07 1,30E+07 1,20E+07 1,10E+07 1,85E+07 1,50E+07 1,40E+07 1,05E+07 1,10E+07 1,00E+07 1,35E+07

14

1,25E+07 1,15E+07 1,40E+07 1,20E+07 1,35E+07 1,50E+07 1,35E+07 1,65E+07 1,05E+07 9,00E+06 1,25E+07 1,25E+07

17

1,15E+07 1,40E+07 1,35E+07 1,10E+07 1,50E+07 1,45E+07 1,40E+07 1,55E+07 1,10E+07 1,25E+07 9,50E+06 1,20E+07

20

1,10E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,75E+07 9,00E+06 1,15E+07 1,00E+07 1,10E+07

24

1,20E+07 1,15E+07 1,35E+07 1,25E+07 1,35E+07 1,40E+07 1,35E+07 1,30E+07 6,00E+06 7,00E+06 6,50E+06 6,00E+06

27

8,50E+06 9,50E+06 1,00E+07 9,50E+06 9,50E+06 1,15E+07 1,05E+07 1,05E+07 5,50E+06 4,00E+06 4,50E+06 5,00E+06

30

5,00E+06 5,50E+06 6,00E+06 6,00E+06 5,50E+06 6,50E+06 4,50E+06 5,00E+06 2,80E+06 2,40E+06 2,55E+06 2,60E+06

Tabla 29. Resultados del logaritmo de la concentracin para TH


Condicin 1

Tiempo,
Das

logC1

logC2

logC3

Condicin 2
logC4

logC1

logC2

5,80

logC3

Condicin 3
logC4

logC1

logC2

5,80

logC3

logC4

5,80

55

5,93

5,98

6,02

6,08

6,04

6,08

6,11

5,95

6,04

6,11

6,15

6,04

6,75

6,70

6,61

6,79

6,79

6,79

6,70

6,66

6,90

6,88

6,74

6,81

6,95

6,85

6,65

6,85

6,78

6,90

6,93

7,08

7,08

6,90

6,88

7,00

7,04

7,10

7,06

6,98

7,24

7,06

7,04

7,13

7,00

7,04

7,02

7,13

12

7,00

7,13

7,08

7,23

7,20

7,18

7,13

7,18

7,18

7,06

7,08

7,11

14

7,28

7,08

6,98

7,16

7,13

7,20

7,11

7,18

7,06

7,19

7,10

7,13

17

7,13

7,15

7,11

7,18

7,11

7,16

7,15

7,20

7,11

7,13

7,11

7,15

20

7,02

7,08

7,19

7,13

7,04

7,02

7,10

7,06

7,08

7,15

7,11

7,11

24

7,08

7,04

6,98

7,00

7,00

7,06

6,95

6,93

6,90

6,85

6,95

6,88

27

6,93

6,88

6,90

6,88

6,88

6,95

6,93

6,88

6,85

6,81

6,78

6,81

30

6,81

6,70

6,85

6,81

6,78

6,78

6,81

6,74

6,65

6,65

6,60

6,70

Tabla 30. Resultados del logaritmo de la concentracin para THa


Condicin 1

Tiempo,
Das

logC1

logC2

logC3

Condicin 2
logC4

logC1

logC2

5,40

logC3

Condicin 3
logC4

logC1

logC2

5,40

logC3

logC4

5,40

56

5,74

5,65

5,70

5,78

5,81

5,90

5,85

5,88

5,88

5,88

5,85

5,65

6,67

6,78

6,77

6,74

6,81

6,77

6,74

6,79

6,47

6,55

6,53

6,53

6,74

6,81

6,88

6,88

6,95

6,90

6,98

6,95

6,74

6,81

6,70

6,78

6,88

6,90

7,06

6,88

7,10

7,06

7,08

7,06

6,95

7,10

6,90

6,90

12

7,10

7,06

7,11

7,08

7,04

7,27

7,18

7,15

7,02

7,04

7,00

7,13

14

7,10

7,06

7,15

7,08

7,13

7,18

7,13

7,22

7,02

6,95

7,10

7,10

17

7,06

7,15

7,13

7,04

7,18

7,16

7,15

7,19

7,04

7,10

6,98

7,08

20

7,04

7,10

7,13

7,13

7,10

7,13

7,10

7,24

6,95

7,06

7,00

7,04

24

7,08

7,06

7,13

