Necesidades para el crecimiento microbiano:

Requerimientos nutricionales de los microorganismos

Los microorganismos, como cualquier ser vivo, requieren una serie de

sustancias que les permitan realizar sus actividades metablicas;
bsicamente necesitan fuentes de: agua, energa, minerales, vitaminas,
carbono, hidrgeno, oxigeno (en caso de que sean aerobios), nitrgeno,
azufre, fsforo, potasio, calcio, magnesio y hierro. (T. Madigan, Martinko,
& Parker)

Medios de cultivo:

Un medio de cultivo es una preparacin lquida o slida utilizada para el

crecimiento, transporte o mantenimiento de microorganismos. Si se
desea utilizar para el crecimiento, deber contener los nutrientes
esenciales para ese microorganismo en concreto. Los medios especiales
son imprescindibles para aislar e identificar los microorganismos,
evaluar la sensibilidad antibitica, analizar agua y alimentos, a pesar de
las necesidades nutritivas que necesitan los microorganismos, la
composicin precisa de un medio depender de la especie que se quiere
cultivar.
El conocimiento del hbitat normal de un microorganismo es a menudo
til para elegir un medio de cultivo adecuado.
Medios sintticos o definidos:
Algunos microorganismos, particularmente los auttrofos fotolitrfieos,
como las cianobacterias y algas eucariotas, pueden crecer en medios
relativamente sencillos, que contienen CO2 como fuente de carbono,
nitrato o amonio como fuente de nitrgeno, sulfato, fosfato, y diversos
minerales. Esta clase de medios de la que se conocen todos los
componentes se denomina medio definido o medio sinttico. Los medios
definidos se emplean frecuentemente en investigacin, pues a menudo
se quiere conocer qu est metabolizando el microorganismo
experimental.
Ejemplos:
Tabla 5.4 Ejemplos de medios definidos
Medio BG-11 para cianobacterias Cantidad (g/L)
NaNO3 1.5
K,HPO4 3H,0 0.04
MgSO4 7H2O 0.075
CaCl2 2H2O 0.036
cido ctrico 0.006
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Citrato amnico frrico 0.006

EDTA (sal de Na, Mg) 0.001
Na2CO3 0.02
Solucin de metales traza" l.OmL/L
pH final de 7.4
Medio para Escherichia coli Cantidad (g/L)
Glucosa 1.0
Na2HPO4 16.4
KH2PO4 1.5
(NH4)2SO4 2.0
MgSO4 7H,0 200.0 mg
CaCl, 10.0 mg
FeSO4 7H2O 0.5 mg
pH final de 6.8 a 7.0
Fuentes: los datos proceden de Rippka et al., Journal of General
Microbiology,
111:1-61. 1979; y S. S. Cohn, y R. Arbogast, Journal of Experimental
Medicine,
91:619, 1950.
* La solucin de metales traza contiene H_,BO3, MnCl2 4H2O, ZnSO4
7H2O,
Na2Mo4 2H,O, CuSO4 5H,0 y Co(NO3)2 6H2O.
Medios complejos:
Son los medios que contienen algunos ingredientes cuya composicin
qumica exacta se desconoce. Estos medios son muy tiles, pues un
nico medio complejo puede ser suficiente rico para satisfacer las
necesidades nutricionales de diversos microorganismos. Adems, los
medios complejos se necesitan porque a menudo se desconocen las
necesidades nutricionales de un microorganismo en particular, por lo
que no se puede elaborar un medio definido. ste es el caso de muchas
bacterias exigentes, algunas de las cuales pueden incluso requerir un
medio que contenga sangre o suero. Los medios complejos contienen
componentes como peptonas, extracto de carne y de levadura. Las
peptonas son hidrolizados de protenas obtenidos de la digestin
proteoltica parcial de carne, casena, harina de soja, gelatina u otras
fuentes proteicas. Sirven como fuente de carbono, energa y nitrgeno.
Los extractos de carne y de levadura son medios lquidos de carne de
vacuno y de levadura de cerveza, respectivamente. El extracto de carne
contiene aminocidos, pptidos, nucletidos, cidos orgnicos,
vitaminas y minerales. El extracto de levadura es una fuente excelente
de vitaminas del complejo B, y de compuestos de nitrgeno y carbono.

