METODOS CUALITATIVOS PARA LA IDENTIFICACION DE

AMINOACIDOS Y PROTEINAS
PREINFORME PRACTICA N 1

PRESENTADO POR:
GLORIA KATHERIN PERDOMO TORRES

LABORATOTIO DE:
BIOQUIMICA

GRUPO DE LABORATORIO:
1

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA.

21 DE MARZO DE 2013 BOGOTA D.C

OBJETIVOS.

Aprender todo acerca de estos temas pues son muy interesantes.

Aprender a identificar los aminocidos
Aprender a identificar las protenas.

MARCO TEORICO.

AMINOACIDOS.
Un aminocido es una molcula orgnica con un grupo amino (-NH2) y un
grupo carboxilo (-COOH). Los aminocidos ms frecuentes y de mayor inters son
aquellos que forman parte de lasprotenas. Dos aminocidos se combinan en una
reaccin de condensacin entre el grupo amino de uno y el carboxilo del otro,
liberndose una molcula de agua y formando un enlace amida que se
denomina enlace peptdico; estos dos "residuos" de aminocido forman
un dipptido. Si se une un tercer aminocido se forma un tripptido y as,
sucesivamente, hasta formar unpolipptido. Esta reaccin tiene lugar de manera
natural dentro de las clulas, en los ribosomas.
Todos los aminocidos componentes de las protenas son L-alfa-aminocidos.
Esto significa que el grupo amino est unido al carbono contiguo al grupo
carboxilo (carbono alfa) o, dicho de otro modo, que tanto el carboxilo como el
amino estn unidos al mismo carbono; adems, a este carbono alfa se unen
un hidrgeno y una cadena (habitualmente denominada cadena lateral o radical R)
de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de cada uno
de los diferentes aminocidos. Existen cientos de radicales por lo que se conocen
cientos de aminocidos diferentes, pero slo 20 (actualmente se consideran 22,
los ltimos fueron descubiertos en el ao 2002) forman parte de las protenas y
tienen codones especficos en el cdigo gentico.
La unin de varios aminocidos da lugar a cadenas llamadas pptidos o
polipptidos, que se denominan protenas cuando la cadena polipeptdica supera
una cierta longitud (entre 50 y 100 residuos aminocidos, dependiendo de los
autores) o la masa molecular total supera las 5000 uma y, especialmente, cuando
tienen una estructura tridimensional estable definida.

CLASIFICACION DE AMINOACIDOS.
La clasificacion de los aminoacidos proteinicos se puede hacer teniendo en
cuenta la relacion de grupos COO-/NH3 +, o considerando criterios que tienen
que ver con su polaridad, presencia o no de cargas positivas o negativas; todo
lo cual, en ltimo trmino, depende de la naturaleza de su cadena lateral (o
grupo R).

AMINOACIDOS NO POLARES:

Los aminocidos apolares neutros o neutros no polares contienen principalmente

grupos R formados por cadenas hidrocarbonadas que no llevan carga ni positiva ni
negativa. Son hidrfobosdebido a su poca interaccin con el agua, y gracias a esto
participan de manera importante en la estructura tridimensional de las protenas.
En este grupo se encuentran dos tipos de cadenas R hidrocarbonatadas:
Aromticos: contienen estructuras cclicas que constituyen una clase de
hidrocarburos insaturados con propiedades nicas. Dentro de estos
podemos encontrar la fenilalanina y el triptfano.
Alifticos: hidrocarburos lineales. En estos se encuentra la glicina,
la alanina, la valina, la leucina, isoleucina y la prolina.

AMINOACIDOS POLARES NO CARGADOS:

Estos aminocidos son relativamente ms solubles en el agua que los

aminocidos anteriores. Sus grupos R contienen grupos funcionales polares,
neutros que pueden establecer enlaces de hidrgeno con el agua. La polaridad de
la serina, la treonina y la tirosina se debe a sus grupos hidroxilos; la de la
aspargina y la glutamina, a sus grupos amdicos y de la cistina a la presencia del
grupo sulfhidrilo (-SH). La glicola, a veces se clasifica como una aminocido no
polar. La cistina y la tirosina poseen las funciones mas polares de esta clase de
aminocidos, sus grupos tilo e hidroxilo fenlico tienden aperder mucho ms
fcilmente protones por ionizacin que los grupos R de otros aminocidos de esta
clase.

Aminocidos cidos:

Se caracterizan porque su grupo R -(COOH) est cargado negativamente a Ph

fisiolgico. Los aminocidos con sus respectivos pK a son:
Aminocido
Aspartico
Glutamico

Abreviatura
Asp
Glu

pKa
3,9
4,2

Aminoacidos bsicos:

En ellos, el grupo R (generalmente NH) esta cargado positivamente a pH

fisiologico. A este grupo pertenece:
Aminocido
Histidina
Lisina
Arginina

Abreviatura
His
Lys
Arg

pKa
6,0
10,5
12,5

 ENLACE PEPTIDICO.
El enlace peptidico se forma por la condensacion del -COOH de un aminocido
con el -NH2 de otro aminoacido:

El enlace peptdico posee especiales caractersticas: Es polar, plano y est

estabilizado por resonancia. Es un hibrido de resonancia; el enlace C-N del enlace
peptdico tiene un carcter parcial de doble enlace, por esta razn no hay libertad
de movimiento. El doble enlace entre el carbono y el oxgeno del grupo carbonilo,
busca la estabilidad electrnica de la molcula.
Se ha mencionado que el carcter parcial de doble enlace no hay libertad de
movimiento, .Pero de quin? La presencia de un doble enlace parcial ocasiona la
presencia de ismeros geomtricos de la forma trans en el oxgeno del grupo
carbonilo y el hidrogeno del grupo amino participantes en el enlace peptdico. La
presencia del doble enlace parcial del enlace peptdico ocasiona que no haya
libertad de movimiento entre el enlace C N, sino que el movimiento se d a nivel
de N- C con un ngulo de torsin o (phi) y entre C-C con un ngulo de torsin
(psi). En la grfica siguiente se evidencia lo expuesto.
NIVELES DE ESTRUCTURACION.
Se considera que cuando un pptido sobrepasa los 40-50 aminocidos tenemos
una cadena polipeptdica que llamamos protena. Estos polmeros poseen un
considerable grado de complejidad que se expresa en todas las protenas en por
lo menos tres niveles de estructura y en algunas hasta cuatro.
ESTRUCTURA PRIMARIA.
Establecer la secuencia es mas complejo; la estrategia que se utiliza consiste en
romper la proteina por medios quimicos o enzimaticos, en un numero no muy
grande de peptidos, separar por diversos metodos (cromatografia, intercambio
ionico, solubilidad, etc). Los peptidos resultantes a cada uno determinarles su
secuencia en la forma ya discutida. Utilizando las combinaciones apropiadas de

agentes de clivaje, se pueden ensamblar como en un rompecabezas los peptidos,

y obtener la secuencia de la proteina.
La primera proteina a la que se le determino su estructura primaria fue la insulina,
hormona originada en el pancreas como proinsulina, que tiene por funcin
disminuir el nivel de glucosa en la sangre y cuya carencia tiene multiples
complicaciones incluyendo la diabetes. Esta proteina tiene dos cadenas
polipeptidicas (A y B) unidas por dos puentes de hidrogeno disulfuro
intermoleculares formados por la oxidacion de cuatro cisteinas.
ESTRUCTURA SECUNDRIA.
En una o varias cadenas polipeptidicas se presentan uniones por puentes de
hidrogeno en las que solo intervienen los grupos C=O y N-H que forman el enlace
peptidico. Todas las configuraciones existentes o propuestas deben satisfacer las
caracteristicas estructurales que ya discutimos para este tipo de enlaces; la
configuracion mas sencilla es la de cadena extendida
En las proteinas fibrosas que tienen un papel estructural, este problema se
resuelve mediante la adopcion de uno de los siguientes tipos de estructura:
Grupo l: Estructura en hoja plegada.
Grupo II: Estructura en -helice.
Grupo III: Estructura en triple helice.

El grupo l se caracteriza por tener una unidad de repeticion de 6.5 a 7.0 A,

con formacion de puentes de hidrogeno intermoleculares entre al menos
dos cadenas o segmentos de cadena que pueden ser, paralelas.

El grupo II posee una unidad de repeticion de 5.1 a 5.4 A, y los puentes de

hidrogeno son exclusivamente intramoleculares, el ordenamiento espacial
de las cadenas polipeptidicas resultante de las interacciones por puentes de
hidrogeno formados unicamente entre los atomos de hidrogeno del
nitrogeno y el oxigeno del carbono carbonilico que conforman el enlace
peptidico.

El grupo III posee una unidad de repeticion de 2.8 A, y los puentes de

hidrogenose forman entre tres cadenas polipeptidicas que se enrollan entre
si, de manera helicoidal. El mejor ejemplo de este tipo de estructura es el
colageno, proteina que constituye un 30% de las proteinas del cuerpo
humano y est presente en tejido conjuntivo, piel, huesos, tendones.

ESTRUCTURA TERCIARIA.
En estas proteinas y como consecuencia de sus estructuras primaria y secundaria,
se presentan simultaneamente varias clases de interacciones que determinan su
conformacin.

 Puentes de hidrogeno intermoleculares o intermoleculares, cuando la

protena tiene ms de una cadena polipeptidica, que se forman entre
cadenas laterales, o entre cadenas laterales y atomos del enlace peptdico
Enlaces salinos o ionicos que resultan de la atraccion electrostatica entre
grupos R con cargas opuestas.
Uniones hidrofobicas provenientes de las interacciones entre cadenas
laterales de AA no polares, que tienden a asociarse entre si excluyendo el
agua.
Enlaces covalentes entre grupos R de CySH (enlaces disulfuro), Lys y Glu o
Asp (enlaces amida)
Estos enlaces en conjunto mantienen la estructura terciaria que fundamentalmente
est determinada por su composicin y secuencia de aminocidos.
ESTRUCTURA CUATERNARIA.
Algunas proteinas y con mucha frecuencia aquellas con peso molecular (PM)
superiores a 100000 estan formadas por la asociacion reversible de dos o mas
cadenas polipeptidicas que no estan unidas entre si por enlaces covalentes y
pueden ser separadas y estudiadas individualmente.
Esta dada por la asociacion reversible de varias cadenas polipeptidicas
(monomeros) iguales o diferentes. Este tipo de estructura solo la poseen algunas
proteinas. Debido a la importancia que revisten estos niveles de organizacion para
la comprension del funcionamiento y propiedades de las proteinas, las
discutiremos con algun detalle a continuacion.
SOLUBILIDAD DE PROTEINAS.