7,10

7,13

7,15

7,13

7,11

6,78

6,85

6,81

6,78

27

6,93

6,98

7,00

6,98

6,98

7,06

7,02

7,02

6,74

6,60

6,65

6,70

30

6,70

6,74

6,78

6,78

6,74

6,81

6,65

6,70

6,45

6,38

6,41

6,41

5.3 Curvas de crecimiento obtenidas


Los grficos 5, 6, 7, 8, 9 y 10 indican las curvas de crecimiento construidas a las diferentes
condiciones de temperatura y humedad para las especies Trichoderma harzianum y
Trichoderma hamatum.

7,50
7,25

logC (UFC/ml)

7,00
6,75
6,50
6,25
6,00
5,75
5,50
0

10

15

20

25

30

35

Tiempo, das

Grfico 5. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condicin 1

7,50
7,25

logC (UFC/ml)

7,00
6,75
6,50
6,25
6,00
5,75
5,50
0

10

15

20

25

30

Tiempo, das

Grfico 6. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condicin 2

57

35

7,50
7,25

logC (UFC/ml)

7,00
6,75
6,50
6,25
6,00
5,75
5,50
0

10

15

20

25

30

35

Tiempo, das

Grfico 7. logC = f (tiempo) para Trichoderma harzianum a condicin 3

7,50

logC (UFC/ml)

7,00

6,50

6,00

5,50

5,00
0

10

15

20

25

30

Tiempo, das

Grfico 8. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condicin 1

58

35

7,50

logC (UFC/ml)

7,00

6,50

6,00

5,50

5,00
0

10

15

20

25

30

35

Tiempo, das

Grfico 9. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condicin 2

7,50

logC (UFC/ml)

7,00

6,50

6,00

5,50

5,00
0

10

15

20

25

30

Tiempo, das

Grfico 10. logC = f (tiempo) para Trichoderma hamatum a condicin 3

59

35

5.4 Resultados estadsticos

Los grficos 11, 12, 13, 14, 15 y 16 muestran la velocidad de crecimiento obtenidas a las
diferentes condiciones para los dos microorganismos las cuales coinciden con los valores de la
tabla 15.
7,50
7,20

logC (UFC/ml)

6,90
6,60
6,30

logC = 0,1557 t + 5,7171


R = 0,8635

6,00
5,70
5,40
0

10

tiempo, das

Grfico 11. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condicin 1

7,60
7,30

logC (UFC/ml)

7,00
6,70
logC = 0,1644 t + 5,7238
R = 0,8858

6,40
6,10
5,80
5,50
0

10

tiempo, das

Grfico 12. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condicin 2

60

7,30

7,00

logC (UFC/ml)

6,70
logC = 0,1523 t + 5,8179
R = 0,8238
6,40

6,10

5,80

5,50

10

tiempo, das

Grfico 13. Velocidad de crecimiento de Trichoderma harzianum a condicin 3

7,50

logC (UFC/ml)

7,00

6,50
logC = 0,1877 t + 5,4252
R = 0,7873
6,00

5,50

5,00
0

10

tiempo, das

Grfico 14. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condicin 1


61

7,50

logC (UFC/ml)

7,00

6,50

logC = 0,1968 t + 5,4788


R = 0,8556

6,00

5,50

5,00
0

10

tiempo, das

Grfico 15. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condicin 2

7,50

logC (UFC/ml)

