TALLER No.

1
PROBLEMAS DE ENZIMOLOGA

LISETH AGUILAR PRADA

JHON ARDILA BARRIOS
BRUNO DANETRA PREZ
JOSE PACHECO HERRERA
CLAUDIA SOLERA ROJAS

UNIVERSIDAD DEL ATLNTICO

INGENIERA QUMICA
BIOPROCESOS
BARRANQUILLA - ATLNTICO
2016

INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Velocidades iniciales a diferentes concentraciones de sustrato.........................5
Tabla 2. Velocidades de reaccin iniciales a las concentraciones de sustrato..................7
Tabla 3. Datos obtenidos sobre una reaccin enzimtica..............................................9
Tabla 4.Concentraciones de sustrato en funcin del tiempo........................................11
Tabla 5.Prametros de la ecuacin de Michaelis - Menten..........................................13
Tabla 6. Punto 3 resuelto por la funcin nlinfit...........................................................14
Tabla 7. Punto 4 resuelto por la funcin nlinfit...........................................................14
Tabla 8. Punto 6 resuelto por la funcin nlinfit...........................................................15

INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Grfica obtenida por el Mtodo de Lineweaver Burk....................................6
Figura 2. Grfica obtenida por el mtodo Eadie Hofstee............................................8
Figura 3. Grfica obtenida por el mtodo de Lineweaver - Burk...................................10

TALLER No. 1
PROBLEMAS DE ENZIMOLOGA
KM

1. La

para el alcohol de la alcohol deshidrogenasa de levadura es de

1,3 102 M . Si la concentracin de alcohol en el medio de reaccin es de

59,2 g /ml

qu proporcin de enzima estar libre y que proporcin estar

combinada con el sustrato?, Cundo la velocidad de reaccin sea igual a

V max
, que valores tomaran estas proporciones?

La concentracin del complejo encima sustrato puede ser expresado por la

ecuacin de Michaelis - Menten de la siguiente forma:

[ ES ] =

[ ET ] [ S ]
K M +[ S ]

De manera que se puede determinar la proporcin de enzima que se encuentra

combinada con el sustrato:

[ ES ]

[ ET ]

[S]
KM +[ S ]

59,2 g 1 106 g 1000 ml

mol
mol

=1,28 103
ml
g
1L
46,79 g
L

[ ES ]

[ ET ]

1,28 10
=0,0896 9
2
3
1,3 10 +1,28 10

De acuerdo con esto la proporcin de encima libre es de

[ E ] =91

Cuando la velocidad de reaccin es igual a la velocidad mxima consideramos

que la enzima se encuentra combinada en su totalidad con el sustrato por lo que la
proporcin de encima combinada sera del 100%.

2. Calcular que velocidad se obtendr en una reaccin enzimtica si la

velocidad mxima es igual a 100 mol/min y la concentracin de sustrato es
10 K M
K M /3
a)
y b)
.
La velocidad de reaccin de una reaccin enzimtica se puede determinar por la
ecuacin de Michaelis-Menten:
r s=

V max ( S )
K M+ ( S )

Para una

r s=

V max =100 mol/ min

y una concentracin de sustrato igual a

10 K M

y una concentracin de sustrato igual a

KM
3

V max ( S ) V max ( S ) V max

=
=
11
K M+ ( S ) ( S )
+( S )
10
10

100 mol /min

=90.90 mol /min
1.1

Para una

r s=

V max =100 mol/ min

V max ( S ) V max ( S ) V max

=
=
4
K M + ( S ) 3 ( S ) +( S )

100 mol /min

=25 mol /min
4

3. Se hicieron diez mezclas de reaccin, cada una contena la misma

concentracin de enzima, a varias concentraciones de sustrato, y las
velocidades iniciales se determinaron como se muestra en la tabla.
Utilizando la ecuacin de Linearweaber - Burk, determine grficamente el
Km y la Vmax . Observe como uno de los factores crticos en la
exactitud de esta determinacin son las escalas seleccionadas por las
ordenadas y las abscisas. Cules son los intervalos de concentraciones de
sustratos ms tiles para estas determinaciones?
Tabla 1. Velocidades iniciales a diferentes concentraciones de sustrato.

Sustrato M

Sustrato M

1,00E-03

Velocidad
(nmol /min)
65

2,00E-05

Velocidad
(nmol /min)
27

5,00E-04

63

1,00E-05

17

1,00E-04

51

5,00E-06

9,5

5,00E-05

42

1,00E-06

2,2

3,00E-05

33

5,00E-07

1,1

En el mtodo de Lineweaver - Burk se invierte la ecuacin de mi MichaelisMenten:

S+ K M
K 1
1
1
=
=
+ M
r s V max S V max V max S

Y se grafica

1
r s

como ordenada contra

1
S

como abscisa y se ajusta a una

lnea recta de manera que se pueden determinar los parmetros de la siguiente

manera:

Intercepto=

Pendiente=

1
V max

KM
V max

Para los datos de la tabla se tiene como resultado la siguiente grfica:

Figura 1. Grfica obtenida por el Mtodo de Lineweaver Burk.