La solubilidad de una proteina es sensible a la concentracion de sal. la

concentracion de sal se expresa en terminos de fuerza ionica (I= Sc i Zi2). La
solubilidad de una proteina a baja fuerza ionica generalmente aumenta con la
concentracion de sal. El salting in es el fenomeno por el cual la concentracion
de sal aumenta la solubilidad de la proteina. A altas fuerzas ionicas, la
solubilidad de la proteinas disminuye, este fenomeno es conocido como
salting out. Este fenomeno se da basicamente por la competencia por las
moleculas de agua que forman parte de la capa de solvatacion
Solventes Orgnicos:

El uso de solventes organicos miscibles con el agua, tales como acetona y etanol,
actuan como buenos precipitantes de de proteinas, ya que tienen menor poder de
disolver estas proteinas, normalmente se utilizan abajas temperaturas (0C), ya
que a temperauras mayores la proteinas tienden a denaturarse. uso tambien
magnifica la conducta de la proteinas en la tecnica del salting out
Efectos De pH

Las proteinas generalmente tiene muchos grupos ionizables, los que tienen una
variedad de pK. Cada proteina tiene un pH caracteristico al cual las cargas
posivitivas se encuentran en igual cantidad a las cargas negativas, a este pH se
conoce como punto isoelectrico, pI, el cual puede ser conocido atraves del
isoelectroenfoque. En el pI las proteinas tienen una solubilidad minima y son
insensibles al salting in. La solubilidad se incrementa cuando el pH se aleja del pI.
Cristalizacin

Cuando la proteina se encuentra en un razonable estado de pureza, esta puede ser

cristalizada. esto se hace levando la solucion a una saturacion de la proteina punto
en el cual se utilizan los metodos de precipitacion ya mencionados.
Reaccion de la Ninhidrina
La ninhidrina (hidrato de triceohidrindeno), un agente oxidante poderoso,
reacciona con todos los aminoacidos a un pH entre 4- 8 para dar un compuesto de
color purpura. Esta reaccion se efectua con aminas primarias y amoniaco pero sin
desprendimiento de CO2.
La reaccion es muy sensible y es ideal para la deteccion de aminoacidos en
cromatografias y su determinacion cuantitativa en fracciones de columnas .
Reaccion Xantoproteica
Los aminoacidos que contienen un nucleo aromatico (triptofano y Fenilalanina),
forman nitroderivados de color amarillo cuando se calientan con acido nitrico
concentrado. Las sales de estos derivados son de color naranja.
Reaccion de Millon

Los compuestos que contienen el radical hidroxibenceno (la tirosina) reaccionan

con el reactivo de millon formado compuestos rojos. Los unicos aminoacidos
fenolicos son la tirosina y sus derivados y solamente ellos dan una reaccion
positiva.
Reaccion de acido glioxilico.
El grupo indolico del triptofano reacciona con el acido glioxilico en presencia del
acido sulfurico concentrado dando un color purpura. El acido acetico glacial que ha
sido expuesto a la luz contiene acido glioxilico.
Prueba de Pauly.
El acido sulfanilico diazotizado se une con las aminas de la arginina y la lisina,
fenoles como el de la tirosina e imidazoles como la Histidina para dar compuestos
azo fuertemente coloreados.
Prueba de nitroprusiato.
Los grupos tioles reaccionan con nitroprusiato de sodio ( Na2Fe(CN)5NO) en
presencia de un exceso de amoniaco para dar un color rojo.
Reaccion de Sakaguchi.
El nico aminocido que contiene grupos guanidinios es la arginina; esta
reacciona con alfa-naftol y un agente oxidante tal como el agua de bromo dando
un color rojo.

prueba de Biuret para enlaces peptdicos.

El sulfato alcalino de cobre reacciona con compuestos que contienen dos o ms
enlaces peptdicos dando un complejo de coloracin violeta. La intensidad del
color obtenido es una medida del nmero de enlaces peptdicos presentes en la
protena.

MATERIALES.
Material de vidrio
Tubos de ensayo
Gradillas
Esptulas
Pipetas 1, 5 y 10
ml
Mallas de asbesto
Papel filtro
Embudos
Agitador de vidrio
Erlenmeyers 100
y 250 ml
Vasos de
precipitado 250 ml
Vasos precipitado
500 ml
Probeta 100 ml
Pinzas para tubos
en madera
Vidrios reloj
grandes
Mortero con
mango
Soporte para
embudos
Pinzas para tubos
de ensayo
metlicas
Vasos de

Material de vidrio
Reactivos
Alimento de origen
Reactivo de milln
Agua destilada,
vegetal o animal:
Solucin de
concentrados,
CuSO4 1%
protena crnica,