7,00

6,50

logC = 0,185 t + 5,4037


R = 0,9151
6,00

5,50

5,00
0

10

tiempo, das

Grfico 16. Velocidad de crecimiento de Trichoderma hamatum a condicin 3

5.4.1 Resultados de %CV. La tabla 31 muestra los resultados corregidos y el coeficiente de


variacin a las diferentes temperaturas para Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

62

Tabla 31. Resultados estadsticos corregidos


Trichoderma harzianum

Trichoderma hamatum

Condicin 1 Condicin 2 Condicin 3 Condicin 1 Condicin 2 Condicin 3

0,3585

0,3787

0,3507

0,4324

0,4531

0,4260

0,0368

0,0351

0,0419

0,0580

0,0481

0,0335

13,166

13,182

13,399

12,494

12,618

12,445

Sb

0,2286

0,2181

0,2602

0,3605

0,2986

0,2081

r2

0,8635

0,8858

0,8238

0,7873

0,8556

0,9151

SLc

0,3928

0,3747

0,4470

0,6192

0,5129

0,3574

%CV

10,27

9,27

11,94

13,42

10,61

7,86

5.4.2 Velocidad especfica de crecimiento microbiano. La tabla 32 muestra la velocidad


especfica de crecimiento para cada microorganismo.

Tabla 32. Resultados de velocidad especfica de crecimiento


Trichoderma harzianum
Condicin

0,3585

0,3787

0,3507

Trichoderma hamatum

0,4324

0,3627

0,4531

0,4372

0,4260

5.5 Seleccin de las mejores condiciones para producir Trichoderma spp.

De acuerdo con los resultados obtenidos en las grficas de preparacin del sustrato, en las
curvas de crecimiento y en el anlisis estadstico se seleccionan las mejores condiciones para
propagar las dos especies nativas de Trichoderma spp.

5.5.1 Anlisis comparativo del % de humedad. El grafico 17 muestra el porcentaje de humedad


requerido por el sustrato versus la temperatura utilizada en la propagacin de los
microorganismos Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

63

% Humedad

40,57

39,29

41,31

41,32

40,82

41,31

Trichoderma harzianum

Trichoderma hamatum

T = 21C

T = 25C

T = 28C

Grfico 17. Anlisis comparativo de la humedad

5.5.2 Anlisis comparativo de la concentracin. En la tabla 33 se observa la concentracin


promedio, valores obtenidos gracias a la repetibilidad de contaje de esporas, observndose que
en las condiciones 1 y 2 se tiene la mxima concentracin en un menor tiempo (12 das).

