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DE BIOQUMICA
MANUAL
DE
PRCTICAS
DE
BIOQUMICA
ZZZPHGLOLEURVFRP
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
PRESENTACIN
NDICE DE PRACTICAS
Prctica:
Pg.:
SOLUCIONES.................................... ................................................... 3
ELECTROLITOS y pH.......................................................................... 13
SOLUCIONES REGULADORAS ......................................................... 23
PROTENAS ........................................................................................ 30
CINTICA QUMICA Y CATLISIS....................................................... 41
ENZIMAS ............................................................................................. 51
OXIDACIONES BIOLGICAS ............................................................. 59
CIDOS NUCLEICOS.......................................................................... 68
GLCIDOS........................................................................................... 75
FENMENOS DE INTERFASE Y SISTEMAS DISPERSOS ................ 85
LPIDOS ............................................................................................... 98
DIGESTIN........................................................................................ 107
METABOLISMO .................................................................................. 115
SOLUCIONES
En esta prctica se estudiarn las soluciones, formas de expresar su concentracin y sus principales propiedades.
Se puede definir una solucin como un sistema monofsico formado por
dos o ms sustancias qumicas. Un sistema monofsico es aquel que presenta las mismas propiedades fsicas y qumicas en todas sus partes. Por
ejemplo si se mezclan agua y cloruro de sodio (NaCI), el NaCI se distribuye
en el solvente (agua), hasta que la concentracin sea la misma en cualquier parte de la solucin, es decir hasta que se alcanza la homogeneidad.
Generalmente se acostumbra denominar soluto a la sustancia que se
disuelve o se dispersa molecularmente en otra a la cual se le denomina
solvente. Sin embargo, cuando se trata de lquidos miscibles en todas sus
proporciones, por ejemplo alcohol y agua, cualquiera de los dos puede ser
solvente o soluto. Debido a sto se acostumbra nombrar solvente al componente que se encuentra en mayor cantidad.
La relacin que existe entre las cantidades de soluto y solvente en una
solucin se llama concentracin.
Mol. Se define como el peso molecular de una sustancia expresado en
gramos, o sea; la masa de una sustancia que contiene el mismo nmero de
12
tomos o molculas que hay en 12 g de C. Experimentalmente este n23
mero es igual a 6.022 x 10 (nmero de Avogadro). La masa molecular o
peso molecular (P.M.) de una sustancia es la suma de los pesos atmicos
de los componentes de la sustancia; por ejemplo: P.M. del cido sulfrico
1
(H2SO4)98gmor .
Equivalente qumico (Eq). Se define segn el tipo de reaccin que se
est examinando. Para las reacciones cido-base, un equivalente de un
cido es la cantidad expresada en gramos que suministra un mol de iones
+
hidrgeno (H ); un equivalente de una base es la cantidad que reacciona
con un mol de iones hidrgeno; por ejemplo: el Eq del H2SO4 es 49 g Eq1.
Existen varias formas de expresar la concentracin de una solucin. Las
de uso ms frecuente son:
MOLARIDAD (M). Nmero de Moles de soluto en un litro de solucin. Un
mol es el peso molecular expresado en gramos.
MOLALIDAD (m). Nmero de Moles de soluto en 1000 gramos de solvente.
NORMALIDAD (N). Nmero de equivalentes qumicos de soluto en un litro
de solucin.
FRACCIN MOLAR (Xi). Nmero de moles de una sustancia en una solucin, entre la suma de los moles de todos los componentes de la misma.
PORCENTUAL (%). Expresa el porcentaje de soluto en una solucin y existen diferentes tipos
Porciento en peso (%p/p). Nmero de gramos de soluto en 100 gramos de
solucin.
Porciento en volumen (%v/v). Nmero de mililitros de soluto en 100 mililitros
de solucin.
Porciento en peso-volumen (%p/v) Nmero de gramos de soluto en 100
mililitros de solucin.
Porciento en moles (%mol). Nmero de moles de soluto disuelto en 100
mililitros de solucin.
PARTE EXPERIMENTAL.
PREPARACIN DE DIFERENTES TIPOS DE SOLUCIONES.
EXPERIMENTO 1 a
Preparacin de una solucin 0.5M de cido actico (CH3COOH). Prepare 100 mi. de una solucin de cido actico 0.5M tomando como base
para sus clculos los siguientes datos: El cido actico tiene un peso
molecular de 60, la pureza del reactivo comercial es de 99.5% y la densi4
fi
DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN
DE UNA SOLUCIN POR TITULACIN.
EXPERIMENTO 2.
En este experimento se utilizar la solucin de cido actico (solucin problema) que se prepar en el experimento 1a.
En un matraz Erlenmeyer de 250 mi. se colocan 10 mi. de la solucin de
cido actico problema, midindolos con la mxima exactitud posible. Aada de 3 a 5 gotas de solucin de fenolftalena y titule utilizando solucin de
hidrxido de sodio (NaOH) 0.2N. Recuerde que el punto de equivalencia se
observar cuando persista, por ms de un minuto, un ligero color rosa.
f
1).- Cuntos mi. de NaOH 0.2N gast para neutralizar los 10 mi. de la
solucin de cido actico?
R= ______________ mi.
2).- Segn los resultados que obtuvo y considerando que la solucin de
NaOH es exactamente 0.2N, Cul es la verdadera normalidad del cido
actico problema?
R= _____________
3).- Escriba el concepto de titulacin cido-base:
donde:
C
1
Keb = constante ebulloscpica = 0.52 C mol kg\ m = molalidad
Fd = factor de disociacin, que para sustancias de:
dos partculas = 1.73
tres partculas = 2.35
cuatro partculas = 3.35
SOLUCIN
Teb Terica
Teb experimental
H2O dest.
NaCI 2m
NaCI 4m
c) tamao y concentracin de
las partculas
b) rea de difusin
d) temperatura
Graham hizo notar estos factores que influyen sobre la difusin y Fick,
de acuerdo con los mismos estableci la siguiente relacin:
V = (dm / dt) * K * Q * (dc / ds)
V = Velocidad de difusin.
K = Constante de difusin,
dm = cantidad de sustancia que difunde.
dt = tiempo que tarda en efectuarse la difusin.
de = concentracin de la sustancia que difunde.
ds = espacio que recorre la sustancia al difundir.
Q = rea de difusin
As, la velocidad de difusin es directamente proporcional al gradiente
de concentracin y al rea de seccin. A temperatura, gradiente de con-
centracin y rea constante, cada sustancia tiene una velocidad de difusin caracterstica en relacin al peso molecular por lo que se incluye una
constante K, llamada constante de difusin.
DIFUSIN EN LQUIDOS
EXPERIMENTO 4.
Llene casi completamente una probeta con agua de la llave, enseguida
espolvoree.con un aplicador de madera, unos granitos de azul de metileno
sobre la superficie del agua y observe qu ocurre. Anote sus observaciones.
A continuacin acerque la llama del mechero a la probeta en cualquier punto y nuevamente observe que ocurre al aplicar calor. Anote sus
observaciones.
Una vez homogenizado el colorante, la difusin se ha efectuado.
1).- Es uniforme el descenso del colorante a travs de la columna de agua?
2).- Qu sucede si se calienta ligeramente un punto de la probeta?
3).- Qu es disolucin, conveccin y difusin?
DILISIS
EXPERIMENTO 5.
Humedezca un tubo de colodin o de celofn de aproximadamente
6 cm de largo por 2.5 cm de dimetro en agua destilada y cierre un extremo
atndolo con hilo. Agregele una mezcla de 1 mi de solucin de NaCI al 1%
y 10 mi de solucin de almidn al 1%.
Ate cuidadosamente el otro extremo del saco y suspndalo en un vaso de
precipitados con agua destilada. Se determinarn almidn por medio de la prueba de lodo, y de cloruros con solucin de nitrato de plata, en el lquido del vaso
de precipitados que rodea al saco, a tiempo cero, a la hora y a las dos horas.
8
ALTURA
0
10
20
30
40
50
60
10
TONICIDAD
El estudio de la presin osmtica es una caracterstica fcil de determinar en los eritrocitos; su membrana es comparable a la membrana
semipermeable ideal y el efecto del paso de agua a travs de ella es fcilmente observable al microscopio cuando el glbulo rojo se encuentra en
medios hipotnico hipertnico.
EXPERIMENTO 7.
En un tubo de ensaye recoja 1.5 mi. de sangre sobre 30 mg. de citrato
de sodio, diluya con 9.5 mi. de solucin de NaCI al 0.86% y homogenice.
(Esta solucin servir para todo el grupo).
Deposite una gota de la dilucin de sangre en un portaobjetos y observe al microscopio el aspecto y el tamao de los eritrocitos. Inmediatamente
despus aplique, con una pipeta Pasteur, una o dos gotas de solucin de
NaCI al 0.6% y observe.
Repita lo anterior agregando a la solucin original solucin salina al 1.2%.
Anote sus observaciones y dibuje esquemas de lo observado.
a) Cul es la solucin hipotnica, la hipertnica y la isotnica?
b) Qu cambios morfolgicos experimenta el eritrocito en cada una de
estas soluciones?
c) Qu es turgencia, y qu es plasmlisis?
PERMEABILIDAD
La permeabilidad es una propiedad intrnseca de las membranas que
se debe nicamente a la naturaleza de las mismas. Si una membrana celular se deja atravesar por una sustancia, se dice que es permeable a esa
sustancia. Los mtodos que se utilizan para el estudio de la permeabilidad
en membranas celulares pueden ser cualitativos y cuantitativos.
En los cualitativos es posible percibir la entrada de solutos a las clulas
por la aparicin de color, precipitados, cambios de color, entre otros, dentro
de ellas. Un mtodo cuantitativo para estudiar la permeabilidad de las membranas es la determinacin de la velocidad de plasmlisis o de desplasmolisis
de las clulas.
11
Tiempo de vire
NH4OH 0.01 N
HCI
0.01 N
12
ELECTROLITOS Y pH
1. ELECTROLITOS
A principios del siglo XIX el cientfico ingls Mlchael Faraday, observ
que cuando conectaba dos electrodos de material inerte a una batera y los
sumerga en una solucin acuosa de sal, se desprenda hidrgeno (H2) en
el electrodo positivo, el estudio de este fenmeno le permiti en 1834 concluir que cuando una corriente elctrica circula por una solucin, hay una
transferencia de materia, una parte circula con la corriente y otra e mueve
en sentido contrario. Faraday llam a los transportadores de corriente "ione'
y denomin "nodo' al electrodo conectado con el polo positivo de la batera, y "ctodo" al conectado con el polo negativo de la batera. Los iones
que se mueven hacia el nodo los denomin aniones, y a los que migran
hacia el ctodo los llam cationes, y design "electrlisis al proceso total.
Refiri tambin a las sustancias que en solucin acuosa permiten el paso
de la corriente como "electrolito^' y a los que no manifiestan esta capacidad como "no electrolito^'. A la capacidad de dar paso a la electricidad se
le conoce como "conductancia".
Los electrolitos se clasifican en fuertes y dbiles, segn su potencia para
conducir la corriente elctrica, la cual va paralela a su grado de disociacin;
sin embargo, no se encuentran definidas con exactitud las dos clases,
encontrndose todos los grados intermedios. En general se puede decir,
que las sales minerales, los hidrxidos de metales alcalinos y los cidos
minerales son electrolitos fuertes. En los lquidos del organismo encontramos como ejemplos al cloruro de sodio (NaCI), cloruro de potasio (KCI),
cloruro de calcio (CaCI2), etc. La mayor parte de los compuestos orgnicos
como cidos (lctico, pirvico, etcj.compuestos nitrogenados, etc., son
electrolitos dbiles. En el agua corporal tenemos muchos ejemplos de compuestos no electrolitos como glucosa, urea y creatinina.
2. CONDUCTIVIDAD.
Posteriormente en 1887 Svante Arrehenius, cientfco sueco, afirm que
la conductividad de las soluciones electrolticas depende exclusivamente
de las "molculas activas" o sea de las molculas disociadas; y por lo tanto
depende del grado de disociacin y de la concentracin de los electrolitos
presentes. Entre mayor sea la concentracin mayor ser la conductividad,
hasta un lmite determinado en el cual se hace constante y luego dlsminu-
13
PARTE EXPERIMENTAL
Electrlisis del agua.
EXPERIMENTO 1
En un cristalizador colocar 50 mi de una solucin de NaCI al 10%, agregar unas gotas de azul de timol o anaranjado de metilo como indicador y
mezclar bien, introducir en la solucin electrodos de carbn provenientes
de una fuente de energa como el Puente de Wheatstone. Observe la formacin de gas y los cambios de color en la solucin cercana a los electrodos, en el electrodo positivo se tornar amarilla, indicando la presencia de
un cido y en el electrodo negativo se tornar roja, demostrando la formacin de una base.
a) Anote las reacciones que se llevan a cabo en cada uno de los electrodos
b) Esquematice el proceso de la electrlisis del agua.
do por la intensidad de luz emitida por el foco. Obsrvese tambin la intensidad en relacin a la distancia a que se coloquen los electrodos.
b) Repita el experimento, empleando acetato de sodio (CH3COONa) al
10%.
