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STRUCTURE ET CLASSIFICATION DES VIRUS

Définition d’André Lwoff

Parasite intracellulaire obligatoire Génome = un seul type d’AN à ADN ou ARN Une reproduction par réplication du génome

Définition simplifiée : un virus est un agent pathogène ultramicroscopique, bien plus petit qu’une bactérie, non cultivable

Structure des virus

Les virus sont composés de deux éléments constants :

Un acide nucléique qui constitue le génome Une structure protéique entourant et proté- geant le génome = capside Génome + capside = nucléocapside (Core pour les rétrovirus) Parfois une 3ème structure, entourant la cap- side -> enveloppe ou péplos (chez certains V)

  • 2. Les génomes à ARN

La variabilité des ARN viraux est sensibilité moins grande que celle des ADN. Les ARN viraux sont généralement monocaténaires et linéaires. PM : 2x15.106 dalton

Acides nucléiques / Génome : 1er critère de classification Structure noble du virus porteuse de l’information génétique et caractérisée par :

Sa nature : ARN ou ADN Sa taille : longueur, masse moléculaire, nombre de paires de base et la capacité approximative de codage Sa composition en bases : notamment le %GC Sa structure : monocaténaire, bicaténaire, ou bien avec des fragments subgénomiques Sa topologie : linéaire ou circulaire

1. Les génomes à ADN

Les ADN des virus animaux, sont le plus souvent bicaténaires et linéaires et présentent pour la plupart une structure tridi- mensionnelle classique en double hélice.

STRUCTURE ET CLASSIFI CATION DES VIRUS Définition d’André Lwoff Parasite intracellulaire obligatoire Génome = un seul
STRUCTURE ET CLASSIFI CATION DES VIRUS Définition d’André Lwoff Parasite intracellulaire obligatoire Génome = un seul
  • 2. Les virus icosaédrique à symétrie cubique

Icosaèdre : structure géométrique avec 12 sommets, 20 faces et 30 arêtes. Il s’organise en sous-unités pro- téiques appelées capsomères.

Exemples : HSV, papillomavirus

  • 3. Les virus à symétrie complexe

Un certain nombre de virus ne semblent pas répondre aux types de description précédente.

Exemple : les Poxviridae ont une forme parallélépipé- dique. La nucléocapside occupe une position centrale dans le virion et présente une forme en « lentille bicon- cave », les concavités étant occupées par des structures denses appelées corps latéraux.

Capsides virales : 2ème critère de classification La capside est une coque de nature protéique qui en- toure le génome. Elle est capable d’assurer sa protec- tion et sa survie dans le milieu extérieur. Elle est com- posée de plusieurs monomères appelés capsomères. Elle peut avoir plusieurs aspects :

1. Les virus à symétrie hélicoïdale

Un seul type de capsomère s’emboîte pour former un volume (la capside) selon une symétrie en hélice. a. Virus de la mosaïque du tabac : bâtonnets allon- gés rigides et creux de 300nm de long sur 15nm de diamètre b. Virus animaux à symétrie hélicoïdale : La nu- cléocapside flexueuse, repliée ou spiralée, est toujours entourée d’une enveloppe.

Exemples :

* La nucléocapside du virus de la rage (rhabdoviridae) :

capsule tubulaire à symétrie hélicoïdale, l’ARN est relié aux sous-unités d’une protéine de 52000 daltons (protéine N). * La nucléocapside des virus grippaux (orthomyxoviridae) : capsule hélicoïdale tubulaire, gé- nome segmenté en 8 fragments à l’intérieur d’une enve- loppe, diamètre de la nucléocapside : 8nm, diamètre de la particule virale entière : 100nm.

Enveloppes virales / péplos : 3ème critère de classification Structure périphérique facultative, lipido-gluco- protéique sensible aux actions physicochimiques

Rôle :

Protection (nucléase, résistance) Antigénicité (induction Ac neutralisants) Infectiosité (interaction/récepteur) Activité enzymatique

Les virus acquièrent leur enveloppe par bour-

geonnement

À travers la membrane nucléaire (herpesviridae), À travers la membrane du réticulum endoplas- mique (Bunyaviridae) À travers la membrane cytoplasmique (orthomyxoviridae)

Classification des virus

Critères de classification des virus

La classification est basée actuellement sur l’ensemble des données biochimiques et morphologiques, proposée en 1962 par Lwoff, Horne, et Tournier et appelée système L.H.T, elle a été adoptée par tous les virologistes.