Tabla 33. Promedio de la Concentracin


Trichoderma hamatum
Dia

Trichoderma harzianum

Condicin 1 Condicin 2 Condicin 3 Condicin 1 Condicin 2 Condicin 3

6,3E+05

6,3E+05

6,3E+05

2,5E+05

2,5E+05

2,5E+05

1,0E+06

1,1E+06

1,2E+06

5,3E+05

7,3E+05

6,6E+05

5,2E+06

5,5E+06

6,9E+06

5,5E+06

6,0E+06

3,3E+06

6,9E+06

8,6E+06

9,4E+06

6,8E+06

8,9E+06

5,8E+06

1,1E+07

1,3E+07

1,1E+07

8,6E+06

1,2E+07

9,4E+06

12

1,3E+07

1,5E+07

1,3E+07

1,2E+07

1,5E+07

1,1E+07

14

1,4E+07

1,4E+07

1,3E+07

1,3E+07

1,5E+07

1,1E+07

17

1,4E+07

1,4E+07

1,3E+07

1,3E+07

1,5E+07

1,1E+07

20

1,3E+07

1,1E+07

1,3E+07

1,3E+07

1,4E+07

1,0E+07

24

1,1E+07

9,8E+06

7,9E+06

1,2E+07

1,4E+07

6,4E+06

27

7,9E+06

8,1E+06

6,5E+06

9,4E+06

1,1E+07

4,8E+06

30

6,3E+06

6,0E+06

4,5E+06

5,6E+06

5,4E+06

2,6E+06

64

concentracin UFC/mL

1,3E+07

1,1E+07

1,5E+07

1,5E+07

1,3E+07

1,2E+07

Trichoderma harzianum

Trichoderma hamatum

T = 21C

T = 25C

T = 28C

Grfico 18. Anlisis comparativo de la concentracin de esporas

5.5.3 Anlisis comparativo del coeficiente de variacin (%CV). En el grfico 19 se observa el


porcentaje de la desviacin de los datos obtenidos en las lecturas del recuento celular, versus las
condiciones de tratamiento realizadas para las dos especies.

%
16,00

Coeficiente de variacin

14,00
13,42

12,00
11,94

10,00
8,00

10,61

10,27

Condicin 1

9,27
7,86

6,00

Condicin 2
Condicin 3

4,00
2,00
0,00
Trichoderma harzianum

Trichoderma hamatum

Grfico 19. Anlisis comparativo del coeficiente de variacin

65

5.5.4 Seleccin de las mejores condiciones. En la tabla 34 se resumen las condiciones que
aprobaron el criterio de mayor produccin de esporas de los hongos Trichoderma harzianum y
Trichoderma hamatum.

Especie

Tabla 34. Mejores condiciones de crecimiento


Concentracin
%H
%CV
UFC/mL

Condicin

Trichoderma harzianum

41,31

1,5E+07

9, 27

Trichoderma hamatum

41,32

1,5E+07

10, 61

5.6 Resultados de aplicacin del hongo Trichoderma spp.

Las figuras 16, 17, 18 y 19 muestran plantas de fresa y moras antes y luego de ser aplicado
Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum. En las fresas se aplic una mezcla de los dos
microorganismos, mientas que en las moras la aplicacin de las especies fue individual. En los
dos tratamientos se dejaron plantas como testigo para poder comparar su desarrollo.

Figura 16. Aplicacin en plantas de fresas

66

Figura 17. Resultados luego de un mes de aplicacin en plantas de fresa

Figura 18. Aplicacin de los microorganismos en plantas de mora

Figura 19. Resultados luego de 50 das de aplicacin en plantas de moras


67

6. DISCUSIN

6.1 Pruebas preliminares

Durante la preparacin del sustrato, se establecieron rangos de humedad amplios, para


observar la influencia que esta variable presenta en el crecimiento de los dos hongos
filamentosos. Luego de varios das de incubacin se apreci que la tonalidad del color verde
caracterstico del gnero Trichoderma variaba segn la cantidad de agua utilizada. Esta
relacin se comprob durante el contaje de esporas, ya que la muestra de color verde ms
intenso dio como resultado una mayor concentracin de esporas que la de menor coloracin.

De las grficas logC en funcin del volumen de agua adicionado al sustrato (Ver grficos 1
y 2) se observa que la interpolacin y extrapolacin de la curvas permite determinar el
punto ptimo de crecimiento a cada temperatura de incubacin, sin embargo para 21C y
25C de Trichoderma hamatum se observa cantidades altas para llegar al ptimo Vop,
produciendo desconfianza de los resultados obtenidos. Motivo por el cual fue necesario
recurrir a la prctica donde se estableci que 400 mL de agua es el valor mximo para
obtener una moderada manipulacin del sustrato.

6.2 Diseo experimental

En el proceso de inoculacin las concentraciones de esporas utilizadas son diferentes (Ver


tablas 7 y 12), lo cual llevara a pensar que la produccin desarrollada en botellas y fundas
sera desigual, pero luego de unos das de crecimiento de los hongos se observa que esto no
influye significativamente ya que se obtuvo valores similares, pudindose evidenciar en las
tablas 20, 21, 27 y 28.