Resultados:
Solucin
Luminosidad
...(1)
15
despejando conductividad
K= R x L
...(3)
L= K / R
...(4)
donde:
K = Constante de la celda,
L = Conductividad especfica en mhos,
R= Resistencia en ohms
Para calcular la constante de la celda (K) se utiliza una solucin de
conductividad elctrica especfica conocida, como la de KCI 0.02N, cuya L
a 18 C = 0.002394 mhos, y se determina su resistencia (R) en la celda que
se va a utilizar. Aplicando la frmula (3) se puede calcular la conductividad
elctrica especfica de cualquier solucin, simplemente determinando su
resistencia en la celda cuya constante ya se conoce.
16
EXPERIMENTO 4
Efecto de la concentracin sobre la conductividad
Utilizando una solucin de KCI 0.02 N determine previamente la constante de la celda que va usar y luego proceda a determinar la conductividad
elctrica especfica de soluciones de H2SO4 al 5,10,15, 20 y 25 %, respectivamente, usando el puente de Wheatstone y siguiendo las instrucciones
ya expuestas.
pH
La concentracin de iones hidrgeno, es un factor importante en una
gran variedad de procesos qumicos, pues intervienen determinando el
equilibrio inico de los electrolitos, modificando as la constitucin molecular
de las sustancias que actan entre s. Adems conviene recordar que las
propiedades de los anfoltos, y por ende de las protenas, que son los componentes fundamentales de la materia viva, dependen generalmente del pH
del medio en que se encuentran. Por ejemplo, conocemos que todas las
enzimas tienen un rango especfico de pH para su actividad.
La concentracin de iones hidrgeno en la sangre humana y dems
mamferos tiene un valor constante, el pH normal de la sangre, medido
potenciomtricamente oscila entre 7.35 y 7.45 a temperatura de 37 C.
Podra decirse que todos los fenmenos biolgicos necesitan, para su realizacin, condiciones ptimas dadas por determinados factores de los cuales uno de los ms importantes es, el pH.
Se sa6e que el agua pura es un mal conductor de la corriente elctrica
lo cual significa que su disociacin es muy baja. Esta se ha determinado y
se conoce que a 22 C es de 1.8 x 1016; o sea:
16
[H ][HO] = [H2O](1.8x10" )
1
16
1
= (55.5mol|- )(1.8x10- molr ) = 1
14
1 2
x10 (mol ) =Kw
En el agua pura por cada ion hidrgeno existe un ion hidroxilo. Es decir,
+
que [H ] = [HO']; por tanto podemos escribir:
+
14
El color que el indicador presente depender de las proporciones relativas en que se encuentren las dos formas del mismo, lo que a su vez es
+
debido a la proporcin [ H ]/K. Pero como K es una constante propia de cada
indicador, el color depender nicamente de la concentracin de iones hidrgeno que existe en la solucin.
Hasta hace poco tiempo se empleaban con ms frecuencia soluciones
diluidas de los indicadores para la determinacin del pH, comparndolas
con soluciones tipo. Este mtodo tiene varios incovenientes, como los siguientes: se desperdicia un poco de muestra en cada determinacin, interfieren la turbidez y la coloracin de las soluciones, etc. Por lo que en la
actualidad es ms frecuente el uso de estos indicadores en tiras de papel
filtro, en las cuales se encuentran adsorbidos los indicadores, stas se introducen en las soluciones de pH desconocido y se compara la coloracin
obtenida con el patrn que acompaa a cada empaque.
2) Mtodo potenciomtrico. El mtodo potenciomtrico se basa en las
llamadas pilas o celdas de concentracin. Al introducir una varilla metlica
en una solucin del mismo metal se establece un equilibrio entre la llamada
18
pH
terico
7
8
9
10
11
I
19
pH = -log [H ]
pH = /2 pka - /2 log C
cido clorhdrico
potenciomtrico
20
cido actico
PH
experimental
HCI 0.01 N
CH3COOH 0.01 M
Curvas de titulacin
Las curvas de titulacin se originan cuando, un cido fuerte o a un cido
dbil se le adiciona una base, produciendo la eliminacin de iones hidrgeno. Esto nos lleva al concepto cido-base de Brnsted y Lowry, que nos
dice que, "un cido es toda sustancia que puede donar protones y una base
como toda sustancia que puede aceptar protones".
Existe otro tipo de electrolitos, muy importantes en bioqumica, que pueden comportarse como cidos o como bases, tal es el caso de los aminocidos, que se conocen como molculas anfotricas, como se demostrar
en la prxima prctica
EXPERIMENTO 8
a) Coloque 30 mi de HCI 0.1 N en un vaso de precipitados de 150 mi y
pngalo sobre el agitador magntico
b) Mida el pH de esta solucin original
c) Titule con NaOH 0.1 N como se indica en la tabla siguiente, midiendo
el pH despus de cada adicin.
d) Repita el procedimiento anterior con cido actico 0.1 N
21
mldeNaOHO.IN
adicionados
30 mi de HCI 0.1 N
pH
30mldeCH3COOH0.1 N
pH
0
2
3
5
5
5
5
1
1
1
1
0.5
0.5
a) Grafique los resultados obtenidos en la titulacin de cada cido.
b) Describa las diferencias entre la curva obtenida para el cido fuerte y
para el cido dbil.
22
SOLUCIONES REGULADORAS
Existen ciertas soluciones a las cuales se pueden adicionar cantidades relativamente grandes de cidos o lcalis sin alterar de manera significativa
su pH. Por tal motivo se les denomina soluciones reguladoras, amortiguadoras, buffer o tampn.
Lo que resulta evidente es que dichas soluciones tienen una accin
amortiguadora, entendindose por sta la capacidad de resistir la adicin o
prdida de iones hidrgeno o de iones hidroxilo sin que se produzca un cambio acentuado en su pH. Si bien es cierto que los cidos y las bases fuertes
pueden actuar como amortiguadores, en circunstancias ordinarias la accin
amortiguadora se debe a la presencia en la solucin de un sistema formado por un cido o por una base dbil y su sal correspondiente (cido-base
conjugado).
Si se toma como ejemplo una solucin que contenga un cido dbil, al
que representaremos por "HA", y su sal, representada por "BA" los iones
hidrgeno existentes en ella procedern nicamente de las molculas acidas, que se disocian como sigue:
+
HA o H + A-El equilibrio de la
disociacin est dado por la siguiente ecuacin:
= Ka
La relacin de estas dos cantidades es, sin embargo, tan sensiblemente constante en condiciones ordinarias que podemos afirmar que la concentracin de la base conjugada A" es igual a la concentracin de la SAL.
Sustituyendo una expresin por otra en la ecuacin anterior tenemos:
23
Ahora bien, si -log [H+] es igual a pH, por analoga podemos decir que log Ka es igual a pKa, por lo que:
Por otra parte, por las leyes de los logaritmos, las expresiones:
Esta ecuacin se conoce con el nombre de ecuacin de Henderson Hasselbalch y nos indica que el pH de una solucin que contenga un cido
dbil y su sal, est determinado por el valor de pKa (constante para cada
cido) y por el logaritmo del cociente que resulta de dividir la concentracin
de la sal entre la concentracin del cido. Por ejemplo, el valor de la cons5
tante de disociacin, Ka del cido actico es de 1.8 x 10 . El valor de su
pKa es por lo tanto igual a 4.74. Si tenemos una solucin reguladora que
posea iguales cantidades de cido actico y acetato de sodio en concentracin 0.1 N, el pH de esa solucin estara dado por la ecuacin:
PARTE EXPERIMENTAL
APRECIACIN DEL PODER REGULADOR Y EFECTO DE
LA CONCENTRACIN
EXPERIMENTO 1
Disponga 3 series de cuatro tubos de ensayo cada una. Numere los tubos
del 1 al 4. Coloque en los tubos nmero uno de cada serie 5 mi de agua
destilada hervida. En los tubos nmero 2; 5 mi de solucin de cloruro de
potasio (KCI) 0.5 M. en tanto que en los tubos nmero 3 ponga una mezcla
formada por 2 mi de solucin de fosfato dicido de potasio (KH2PO4) y 3 mi
de solucin de fosfato monocido disdico (Na2HPO4) de concentracin
0.01 M. En los tubos nmero 4 poner 2 mi de solucin KH2PO4 y 3 mi de
solucin Na2HPO4 de concentracin 0,1 M.. A continuacin, compruebe en
la serie I, que el pH de las soluciones es aproximadamente neutro, para ello
haga uso del mtodo colorimtrico empleando rojo de fenol; agregue una
gota de indicador a cada uno de los tubos de la serie y observe el color
caracterstico amarillo o rojo (pH 6.8 a 8.2).
A los cuatro tubos de la serie II, adicione una gota de verde de
bromocresol, que es un indicador de zona acida. A continuacin; agregue
10 gotas de HCI 0.01 M. al tubo nmero 1 y observe el cambio de color que
se opera (de verde a amarillo). Enseguida determine cuntas gotas de la
misma solucin de HCI es necesario agregar a los tubos 2, 3 y 4 de la serie
en cuestin, para igualar la coloracin con el tubo nmero 1.
A los cuatro tubos de la serie lll.adicione una gota de azul de timol, que
es un indicador de zona alcalina, que vira de amarillo a azul fuerte (pH 8.0
a 9.6) a continuacin; agregue 10 gotas de solucin de NaOH 0.01 M al tubo
nmero 1 y observe tambin el cambio de coloracin (de amarillo a azul).
25
Tubo No. 2
H2O
0.5 M
2 mi
2 mi
5 mi
5 mi
NaaHPO4
Na2HPO4
0.01 M
0.1 M
3 mi
3 mi
KCI
SERIE I
Tubo No. 3
KH2PO4
0.01 M
Tubo No. 4
KH2PO4
0.1 M
Tubo No. 4
KH2PO4
KCI
0.1 M
0.01 M
SERIEN
H2O
0.5 M
2 mi
2 mi
HCI0.01N
5,ml
5 mi
Na2HPO4
Na2HPO4
0.01 M
0.1 M
3 mi
3 mi
Tubo No. 2
Tubo No. 3
Tubo No. 4
KH2PO4
0.01 M
2 mi
KH2PO4
0.1 M
2 mi
Na2HPO4
Na2HPO4
0.01 M
0.1 M
3 mi
3 mi
SERIE III
H2O
KCI
0.5 M
NaOH 0.01 N
5 mi
5 mi
26
pH DE LA LECHE DE VACA.
EXPERIMENTO 2b
Mida el pH de una muestra de leche de vaca, enseguida, en un vaso de
precipitados, coloque 2 mi de leche y adicione 38 mi de agua destilada hervida. Determine el pH de esta dilucin.
EXPERIMENTO 2c
De la misma manera que trat la leche, haga una determinacin del pH de
una solucin de cido clorhdrico 0.1N sin diluir y despus de diluir.
Compare y analice sus resultados
Muestra
pH normal
pH experimental
Orina
Leche
Leche diluida
Muestra
pH terico
HCI0.1 N
HCI diluido
27
pH experimental
CURVAS DE TITULACIN.
Como ya mencionamos en la prctica de electrolitos y pH existen sustancias de mucha importancia en bioqumica como son los aminocidos y
las protenas, que tambin poseen grupos titulables y que actan como
+
anfolitos aceptando iones H o iones OH".
En esta prctica se determinar la curva de titulacin de la glicina con
HCI y con NaOH y se har la comparacin de las curvas obtenidas en la
prctica de electrolitos y pH obtenidas con el cido fuerte y el cido dbil
para reafirmar los conceptos.
EXPERIMENTO 3
En dos vasos de precipitados de 150 mi coloque 30 mi de solucin de
glicina 0.1 N, agregue una barra magntica y colquela sobre el agitador,
determneles el pH y titule como se indica en la tabla, un vaso con NaOH
0.1 N y el otro con HCI 0.1 N.
Con los valores obtenidos hacer las grficas correspondientes, poniendo en las ordenadas el valor de pH y en las abscisas los mililitros gastados
de HCI y de NaOH.
Agregar HCI
0.1N
30 mi
Glicina 0.1N
PH
Agregar NaOH
0.1N
0
2
3
5
5
5
5
1
1
1
1
0.5
0
2
3
5
5
5
5
1
1
1
0.5
0.5
30 mi
Glicina 0.1 N
PH
H
0.5
Compare las curvas obtenidas para los cidos fuertes y dbiles con sta
y diga cuales son sus pKa y adems calcule el punto isoelctrico sabiendo
que:
28
29
PROTENAS
El nombre de protenas deriva del griego "protos" que significa "primero",
"primordial" o fundamental. Este nombre fue propuesto en 1940 por Mller
para asignar a ciertas sustancias orgnicas de extrema complejidad, son
las sustancias de mayor trascendencia en los seres vivos, ya que son quiz las macromolculas ms verstiles, responsables en gran parte de las
capacidades metablicas y de la morfologa de los seres vivos. Las protenas son los constituyentes principales del protoplasma y las membranas
celulares, tanto de animales como de vegetales.
Las protenas contienen en su molcula C, H, O, N y en ocasiones P y
S; el nitrgeno en ellas se encuentra aproximadamente en un 16%; por
hidrlisis se desdoblan dando como producto final, alfa aminocidos, los
cuales varan en nmero, cantidad y posicin en cada protena.
Existen diferentes tipos de protenas en un organismo, cada una con
una funcin especfica; algunas son estructurales, otras actan como catalizadores, hormonas, transportadores de gases, transportadoras de solutos
a travs de la membrana, de electrones, en mecanismos de defensa, mecanismos genticos, en el mantenimiento del balance hidroelectroltico, etc.