Solucin NaOH
hgado, huevo, etc.
Tapabocas
30% y 40%,
Libros de
Solucin saturada
bioqumica
de NaCl
Marcador de vidrio
HNO3
Cinta para rotular
concentrado,
Cuaderno de
Cristales de
laboratorio
sacarosa
Bata blanca
HCl concentrado,
Marcador para
Acido triclorcetico
vidrio
10%
Solucin cido
pcrico saturada,
Etanol 95%
Solucin de
(NH4SO4) al 50%,
acetona
Solucin de
acetato de plomo
0.5 %
Reactivo de
sakaguchi, cido
actico glacial
HSO4

precipitado de
1000 ml plstico
Vasos de
precipitado de 600
plstico

DIGRAMA DE FLUJO:
Obtencin de los Extractos:

concentrado,
Acido actico al
30%
Aminocidos:
glicina, tirosina,
triptfano,
aminocidos
azufrados, leucina
Ninhidrina ( 2g/l)
preprese en
fresco, Hidrxido
de amonio.
cido sulfanilico
(10g/l en solucin
de HCl 1 mol/l).
Nitrito de sodio,
Carbonato de
sodio
Acetato de plomo,
Nitrato de
mercurio.
Nitroprusiato de
sodio (20 g/l,
preprese fresco).
Alfa- naftol, Agua
de bromo
cido fosfrico,
Molibdato de sodio
Tungsteno de
sodio, Sulfato de
cobre, Nitrato de
sodio

n
E
c

:H
3
p
s
ilo
v
e
d
a
g

q
x
t
r
u
0
1
h
,j
L
y
b
C
)
(
A
.R
fi
m
D

FRACCIONAMIENTO DE PROTENAS EN SEMILLAS DE

LEGUMINOSAS Y CEREALES POR SOLUBILIDAD
PREINFORME PRACTICA N 2

PRESENTADO POR:
GLORIA KATHERIN PERDOMO TORRES

LABORATOTIO DE:
BIOQUIMICA

GRUPO DE LABORATORIO:
1

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA.

21 DE MARZO DE 2013 BOGOTA D.C
OBJETIVOOS.
Realizar la extraccin fraccionada de los componentes protenicos de las
semillas de leguminosas y cereales, utilizando para ello la diferencia de
solubilidades de los diferentes tipos de protenas.

Cuantificar cada una de las fracciones obtenidas utilizando el mtodo de

Biuret.

SOLUBILIDAD Y PRESIPITACION DE LAS PROTEINAS.

La solubilidad de una buena cantidad de protenas es funcin de la fuerza lnica,
el pH y la concentracin de solventes orgnicos. A bajas concentraciones salinas
del solvente, las protenas (como electrolitos multivalentes que son)se comportan
de manera muy similar a los iones simples, es decir cumplen la teora de DebyeHuckel,o sea en esta regin de concentraciones de sal, el aumento de
sta estabiliza los grupos cargados sobre la protena y por lo tanto
aumenta su solubilidad (solubilizacin por salado: saltlng-In). El
fenmeno contrario
(precipitacin
por salado: saltlng-out)
que
se observa a altas fuerzas inicas, es probablemente el resultado de la
competencia entre la protena y los iones de la al por las molculas de agua del
medio para solvatarse
Esto quiere decir que a concentraciones de sal suficientemente altas, la
concentracin efectiva de las molculas de agua (solvente) disminuye y son
insuficientes para la solvatacin total de la protena, por lo tanto la interaccin
protena-protena predomina sobre la interaccin protena-agua y ocurre
la precipitacin. En esta regin la solubilidad de la protena est a
menudo relacionada en una forma logartmica con la fuerza lnica y se rige
por la ecuacin:
log S = - K
donde:

S = Solubilidad
= log. de la solubilidad hipottica a fuerza lnica (ji) igual a cero.
Ks= Constante de precipitacin por salado, que varia considerablemente con la
naturaleza de la sal y muy poco con la naturaleza de la protena.
La solubilidad de la mayora de las protenas a una fuerza inica constante,
presenta un mnimo cerca del punto isoelctrico. A este pH, las repulsiones
electrostticas intermoleculares entre las molculas de soluto estn en su mnimo,
lo mismo que las interacciones electrostticas entre los grupos polares cargados y
el agua, por lo tanto las protenas precipitan ms fcilmente.
La mayora de los solventes
orgnicos son
buenos
p r e c i p i t a n t e s p u e s e n g e n e r a l t i e n e n b a j a constante dielctrica.
El dimetilsulfxido y la formamida, con constantes dielctricas
relativamente altas, son buenos solventes
CLASIFICACIN DE OSBORNE DE LAS PROTENAS, POR EL CRITERIO DE
SOLUBILIDAD
La clasificacin comnmente usada no se basa en aspectos estructurales de stas
sino principalmente en su solubilidad frente a diferentes solventes.
Desafortunadamente entre los grupos clasificados no existe un lmite
fijo, pero de todas maneras permite el fraccionamiento de las protenas
provenientes de una misma fuente. Segn Osborne, las protenas vegetales
pueden clasificarse segn su so lubilidad en: albminas, globulinas y glutelinas.
Las albminas corresponden al grupo de protenas que son
s o l u b l e s e n a g u a d e s t i l a d a y e n soluciones salinas diluidas.
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua
destilada pero son solubles en soluciones salinas diluidas. Con base en las
propiedades de solubilidad no es posible distinguir entre albminas y
seudoglobulina s.
Si se aplican los conceptos de precipitacin por salado, se observa
que las globulinas precipitan en s o l u c i o n e s d e s u l f a t o d e a m o n i o d e l
50% de saturacin, mientras que las albminas lo hacen a
concentraciones mayores del 75% de saturacin. Estas precipitaciones
son mejores si se hacen a pHs cercanos a sus puntos isoelctricos.
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en soluciones acuosas
de alcoholes de bajo peso molecular, en concentraciones entre el 50 y el 90%.
Las glutelinas son insolubles en los solventes anteriores pero se solubilizan en
soluciones diluidas de cido o bases.