Los resultados de porcentaje de humedad obtenidos (Ver tabla 26) se encuentran alrededor
del 40%, valores que se estn dentro del rango (20 - 70%) establecido en la teora (Ver cita
24). Sin embargo en esta tabla se puede observar que a 28C se requiere una menor
humedad; este fenmeno se justifica que a mayor temperatura existe un mayor riesgo de
contaminacin con microorganismos del ambiente.

68

En el anlisis comparativo de la concentracin de esporas (Ver tabla 33) se aprecia que el


mximo crecimiento se obtiene a los 12 das de incubacin para las condiciones 2 y 3,
mientras que cuando se trabaja a temperatura ambiente (condicin 1) se requiere de mayor
tiempo (14 das). Lo cual indica que cuando se modifica las variables humedad del sustrato
y temperatura se reduce el tiempo de produccin de esporas Trichoderma.

Las velocidades especficas de crecimiento microbiano obtenidas (Ver tabla 32) muestran
valores similares entre las mismas especies, pero si se compara entre las dos especies
estudiadas se observa que estas difieren, pudindose evidenciar que la especie Trichoderma
hamatum que se desarrolla con mayor rapidez.

Para Trichoderma hamatum se acepta el %CV = 10,6 (Ver tabla 31 y grfico 17) a pesar de
tener un valor menor a 28C. Para esta decisin se bas en la concentracin (Ver tabla 33) y
en la curva obtenida de las pruebas preliminares (Ver grfico 2), donde a 25C se obtiene la
mayor concentracin de esporas y se justifica que pudo existir contaminacin lo que gener
que el %CV sea un poco alto. No obstante son valores aceptables para los microorganismos.

6.3 Aplicacin de Trichoderma spp. en plantas

Las especies aplicadas en las plantas de fresas ejercen un efecto positivo pues generan un
desarrollo y produccin de frutos ms rpido en comparacin con las que no fueron
aplicadas. Adems se observa un tamao de hojas ms grande, las plantas se tornan ms
verdes y brillosas siendo estos indicativos de que se encuentran sanas (Ver figuras 16 y 17)

En las plantas de moras se observa que luego de un tiempo de aplicacin estas se


desarrollan con mayor rapidez en comparacin con la testigo que a pesar de haber sido la
ms grande, transcurrido los 2 meses la planta que contiene Trichoderma Hamatum supero
en tamao. Estas observaciones indican que el microorganismo ejerce todas sus
caractersticas de proteccin en las races de las plantas (Ver figuras 18 y 19).

69

7. CONCLUSIONES

7.1 Pruebas preliminares

La tonalidad del color verde que presenta Trichoderma es un indicativo de la concentracin


de esporas, mientras ms verde se presente la muestra, mayor ser la cantidad de unidades
formadoras de colonias, existiendo una relacin directa entre la intensidad del color y la
manifestacin de conidios.

El sustrato utilizado y la cantidad de agua adicionada es una relacin 2:1, pues se comprob
que un valor superior dificulta la manipulacin del sustrato, reduce el crecimiento, limita la
adecuada oxigenacin de la matriz slida y el crecimiento solo se realiza en la superficie.

7.2 Diseo Experimental

La concentracin de inoculo utilizado para sembrar los microorganismos no influye


significativamente en la produccin de esporas, vindose reflejado en la similitud que existe
entre las dos propagaciones.

En la produccin Trichoderma una temperatura de 28C incrementa la formacin de gotas


de agua, limitando el crecimiento de estos hongos filamentosos, presentando un mayor
riesgo de contaminacin con microorganismos del ambiente.

Modificando las variables humedad del sustrato y temperatura se generan resultados


positivos en la experimentacin, pues reduce el tiempo de produccin de los hongos
Trichoderma harzianum y Trichoderma hamatum.

La velocidad especfica de crecimiento es independiente para cada microorganismo, segn


los resultados obtenidos la especie Trichoderma hamatum se adapta ms rpido al medio,
desarrollndose con mayor velocidad en comparacin con Trichoderma harzianum.