Le génome

1. Nature du matériel génétique :

ADN ou ARN

  • 2. Structure de l’acide nucléique :

Monocaténaire ou bicaténaire

  • 3. Forme de l’acide nucléique :

Linéaire ou circulaire

Segmenté ou non

L’enveloppe

Virus nus (N) Virus enveloppés (E)

Système de la capside

Symétrie hélicoïdale (H) Symétrie icosaédrique (I) Symétrie inconnue (?)

Principaux virus à ARN ayant un pouvoir pathogène chez l’Homme

Les virus à ARN+ ont un génome « sens », de polarité +, directement traduit par lesvribo- somes, excepté pour les Rétroviridae et Reoviridae. Les virus à ARN- on un génome « anti-sens », de polarité -, à transcrire en brin + par une ARN polymérase incluse dans le virion. Les virus à ARN (+/-) sont des ARN ambi- sens (une partie du génome est + soudée à une autre -)

Nomenclature virale Ecriture en italique avec 1ère lettre majuscule

Niveau taxonomique

Suffixes

Exemples

Ordre

-virales

Mononegavirales

Famille

-viridae

Paramyxoviridae

Sous-famille

-virinae

Paramixovirinae

Genre

-virus

Morbillivirus

Espèce

(virus individuel)

Virus de la rougeole

Principaux virus à ADN ayant un pouvoir pathogène chez l’Homme
Principaux virus à ADN ayant un pouvoir pathogène chez l’Homme
Enveloppes virales / péplos : 3ème critère de classification Structure périphérique fa cultative, lipido-gluco- protéique sensible

MULTIPLICATION INTRA CELLULAIRE DES VIRUS

Introduction

Les virus d’intérêt médical sont nombreux. Certains donnent des infections bénignes, tandis que d’autres provoquent des infections +/- graves, voire même mortelles. Les virus sont des parasites intracellulaire obliga- toire.

  • 2. Chez les virus

Un virus est incapable de se diviser par lui-même. Par définition, c’est un parasite intracellulaire obli- gatoire. En dehors d’une cellule, la particule virale ou virion existe sous une forme statique. Pour se multiplier, un virus n’a que son génome : pas de système enzymatique de production d’énergie de Lippmann ni de synthèse protéique. Dans la cellule, le virus détourne la machinerie cel- lulaire à son profit pour sa propre multiplication.

  • 3. Conditions de la multiplication virale

Parasiter une cellule Trouver des sources de matière première Trouver des sources d’E Trouver des enzymes

Etapes du cycle de multiplication virales

Un cycle de multiplication comprend les mêmes étapes regroupées en 3 périodes :

Conditions nécessaires à la multiplication d’un virus

1. La multiplication d’un être vivant

Se reproduire est un processus à la fois très complexe, très précis et très organisé faisant intervenir 4 condi- tions :

Support de travail : information génétique, contenue dans le génome Matière première : petites molécules, acides aminés, acides gras, sels minéraux… Source d’énergie d’ATP : nécessaire à toute édification Système enzymatique : nécessaire aux grandes voies de synthèse biologique.

La multiplication intra cellulaire des virus

Cycle de multiplication

La vie des virus est cyclique avec une succession d’étapes intra et extracellulaires. La durée d’un cycle viral dépend de la taille et de la complexité du virus, ex : 4 à 8h pour le poliovirus alors que plus de 40h pour l’herpesviridae. Etude sur culture cellulaire :

Phase d’éclipse : absence de virions détectés (intracel et extracel) - Disparition des virus inoculés - Dégradation de la particule virale, exposition du gé- nome viral à la machinerie cellulaire Phase de latence : absence de virions (extracel), com- prend le délai de libération des virion

1.