Las diferencias entre una protena y otra se deben a: 1) el nmero total y
estructura de los aminocidos que contenga y 2) del orden o secuencia en
que estn unidos estos aminocidos. Esto quiere decir que el simple anlisis qumico no sirve para caracterizarlas individualmente, ya que es posible
que existan protenas que tengan el mismo peso molecular, el mismo tipo
de aminocidos y sin embargo exhiban propiedades y funciones completamente diferentes. Esto se comprender si se recuerda que la estructura de
una protena esta determinada por cuatro niveles de organizacin, o niveles estructurales que se designan como estructura primaria, secundaria,
terciaria y cuaternaria.
La estructura primaria depende del nmero y secuencia de aminocidos que se unen entre s por el enlace peptdico (-CO-NH) covalente.
La cadena polipeptdica puede enrollarse sobre si misma formando estructuras helicoidales u otro tipo de conformacin, estabilizada por puentes
de hidrgeno (entre los enlaces peptdicos). Esta ordenacin espacial de la
molcula se conoce como estructura secundaria. La cadena polipeptdica
ya enrollada adopta en el espacio la conformacin ms estable, p sea, sufre un super enrollamiento que se designa como estructura terciaria. En la
mayora de las ocasiones una protena biolgicamente activa puede estar
constituida por ms de una cadena polipeptdica. La asociacin de estas
cadenas en el espacio para adoptar una estructura tridimensional caracterstica es lo que se llama estructura cuaternaria. Tanto la estructura terciaria como la cuaternaria carecen de enlaces definidos, ya que participan to30
dos los tipos de enlaces qumicos, fuertes o dbiles, en estos niveles estructurales.
La actividad de una protena depende fundamentalmente de su conformacin espacial, ms que de su estructura qumica. Existe una gran cantidad de agentes fsicos y qumicos capaces de modificar la conformacin de
las protenas al alterar los diferentes enlaces que estabilizan las estructuras
secundaria, terciaria y cuaternaria. Estos agentes se denominan agentes
desnaturalizantes, algunos de los ms comunes son: cidos, bases,
detergentes, metales pesados, solventes orgnicos, alcaloides, calor, radiacin ultravioleta, rayos x, ondas ultrasnicas, sales inorgnicas, sustancias
orgnicas como urea, guanidina, agentes reductores, agentes oxidantes, etc.
Las protenas tal como existen en la naturaleza se denominan protenas nativas; si se modifican por cualquiera de los agentes anteriores en su
conformacin, se transforman en protenas desnaturalizadas, las cuales
generalmente pierden su actividad, modifican su solubilidad y precipitan.
PARTE EXPERIMENTAL
ALGUNAS PROPIEDADES QUMICAS
DE LAS PROTENAS
Como ya se explic, las protenas estn formadas por aminocidos, unidos por enlaces peptdicos y aunque presentan propiedades fisicoqumicas
y biolgicas caractersticas stas son reflejo de las de los aminocidos que
las constituyen. Muchas de las reacciones coloridas que se utilizan para el
anlisis de las protenas en realidad se deben a la presencia de un
aminocido especfico.
REACCIN DE MILLN
La reaccin de Milln es especfica para el grupo fenlico y por lo tanto, la
dan positiva todas las sustancias que poseen esta funcin, como el fenol, cido
saliclico, timol, tirosina y todas aquellas protenas que contengan tirosina.
EXPERIMENTO 1
Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados.coloque en cada
uno, 2ml de una de las soluciones siguientes:
TUBO No
Protena
1
2
3
Peptona
Casena
Gelatina
Albmina
31
REACCIN DE BIURET
Todas las molculas que contengan dos o ms uniones peptdicas, por
lo tanto todas las protenas y todos los pptidos no menores de 3 unidades,
dan positiva la reaccin de Biuret.
El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual
da positiva la prueba.
Cuando una protena o un polipptido se hacen reaccionar con sulfato
de cobre en solucin alcalina se produce un color caracterstico prpura
o violeta.
El color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los
tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Esta reaccin nos sirve para
diferenciar las protenas y pptidos de los aminocidos y su utilidad principal es la de seguir el proceso de hidrlisis proteica, la reaccin ser negativa cuando la hidrlisis sea completa.
EXPERIMENTO 2
Prepare una serie de 4tubos de ensaye numerados coloque en cada
uno 1ml de una de las siguientes
TUBO No.
Protena
1
2
3
Peptona
Casena
Gelatina
Albmina
32
a).- Anote sus resultados en la tabla que se encuentra al final del captulo,
b).- Se puede considerar al biuret como una reaccin caracterstica para
todas las protenas? Por qu? c).Escriba la reaccin.
REACCIN XANTOPROTEICA
Esta reaccin se debe a la formacin de nitroderivados aromticos por
reaccin del cido ntrico sobre grupos bencnicos que poseen algunos
aminocidos como la fenilalanina, la tirosina y el triptofano. Por lo tanto, la
dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos aromticos
en su molcula.
EXPERIMENTO 3
Prepare una serie de 4 tubos de ensaye , numerados, agregue en cada
uno 2 mi de una de las siguientes soluciones:
TUBO No.
Protena
1
2
3
Peptona
Casena
Gelatina
Albmina
REACCIN DE HOPKINS-COLE
La reaccin de Hopkins-Cole es especfica para el aminocido triptofano
y el color violeta que se produce se debe a la condensacin del anillo indlico
del triptofano con el aldehido presente en el reactivo de Hopkins- Col. Esta
reaccin la darn positiva los pptidos y protenas que contengan triptofano
en su molcula.
33
EXPERIMENTO 4
Prepare una serie de 4 tubos de ensaye numerados, coloque en cada
uno 2 mi de una de las siguientes soluciones:
TUBO No.
Protena
1
2
3
Peptona
Casena
Gelatina
Albmina
Protena
1
2
3
Peptona
Casena
Gelatina
Albmina
Agregue 2 mi de solucin de hidrxido de sodio (NaOH) al 10% PRECAUCIN! caliente ligeramente. Aada a todos 0.5 mi de solucin de acetato
de plomo (Pb (CH3-COO)2). Coloque los tubos en bao mara a ebullicin
por 5 min. El oscurecimiento de la solucin o la formacin de un precipitado
negro indica la presencia de aminocidos azufrados.
34
REACCIN DE NINHIDRINA.
Esta es una de las reacciones mas sensibles que se conocen para identificar aminocidos en general (se puede detectar una parte de alanina en 1
500 000 partes de agua).
Por su sensibilidad esta reaccin se emplea para valoracin cuantitativa de aminocidos por colorimetra.
La valoracin de aminocidos en orina, por ejemplo, tiene importancia
en medicina ya que en algunas enfermedades como hepatopatas, infecciones agudas o diabetes mellitus en las que se presenta hiperaminoacidemia se ve acompaada por hiperaminoaciduria paralela. Algunas enfermedades metablicas congnitas tambin dan lugar a eliminacin anormal de
algunos aminocidos en la orina.
Los aminocidos y muchas aminas primarias dan un color violeta caracterstico. La prolina da coloracin amarilla.
EXPERIMENTO 6
Se utilizarn rectngulos de papel filtro Whatman No 1 ,de 2 x 2 cm, sobre
los cuales se colocarn gotas de una de las siguientes soluciones:
Cuadro de papel
Sustancia
1
2
3
4
5
Glicina
Peptona
Gelatina
Casena
Albmina
35
MILLN BIURET
XANTOPROTEICA
HOPKINS- AMINOCIDOS
COLE
NINHIDRINA
AZUFRADOS
GELATINA
PEPTONA
CASENA
ALBMINA
DESNATURALIZACIN DE PROTENAS
Las propiedades fsico-qumicas y biolgicas de las protenas se alteran profundamente cuando se someten a la accin de agentes fsico-qumicos capaces de romper los diferentes enlaces que estabilizan las estructuras 2a. 3a. y 4a. de las protenas. De tal forma que la estructura altamente
ordenada de una protena queda reducida al llamado polmero estadstico
formado por la cadena de aminocidos. Estos agentes pueden ser muy diversos y se denominan, en general, agentes desnaturalizantes. En esta
prctica se estudiarn algunos de los que se consideran ms importantes.
36
EXPERIMENTO 7
Prepare una serie de 4 tubos de ensaye , numerados, coloque en cada
uno 3 mi de una de las siguientes soluciones:
TUBO Nc
Protena
1
2
3
Peptona
Casena
Gelatina
Albmina
37
38
CALOR
Fe
Hg
Pb
SUSTANCIASI
Peptona
Albmina
Gelatina
Casena
39
ACIDO
TRICLOROACETICO
SULFATO
DE
AMONIO
ALCOHOL
969
0.1N
Agua Destilada
8.4
7.8
8.8
8.5
8.0
7.0
5.0
1.0
7.4
Acido Actico
--
---
---
--
--
---
---
---
1.6
--
---
0.2
0.5
1.0
2.0
4.0
8.0
.----
0.6
1.2
---
---
---
---
---
---
---
No. Tubo-
SUSTANCIAS^
Casena 5% en
Acetato de Sodio
1N
cido Actico
I
0.1N
Acido Actico
0.01 N
pH Terico
Observacin a
los 15 min.
Observacin a
los 30 min.
40
Cuando se alcanza el equilibrio qumico, las dos velocidades son iguales; es decir:
v, = v2
sustituyendo estos valores por sus equivalentes, tenemos:
41
PARTE EXPERIMENTAL
COMPROBACIN DE LA LEY DE ACCIN DE MASAS.
EXPERIMENTO 1
En un vaso de precipitados de 500 mi de capacidad, aada 100 mi de
agua destilada, 0.5 mi de solucin de sulfocianuro de amonio (NH4SCN)0.2
M y 0.5 mi de solucin de Cloruro frrico (FeCI3 0.2 M) en HCI 0.1N mezclando hasta lograr la homogeneidad. Observar la aparicin de una
coloracin roja, debido a la formacin de sulfocianuro frrico(Fe(SCN)3).
En cuatro vasos de precipitados de 100 mi. de capacidad, coloque en
cada uno 25 mi de la mezcla reaccionante anterior, despus de haber agitado hasta completa homogeneidad, enseguida agregue a cada vaso los
reactivos descritos en la tabla siguiente:
Reactivos-
Vasoi
1
2
3
4
FeC 3(HCI) mi
0.5
1.0
E S
NH.SCN
mi
0.5
1.0
I G O
NH4CI mi
5.0
CINTICA QUMICA
El objetivo de la cintica qumica es predecir la velocidad de las reacciones qumicas y describir el curso de las mismas.
La velocidad de una reaccin qumica puede medirse por varios mtodos. Uno de los ms utilizados consiste en tomar muestras de la mezcla
reaccionante, a un tiempo dado, suspender la reaccin y analizar los componentes de la mezcla en ese momento. Esto en ocasiones no es fcil, ya
que muchas reacciones en solucin acuosa son instantneas.
42
EXPERIMENTO 2
2a.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de una solucin de nitrato de
plata (AgNO3) 0.1 M y aada 1 mi de solucin de cloruro de sodio
(NaCI) al 1%. Observe la aparicin del precipitado, como resultado
de la reaccin que se efecta.
2b.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de solucin de hidrxido de sodio
(NaOH) 0.1 N agregue 1 gota de solucin de fenolftalena al 0.1%
y aada finalmente 6 mi de cido clorhdrico (HCI) 0.1 N. Agite el
tubo.Observe la decoloracin que ocurre debido a la reaccin.
2c.) Coloque en un tubo de ensaye 5 mi de la solucin de cloruro frrico
(FeCI3) al 1% y aada 5 mi de solucin NaOH 0.5 N.Observe la formacin del floculado.
Escriba en cada caso la reaccin qumica que se ha efectuado:
2a)
2b)
2c)
En que condiciones experimentales cree que sea posible medir la velocidad de estas reacciones?
43
Primer orden
Son aquellas en las que, se ha demostrado experimentalmente, que la velocidad de reaccin es directamente
proporcional a la concentracin de una de las sustancias
reaccionantes.
Segundo orden
Tercer orden
La mayor parte de las reacciones enzimticas se caracterizan por seguir el modelo correspondiente a las reacciones de primer orden.
Matemticamente, la reaccin puede representarse as:
dc/dt = kc
dt = tiempo
de = concentracin del material
Kc = constante especfica de velocidad de reaccin.
Si representamos por (a) la concentracin inicial de material y por (x) la
cantidad que ha reaccionado en el tiempo (t), la expresin (a-x) significa
concentracin del material en el tiempo (t). La ecuacin anterior puede expresarse en funcin de (a), (x) y (t) y al integrarla nos queda:
44
KMnO4 (mi)
(a-x)mol I
log a/a-x
Kc
0
300
500
1200
1800
Para calcular la Kc a cada tiempo debe utilizar la siguiente ecuacin:
45
Esto quiere decir que por cada 10C de incremento, la velocidad de una
reaccin aumenta al doble. En la mayor parte de las reacciones se observa
este aumento bajo ciertas temperaturas lmites.
EXPERIMENTO 4
4a) Coloque en un matraz erlenmeyer de 250 mi de capacidad 0.25 g
de yoduro de potasio (Kl) y aada 25 mi de solucin de H2SO4 1:6. Agite
hasta disolucin completa y agregue agua destilada hasta completar 50
mi.