70

Los resultados del coeficiente de variacin obtenidos son aceptables, considerando que se
trabaj con microorganismos donde los errores producidos pueden ser altos, debido a la
contaminacin con microorganismos del ambiente y al equipo utilizado en el contaje de
esporas.

Se concluye que la temperatura de 25C y 41,3 % de humedad son las condiciones ms


adecuadas para producir estos biofungicidas, en un menor tiempo, obtenindose como
mximo, 1,5x107 UFC/mL para Trichoderma harzianum y 1,5x107 UFC/mL de
Trichoderma hamatum a los 12 das de tratamiento.

7.3 Aplicacin de Trichoderma spp. en plantas

Los microorganismos aplicados independientes o en mezcla, ejercen aspectos positivos a las


plantas de fresas y moras, generando un mayor desarrollo, adems de producir frutos de
muy buena calidad en el caso de las fresas. Los frutos de las moras no se pudo calificar
porque requeran mayor tiempo.

71

8. RECOMENDACIONES

Implementar un mechero bunsen en el laboratorio, con el propsito de incrementar el rea


de esterilizacin al momento de toma de muestras para el recuento celular.

Elaborar un manual propio del laboratorio de recopilacin de experiencias obtenidas durante


el proceso de propagacin de Trichoderma spp. teniendo en cuenta aspectos como: normas
de bioseguridad y focos de contaminacin.

Realizar un estudio de propagacin de Trichoderma spp. utilizando diferentes sustratos para


determinar crecimiento versus costo.

Implementar una cmara de flujo laminar para reducir la contaminacin causada por
microorganismo del ambiente al momento de las inoculaciones.

Aplicar el producto obtenido en diferentes especies de plantas para determinar su


efectividad.

Difundir a la colectividad agrcola los beneficios que brinda Trichoderma en los diferentes
cultivos con la finalidad de obtener productos orgnicos de calidad.

72

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78

ANEXOS

79

ANEXO A. Taxonoma de Trichoderma spp.

80

ANEXO B. Biograma Microbiano

81

ANEXO C. Norma INEN 1690

Fuente: Norma Norma INEN 1690

82

ANEXO D. Materiales necesarios

Figura D.1. Materia prima

Figura D.2. Material de limpieza

Figura D.3. Autoclave

Figura D.4. Tapones limpios y secos

83

ANEXO E. Propagacin de Trichoderma en cajas Petri

Figura E.1. Preparacin del medio de cultivo PDA

Figura E.2. Inoculacin del microorganismo en cajas Petri

84

ANEXO F. Preparacin del sustrato

Figura F.1. Lavado del arrocillo

Figura F.2. Escurrido del arrocillo

Figura F.3. Adicin del agua para la


coccin del arrocillo

Figura F.4. Sustrato de arrocillo

85

ANEXO G. Esterilizacin del sustrato

Figura G.1. Llenado de botellas

Figura G.2. Sustrato en botellas selladas con


tapones

Figura G.3. Sustrato en fundas

Figura G.4. Esterilizacin en autoclave

86

ANEXO H. Preparacin del inculo

Figura H.1. Peso de sustrato propagado

Figura H.2. Liberacin de esporas en agua


estril

Figura H.3. Solucin madre de Trichoderma spp.

87

ANEXO I. Inoculacin del sustrato

Figura I.1. Material listo para ser inoculado en la cmara de siembra

Figura I.3. Inoculacin en fundas

Figura I.2. Inoculacin en botellas

88

ANEXO J. Determinacin de la concentracin de esporas

Figura J.1. Diluciones seriadas

Figura J.2. Contaje de esporas

89

ANEXO K. Incubacin de las especies

Figura K.1.Incubacin a 21C

Figura K.2.Incubacin a 25C

Figura K.3.Incubacin a 28C

90