Estos dos ltimos grupos solo se encuentran en mate riales vegetales, mientras
que las protenas animales estn constituidas bsicamente por albmin as y
globulinas.
MTODO BIURET
La reaccin de Biuret es una medida del nmero de enlaces peptdicos
presentes. Los compuestos que contienen dos o ms enlaces peptdicos entre
el los pptidos y protenas dan un color rosado o lila caracterstico cuando se
tratan con sulfato de cobre diluido en solucin alcalina. El color se debe al
complejo de coordinacin que se forma entre el tomo de cobre y cuatro tomos
de nitrgeno provenientes de enlaces peptdicos (dos de cada pptido)
METODO DE FOLIN LOWRY PARA DETERMINACION DE PROTEINAS
Las protenas reaccionan con el reactivo de Folin para dar un complejo colorado.
El color que se forma es debido a la reaccin del cobre alcalino con la protena, tal
como sucede en el ensayo de biuret y la reduccin de fosfomolibdato por la
tirosina y el triptfano presentes en la protena. La intensidad del color depende
del nmero de aminocidos aromticos presentes y cambiaran segn la clase de
protena.
MATERIAL DE VIDRIO
MATERIAL BIOLGICO
REACTIVOS
Y OTROS
(ESTUDIANTES)
Tubos de ensayo
Harinas
de
Reactivo de folin
Gradillas
Solucin de sulfato
diferentes cereales
Esptulas
de cobre tartrato
y
leguminosas:
Pipetas 1, 5 y 10
sdico de potasio (
soya, arveja, trigo
ml
5g/l
de
y frijol.
Balones aforados
Tapabocas
CuSO4.5H2O en
de 25 ml
Libros
de
tartrato
sdico
Vasos
de
bioqumica
potsico 10 g/l).
precipitado
de
Marcador de vidrio
Carbonato
de
Cinta para rotular
1000 ml plstico
sodio en NaOH 0.1
Vasos
de
Cuaderno
de
mol/l.
precipitado de 600
laboratorio
NaCI al 1%,
Bata blanca
plstico
Etanol al 75%,
Agitador de vidrio
Marcador
para
NaOH 0.1 N,
Erlenmeyers 100 y
Solucin patrn de
vidrio
250 ml
albmina de huevo
Vasos
de
de concentracin

precipitado 250 ml
Vasos precipitado
500 ml
Probeta 100 ml
Vidrios
reloj
grandes

conocida.(0.25
mg/ml)
Reactivo de Biuret.

DIAGRAMA DE FLUJO.

Por ltimo sobre el

mismo residuo, con
la adicin de solucin
de NaOH 0.1 N y
aplicando e mismo
procedimiento
general, se separa la
fraccin de las
glutelinas.l

Pesar 2.0 g de
muestra (en
cada caso ser
una de las
harinas de:
arveja, soya,
frjol, haba,
trigo, cebada,
etc.); pasarla a
un tubo de
ensayo

Vaciar
el sobrenadante a un
baln aforado de 25 ml. Al
residuo agregar de nuevo
otros 10 ml de H2O
desmineralizada y repetir
exactamente el proceso
anterior.

Sobre el residuo anterior

se extrae en idntica
forma la fraccin de las
prolaminas, usando esta
vez alcohol etlico al 75% y
una temperatura de
extraccin cercana a 60C.
. Despus de
centrifugar, los
sobrenadantes de la
primera y segunda
extraccin con NaCl
al 1%, se llevan a
otro baln aforado de
25 ml y se completa
hasta el enrase con
el mismo NaCI al 1%.
Esta es la fraccin de
las globulinas.

METODO BIURET:

agregar 10 ml de H2O
desmineralizada, agitar
manualmente durante
10 minutos y centrifugar
la suspensin a 2500
rpm por 3 minutos.

Sobre el
residuo que
queda de la
separacin de
las albminas,
se repite ahora
todo el proceso
anterior, pero
agregando esta
vez NaCl al 1%.

Despus de
centrifugar, el
sobrenadante de esta
segunda extraccin se
adiciona al baln que
contiene al primer
sobrenadante. Se
completa su volumen a
25 ml con H2O
desmineralizada
hasta el enrase.

Para las muestras de

soya, arveja y frjol, de
las fracciones de
albminas y glutelinas
deber
tomarse para cada una y
por aparte, una alcuota
de 0,5 ml.