46
Hl
Na2S2O3
0.02N
Almidn
Preincubar
5 min a:
H2O2 0.2%
tiempo de
reaccin
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 gotas
a
5C
5 gotas
S
25 C
5 gotas
Q
40 C
5 gotas
s
60 C
5 gotas
s
90 C
2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
Hl
Na2S2O3
0.02N
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 mi
1.5
5 mi
1.5
Almidn
H20 dest.
5 gotas
5 mi
5 gotas
5 gotas
5 gotas
5 gotas
HCI.0.01N
HCI0.1N
HCI1 N
HCI2N
H2O20.2%
tiempo de
reaccin
5 mi
5 mi
5 mi
2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
5 mi
2 mi
48
49
50
ENZIMAS
FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD
ENZIMATICA
La vida depende de una serie de reacciones qumicas cuyo curso y
velocidad estn determinados por la presencia de diversos catalizadores
orgnicos denominados enzimas: (del griego: en=en, zymo=fermento). La
definicin de enzimas dada por Woldschmidt y Leitz las describe como:
catalizadores producidos por las clulas pero que pueden actuar fuera
de ellas a diferencia de vitaminas y hormonas. La mayor parte de las
reacciones biolgicas seran cinticamente insignificantes si no fuera por
las enzimas.
La mayor parte de las enzimas desde el punto de vista qumico son
compuestos que pertenecen al grupo de las protenas (aunque algunas solo
funcionan asociadas a un grupo no proteico, grupo prosttico o coenzima).
Debido a su carcter protenico, las enzimas son muy sensibles a cualquier
cambio fsico, qumico o fisicoqumico. As, cualquier cambio en la temperatura, el pH, la fuerza inica, la adicin de sales, la presencia de agentes
oxidantes o reductores, la presencia de metales pesados, etc., producen
modificaciones profundas en su actividad. En general, cualquier factor que
sea capaz de desnaturalizar a las protenas ser capaz de alterar su actividad.
51
Temperatura
Las velocidades de las reacciones qumicas aumentan al incrementar
la temperatura, originando aumento en la energa cintica y en las velocidades medias de las molculas con el resultado de una mayor probabilidad
de colisiones efectivas. Sin embargo, las enzimas se inactivan y desnaturalizan a temperaturas elevadas. La mayor parte de las enzimas tienen una
temperatura ptima, en la cual catalizan con una velocidad mxima.
PH
La actividad de la mayora de las enzimas depende del pH, debido a la
+
participacin de iones H o de iones HO en las reacciones, adems de que
se afecta la de los grupos funcionales. La mayora de las enzimas tienen un
pH ptimo en el cual su actividad es mxima.
Concentracin de la enzima
La velocidad de una reaccin aumenta en proporcin directa a la concentracin de la enzima que la cataliza. La interaccin enzima-sustrato
cumple la Ley de Accin de Masas. Se emplea con frecuencia la velocidad
de una reaccin como medida de concentracin de la enzima manteniendo
fija la concentracin de sustrato.
Concentracin de sustrato
Si se trabaja con una concentracin fija de enzima la velocidad inicial
de reaccin aumenta al incrementar la concentracin del sustrato, hasta que
se alcanza un mximo y la adicin de ms sustrato ya no influye sobre la
velocidad, ya que la enzima se ha saturado.
PARTE EXPERIMENTAL
Nota: Recuerde la necesidad de lavar el material de vidrio y de enjuagar
con agua destilada.
52
EXPERIMENTO 1.
Se prepara una serie de siete tubos como se indica:
1
Agua
Preincubar 5 minutos a:
Enzima (Sol. de amilasa
salival)*
5
fi
25
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
1.5
3
B
5
3
fi
25
3
a
40
3
a
50
3
a
60
3
a
92
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
RESULTADOS:
Temperatura (C)
25
40
50
60
92
D.O.
a) Con los datos obtenidos trace una grfica anotando la densidad p
tica en las ordenadas y la temperatura en las abscisas.
b) Interprete la grfica obtenida.
53
Sustrato (Sol. de
almidn 8mg./ml)
Sol. Reguladora
al pH indicado:
mi:
Enzima (sol. de
amilasa salival)
mi:
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
pH=7
5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
RESULTADOS:
pH
D.O.
a).- En base a sus resultados diga Cul es el pH ptimo de la amilasa
salival?
La velocidad de formacin (Vf) del complejo [ES] depende de v, mientras que la velocidad de degradacin (Vd) depende de v2+v3. Por lo tanto en
el equilibrio tenemos:
55
La constante de Michaelis-Menten se utiliza como una medida de la afinidad entre la enzima y el sustrato, aunque no es propiamente la constante de
afinidad. La KM se define como la concentracin de sustrato cuando la reaccin adquiere la mitad de su velocidad mxima. Cuando sto sucede:
Sustrato (sol.
almdn)8mg/ml
0.5
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
7.5 0.0
7.0
6.5
5.5
4.5
3.5
2.5
0.0
8.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
56
RESULTADOS:
[S] mg/ml
D.O.
a) En base a sus resultados, trace la grfica correspondiente a D.O.
contra concentracin de sustrato en mg/ml
b) Determinar el valor de la KM para el sistema almidn/amilasa en es
tas condiciones.
Sol.sustrato de almidn
8mg/ml
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
Sol.reguladora fosfatos
0.02M pH=6.9
4.9
4.8
4.6
4.2
3.4
0.1
0.2
0.4
0.8
1.6
Agua
a
Preincubar a 40 durante 5
minutos
Sol.enzima (amilasa
salival).
57
58
OXIDACIONES BIOLGICAS
De todas las propiedades que posee un ser vivo, quiz la ms caracterstica es su capacidad para utilizar y transformar la energa del medio
ambiente. Todos los procesos qumicos y fsicos que estn relacionados con
la obtencin de la energa en un ser vivo se denomina respiracin. Sin
embargo, este trmino se utiliza para designar simplemente la entrada y
salida de aire de un compartimiento a otro. Un trmino que cada da se utiliza ms como sinnimo bioqumico de respiracin es bioenergtica, aunque este trmino es ms amplio que respiracin, ya que quedan incluidos
los procesos fotosintticos.
Todos los procesos qumicos que constituyen la respiracin conducen
a la oxidacin de substancias denominadas metabolitos, hasta CO2 y H2O.
Por regla general todas las reacciones de oxidacin son reacciones
exergnicas, es decir, liberan energa cuando se efectan; en ocasiones
toda la energa se libera como calor, como ocurre cuando se quema u oxida
un pedazo de madera.
Sin embargo, un organismo viviente no es una mquina trmica y, por
tanto, debe poseer un mecanismo enzimtico que le permita capturar y almacenar la energa liberada en los procesos de oxidacin. La utilizacin o
captura de la energa involucra la participacin de enzimas especficas,
capaces de catalizar la conversin del ADP en ATP (reaccin endergnica).
AUMENTOS
ADP + P
PROCESOS
-ENERGIA- -ENERGIA-
[OJ
ENDERGONICOS
CO2 + H2O
ATP
REACCIONES DE OXIDO-REDUCCION
Un compuesto qumico puede oxidarse de diferentes maneras. La oxidacin tpica es aquella en la cual el oxgeno se une a un compuesto
(oxigenacin). Otra forma de oxidacin es la prdida de hidrgeno
(deshidrogenacin). Tambin se oxida un compuesto cuando pierde electrones, o cuando gana valencias positivas.
59
K3( Fe(CN)6)
60
KSCN
Tubo numero:
2
Calor
1
Testig
3
Temp. 4H2O2 5FeCI
Amb.
3
61
62
DESHIDROGEENASA LCTICA
EXPERIMENTO 3
Se mata una rata, se disecan los msculos de las patas traseras 8 g;
+
4 g para la enzima (LDH) y 4 g. para la coenzima (NAD ) adems se extrae
el hgado y se mantiene en hielo hasta el momento de utilizarlo en otro
experimento.
+
63
KCN 0.5 %
LACTATO1%
AZUL DE METILENO
0.002 M
AGUA DESTILADA
SOBRENADANTE
+
"COENZIMA NAD "
SOBRENADANTE
"ENZIMA LDH"
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0
1.0
1.0
0.3
0.3
0.3
0.3
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0
10
20
30
b) Explique sus resultados en base al contenido de cada tubo.
64
PROCEDIMIENTO:
Prepare una serie de tubos de ensaye, numrelos y aada los reactivos
correspondientes, de acuerdo con las instrucciones de la tabla siguiente:
TUBOS No.^>
REACTIVOS EN mil
AZUL DE METILENO
0.002 M
SUCCINATO DE SODIO
0.1 M
MALONATO DE SODIO
O.1 M
AGUA DESTILADA
SUSPENSIN DE HGADO
SOBRENADANTE DE
HGADO
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.3
0.0
0.5
0.5
0.0
0.5
0.5
0.0
0.0
0.5
0.0
0.0
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.0
0.5
0.0
0.5
0.0
0.0
0.0
0.0
0.5
0.5
0.5
65
Una vez agregada la vaselina no agitar el contenido de los tubos e incubar en bao mara a 37C y hacer lecturas en los tiempos sealados, anotando en el siguiente cuadro el grado de coloracin, con cruces (de una a tres).
a) Resultados
0
10
20
30
b) En cul de las fracciones de hgado deben encontrarse las mitocondrias y por qu?
c) Describa cmo acta el malonato de sodio en esta reaccin.
d) Explique sus resultados en base al anlisis del contenido de cada tubo.
66
1
Sol.alfa-naftol
0.15%enetanolal
10%
Sol. dimetil- para
fenilen-diamina
0.15%
0.5
H2O
Sol. *KCN 0.01%
0.5ml = 10 gotas
Sobrenadante de
hgado
0.5
1.0
1.5 1.5
2.0 0.5
1.0 1.0
10
0.5 0.5
0.5
1.0
Suspensin de
hgado
0.5
1.0
0.5
1.0
* No pipetear.
Agite los tubos ocasionalmente, observe la aparicin del azul de ndofenol
y anote sus resultados en la siguiente tabla.
a)Resultados:
TUBO
No->
TIEMPO
(mn)
10
0
10
20
30
b) Escriba la reaccin de formacin del azul de indofenol.
c) Explique por qu no se us vaselina en este experimento?
d) Explique sus resultados en base al anlisis del contenido de cada tubo.
67
CIDOS NUCLEICOS
Una de las principales caractersticas de un ser vivo es la forma tan ordenada como realiza sus funciones. El control de todos los procesos vitales
que realiza una clula, como son la transformacin de energa en sus diferentes formas, la sntesis de molculas propias, la degradacin de los
metabolitos, el transporte de diferentes materiales a travs de sus membranas, la formacin de nuevas clulas, la diferenciacin celular, la creacin de nuevos seres, etc., se puede explicar debido a la existencia de protenas especficas, fundamentalmente las enzimas, sin embargo, es
indispensable saber cmo se producen las enzimas y cmo se controla su
produccin y su actividad. Se han descrito unas melculas presentes en
todos los seres vivos, que son las que poseen la informacin necesaria para
controlar la biosntesis de protenas y, por lo tanto, controlar todos los procesos vitales. -Ms an, rompiendo la mxima bioqumica de que "todas
las enzimas son protenas", se descubri (1982-1983) que algunos RNA
pueden funcionar como enzimas.- Estas molculas son los llamados cidos nucleicos.es decir, el cido desoxirribonucleico (DNA) y el cido
ribonucleico (RNA).
Los cidos nucleicos reciben este nombre debido a que el ao de 1871,
el qumico suizo, Friedrich Miescher, logr aislar del ncleo celular una sustancia que llam nuclena, la cual debido a su carcter cido se denomin
posteriormente "cido nucleico". Sin embargo, existen otros tipos de cidos
nucleicos. El cido desoxirribonucleico se encuentra fundamentalmente en
el ncleo y es el que posee la informacin gentica, trasmite esta informacin al citoplasma y por ser capaz de replicarse puede trasmitir la informacin de padres a hijos. En la clula normalmente existen 3 tipos de cidos
ribonucleicos, que son: el cido ribonucleico ribosomal (RNAr), el cido
ribonucleico mensajero (RNAm) y el cido ribonucleico soluble o de
trasferencia (RNAt). El RNAr se encuentra en los ribosomas y su P.M es de
2 000 000. El RNAm tiene un P.M de 300 000, se forma en el ncleo y lleva
la informacin al citoplasma. El RNAt tiene un P.M de 25 000 a 30 000 y se
encuentra disuelto en el citoplasma. El DNA es una de las biomolculas ms
grandes que se conocen hasta ahora y su peso molecular va 1.000.000 a
1000.000.000.
Tanto el DNA como el RNA se encuentran asociados con protenas fuertemente bsicas (histonas o protaminas) formando las llamadas nucleoprotenas.
La estructura qumica es similar en todos los cidos nucleicos, todos estn
constituidos por bases pricas, bases pirimdicas, un azcar y un cido fosfrico.
El DNA tiene como bases pricas adenina y guanina, como bases pirimdicas
citosina y timina, como azcar la 2-desoxirribosa y cido fosfrico
68
PARTE EXPERIMENTAL
OBTENCION DE DNA DE BAZO.
Cuando se desea purificar una sustancia se deben seleccionar las clulas o tejidos que se van a utilizar como materia prima. En el caso de DNA
esta seleccin es en especial importante porque el contenido del DNA es
pequeo en la mayor parte de las clulas. La clula ideal es aquella que
tenga una relacin ncleo/citoplasma alta, como en los linfocitos y clulas
del tumor asctico de Ehrlich. Sin embargo, no es fcil obtener este tipo de
clulas, por lo que, frecuentemente se usan rganos tpicamente linfoides,
como el timo y el bazo.