De manera que los parmetros se pueden calcular con las ecuaciones anteriores

intercepto=0,0147=

1
V max

V max =68,02 nmol/min

pendiente=4,46 107 =

KM
V max

K M =3,03 105 M
Al observar la grfica vemos que los puntos se concentran alrededor de valores
KM
para una concentracin de sustrato cercano al valor de
, un intervalo de
concentracin til para determinar los parmetros por el ajuste seria 0,33<

KM

<2.0. Debido a que es ms certero hacer un ajuste con valores ms cercanos que
con datos disperso.

4. Se hicieron varias mezclas de reaccin que contenan concentraciones

iguales de una enzima, a las concentraciones de sustrato indicadas en la
tabla y se determinaron las velocidades de reaccin iniciales. Utilizando la
ecuacin de Eadie - Hofstee, (v = f(v/S)) determine grficamente la Km y la
Vmax . Cul es la ventaja de este tipo de grafica sobre la de LineweaverBurk?

Tabla 2. Velocidades de reaccin iniciales a las concentraciones de sustrato.

Sustrato
(M)
4 104

Velocidad
(nmol/min)
130

2 10

110

1 104

89

5 105

62

4 105

53

2,5 105

38

2 10

En el mtodo de Eadie - Hofstee graficamos

32

r s

en funcin de

r s / ( S )

ecuacin de Michaelis - Menten se puede re arreglar de la siguiente forma:

r s=V max +

1
V max

( S)

Para los datos de la tabla se tiene como resultado la siguiente grfica:

y la

Figura 2. Grfica obtenida por el mtodo Eadie Hofstee.

Para este mtodo los parmetros de la ecuacin de Michaelis-Menten se

determinan de la siguiente forma:
intercepto=V max =154,29

pendiente=K M =7,60 105

La ventaja de este mtodo es que la grfica de Eadie-Hofstee puede desplazar los

datos en un intervalo mayor de concentraciones de sustrato. De este modo, los
datos que se presentan lineales en una grfica de Lineweaver-Burk, algunas
veces exhiben desviaciones significativas de la linealidad con la grfica de EadieHofstee.

5. A partir de los siguientes datos obtenidos al estudiar el efecto de un

inhibidor sobre una reaccin enzimtica, determine el tipo de inhibicin y la
Km para el sustrato.

Tabla 3. Datos obtenidos sobre una reaccin enzimtica.

V ( g de
Sustrato (M)
2
3
4
10
15

producto/min)
[inhibidor] = 0mM
139
179
213
313
370

V ( g

de

producto/min)
[inhibidor] = 6mM
88
121
149
257
313

A altas concentraciones de sustrato como es el caso de este problema, se pueden

distinguir tres tipos de inhibicin, una competitiva en la que el inhibidor reduce la
V max
velocidad de reaccin pero la
sigue siendo la misma. Y otra no competitiva
en la que el inhibidor reduce la velocidad mxima pero la

KM

misma. Y una tercera incompetitiva en la que los valores de

sigue siendo la
V max

generalmente son menores que los obtenidos en ausencia de inhibidor.

KM

Figura 3. Grfica obtenida por el mtodo de Lineweaver - Burk.

De acuerdo con la grfica, la lnea inferior corresponde a una representacin de la

ecuacin de Michaelis-Menten por el mtodo de Lineweaver - Burk, para
determinar los parmetros cinticos, para una muestra sin inhibidor y la lnea
superior corresponde a una muestra con una concentracin baja de inhibidor.
Debido al comportamiento de la grfica y su intercepcin en el eje de las
ordenadas podemos deducir que se trata de inhibicin competitiva.

6. La hidrolisis de N-glutani-L-fenilalanina-p-nitroanilida (GPNA) para dar pnitroanilina y N-glutanil-L-fenilalanina, esta catalizado por la enzima quimotripsina. En unas determinadas condiciones de pH y temperatura los
datos cinticos obtenidos teniendo un volumen constante de 0.1L son los
siguientes:
a) Utilizar los mtodos de Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf, Eadie-Hoftee.
b) Reportar constantes con cada mtodo as como graficas
correspondientes, hacer una valoracin del ajuste de cada ecuacin
obtenida y seleccionar la mejor.