Trazar en papel milimetrado la

grfica de calibracin (absorbancia
en ordenadas vs. concentracin
(mg/mI) en abcisas) e interpolar las
Absorbancias de los tubos
problemas; proceder, teniendo en
cuenta las diluciones de cada caso,
a calcular los porcentajes de cada
fraccin protenica.

(dilucin 1 a 10) con

agua desmineralizada
para las albminas y con
NaOH 0,1 N para las
glutelinas. Estas
diluciones se usarn
como extractos
problemas para dichas
fracciones.

En 15 tubos de ensayo rotulados

pipetear en c/u las cantidades de
reactivos que se indican en
el cuadro. Mezclar bien y dejar en
reposo por 30 minutos a temperatura
ambiente o introducir los tubos en
un bao de agua a 30C durante 10
minutos para desarrollo del color. Leer
en cada tubo
porcentaje de transmitancia a 540 nm
usando el tubo B para ajustar el 100%
de transmitancia.

METODO DE FOLYN.

O
E
S
+
x
=
N
4
9
fi
C
/q
g
m
t
p
ilz
c
o
b
).A
(Y
s
a
n
e
rd
P
h
,0
:X
v
y
u

5
2
jM
1
D
3

U
fH
F
7

ENSAYOS ENZIMATICOS CUALITATIVOS

PREINFORME PRACTICA N 3

PRESENTADO POR:
GLORIA KATHERIN PERDOMO TORRES

LABORATOTIO DE:
BIOQUIMICA

GRUPO DE LABORATORIO:
1

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA.

21 DE MARZO DE 2013 BOGOTA D.C
OBJETIVOS.

Aprender a identificar esta clase de ensayos

Saber cules son los ensayos cualitativos y que tipos de ensayos ms ay
Aprender todo acerca es este tema pues es muy interesante

ENZIMAS.

La Enzima Como Unidad Fundamental De Vida

Cada clula y cada tejido tienen su actividad propia, lo que comporta continuos
cambios en su estado bioqumico, en la base de la cual estn las enzimas, que
tienen el poder de catalizar, facilitar, y agilizar determinados procesos sintticos y
analticos. Los propios genes son reguladores de la produccin de las enzimas;
por tanto, genes y enzimas pueden considerados como las unidades
fundamentales de la vida.
Este concepto poco difundido casi hasta el siglo XX, se ha desarrollado y
concretado cada vez ms, y constituye un componente esencial de diversas
disciplinas: la microbiologa, la fisiologa, la bioqumica, la inmunologa y
la taxonoma, formando adems parte del campo aplicado, en gran variedad
de industrias. El rasgo particular de las enzimas es que pueden catalizar procesos
qumicos a baja temperatura, compatible con la propia vida, sin el empleo de
sustancias lesivas para los tejidos. La vida es, en sntesis, una cadena de
procesos enzimticos, desde aquellos que tienen por sustratos los materiales ms
simples, como el agua (H2O) y el anhdrido carbnico (CO2), presentes en los
vegetales para la formacin de hidratos de carbono, hasta los ms complicados
que utilizan sustratos muy complejos.
La formacin de los prtidos, los glcidos y los lpidos es un ejemplo tpico: Son a
la vez degradados y reconstruidos por otras reacciones enzimticas, produciendo
energa a una velocidad adecuada para el organismo, sin el gasto energtico que
exigen los mtodos qumicos de laboratorio.
o CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS.
Desde el punto de vista qumico, las enzimas estn formadas de carbono
(C), Hidrgeno (H), oxigeno (O), Nitrgeno (Ni), y Azufre (S) combinados, pero
siempre con peso molecular bastante elevado y comn propiedades catlicas
especficas. Su importancia es tal que puede considerarse la vida como un "orden
sistemtico de enzimas funcionales". Cuando este orden y su sistema funcional
son alterados de algn modo, cada organismo sufre ms o menos gravemente y el
trastorno puede ser motivado tanto por la falta de accin como por un exceso de
actividad de enzima.
Las enzimas son catalizadores de naturaleza protenica que regulan la velocidad a
la cual se realizan los procesos fisiolgicos, producidos por los organismos vivos.
En consecuencia, las deficiencias en la funcin enzimtica causan patologas.
Las enzimas, en los sistemas biolgicos constituyen las bases de las complejas y
variadas reacciones que caracterizan los fenmenos vitales. La fijacin de la
energa solar y la sntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los
vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su
vez, estn dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con

fines energticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la

vida de relacin, como la locomocin, la excitabilidad, la irritabilidad, la divisin
celular, la reproduccin, etc. Estn regidas por la actividad de innumerables
enzimas responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones
favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de energa a temperaturas
fijas en un medio de pH, concentracin salina, etc.; prcticamente constante.
A diferencia de un catalizador inorgnico que interviene en numerosas reacciones
las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un
tipo de reaccin o solo una reaccin determinada; la especificidad de las enzimas
es tan marcadas que en general actan exclusivamente sobre sustancias que
tienen una configuracin precisa; por ejemplo, si solo atacan a los aminocidos
que tienen su carbono a , asimtrico, con estructura L-, no muestran la menor
actividad sobre formas idnticas de dichos aminocidos, pero que sean del tipo D-.
En los sistemas biolgicos se llevan a cabo diversas reacciones a partir de la
misma sustancia; por ejemplo algunos microorganismos convierten la glucosa en
alcohol y bixido de carbono, al paso que otros grmenes la convierten en cido
lctico o cido pirvico o acetaldehdo. Esto quiere decir que la glucosa puede
descomponerse en distintos productos y aunque todas las posibilidades son
tericas y prcticamente posibles la presencia de ciertas enzimas favorece uno de
los caminos que llevan a la acumulacin de determinados compuestos.
Las enzimas, por lo tanto, se consideran como catalizadores altamente especficos
que:

Modifican la velocidad de los cambios promovidos por ellas.