El primer paso en la extraccin de DNA es la homogeneizacin del tejido. Este paso puede degradar en parte, la molcula del DNA si no se toman las precauciones necesarias, aunque en este experimento la degradacin no es importante. La solucin reguladora es de citrato 0.01 M y NaCI
0.14M, el pH 7.2 - 7.4; la fuerza inica de esta solucin hace insoluble a la
desoxirribonucleoprotena. Si se centrifuga este homogeneizado, en el sedimento quedarn los residuos celulares y las desoxirribonucleoprotenas
insolubles. En el sobrenadante se escontrarn todos los compuestos solubles, entre ellas la mayor parte de los cidos ribonucleicos.
Al homogenizar el tejido se liberan varias enzimas de los lisozomas, entre
ellas la DNAasa, la cual es capaz de destruir por despolimerizacin el DNA.
++
Se sabe que el Mg es indispensable para la actividad de esta enzima:si
++
en la solucin existe citrato, ste se une al Mg e impide la accin de la
DNAasa. Otra forma de evitar la accin hidroltica de la enzima es trabajar
a temperaturas bajas (0 a 2C).
El siguiente paso en la purificacin est basado en que las desoxirribonucleoprotenas y el DNA son solubles en soluciones salinas concentradas,
mientras que la mayor parte de las protenas precipitan en estas condiciones. Si el residuo se suspende en solucin cte NaCI 2.6M y se centrifuga, el
residuo insoluble estar formado fundamentalmente por protenas, mien-
69
70
CONCENTRACIN DE DNA
1 mg / mi
0.5mg / mi
0.25 mg / mi
0.125 mg/ml
0
Problema
72
Absorbancia a 660 nm
__
Problema
73
Preparar una
Acetato 0.1 M
Buffer acetato
0.1MapH4.0
Reactivo molibdato (2.5%)
Agua destilada
Sol. Vit. C 1 %
Reciente
Sol.tipo
1nM/ml
Sol. tipo
2.5nM / mi
Sol. tipo
5^M / mi
Problema DNA
Problema RNA
1 mi
1 mi
1 mi
1 mi
1 mi
1 mi
7 mi
7 mi
7 mi
7 mi
7 mi
7 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5ml
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
2 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
0.5 mi
2 mi
2 mi
2 mi
2 mi
-
2 mi
74
GLUCIDOS
Los glcidos o carbohidratos se definen como derivados aldehdicos o
cetnicos reales o en potencia de alcoholes polivalentes que poseen en su
molcula uno o ms carbonos asimtricos. Estos compuestos se encuentran presentes en todos los seres vivos, en cantidades variables, desempeando importantes funciones estructurales y energticas.
Debe recordarse que todas las propiedades qumicas de los glcidos
dependen de sus grupos funcionales, o sea, grupo alcohlico, y grupo
carbonilo (aldehdico o cetnico).
Los glcidos se clasifican, segn el nmero de compuestos hidrocarbonados simples que los constituyen, en 3 grupos: monosacridos, oligosacridos y polisacridos. Los monosacridos son aquellos que por hidrlisis
no se pueden desdoblar en compuestos ms sencillos, a su vez se
subdivden,segn el nmero de carbonos que contengan, en: triosas,
tetrosas, pentosas, hexosas, etc.
Los oligosacridos son aquellos glcidos que por hidrlisis dan pocas
molculas de monosacridos. En la naturaleza existen varios disacridos
(sacarosa, lactosa, maltosa, etc.), unos cuantos trisacridos, tetrasacridos
y pentasacridos libres. Se pueden obtener por sntesis qumica en el laboratorio o por degradacin hidroltica de polisacridos. Los oligosacridos
poseen propiedades fsicas similares a las de los monosacridos.
Los polisacridos son aquellos que por hidrlisis dan muchas molculas de monosacridos. Desde el punto de vista fisiolgico se dividen en dos
grupos; polisacridos estructurales y polisacridos nutrientes o de reserva.
Entre los primeros tenemos en vegetales, la celulosa, cidos pcticos, y
hemicelulosas. En los animales los ms importantes son los llamados
mucopolisacridos, tales como el cido hialurnico, condroitin sulfato, abundantes en varios tejidos y lquidos como el cuerpo vitreo del ojo, cordn
umbilical, lquido sinovial, tendones, cartlagos, etc. Entre los polisacridos
nutrientes o de reserva los ms importantes son, en los vegetales, almidones e inulina y en los animales, glucgeno.
PARTE EXPERIMENTAL
OBTENCIN DE GLUCGENO HEPTICO DE RATA.
EXPERIMENTO 1.
Se matan dos ratones por descerebracin ,uno excitndolo previamente
durante 10 minutos y otro sin excitacin .En ambos casos se diseca el
hgado y se coloca sobre hielo molido. Una vez fro, se pesa lo ms exacto
posible y se anota el peso. Se corta en pequeos pedazos y se coloca en
un mortero previamente enfriado que contenga 1 mi. de cido tricloroactico
al 10% por cada gramo de tejido. Se muele, con precaucin, hasta obtener
una pasta homognea. Este homogeneizado se coloca en un tubo de centrfuga teniendo cuidado de vaciar completamente el contenido. Se centrfuga a 4000-5000 r.p.m. durante 5 minutos (recuerde la necesidad de tarar
con el tubo opuesto). El lquido sobrenadante se decanta en otro tubo, el
residuo se desecha.
Aada lentamente 2 volmenes de alcohol etlico al extracto del cido
tricloroactico, agitando constantemente. Deje reposar la mezcla hasta que
observe un precipitado. (Si no hay precipitado aada un poco de cloruro de
sodio en cristales y caliente ligeramente el recipiente).Pese un tubo de centrfuga vaco y reciba el precipitado formado, centrifugue por 5 minutos a
5000 r.p.m. Elimine el liquido sobrenadante y lave su precipitado con 3 mi.
de alcohol etlico al 95%, (agitando enrgicamente) vuelva a centrifugar y
elimine el sobrenadante, repita el lavado con 3 mi. de alcohol etlico absoluto y centrifugue finalmente con 3 mi. de ter etlico. Deje secar el precipitado al aire. Una vez seco, pese el tubo nuevamente y por diferencia determine el peso del glucgeno obtenido, anote sus resultados en la tabla
siguiente. (Guarde el glucgeno obtenido para la prueba de lugol). (Experimento 12)
DATOS
RATN NO EXCITADO
RATN EXCITADO
76
SABOR
EXPERIMENTO 2.
Determinar cuidadosamente el sabor de los siguientes glcidos: glucosa, maltosa, almidn y celulosa.
a) Qu glcidos tienen sabor dulce?
b) Cuales son inspidos?
c) Cmo explica esta diferencia?
SOLUBILIDAD
EXPERIMENTO 3.
Determine la solubilidad a temperatura ambiente y en caliente (en bao
mara a ebullicin) de glucosa, sacarosa, almidn y celulosa en los siguientes solventes: agua, alcohol etlico y benceno.
Anote sus resultados en la siguiente tabla:
GLUCOSA
SACAROSA
ALMIDN
AGUA T.Amb.
ALCOHOL
BENCENO
Calor
T Amb
T Amb
CELULOSA
77
Calor
Calor
ESTRUCTURA CRISTALINA.
EXPERIMENTO 4
Examine al microscopio los siguientes glcidos: glucosa, sacarosa, almidn y celulosa y haga los esquemas correspondientes:
a) Cules de estos glcidos tienen estructura cristalina, por qu?
REACCIN DE MOLISCH-UDRANSKY.
Es una reaccin general para todos los glcidos, debido a que el cido
sulfrico concentrado que contiene el reactivo hidroliza y deshidrata a los
azcares obtenindose furfural o hidroximetilfurfural como producto final y
estas sustancias son capaces de reaccionar con el oc-naftol formando un
compuesto color violeta en la interfase.
Esta prueba es una de las mas sensibles, la dan positiva soluciones de
glucosa al 0.001 % y soluciones de sacarosa al 0.0001%. Sin embargo, la
reaccin no es especfica, ya que la dan positiva los aldehidos, las cetonas
y algunos cidos orgnicos tales como frmico, oxlico, lctico, ctrico, etc.
EXPERIMENTO 5.
Colocar en una gradilla 6 tubos de ensaye, poner en cada uno 3 mi. de
una de las siguientes soluciones:
78
Tubo No.
Solucin
1
2
3
4
5
formaldehdo
glucosa
fructosa
arabinosa
sacarosa
almidn
Clasificacin
Resultado
REACCIN DE FEHLING
La mayor parte de las pruebas para el anlisis cualitativo y cuantitativo
de azcares se basa en su propiedad reductora, aunque esta propiedad no
sea especfica de ellos.Se sabe que los azcares reductores son capaces
de reducir diversos iones metlicos como el cobre, bismuto, mercurio, plata, etc., cuando se encuentran stos en solucin alcalina.
Este tipo de reacciones son muy empleadas porque los reactivos son
estables, existe poca interferencia con otras sustancias, las reacciones son
sensibles y puede usarse la misma reaccin para un anlisis cualitativo o
cuantitativo.
EXPERIMENTO 6.
En 5 tubos de ensaye se colocan 2 mi. de la solucin A y 2 mi. de la
solucin B del reactivo de Fehling, y a cada tubo se le agregan 3 gotas de
los siguientes azcares:
Tubo No.
1
2
3
4
5
Solucin
glucosa
fructosa
arabinosa
sacarosa
Clasificacin
almidn
79
Resultado
80
REACCIN DE BARFOED.
El reactivo de Barfoed es una solucin de acetato cprico en cido actico, y, una vez ms, se determina la. capacidad de los azcares para reducir el n cprico a cuproso (Cu20).
Esta reaccin sirve para diferenciar un monosacrido de un disacrido,
ya que los primeros a los 3 minutos reducen el reactivo y los disacridos
necesitan mas tiempo para que se lleve a cabo la reaccin de reduccin,
mas o menos unos 15 minutos.
EXPERIMENTO 8.
Se colocan 4 tubos de ensaye y a cada uno se le agregan 3 mi. del
reactivo de Barfoed y 1 mi. de una de las siguientes soluciones de glucidos:
Tubo No.
1
2
3
4
Sustancia
Glucosa
Arabinosa
Lactosa
Clasificacin
Resultado
Maltosa
REACCIN DE BIAL
Esta reaccin sirve para diferenciar pentosas de hexosas, este reactivo
consiste en una solucin de orcinol en HCI concentrado con una pequesima cantidad de FeCI3. El fundamento de esta reaccin, igual que la reaccin de Molisch, la de Seliwanoff y otras, se basa en la produccin de furfural
o hidroximetil furfural cuando se calienta con cidos concentrados y la condensacin de stos con otras sustancias dando productos coloridos, en este
caso las pentosas dan color azul y las hexosas dan color amarillo o caf.
EXPERIMENTO 9.
En tubos de ensaye se colocan 3 mi. del reactivo de Bial. PRECAUCIN!.
Adale 0.2 mi. de las siguientes soluciones:
Tubo No.
1
2
3
Sustancia
Glucosa
Arabinosa
Clasificacin
Agua
81
Resultado
Caliente los tubos ligeramente sobre la flama del mechero, hasta que se
inicie la ebullicin, retire de la flama, diluya cada tubo con 10 mi. de agua y
agregue 2 mi. de butanol. Agite los tubos, deje reposar y haga su observacin.
a) Explique las diferencias observadas
REACCIN DE SELIWANOFF
Esta reaccin sirve para diferenciar aldosas de cetosas. Las cetosas
reaccionan rpidamente mientras que las aldosas lo hacen lentamente. El
reactivo es una solucin de resorcinol al 0.05% en HCI l:3 recin preparado. Este compuesto es el que se condensa con el furfural o sus derivados
dando productos coloridos.
EXPERIMENTO 10.
En 3 tubos de ensaye se coloca 1 mi. de los azcares que se mencionan abajo y agregue a cada tubo 0.5 mi. del reactivo y caliente en bao a
ebullicin exactamente 60 segundos. Anote sus resultados y contine calentando y observando el cambio de color a intervalos de 1 minuto durante
5 minutos.
Tubo No.
1
2
3
Sustancia
Glucosa
Fructosa
Clasificacin
Resultado
Agua
Las cetosas dan una coloracin rojo fuego y las aldosas la dan muy dbil
y muy lentamente.
a) Observ alguna diferencia en las soluciones?
b) Escriba la reaccin que se efecta:
FORMACIN DE OSAZONAS.
Esta reaccin es una de las de mayor utilidad para la identificacin de
azcares por ser especfica para cada azcar. La dan positiva tanto los
monosacridos como los disacridos reductores, sirviendo para identificarlos el tiempo que tardan en formar la osazona correspondiente, la forma
cristalina de ellas, la solubilidad en caliente o en fro y los puntos de fusin
82
EXPERIMENTO 11.
Se colocan en un tubo de ensaye 0.1 g. de un carbohidrato, 0.2 g. de
clorhidrato de fenilhidracina, 0.3 g. de acetato sdico anhidro y 2 mi. de agua,
se agita, se tapa el tubo con un tapn de papel procurando que no quede
muy cerrado, se coloca en bao mara a ebullicin, agite ocasionalmente,
observe el tiempo que tardan en aparecer los precipitados y si lo hacen en
fro o en caliente.