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Ejemplo:
Caldo nutritivo Cantidad (g/L)
Peptona (hidrolizado de gelatina) 5
Extracto de carne 3
Caldo de triptona y soja
Triptona (producto digerido pancretico
de la casena) 17
Peptona (producto digerido de semilla de soja) 3
Glucosa 2.5
Cloruro sdico 5
Fosfato dipotsico 2.5
Agar MacConkey
Producto digerido pancretico de gelatina 17.0
Producto digerido pancretico de casena 1.5
Producto digerido de tejido animal 1.5
Lactosa 10.0
Sales biliares 1.5
Cloruro sdico 5.0
Rojo neutro 0.03
Cristal violeta 0.001
Agar 13.5
Tipos de medios de cultivo:
Medios generales: Permiten el desarrollo de una gran variedad de
microorganismos.
Medios de enriquecimiento: Favorecen el crecimiento de un
determinado tipo de microorganismo, sin llegar a inhibir
totalmente el crecimiento del resto.
Medios selectivos: Permiten el crecimiento de un tipo microbiano
determinado, inhibiendo el desarrollo de los dems.
Medios diferenciales: Son aquellos en los que se ponen de relieve
propiedades que posee un determinado tipo de microorganismos.
Preparacin de los medios de cultivo:
En general, la preparacin de un medio de cultivo consiste
simplemente es pesar la cantidad deseada del mismo y disolverla
en agua desionizada libres de inhibidores del crecimiento,
siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias
termolbiles se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los
componentes previamente esterilizados en autoclave.
Antes de su esterilizacin, los medios lquidos se distribuyen en los
recipientes adecuados (tubos o matraces); en ningn caso a la
altura del lquido en el recipiente debe exceder un tercio del
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volumen total de este. Si es un medio slido, habitualmente se

produce a fundir el agar en un bao Mara antes de ser
esterilizado, una vez fundido, se distribuye en caliente en tubos o
en matraces (no en placas de Petri), se tapan y se esterilizan.
Finalizada la esterilizacin en el autoclave:
1. Los medios lquidos se dejaran enfriar
a temperatura
ambiente.
2. Los medios solidos contenidos en tubos deben inclinarse
para que al solidificarse adopten la forma de agar inclinado
(slant) si esta es su finalidad.
3. Las cajas de Petri pueden tambin ser preparadas en este
momento, vertiendo el medio an fundido y estril dentro de
ellas en un ambiente asptico (p. ej., en la proximidad de la
llama de un mechero de Bunsen). Sin embargo, antes de
verterlo a las placas, se recomienda temperar el matraz que
contiene el medio para evitar un exceso de evaporacin y
posterior condensacin, tras el contacto con la superficie de
las placas. Es posible, asimismo, conservar el medio
destinado a placas solidificado y estril en tubos, que se
fundirn al bao Mara en el momento de prepararlas.
Los medios lquidos y slidos pueden conservarse, una vez
esterilizados, a temperatura ambiente, sin embargo para
reducir su deshidratacin y el consiguiente cambio de las
concentraciones de los componentes es preferible conservarlos
a 4C.

Fisin binaria y tiempo de generacin:

La fisin binaria se lleva a cabo a travs de una serie de pasos
sucesivos que inician con la
obtencin, por parte de la bacteria,
de los nutrimentos que requiere a
partir del ambiente, en el que se
encuentra.
Utilizando
estos
nutrimentos, la clula sintetiza las
sustancias como el ARN, el ADN,
las protenas, etc. Cuando esto
sucede, la clula crece (aumenta su masa y su tamao).
Posteriormente se sintetizan los componentes de la pared
transversal y se inicia la fisin lo que da como resultado dos
celular nuevas.
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La fisin en las formas bacilares y espirilares, tiene lugar en un

nico plano perpendicular al eje mayor de la clula. En los cocos,
puede darse en uno o ms planos.
Tiempo de generacin (G) es el tiempo requerido para que una
clula se divida o una poblacin se duplique.
G = t/n
Si partimos de una clula al cabo de una generacin habr
duplicado su nmero y as sucesivamente en cada generacin.
Como se puede comprobar el crecimiento se produce en
progresin geomtrica:
1 generacin -------------> 2 clulas
2 generaciones -------------> 4 clulas
3 generaciones -------------> 8 clulas
4 generaciones -------------> 16 clulas
5 generaciones -------------> 32 clulas
To -------------> No
1 generacin -------------> 2No = No21
2 generaciones
-------------> 4No =

No22
3 generaciones
-------------> 8No = No23
4 generaciones -------------> 16No = No24
5 generaciones -------------> 32No = No25
n generaciones (T) -------------> N = No2n