Determinan que sustancias particulares, de preferencia a otras distintas son

las que van a sufrir los cambios.

Impulsan dentro de los distintos cambios posibles que pueda seguir una
sustancia, cul de ellos en especial, ser el utilizado.

Las enzimas representan las sustancias encargadas de graduar la velocidad de

una reaccin determinada en el interior de las clulas; como en las diversas
clulas se realizan infinidad de reacciones, ya que en una de ellas se encuentran
varios miles de sustancias, se deduce, tambin, la presencia de varios miles de
enzimas. Es posible, por lo tanto, que la mayor parte de esta estructura protenica
celular est formada por enzimas, encargadas de las diversas funciones de
sntesis, degradacin, oxidacin, etc. caractersticas de la actividad vital de los
distintos organismos.

o NATURALEZA QUIMICA DE LAS ENZIMAS.

Existen numerosas razones para afirmar que las enzimas son protenas. La
Ms importantes son las siguientes:
a.

El anlisis de las enzimas obtenidas en forma ms pura, cristalizada,

demuestra que son protenas.

b.

Las enzimas son inactivadas a altas temperaturas y, en general, la cintica

de la desnaturalizacin trmica de las enzimas da resultados muy parecidos a
los de la desnaturalizacin trmica de las protenas; por ejemplo el Q10 de la
mayora de las reacciones qumicas es de 2 a 3, y, en el caso de las enzimas,
a temperaturas elevadas, alrededor de 60 a 70 C, la actividad neta aumenta
varios cientos, como sucede con la velocidad de la desnaturalizacin trmica
de las protenas.

c.

Las enzimas son activadas en unas zona muy restringida de pH, y presenta
un punto ptimo de ph donde su actividad es mayor. Las protenas en su
punto isoelctrico, muestran propiedades parecidas desde el punto de vista
de viscosidad, solubilidad, difusin, etc., que resulta del todo similares a las
propiedades de este tipo que muestran las enzimas.

d.

Todos los agentes que desnaturalizan a las protenas tambin destruyen o

inactivan a las enzimas, ya sea el calor, los cidos fuertes, o los metales
pesados que pueden combinarse con ellas.

e.

Los problemas de solubilidad y de precipitacin son comunes a las

protenas y las enzimas; en general, son solubles en agua
o soluciones salinas, insolubles en alcohol, precipitan con determinadas
concentraciones de sales neutras, etc.

LA SACARASA.

La sacarasa conocida tambin como invertasa, es una enzima que convierte

la sacarosa (azcar comn) en glucosa y fructosa. Est presente en el intestino
delgado, en el borde del cepillo de las vellosidades intestinales.
La ausencia de sacarasa provoca una enfermedad denominada intolerancia a la
sacarosa, de difcil diagnstico, muchas veces se confunde con la intolerancia a la
lactosa.
Pertenece a la familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan
de romper los disacridos en los monosacridos que los forman.

o SUSTRATO.
Los
sustratos
son
especficos
para
cada
enzima:
La sacarosa es el sustrato de la sacarasa que acta rompindola en sus
componentes.

CLASE DE ENZIMAS:

Pertenece a la familia de las disacaridasas, que son las enzimas que se encargan
de romper los disacridos en los monosacridos que los forman.
o ESTRUCTURA EL ALMIDON.

o HIDROLISIS.
La hidrlisis implica la ruptura de un enlace mediante la adicin en medio del
mismo de los elementos del agua. Los polisacridos de la dieta se metabolizan
mediante hidrlisis a monosacridos.
La mayora de los pasos de la degradacin de almidn a glucosa pueden ser
catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras ms que se necesitan para
completar el proceso. Las tres primeras enzimas son una -amilasa, -amilasa y
almidn fosforilasa. Al parecer solo la -amilasa puede atacar grnulos de almidn
intactos, por lo que cuando participan la -amilasa y la almidn fosforilasa, es
probable que acten sobre los primeros productos liberados por la -amilasa. La
-amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1,4 en las molculas de amilosa y
amilopectina, al principio creando huecos al azar en los granos de almidn y
liberando productos que an son grandes. En cadenas de amilosa no ramificadas,
el ataque repetido por la -amilasa produce maltosa, un disacrido que contiene
dos unidades de glucosa. Sin embargo, la -amilasa no puede atacar los enlaces

1,6 localizados en los puntos de ramificacin de la amilopectina, por lo que la

digestin de amilopectina cesa cuando an quedan dextrinas ramificadas con
cadenas de longitud corta. Muchas -amilasas son activadas por Ca+, lo cual es
una de las razones por las que el calcio es un elemento esencial.