La glucosa, fructosa y galactosa precipitan en caliente, pero la maltosa
y la lactosa en fro por lo que despus de 20 minutos de calentamiento se
deben retirar del fuego.
a) Observe al microscopio los cristales de la osazona preparada por
usted y las preparadas por sus compaeros de grupo.
b) Haga un esquema de los cristales.
REACCIN DE LUGOL
El reactivo de lugol es una solucin de yodo en yoduro de potasio. Este
reactivo reacciona con algunos polisacridos como los almidones, glucgeno
y ciertas dextrinas formando un complejo de inclusin termolbil que se
caracteriza por ser colorido, dando color diferente segn las ramificaciones
que presenta la molcula.
EXPERIMENTO 12
En un tubo de ensaye se colocan 2 mi. de solucin de almidn, en otro
se colocan 2 mi. del glucgeno que obtuvo en el experimento 1, disolviendo
20 mg. en 2 mi. de agua calentando ligeramente, aada una gota de lugol y
anote el color producido en cada uno de los tubos. El tubo que contiene el
almidn se calienta a ebullicin y se deja enfriar nuevamente observando
lo que ocurre con la coloracin.
a) Por qu el complejo almidn-yodo es termo|bil?
b) Se puede considerar la reaccin del lugol caracterstica para cual
quier polisacrido?
83
84
INTERFASE
Se conoce como interfase a la superficie de contacto entre dos fases,
las molculas que forman la interfase son suficientemente diferentes de las
del seno o cuerpo de cada fase, de manera que forman una'"zona interfasial".
Existen varios tipos de interases dependiendo del estado fsico en que
se encuentran las dos fases adyacentes.
Cada partcula o conjunto de partculas de materia, sea una clula o un
organismo superior, posee una interfase en el lmite de sus alrededores,
por lo que los fenmenos interfasiales son tema de importancia evidente y
factor significativo en: penetracin de molculas a travs de membranas
biolgicas, dispersin de partculas insolubles en el medio extracelular,
adsorcin de frmacos, intercambio gaseoso, etc.
Por conveniencia estas combinaciones se pueden dividir en dos grupos:
las llamadas interfases lquidas (lquido-gas o bien lquido-lquido) y las
interfases slidas (slido-gas y slido-lquido).
INTERFASES LIQUIDAS
TENSIN SUPERFICIAL Y TENSIN INTERFASIAL.
En la superficie de contacto entre un lquido y un gas se han observado,
experimentalmente, fenmenos similares a los que se presentan donde
existe una membrana tensa. La explicacin de sto la tenemos suponiendo
que podemos ver las molculas del lquido y analizamos una que se encuentre en el seno del mismo; sta se halla interactuando con las dems
molculas que la rodean y el resultado es que no hay fuerza vectorial que la
desplace hacia ningn lado. En cambio, una molcula situada en la superficie, slo interacta con las que estn situadas a los lados y debajo de la
misma, arriba, las molculas de gas o vapor ejercen poca interaccin. El
resultado es que cada una de las molculas de la superficie sufre atracciones abajo y a los lados constituyendo una resistencia o tensin. Esta fuerza
se denomina tensin superficial, (T.S,).
Debido a esta tensin, que es una manifestacin de la energa de superficie, las gotas de un lquido o las burbujas de un gas tienden a contraerse y ocupar el menor espacio posible, la forma esfrica es la que tiene el
mnimo de superficie para un volumen dado.
85
PARTE EXPERIMENTAL
OBSERVACIN DE LA TENSIN SUPERFICIAL
EFECTO DE SUSTANCIAS TENSO ACTIVO NEGATIVAS.
EXPERIMENTO 1
a) Tome un vaso de precipitados de 250 mi. y llnelo con agua. En la
superficie de sta deposite, por una de sus caras, una navaja de afeitar lim
pia y seca. Observe primero la depresin que ocasiona sobre la superficie
del lquido y luego, con un estilete, trate de hundir la navaja.
Qu observa al tratar de hundir la navaja ?
b) Repita a continuacin el experimento slo que, antes de colocar la
navaja, disuelva en el agua 100 mg de detergente en polvo, procurando que
no se formen burbujas. Si se formaran, destruyalas con un pedazo de pa
pel filtro. Coloque entonces con suavidad la misma navaja limpia y seca.
Observe lo que ocurre.
c) Repita el experimento agregando previamente al agua solucin de
bilis al 1 %.
86
EXPERIMENTO 2
Sumerja en agua, un tubo de vidrio limpio y otro cubierto con parafina y
observe en cul se adhiere el lquido, es decir, cul se moja.
a) En qu tubo se eleva el agua en contra de la gravedad?
b) Existe alguna relacin entre adhesin y T.S.?
FUERZAS DE COHESIN
EXPERIMENTO 3
Coloque una gota de agua entre dos portaobjetos y trate de separarlos.
c) Qu observa?
Repita el experimento anterior utilizando una gota de los siguientes solventes: alcohol etlico, ter etlico, cloroformo y benceno.
d) Qu concluye de sus observaciones?
87
Como se refiri anteriormente, la tensin superficial es una de las propiedades fisicoqumicas que tiene coeficiente trmico negativo, es decir, que
al aumentar la temperatura, el valor de la tensin superficial disminuye.
Existen varios mtodos para conocer la tensin superficial como son:
del tensimetro, del capilar, del anillo de Du Nouy y el estalagmomtrico.
MTODO ESTALAGMOMTRICO
El mtodo estalagmomtrico ( medida de las gotas ) consiste en hacer
fluir un lquido por un tubo de dimetro estrecho. Algunos lquidos dan gotas muy pequeas que fluyen rpidamente, otros en cambio dan gotas grandes. La gota que aparece por el extremo del tubo (pipeta) se detiene por la
membrana tensa que resiste la accin de la gravedad . Si la gota aumenta
de tamao, llega un momento en que su peso vence a la tensin superficial, se rompe la membrana y la gota cae.
As, contando el nmero de gotas que hay en determinado volumen se
puede calcular su tensin superficial, comparando con un lquido de tensin superficial conocida, generalmente el agua (72.8 dinas/cm, a 20C),
segn la siguiente frmula:
donde:
T.S.H2o = Tensin superficial del agua. T.S
prob. = Tensin superficial del problema. V, y
D, = Volumen y densidad del agua. V2 y D2 =
Volumen y densidad del problema.
Para calcular el volumen de la gota, se divide el volumen total que se
utiliza entre el nmero de gotas, que se obtienen. Si se emplea 1 mi el volumen de la gota ser:
As tenemos:
EXPERIMENTO 4
Para medir la tensin superficial por este mtodo debe emplearse la
misma pipeta en todas las determinaciones, lavndola cuidadosamente al
terminar cela valoracin.
Mida exactamente 1 mi de las sustancias a determinar, en el orden indicado en la siguiente tabla, cuente el nmero de gotas que se forman al
vaciar la pipeta.
No desperdicie el solvente, vace las gotas al frasco !
TENSIN SUPERFICIAL
(dinas/ cm)
DENSIDAD g
errv3
LIQUIDO
Agua
Alcohol etlico (95)
ter etlico
Cloroformo
1.000
0.816
0.719
1.484
Benceno
0.878
ADSORCIN
Toda superficie contiene una cierta cantidad de energa que puede ser
fcilmente transformada en trabajo. Ese trabajo puede manifestarse cuando se concentran en las interfases iones o molculas en solucin, o sea,
cuando aparece el fenmeno de adsorcin. En este fenmeno intervienen
las fuerzas de cohesin intermoleculares, las valencias residuales y la carga elctrica.
La adsorcin tiene numerosas aplicaciones, tanto en la industria como
en los laboratorios de investigacin, siendo una de estas aplicaciones la
cromatografa en sus diversas formas como son: en papel, en capa fina,
de intercambio inico, de lquidos de alta resolucin etc.; tcnicas de gran
utilidad en mtodos de separacin, purificacin y anlisis cualitativo y
cuantitativo.
La adsorcin cromatogrfica permite la separacin de los componentes
de una mezcla, dependiendo del grado en que los solutos adsorbidos son
intercambiados entre la solucin original (fase mvil) y una segunda fase
slida o lquida (fase estacionaria). El grado de separacin depender de
las propiedades polares, afinidad, estricas (conformacin espacial), etc.
de los solutos en relacin al adsorbente.
La relacin entre cantidades de gas adsorbido por un slido y la presin
o concentracin, a temperatura constante se denomina isoterma de
adsorcin.
ADSORCIN EN IIMTERFASE SOLIDA.
La adsorcin de materiales slidos o gaseosos sobre la superficie de
slidos es semejante en muchos aspectos a la adsorcin en interfases l89
x/m = KC
donde:
90
EXPERIMENTO 5
Tome cuatro matraces Erlenmeyerde 125 mi y numrelos. En cada uno
de ellos deposite 0.5 gr de carbn activado en polvo. En seguida agregue a
cada matraz, solucin de cido oxlico.en las siguientes concentraciones:
matraz 1 solucin 0.05 N; matraz 2 solucin 0.2 N; matraz 3 solucin 0.4N
matraz 4 solucin 0.8 N; un volumen igual a 50 mi en cada matraz.
Agite fuertemente durante 3 minutos todos los matraces y luego djelos
en reposo por 10 minutos. A continuacin filtre.
Tome 10 mi de cada filtrado y adicione 2 gotas de solucin de fenoftalena.
Titule por separado cada alcuota con NaOH 0.2 N y anote la diferencia entre
la cantidad de NaOH 0.2N que debi gastarse y la que realmente gast.
Esta diferencia ser la cantidad de cido oxlico que qued adsorbida
al carbn.
Calcule la cantidad de cido oxlico adsorbido en miligramos en cada
caso. Utilizando la ecuacin de Frendlich, construya la grfica correspondiente colocando en las ordenadas los valores de x/m y en las abscisas los
valores de C.
a) Qu tipo de curva se obtiene?
b) Cules son los valores de K y n obtenidos en la grfica?
c) Qu caractersticas debe tener el adsorbente (carbn) utilizado en
este experimento?
91
ADSORCIN ELCTRICA
Se ha denominado as al fenmeno mediante el cual la acumulacin de
las sustancias en la superficie depende de su carga elctrica y no de la
energa de superficie. Este fenmeno se diferencia de la adsorcin propiamente dicha, en que es un fenmeno irreversible y en que no es afectado
por la temperatura. Se puede demostrar en el laboratorio estudiando el comportamiento de superficies de carga elctrica negativa, como el papel filtro,
frente a colorantes. Un colorante electropositivo, es adsorbido fuertemente
y no puede ser lavado.
En cambio, un colorante electronegativo, por tener la misma carga que
el papel no es fijado, se extiende en una mayor superficie y puede ser fcilmente separado por lavado con agua.
ADSORCIN DE COLORANTES
DETERMINACIN DE LA CARGA ELCTRICA
Los colorantes son sales disociables que se clasifican segn la carga
elctrica de sus iones cromforos. Los que tienen carga positiva se denominan colorantes bsicos y los que tienen carga negativa se denominan
colorantes cidos.
EXPERIMENTO 7.
Para determinar la carga elctrica de un colorante, utilice cuadros de
papel filtro de 3 x 3 cm y deposite en el centro una gota de colorante problema. Observe la extensin de la mancha y luego lvelos en un recipiente
con agua de la llave.
Para tener un patrn de comparacin, observe el comportamiento de
dos colorantes, uno positivo y otro negativo. Como colorante bsico (positivo) utilice solucin diluida de azul de metileno y como colorante cido (negativo) use fucsina acida.
a) Relacione el grado de extensin de la mancha y su comportamiento
al lavado, con la carga elctrica, en ambos colorantes. Tomando
como base este comportamiento, determine la carga elctrica de los
colorantes rojo neutro y safranina.
92
93
94
EXPERIMENTO 9
En un tubo de ensaye coloque 2 mi. de solucin de gelatina al 3% y aada
2 mi. de solucin de nitrato de plomo (Pb(NO3)2) 0.1 M. En otro tubo de
ensaye coloque 2 mi. de solucin de almidn al 3% y agregele 2 mi de la
misma solucin de Pb(NO3)2 0.1 M.
En un portaobjetos coloque una gota de cada una de las mezclas anteriores y una gota de solucin de Pb(NO3)2 0.1 M.
Deposite en el borde de cada una de las tres gotas anteriores, con ayuda de un gotero, una gota de solucin de dicromato de potasio (K2Cr207)
0.2M.
Observe la magnitud y velocidad de precipitacin en cada caso.
a) De las sustancias empleadas identifique los coloides lioflicos protectores y explique su accin sobre el dcromato de plomo obtenido.
EMULSIONES
Una emulsin es un sistema termodinmicamente inestable formado por
dos lquidos inmiscibles, uno de los cuales est disperso en forma de gotas
en el otro lquido. El tamao de las partculas dispersas puede o no corresponder al tamao de las micelas coloidales pero, generalmente, el estudio
de las emulsiones est asociado al de dichos sistema, puesto que la estabilidad de las emulsiones depende de la presencia de un agente emulsificante de naturaleza coloidal.
El que dos lquidos inmiscibles permanezcan mezclados se explica por
el hecho de que las fuerzas de cohesin entre las molculas de cada lquido individual o separado, son mayores que las fuerzas de adhesin entre
los dos lquidos.
Cuando un lquido es disgregado en pequeas gotitas, el rea interfasal
de los glbulos constituye una superficie enormemente mayor que la superficie original del lquido, por lo tanto la energa libre de superficie tambin se incrementa.