Curva de crecimiento bacteriano

El crecimiento de una poblacin microbiana se estudia analizando la

curva de crecimiento de un cultivo microbiano.
Cuando los microorganismos se cultivan en un medio lquido,
normalmente se trata de un cultivo discontinuo o en sistema cerrado
esto es, se incuban en un tubo de ensayo cerrado al que no se aade
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ms cantidad de medio que la inicial; en consecuencia, las

concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos aumentan.
Se puede representar el crecimiento de los microorganismos que se
multiplican por fisin binaria como el logaritmo del nmero de clulas
frente al tiempo de incubacin. La curva resultante tiene cuatro fases
diferentes (Figura 6.1).
Fase de latencia (lag).
Cuando se introducen microorganismos en un medio de cultivo fresco,
normalmente no se produce un aumento inmediato del nmero de
clulas o de masa y, por ello, este perodo se denomina fase de
latencia (lag). Aunque la divisin celular no se produce
inmediatamente y no hay un incremento neto de masa, es un proceso
activo, la clula est sintetizando nuevos componentes. Una fase de
latencia previa Tiempo *-

Figura 6.1 Curva de crecimiento microbiano en un sistema

cerrado. Las cuatro fases estn identificadas en esta curva y
descritas en el texto.
Al comienzo de la divisin celular puede ser necesaria por diversas
razones. Las clulas pueden ser viejas y poseer cantidades reducidas de
ATP, cofactores esenciales o de ribosomas; estas sustancias deben
sintetizarse antes de que se inicie el crecimiento. El medio puede ser
diferente al anterior donde crecan los microorganismos; en este caso,
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necesitar nuevas enzimas para usar esos otros nuevos nutrientes. Por
ltimo, tambin es posible que los microorganismos se hayan alterado y
necesiten un tiempo de recuperacin. Cualquiera que sea el motivo,
durante la fase de latencia las clulas se equipan de nuevo, replican su
DNA, comienzan a incrementar su masa y por ltimo, se dividen. La
duracin de la fase de latencia vara considerablemente segn el estado
de los microorganismos y la naturaleza del medio. Esta fase puede ser
bastante larga si el inoculo procede de un cultivo viejo o de uno que
haya sido refrigerado. La inoculacin de un cultivo en otro qumicamente
diferente resulta tambin en una fase de latencia mayor. En este mismo
sentido, cuando se transfiere un cultivo en fase de crecimiento
exponencial a un medio nuevo de la misma composicin, la fase de
latencia se acorta o no se produce.
Fase exponencial
Durante la fase exponencial o logartmica (log), los microorganismos
crecen y se dividen hasta el nivel mximo posible, en funcin de su
potencial gentico, el tipo de medio y las condiciones en que crecen. La
velocidad de crecimiento es constante durante la fase exponencial; esto
es, los microorganismos se duplican en nmero a intervalos regulares.
No existe sincronizacin, cada clula se divide en un momento
ligeramente diferente del resto, por ello, la curva de crecimiento
aumenta suavemente, en lugar de realizar saltos discretos (Figura 6.1).
Durante esta fase, la poblacin es ms uniforme, qumica y
fisiolgicamente; por ello, los cultivos en fase exponencial se utilizan
normalmente en estudios bioqumicos y fisiolgicos. El crecimiento
exponencial es un crecimiento equilibrado. Es decir, todos los
constituyentes celulares se producen a una velocidad constante, unos
respecto de otros. Si se modifican las concentraciones de nutrientes o
las condiciones ambientales, se origina un crecimiento desequilibrado.
Se denomina as porque las velocidades de sntesis de los componentes
celulares varan entre s, hasta que se alcanza un nuevo estado de
equilibrio. Esta respuesta se observa fcilmente en un experimento en el
que se inoculan bacterias desde un medio pobre en nutrientes a otro
ms rico (shift-up).
Fase estacionaria
Finalmente, el crecimiento de la poblacin cesa y la curva de
crecimiento se hace horizontal (Figura 6.1). Las bacterias llegan
normalmente a la fase estacionaria cuando la concentracin es de,
aproximadamente, 109 clulas por mL. Otros microorganismos no
alcanzan normalmente esta densidad de poblacin; los cultivos de
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protozoos y algas no suelen sobrepasar concentraciones de 106 clulas