MATERIALES.
Material de vidrio

Vaso de
precipitado de 50
ml Vaso de
precipitado de 50
ml( para el grupo
2)

Material biolgico
(estudiantes)

Levadura
granulada
comercial. (No
sirve pulverizada).
Solucin de saliva.

Reactivos

300 ml Acetona

Agua destilada

100 ml de
Solucin de
sacarosa al 5%

Reactivo de
Fehling

Hielo

Mortero con mango

Esptula

Vidrio reloj

Vaso de
precipitado de 600
ml

100 ml TCA al
10%

200 ml Solucin
de almidn 2%.

Vaso de
precipitado de
250ml

100 ml de KCl al
1.0%

100 ml de solucin
de

lugol.

50 ml Solucin
cido tartrico al
1%

50 Solucin de
NaOH al 0.1 N

50 Solucin de
NaOH al 0.5 N

Vaso de
precipitado de
500ml

Vaso de
precipitado plstico
de 1000 ml

Vaso de
precipitado plstico
de 600 ml

Agitador de vidrio

Pipeta pasteur

Probeta de 100 ml

Embudos y soporte

Erlenmeyers 250
ml

50 ml de buffer
fosfato pH 6.9-7.0

50 ml de cido
clorhdrico al 10%

100 ml de solucin
de glucosa al 5%

Reactivo de
selliwanoff

150 ml de acido
tartrico al 1%

150 ml de NaOH
0.1 M

Erlenmeyers 50 ml

Tubos de ensayo

Gradillas

Pipetas 1, 5,10 ml

Pinzas para tubos

de ensayo

Pinzas de madera
para tubos de
ensayo

Solucin de HCl al
5%, Solucin de
NaOH al 5%

Hielo y agua
caliente

DAGRAMA DE FLUJO.

Extraccin de la enzima.

7
1
T
g
(
o
d
a
t
s

h
,)

ie
p
c
.r
A
M
IlZ
u
q
N
n
z
U
L
O
S
m

E
v
C

F
D
fi
b
y
5
jV
0

Obtencin de la enzima

d
S
n
e
is
a
v
z
b
tg
.P
u
j

y
A
F
5
c
ro
lp
m
0
x
1
k
IM
Z
N
E

-L
3

7
,U
O
8
C

Preparacin de la solucin de enzima y Efecto de la concentracin de

la enzima sobre la velocidad de reaccin.

Se debe recolectar una

muestra de saliva para
obtener una solucin de
enzima. Para ello
enjuguese varias veces
con agua de bolsa y
proceda a recoger en un
beaker de 50 ml
aproximadamente 10 ml
de saliva.

Coloque cada tubo a

incubar a 38C por 20
minutos. Transcurrido 20
minutos en cada tubo de
ensayo adicionar 0.2 ml
de acido triclorcetico al
10% y adicione de
manera inmediata a cada
tubo (o hasta el 4) t gotas
del reactivo de lugol.

Adicione a la saliva 10 ml
de agua destilada y
mezcle bien. Filtre la
solucin de saliva y rotule
el erlenmeyer como
SOLUCIN DE ENZIMA AMILASA e incube a 38C.

Efecto de la temperatura sobre el efecto de la actividad enzimtica.

Prepare tres tubos de

ensayo as: efecto de la
temperatura sobre el
efecto de la actividad
enzimtica.
Transcurrido 20 minutos
en cada tubo de ensayo
aadir 0.2 ml de acido
triclorcetico al 10% y
adicione de manera
inmediata a cada tubo (o
hasta el 4) tres gotas del
reactivo de lugol.

Anote las temperaturas

respectivas en cada tubo.
Despus de este tiempo
aada a cada tubo:
Coloque cada tubo a
incubar a 38C por 20
minutos

Degradacin Enzimtica De Polisacridos

Coloque el tubo # 1 por

10 minutos a 90C

Coloque el tubo # 2 a
temperatura ambiente

de lugol a
cada uno.
Registre
todos los
cambios
que
observe.
tubos

1. Coloque 3.0
mL de solucin
de almidn y 2
gotas de saliva
en tres tubos de
ensayo
previamente
marcados A, B y
C.

Retire los
de ensayo D, E y
F de las
anteriores
condiciones y
agregue cinco
gotas

. Durante diez
minutos coloque el
tubo D en hielo, el
tubo E en el bao
Mara a 37 C y el
tubo F en agua
hirviendo.
previamente
marcados
como D, E y
F, adicione
tres mL de
almidn y
dos gotas de
saliva, a cada
uno.

. Determine el pH
en cada tubo,
utilizando un
pHmetro o papel
indicador
universal.
Registre los
resultados.
Agregue al tubo
A 1.0 mL de
cido clorhdrico
al 5%; al tubo B
1.0 mL de NaOH
al 5%; y al tubo C
1.0 mL de agua
. Prepara un bao
Mara con una
temperatura de
37 C y coloque
los tres tubos de
ensayo durante
10 minutos.

En otros tres
tubos de
ensayo,

Registre los
cambios de
color, olor,
temperatura,
etc.

Retire los
tubos de
ensayo del
bao Mara y
aada cinco
gotas de
lugol a cada
uno.