95
Tipos de emulsiones. Invariablemente uno de los lquidos que participan en la emulsin es de naturaleza polar (por ej. agua) y el otro es relativamente no polar (por ej. aceite). Cuando el aceite es dispersado en forma de
glbulos en una fase acuosa continua, el sistema es considerado como una
emulsin aceite en agua. Cuando la fase oleosa es la fase continua, la
emulsin es de agua en aceite. Muchas emulsiones de uso medicinal para
administracin oral son emulsiones del tipo aceite en agua que requiere de
un agente emulsificante como gelatina, goma de acacia, goma de tragacanto,
etc. Sin embargo, algunas emulsiones de consumo comn como la mantequilla y salsas para ensaladas son emulsiones del tipo de agua en aceite.
El tipo de emulsin depender de varios factores tales como concentracin
de cada fase, tipo de emulsificador, tensin superficial de cada lquido, etc.
Los agentes emulsificantes ms eficaces para todo sistema que contenga agua, son los que ms activamente disminuyen la tensin superficial
de ella.
Bancroft demostr que si se emulsiona aceite y agua en presencia de
un jabn de sodio, las emulsiones resultantes son de tipo aceite en agua,
pero cuando se emplean jabones de calcio, las emulsiones son de agua en
aceite. Esto se debe segn Bancroft, a que el jabn de sodio es ms soluble en agua y disminuye su tensin superficial en grado suficiente para
permitir emulsionar grasa.
Adems de los jabones de sodio, otras sustancias como monoacilglicridos, sales biliares, etc, favorecen la emulsin de grasa, y en estas condiciones, son ms fcilmente atacadas por las lipasas cuando se encuentran
en el intestino para ser hidrolizadas. As tambin las vacunas son ms efectivas en la produccin de anticuerpos cuando se encuentran emulsionadas,
ya que son englobadas mejor las partculas antignicas por los macrofagos
(primera fase en la formacin de anticuerpos).
96
97
LIPIDOS
Este grupo de compuestos esenciales para los organismos y que tambin se encuentran en los productos naturales, son un conjunto heterogneo
de molculas orgnicas de cuyas propiedades, lo que mejor las relaciona
entre s, es su insolubilidad en agua y solubilidad en solventes no polares
como el benceno, cloroformo, ter, etc. Por lo que este grupo incluye sustancias de muy diversa estructura. Suelen ser molculas de nmero relativamente alto de tomos de carbono e hidrgeno y bajo en tomos de oxgeno; ciertos lpidos tambin poseen tomos de fsforo, nitrgeno, y azufre
en su molcula.
Cualquier clasificacin presenta sus limitaciones y la nomenclatura puede
producir falsas interpretaciones ya que idntica terminologa ha sido empleada por diferentes autores para denominar a distintos grupos de lpidos.
De los lpidos ms recientemente estudiados son por ejemplo: prostaglandinas, tromboxanos, leucotrienos, etc, ya que este tipo de sustancias
hasta hace poco se consideraban muy complejas y de poco inters.
Las funciones de los lpidos son muy variadas y las ms aceptadas actualmente son las siguientes:
1. Funcin estructural, principalmente en las membranas celulares.
2. Actan como material de energtico y de reserva.
3. Intervienen en ei transporte de algunos compuestos energticamente
activos y, como precursores de otros.
, 4. Algunos lpidos actan como componentes protectores de la pared
celular de ciertas bacterias, plantas, insectos y vertebrados.
5. Dentro de los lpidos se encuentran sustancias de gran actividad bio
lgica como vitaminas y hormonas. Las cuales se consideran como
verdaderos reguladores metablicos.
6. La capa de tejido subcutneo, abundante en lpidos, sirve como aislante
trmico y como proteccin alrededor de determinados rganos.
PARTE EXPERIMENTAL
EXPERIMENTO 1.
Describa el estado fsico de los siguientes lpidos:
LIPIDO:
ESTADO FSICO:
Aceite de algodn.
Grasa de algodn.
Mantequilla
Acido esterico.
a) Cules son los cidos grasos ms abundantes en el aceite de
algodn?
b) En qu difieren el aceite y la grasa de algodn?
SOLUBILIDAD
Los grupos principales de los lpidos, tienen caractersticas de solubilidad
diferentes y esta propiedad se utiliza en la extraccin y purificacin de los
mismos a partir de materiales biolgicos.
EXPERIMENTO 2
Determinar la solubilidad en fro, a temperatura ambiente y en caliente
(en bao mara a ebullicin) de los lpidos utilizados en el experimento anterior con los solventes indicados:
SOLVENTE ->
AGUA
LIPIDO-i
Aceite de algodn
Mantequilla
Grasa de algodn
Acido esterico
ALCOHOL
CLOROFORMO
BENCENO
Las grasas y los aceites de los alimentos no son solubles en agua, por
lo tanto, para que puedan ser absorbidos tienen que ser hidrolizados o finamente emulsificados. Las sales biliares desempean una funcin muy importante ya que por ser tensoactivas negativas favorecen la formacin de
emulsiones.
MANCHA TRANSLCIDA.
Formacin de la mancha translcida en papel. Los lpidos, en general,
tienen la propiedad de manchar el papel dejando una mancha translcida
caracterstica y duradera.
100
EXPERIMENTO 5
Coloque una gota de aceite de algodn sobre un papel filtro, y observe
el tipo de mancha que se produce. Repita el experimento utilizando indistintamente cualquier compuesto no lpido, por ejemplo: agua, alcohol etlico,
ter, acetona, etc.
a) Explicar si observa alguna diferencia entre los compuestos no lpidos
y los lpidos.
b) Qu utilidad cree que pueda tener esta propiedad de ios lpidos?
101
IDENTIFICACIN DE ACILGLICEROLES
REACCIN DE LA ACROLEINA
Una de las reacciones ms usadas para la identificacin de acilglicridos,
es la formacin de la acrolefna o aldehido acrlico, el cual se puede obtener
por deshidratacin del glicerol o de cualquier glicrido y se reconoce fcilmente por su fuerte olor acre caracterstico.
EXPERIMENTO 8
Coloque en dos tubos de ensaye secos, un poco de bisulfato de potasio
y aada 3 o 5 gotas de glicerina en uno de los tubos y en el otro 5 gotas de
102
REACCIN DE HANUS
El grado de insaturacin de los cidos grasos que forman parte de un
lpido es uno de los factores determinantes en sus propiedades fsicas,
qumicas y fisiolgicas. Se ha observado que aparecen ms dobles enlaces en los triacilgliceroles de almacenamiento y en los lpidosestructurales
cuando la temperatura ambiente disminuye, los dobles enlaces disminuyen
el punto de fusin por lo que se cree que sea un mecanismo del organismo
para impedir la cristalizacin de los lpidos en los tejidos.
El reactivo de Hanus es una solucin de yodo y bromo que nos permite
determinar el grado de insaturacin de un lpido, midiendo la capacidad que
tiene para fijar halgenos en su molcula.
EXPERIMENTO 9
Coloque en 3 tubos de ensaye limpios y secos 6 mi. de soluciones clorofrmicas al 10%,de aceite de algodn, aceite de crtamo y monoestearilglicerol. Aada a cada tubo 5 gotas del reactivo de Hanus y agite vigorosamente. Anote cada 30 min. el grado de decoloracin de cada tubo protegindolos
de la luz.
a) Anote sus resultados en la siguiente tabla:
30 min.
60 min.
Aceite de Algodn
Aceite de Crtamo
Monoestearilglicerol
103
90 min.
120 min.
REACCIONES DE IDENTIFICACIN
DEL COLESTEROL
REACCIN DE SALKOWSKY
Cuando una solucin clorofrmica de colesterol se mezcla con H2SO4
conc, se produce una serie de colores caractersticos. Hasta la fecha se
desconoce el mecanismo de la reaccin y la naturaleza qumica del producto o de ios productos coloridos que se forman. Sin embargo es probable
que el color se deba a la formacin de dobles enlaces conjugados en el
ncleo del colesterol, o bien, a la conjugacin de dos molculas de colesterol,
para formar bi-esteroides.
EXPERIMENTO 10
Prepare una serie de 3 tubos de ensaye. Aada al tubo No. 1, 3 mi. de
cloroformo (servir como testigo); al tubo No. 2,3 mi. de solucin clorofrmica
de colesterol puro, y al tubo No. 3,3 mi. de extracto clorofrmico de colesterol
obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro (exp. 6). Agregue a cada
tubo 1 mi. de H2SO4 conc, resbalndolo lentamente por las paredes del tubo.
a) Observe y describa los cambios de coloracin que se producen
REACCIN DE LIEBERMANN-BURCHARDS
El anhdrido actico se puede condensar con los grupos -OH, en posicin 3 de esterles como el colesterol y dar los correspondientes esteres.
Si el esterol tiene un doble enlace en posicin 5, se produce adems una
epimerizacin y una deshidratacin en presencia de H2SO4 conc, dando
como resultado una serie de compuestos de estructura desconocida que
se caracterizan por tener colores que van del rojo al azul y del azul al verde.
Esta reaccin es especfica, por lo tanto, paro todos los esterles que tengan un grupo -OH en posicin 3 y un doble enlace en posicin 5.
EXPERIMENTO 11
Prepare 2 tubos de ensaye. En el tubo No. 1 coloque 3 mi. de solucin
clorofrmica de colesterol puro y en el tubo no. 2, 3 mi. de solucin
clorofrmica de colesterol obtenido en la extraccin de lpidos de cerebro
(exp. 6). Aada a los 2 tubos, 1 mi. de anhdrido actico y mezcle bien,
aada lentamente, resbalndolo por las paredes del tubo, 1 mi de H2SO4
concentrado.
a) Observe y describa los cambios de coloracin que se producen.
104
105
EXPERIMENTO 13
Preparar 4 tubos de ensaye como se indica en la siguiente tabla colocando las soluciones con mucho cuidado resbalando por las paredes del
tubo para estratificar.
Agua
Azul de metileno en butanol ms
monoesterato de glicerilo
Azul de metileno en butanol ms
fosfolpidos*
Azul de metileno en butanol ms
colesterol
Azul de metileno en butanol
5
2
* 2.0 m de! extracto clorofrm'ico obtenido en el experimento 6 se evapora a sequedad (cuidando que no se queme), el residuo se redisuelve
con 2.0 mi de azul de metileno en butanol y agregue este contenido al tubo
No. 2 de la serie.
Dejar los tubos en reposo procurando moverlos lo menos posible y hacer observaciones a las 2, 4 y 24 horas.
a) Observ el paso del colorante en todos los tubos?
b) Explique a qu se debe la diferencia.
106
DIGESTIN
Los seres vivos para subsistir requeren un suministro continuo de energa
libre, por tres razones principales;
1) Para la sntesis de molculas y macromleculas de importancia bio
lgica, a partir de compuestos ms simples.
2) Para mantener la distribucin inica y el transporte activo de iones y
molculas a travs de las menbranas de las clulas que las constituyen.
3) Para realizar trabajo mecnico, tal como el desarrollado en el movi
miento de los organismos unicelulares y la actividad muscular de los
animales superiores.
Esta energa la obtienen los seres vivos, invariablemente de oxidacin
o de combustin de los alimentos, que son generalmente compuestos qumicos procedentes de otros animales o de vegetales, tales como; protenas, lpidos y glcidos los cuales se caracterizan por ser de elevado peso
molecular y de estructura muy compleja; por lo que la mayor parte de ellos
no pueden ser absorbidos directamente. Para que puedan ser asimilados
por el organismo deben ser degradados a sus componentes ms sencillos
es decir: las protenas a aminocidos, los oligo y polisacridos a monosacridos y los lpidos a alcoholes y cidos grasos. Todo el conjunto de procesos hidrolticos y mecnicos que sufren los alimentos para que puedan ser
asimilados se denomina "Digestin" sta puede ser extra o intracelular. En
la mayor parte de los organismos inferiores la digestin es intracelular ,no
as en los organismos superiores en los que es extracelular y se realiza en
un tubo digestivo.
Todos los cambios qumicos que ocurren durante el proceso de digestin se efectan con ayuda de enzimas, las cuales se encuentran distribuidas en diferentes zonas del aparato digestivo. Uno de los factores que ms
afectan la actividad de las enzimas es el pH. Cada enzima presenta su
mxima actividad a un determinado valor de pH (pH ptimo), valores ms
cidos o ms alcalinos disminuyen notablemente la actividad de la enzima;
considerando que en el tubo digestivo existen zonas con pH muy diferentes, en esta prctica se efectuarn los diferentes experimentos necesarios
para confirmarlo.
107
PARTE EXPERIMENTAL
DETERMINACIN DE pH EN DIFERENTES REGIONES
DEL APARATO DIGESTIVO
EXPERIMENTO 1
Se utilizarn como animales de experimentacin conejos adultos, los
cuales se sacrificarn por descerebracin. Se abrir el abdomen y se expondr el aparato digestivo "in sit'. Con todo cuidado se har una incisin
en el esfago, en el estmago, en diferentes niveles del intestino delgado
(duodeno, yeyuno e leon), intestino grueso y recto. En caso necesario retire los restos de alimento presente en la regin de estudio. Con ayuda de
un gotero terminado en capilar se tomar una pequea cantidad del lquido
presente en cada zona y se depositar sobre un pedazo de papel pH, teniendo cuidado de lavar el gotero muy bien, antes de cada determinacin.