Tabla 4.Concentraciones de sustrato en funcin del tiempo.

t (min)
0
0,00011576
0,00023152
0,00034727
0,00069918
0,00105109
0,00140299
0,0017549
0,00229147
0,00282803
0,00323451
0,00364099
0,00404747
0,00445395
0,00505415
0,00565436
0,00625457
0,00685478
0,00745499
0,00833796
0,00922092
0,01

[S] (M)
0,0015
0,00142095
0,00134385
0,00126881
0,00105301
0,00085805
0,00068574
0,00053707
0,00035554
0,00022463
0,00015475
1,05E-04
7,00E-05
4,63E-05
2,52E-05
1,36E-05
7,06E-06
3,45E-06
1,61E-06
5,31E-07
4,45E-08
-2,1941E-07

Los parmetros de la ecuacin de Michaelis-Menten se pueden encontrar por tres

mtodos grficos diferentes los cuales tienen sus ventajas y desventajas en

cuanto a la forma de determinar dichos parmetros y el grado del ajuste frente a

determinado conjunto de datos de velocidades. La tcnica consiste en linealizar la
ecuacin de Michaelis-Menten para obtener la forma de la ecuacin de una lnea
recta. A continuacin, se emplean los tres mtodos haciendo una valoracin del
ajuste y seleccionando el mejor para el problema en cuestin. Las grficas para
cada uno de los mtodos se presentan a continuacin.

(a)

(b)

(c)
Figura 4. (a) Grfica por el mtodo Lineweaver Burk. (b) Grfica por el mtodo Eadie Hoftee.
(c) Grfica por el mtodo Hanes Woolf.

Tabla 5.Prametros de la ecuacin de Michaelis - Menten.

PARAMETROS DE LA ECUACIN DE MICHAELIS - MENTEN

METODO
VMAX
Km(mol/L)
R2
(mol/L.min)
Lineweaver Burk
3,1303e-04
7,6231e-10
0,2486
Eadie Hofstee
3,1305e-04
7,6495e-10
0,2451
Hanes - Woolf
3,1551e-04
7,3192e-07
1,0000
En la tabla anterior se muestran los parmetros de velocidad y constante cintica
que se obtienen con cada uno de los mtodos y su respectivo valor del coeficiente
de determinacin como valoracin del ajuste. Es claro tanto en las grficas como
en los resultados numricos que el mtodo de Hanes-Woolf es el que presenta un
mejor ajuste de los datos experimentales.

7. Apyese en el documento de Conducting a Nonlinear Fit Analysis in

MATLAB para aprender a usar la funcin nlinfit de MATLAB y obtener las
constantes cinticas de todos los puntos que tienen datos experimentales

adems de realizar los anlisis estadsticos correspondientes y determinar

cul es el mejor ajuste.
Las herramientas computacionales son una gran herramienta para el empleo de
mtodos numricos. La funcin nlinfit de MATLAB realiza una regresin no lineal
con la que se pueden obtener los parmetros de un modelo a partir de datos
experimentales. En este punto empleamos dicha funcin para encontrar los
parmetros que ya se determinaron en puntos anteriores y hacer una comparacin
del ajuste.
Para el punto 3:
Tabla 6. Punto 3 resuelto por la funcin nlinfit.

PARAMETROS DE LA ECUACIN DE MICHAELIS - MENTEN

METODO
VMAX
Km(mol/L)
R2
(mol/L.min)
Lineweaver Burk
6,8145e+01
3,0379e-05
1,0000
nlinfit
6,6761e+01
2,9934e-05
0,9999
Para el punto 4:
Tabla 7. Punto 4 resuelto por la funcin nlinfit.

PARAMETROS DE LA ECUACIN DE MICHAELIS - MENTEN

METODO
VMAX
Km(mol/L)
R2
(mol/L.min)
Eadie Hofstee
1,5429e+02
7,5975e-05
0,9979
nlinfit
1,5263e+02
7,5109e-05
0,9993

Para el punto 6:
Tabla 8. Punto 6 resuelto por la funcin nlinfit.

PARAMETROS DE LA ECUACIN DE MICHAELIS - MENTEN

METODO
VMAX
Km(mol/L)
R2
(mol/L.min)
Lineweaver Burk
1,1675e-02
2,4087e-06
0,9558

Eadie Hofstee
Hanes - Woolf
nlinfit

4,0807e-01
1,1099e+00
1,2392e+00

1,4241e-04
9,5611e-04
1,1943e-03

0,2334
0,9005
0,9999

Podemos ver que la funcin nlinfit da un ajuste tan bueno o en algunos casos
mejor que el mtodo grafico empleado, dando un valor ms certero y confiable
para los parmetros cinticos de los modelos.