por mL. El tamao final de la poblacin depende, por supuesto, de la
disponibilidad de nutrientes y otros factores, as como del tipo de
microorganismo que se cultive. En la fase estacionaria, el nmero total
de microorganismos viables permanece constante. Este hecho puede ser
el resultado del equilibrio entre la divisin y la muerte de las clulas o,
simplemente, que la poblacin deje de dividirse, aunque siga
metablicamente activa.
Las poblaciones microbianas entran en fase estacionaria por varias
razones. Un factor obvio es la limitacin de nutrientes; si se reduce
drsticamente la concentracin de un nutriente esencial, la poblacin
crecer muy lentamente. Los organismos aerobios estn limitados a
menudo por la disponibilidad de O2.
Fase de muerte
Cambios ambientales perjudiciales, como privacin de nutrientes y
acumulacin de residuos txicos, originan la disminucin del nmero de
clulas viables, hecho que caracteriza la fase de muerte. La muerte de
una poblacin microbiana, al igual que su crecimiento durante la fase
exponencial, es normalmente logartmica (esto es, una cantidad
constante de clulas muere cada hora). Este modelo se mantiene incluso
aunque se observe que el nmero total de clulas permanece constante,
ya que las clulas no se Usan inmediatamente despus de morir. A
menudo, la nica forma de decidir si una bacteria es viable consiste en
incubarla en un medio fresco; si no crece ni se multiplica, se considera
que est muerta. Es decir, la muerte microbiana se define como la
prdida irreversible de la capacidad de multiplicarse. Aunque la mayor
parte de una poblacin microbiana normalmente muere de forma
logartmica, la velocidad de mortalidad puede disminuir despus de
reducirse drsticamente la poblacin. Esto se debe a la supervivencia
prolongada de clulas particularmente resistentes. Por stas y otras
razones, la curva de la fase de muerte puede ser compleja.
Cuantificacin de microorganismos:
Diluciones seriadas:
Son diluciones que se preparan a partir de una dilucin madre, diluyendo
esta a concentraciones cada vez ms pequeas. Es muy frecuente
utilizarlas cuando se quiere preparar concentraciones muy pequeas o
cuando se quiere preparar una recta de calibrado para un anlisis. Hay
dos formas de prepararlas.

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1.- En la primera forma se parte de un volumen fijo para todas las

disoluciones seriadas, y se va aadiendo a un volumen fijo de la dilucin
anterior. Este volumen ya est calculado por la frmula 3.7

2.- En la segunda forma, se parte de la

madre y se van calculando las disoluciones
con la frmula 3.7, partiendo siempre de la
solucin madre y no de la solucin anterior.

Nmero ms probable:
El mtodo de nmero ms probable (NMP) es una estrategia eficiente de
estimacin de densidades poblacionales especialmente cuando una
evaluacin cuantitativa de clulas individuales no es factible. La tcnica
se basa en la determinacin de presencia o ausencia (pos o neg) en
rplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de
microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por
lo tanto, un requisito importante de este mtodo es la necesidad de
poder reconocer un atributo particular de la poblacin(es) en el medio
de crecimiento a utilizarse. El estimado de densidad poblacional se
obtiene del patrn de ocurrencia de ese atributo en diluciones seriadas y
el uso de una tabla probabilstica.
Algunas de las ventajas del NMP son:
(i)

La capacidad de estimar tamaos poblacionales basados en

atributos relacionados a un proceso (selectividad); por ejemplo
se puede determinar la densidad poblacional de organismos
que pueden nodular leguminosas en una muestra de suelo
usando el mtodo de infeccin de plantas
(ii)
(ii) Provee una recuperacin uniforme de las poblaciones
microbianas de suelos diversificados
(iii) (iii)
Determina
slo
organismos
vivos
y
activos
metablicamente, y (iv) suele ser ms rpido e igual de
confiable que los mtodos tradicionales de esparcimiento en
platos de cultivo, entre otros.
Nefelmetro de McFarland
Los patrones de McFarland se utilizan como patrones de turbidez en
la preparacin de suspensiones de microorganismos.
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 Turbidemetra
Mide el grado de enturbamiento de una solucin proucida en una
reaccin qumica. Es una tcnica poco selectiva que hoy est en desuso
y es de menor precisin que la nefelometra.
Espectrofotometra
La espectrofotometra es uno de los mtodos de anlisis ms usados, y
se basa en la relacin que existe entre la absorcin de luz por parte de
un compuesto y su concentracin. Cuando se hace incidir luz
monocromtica (de una sola longitud de onda) sobre un medio
homogneo, una parte de la luz incidente es absorbida por el medio y
otra transmitida, como consecuencia de la intensidad del rayo de luz sea
atenuada desde Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la
intensidad del rayo de luz transmitido. Dependiendo del compuesto y el
tipo de absorcin a medir, la muestra puede estar en fase lquida, slida
o gaseosa. En las regiones visibles y ultravioleta del espectro
electromagntico, la muestra es generalmente disuelta para formar una
solucin. Cada sustancia tiene su propio espectro de absorcin, el cual
es una curva que muestra la cantidad de energa radiante absorbida,
Absorbancia, por la sustancia en cada longitud de onda del espectro
electromagntico, es decir, a una determinada longitud de onda de la
energa radiante, cada sustancia absorbe una cantidad de radiacin que
es distinta a la que absorbe otro compuesto.

Bibliografa
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M. Prescott, L., Harley, J., & Klein, D. (2002). Microbiologa. Espaa: McGraw-Hill.
T. Madigan, M., Martinko, J., & Parker, J. (s.f.). Brock: Biologia de los microorganismos.
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