Se puede tambin hacer la determinacin introduciendo un pequeo pedazo de papel pH, con ayuda de unas pinzas en cada parte mencionada anteriormente, teniendo cuidado de no tocar lquidos de otras zonas.
a) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
CAVIDAD
pH
Boca
Esfago
Estmago
Intestino
delgado
duodeno
yeyuno
ileon
Intestino grueso
Recto
DIGESTIN EN LA BOCA.
La digestin en los organismos superiores, como el hombre, se inicia
en la boca con la masticacin de los alimentos transformndolos en una
papilla ntimamente mezclada con saliva. La saliva desempea una doble
funcin, por una parte el agua y las mucinas lubrican el bolo alimenticio, por
otra, las enzimas que contiene inician la digestin. Sin embargo, en condiciones normales, debido al poco tiempo que permanecen los alimentos en
108
109
BLANCO
PROBLEMA
0.1
1
0.1
Solucin amortiguadora
Colocar en bao mara
a37C15'
Reactivo desabollador
de color p/fosfatos
Deje en reposo 10'
reguladora PO4;pH=3.0
reguladora PO4;pH=7.0
reguladora PO4;pH=10.0
sustrato de almidn al 1%
dilucin de saliva s/ dializar (d)
dilucin de saliva dializada (d)
5
1
5
1
4
5
1
5
1
110
Reaccin de lugol
TUBO NO
Tiempo en
minutos
i
'j
3
6
9
12
15
18
DIGESTIN EN EL ESTOMAGO.
Una vez que el bolo alimenticio ha sido preparado, como ya se mencion en digestin en la boca, pasa al estmago a travs del esfago, al llegar
al estmago se mezcla con el jugo gstrico, esta mezcla se denomina quimo.
El estmago sirve como almacn de alimentos, acta como zona antisptica, bactericida y adems, desempea un papel importante en la digestin. En l se encuentra el jugo gstrico, el cual en un organismo normal es
secretado de 1 a 3 litros al da, aunque se reabsorbe una gran cantidad.
La enzima original del jugo gstrico es una proteasa, la pepsina, que es
secretada como una proenzima y para activarse sufre una protelisis parcial. Esto constituye un mecanismo de control de la actividad, tpico de las
enzimas digestivas y de las que participan en la coagulacin de la sangre.
Esta proteasa por encontrarse en el estmago trabaja a pH muy cido
(1 a 3), en contraste con la amilasa y fosfatasa salivales que lo hacen a pH
casi neutro.
111
Sustrato (leche)
Agua
Preincubacin a 40C por 5 min.
* Pepsina al 1 % en Buffer pH3
5
0.8
5
0.6
5
0.4
5
0.2
0.2
0.4
0.6
0.8
Incubacin a 40 C
* Despus de agregar la pepsina agite muy bien para que se redisuelvan
los pequeos grumos que se hayan formado ya que nos encontramos a un
pH por debajo del punto isoelctrico de la leche.
Con ayuda de un cronmetro, mida el tiempo desde el momento en que
se agreg la enzima al momento en que aparezcan grumos en la leche, lo
que nos indicar la accin de la pepsina.
Grafique la inversa del tiempo en las ordenadas contra la concentracin
de enzima en las abcisas e indique el orden de la reaccin
DIGESTIN INTESTINAL.
El tiempo que permanecen los alimentos en el estmago es variable,
pasando luego al intestino donde son sometidos a la accin de 3 secreciones digestivas: el jugo intestinal, el jugo pancretico y la bilis.
El jugo pancretico es un lquido transparente y viscoso de pH 7.5 a 8,
contiene una gran cantidad de enzimas entre las que se encuentran:el
tripsingeno que pasa a su forma activa, tripsina, por accin de la enteroquinasa del jugo intestinal; quimotripsingeno y precarboxilasa que pasan
a quimotripsina y carboxilasa por efecto de la tripsina; amilasa y lipasa
pancretica, sta ltima acta sobre las grasas siempre y cuando estas sean
previamente emulsionadas por la secrecin biliar. Existen adems exopeptidasas, ribonucleasas, desoxirribonucleasas, colagenasa y colesterolesterasas, que se complementan con las enzimas que contiene el jugo intestinal. Este ltimo adems de la enteroquinasa contiene carboxipolipeptidasas,
polipeptidasas, aminopolipeptidasas, dipeptidasas, sacarasa, maltasa,
nucleosidasas y lecitinasas, entre otras.
Para comprobar la digestin a nivel intestinal veremos nicamente
la pancreatina. Antiguamente se crey que era una sola enzima y ahora
112
se sabe que es una mezcla de enzimas, nosotros comprobaremos su actividad lipoltica y proteoltica.
Aceite vegetal
pancreatina 1%
Pancreatina 1%
Hervida
Bilis 6%
1
1.5
1
1.5
1.5
1
113
EXPERIMENTO 5
a) Coloque 150 mi de formol en un matraz Eriermeyer de 250 mi.
Aada 5 gotas de fenolftalena y titule con KOH 0.01 M hasta vire rosa.
Esta solucin se denominar formol neutro. En dos matraces Eriermeyer
de 125 mimi da exactamente 15 mi de esta solucin (matraz 1 y matraz
2).Coloque 100 mi de solucin de gelatina al 3% (disuelta en una solu
cin reguladora de carbonato sdico 0.1 M pH 7.5) en un matraz
Eriermeyer de 250 mi y ponga el matraz en un bao a temperatura
constante de 40C.
Una vez que la solucin alcance esta temperatura aada 10 mi de
solucin de pancreatina al 2%, mezcle, inmediatamente tome 2 muestras
de 10 mi y colquelas en los matraces con formol neutro que quedaron
listos en el inciso
(a), agregue 3 a 4 gotas de fenolftalena como indicador. Titule con
KOH 0.01 M y anote sus resultados.
b) Repita lo anterior cada 20 minutos tomando cada vez dos muestras
de 10 mi de la mezla y titulando con KOH 0.01 M.
c) Resuma sus resultados en la siguiente tabla:
TIEMPO
,
minutos
Promedi Promedio
KOH 0.01 M mi
o de 1 y2 menos
gastados
Matraz 1 Matraz 2
tiempo
cero
Enlaces
hidrolizados,
mM/100ml
0
20
40
60
80
e) Calcule el nmero de milimoles de enlaces peptdicos hidrolizados
en cada tiempo en la muestra total (mi gastados x 0.01 = mmoles para los
10 mi x 10 = mmoles/100 mi) de gelatina.
114
METABOLISMO
Para que exista un funcionamiento armnico del organismo, es necesario que subsista buena interrelacin y coordinacin metablica entre los
diferentes rganos y tejidos.
En la prctica mdica diaria, se puede apreciar la importancia del conocimiento de los factores que participan en las interrelaciones metablicas, que
por lo general se reflejan en la composicin de los lquidos corporales, como
la sangre y la orina que a travs de los cambios en su composicin orientan
a un diagnstico oportuno para un tratamiento efectivo de la enfermedad.
Uno de los rganos que juega un papel primordial en el metabolismo es
el hgado; por lo que ser el rgano a utilizar en nuestra prctica.
METABOLISMO HEPTICO
Como ya mencionamos el hgado es uno de los rganos que juega un
papel importante en el metabolismo y es interesante recalcar que se encuentra en una posicin estratgica, donde recibe todos los nutrientes,
adems esta misma ubicacin entre las circulaciones portal y general, no
slo permite que absorba, transforme y almacene los nutrientes resultantes de la digestin, sino que tambin protege al resto del cuerpo de los
metabolitos txicos producidos en los intestinos, como el amoniaco (NH3) o
presentes en la dieta, al convertirlos en sustancias no txicas antes de que
entren a la circulacin general.
Entre algunas de la funciones del hgado podemos encontrar las siguientes:
a) metablicas
b) de destoxificacin y protectora
c) excretora
d) de almacenamiento
e) circulatorias
Al observar esta lista de funciones del hgado nos damos idea de la gran
cantidad de enzimas que contiene, algunas de las cuales son, en cierto
modo, especficas de este tejido. Por lo que un incremento o disminucin
de sus niveles en el plasma constituye una evidencia de dao en las clulas hepticas.
115
Las enzimas que ms se consideran para este fin son las transaminasas:
transaminasa glutmica oxalactica (TGO) y transaminasa glutmica
pirvica (TGP) aunque existen algunas otras.
Nosotros estudiaremos una de las enzimas que se usan para la
desintoxicacin, la arginasa. Ya que a lo largo de nuestro curso hemos empleado el hgado como base para observar algunas otras funciones de l como
la obtencin de glucgeno heptico, reacciones de oxidoreduccin biolgicas, localizacin de citocromo-oxidasa y de la deshidrogenasa succnica.
PARTE EXPERIMENTAL
DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE ARGINASA
Todos los organismos requieren como alimento sustancias nitrogenadas, generalmente aminocidos, ya sea para la biosntesis de protenas o
para la sntesis de otras sustancias nitrogenadas no protenicas, indispensables en la regulacin del metabolismo como algunas hormonas. Una parte
de estos compuestos nitrogenados se metabolizan con objeto de utilizar la
energa potencial que contienen y, en esta degradacin se elimina el nitrgeno, el cual puede excretarse en diferentes formas.
En forma de amoniaco (NH3) por los animales que viven en el agua
(amoniotlicos), en forma de cido rico por aves, reptiles etc. (urcotlicos).
La mayor parte d los animales terrestres eliminamos el nitrgeno en forma
de urea, compuesto muy soluble y poco txico, estos animales se denominan ureotlicos.
La urea se descubri en la orina desde el ao de 1773 por Robelle, en
un principio l crey que se formaba por la unin directa del bixido de carbono (CO2) y del amoniaco, segn la siguiente reaccin:
116
Enzimas:
1. Carbamilfosfato sintetasa
2. Ornitina transcarbamilasa
3. Argininosuccnico sintetasa
4. Argininosuccnico sintetasa
5. Arginasa
Determinacin de arginasa
EXPERIMENTO 1.
a) Preparacin del homogeneizado de hgado de ratn.
Se utilizar para este propsito un ratn blanco adulto, el cual se sacrificar por descerebracin, se le extrae el hgado y se pesa lo ms rpido
posible, se aade la cantidad de agua helada necesaria para que la solucin quede al 2%. Se homogeneiza y se centrifuga a 2000 rpm, por 20 minutos. El sobrenadante se utilizar como fuente de enzimas. El residuo se
deshecha. Dicha fuente de enzimas deber conservarse en hielo hasta el
momento de usarse.
b) Preparacin de la serie enzimtica.
117
MnCI20.01M
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
Sol. reg.
glicina 0.1 M
pH9.5
0.25
0.25
0.25
0.25
0.25
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.2
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
5'
10'
*&'
20'
25'
Agua
5.5
5.5
5.5
5.5
5.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.5
0.4
0.4
0.4
0.4
0.4
Mezcla acida
Isonitroso propiof
enona 1 %
118
d) Trace una grfica que relacione la actividad de la enzima contra tiempo de incubacin.
119
120
Blanco
0.5
0.5
02
0.5
0.5
0.2
5.0
5.0
Agua destilada
Piruvato de sodio 2mM
(patrn)
Sustrato para TGO (Aspartato
+ ct-cetoglutarato
0.2
-
0.2
0.05
0.2
0.1
0.2
0.2
0.2
0.3
1.0
0.95
0.9
0.8
0.7
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
11
22
55
95
Mezclar bien todos los tubos y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente. Despus de este tiempo agregar 5 mi. de NaOH 0.4N.
Mezclar, dejar en reposo por 5 minutos. Medir la absorbancia a 505 nm con
filtro verde. Trazar una grfica en papel milimtrico con la lectura de densidad ptica (D.O.) contra las unidades internacionales anotadas en la tabla
anterior.
121
Determinacin de TGP
La transaminasa glutmico pirvica es similar a la TGO y es determinada por los mismos mtodos excepto que el sustrato contiene L-alanina en
vez de cido asprtico y el producto intermedio es cido pirvico en lugar
de cido oxalactico.
EXPERIMENTO 3.
a) Determinacin cuantitativa de TGP
El procedimiento es el mismo que para TGO excepto que se usa el
sustrato para TGP y que el tiempo de incubacin es de 30 minutos, en lugar
de una hora.
Prepare dos tubos de ensaye, siguiendo las mismas indicaciones que
en el experimento anterior, cambiando los reactivos, en esta ocasin para
TGP y modificando el tiempo de incubacin.
b) Preparacin de la curva tipo.
1
Agua destilada
Piruvato de sodio 2mM
(solucin patrn)
Sustrato para TGP
(alanina + a-cetoglutarato)(BIOXON)
Reactivo desabollador
de color (2,4dinitrofenilhi-dracina).
0.2
_
0.2
0.05
0.2
0.1
0.2
0.2
0.2
0.3
1.0
0.95
0.9
0.8
0.7
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
12.5
25
50
85
122
Mezclar bien todos los tubos y dejar en reposo por 20 minutos a temperatura ambiente. Despus de este tiempo agregar 5 mi de NaOH 0.4N. Mezclar, dejar en reposo por 5 minutos. Medir la absorbancia a 505 nm con
filtro verde. Trazar una grfica en papel milimtrico con las lecturas de densidad ptica (D.O.) contra Ul/ml anotadas en la tabla anterior.
Los resultados de la lectura del blanco y el problema se interpolan en la
curva tipo para TGP.
123
125