Etape initiale :

 

La fusion des membranes :

a. Attachement :

Pour les virus enveloppés, ex : Retroviridae,

  • - Interactions protéine virale-récepteur cellulaire

Paramyxoviridae, Herpesviridae,

  • - C’est le 1er facteur conditionnant le tropisme d’un virus pour

-

Insertion dans la membrane cellulaire

une cellule, un tissu, un organe ou un hôte particulier

d’une protéine virale de fusion

 

(permissivité)

-

Puis, fusion des 2 membranes virales et

  • - Les récepteurs cellulaires sont spécifiques ou non

cellulaire

  • - Les récepteurs sont présents sur certains types cellulaires

-

C’est un phénomène indépendant du pH

  • - Notion de Co récepteurs

Ex du HIV :

  • - Cet attachement se fait en plusieurs étapes

-

Attachement de la glycoprotéine gp120 sur

b. Pénétration : Trois mécanismes : endocytose – fusion des

la molécule CD4

membranes – transfert du matériel viral à travers la membrane

-

Interaction avec le 2ème récepteur (ici

cellulaire

CCR5) et modification de la conformation

 

L’endocytose :

des glycoprotéines virales

Virus enveloppés : Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Togavi-

-

Insertion de la région hydrophobe de gp41

ridiae, Flaviviridae

dans la membrane cellulaire

Virus non enveloppés : Adenoviridae, Polyomaviridae

-

Fusion des 2 mb et pénétration de la cap-

  • - Le virus est « internalisé » au sein d’une vésicule (endosome).

side dans le cytosol

  • - L’acidification de l’endosome modifie la conformation des pro-

téines virales d’attachement (HA pour influenza A) qui s’insèrent dans la membrane cellulaire

 
téines virales d’attachement (HA pour influenza A) qui s’insèrent dans la membrane cellulaire
  • - L’acidification du virus induite par une « pompe à protons » (la protéine M2 pour le virus influenza A) entraîne une décapsida- tion et une dissociation des constituants viraux (M1 et RNP)

  • - Libération des génomes qui pourront pénétrer dans le noyau

Le transfert du matériel viral à travers la membrane cellulaire Exemple : Picornaviridae Insertion d’une partie hydrophobe de VP1 dans la mem- brane. Réalisation d’un pore dans la membrane cellulaire qui per-

met le passage de VP4 et de l’ARN viral dans le cytosol.

c. Décapsidation

Dégradation de la capside et libération du génome viral dans le cytoplasme cellulaire. Étape nécessaire pour que le génome puisse fonctionner (détourner la machinerie enzymatique) et livrer son informa- tion génétique

  • a. Virus à ADN :

Double brin, exemple : HPV (voie 1-2-3)

Simple brin, exemple : Parvo B19 (voie 7-1-2-3)

  • b. Virus à ARN :

Le génome des virus à ARN peut prendre différents aspects :

segmenté ou non, bicaténaire ou monocaténaire, polarité (+) (identique à un ARNmessager) ou polarité (–) (l’ARN polymé- rase doit alors être associée aux virions) La synthèse de nouvelles molécules d’ARN (génomiques ou messagers) fait intervenir une enzyme inconnue de la machi- nerie cellulaire : l’ARN polymérase-ARN dépendante + Virus à ARN + (ex : Flaviviridae, virus hépatite C, Zika virus) : voie 3 ARN génomique directement messager -> synthèse protéique + Virus à ARN – (ex : Rhabdoviridae, virus de la rage) : voie 5 puis 3 ARN génomique non directement messager, nécessite une transcription ARN- en ARN+ grâce à une ARN polymérase ARN dépendante (transcriptase). L’ARN+ synthétisé sert d’ARNmessager -> synthèse pro- téique + Rétrovirus (ex : HIV) ARN+ -> ADN complémentaire par une transcriptase inverse Intégration au génome cellulaire par une intégrase -> provi- rus Transcription en ARNm et ARN génomique Traduction des protéines virales

2. Expression et réplication du génome viral

Le génome viral libéré prend la direction des synthèses, dans la cellule. Il se substitue en totalité ou en partie au génome cellulaire qui jusque là organisait les synthèses cellulaires. Le génome cellulaire faisait en sorte que la cel- lule produise des sécrétions, exocrines ou en- docrines, et éventuellement des éléments pour faire une 2ème cellule. Désormais, la cellule va produire des virus. Plus précisément : des copies du génome viral (réplication), des répliques de protéines virales, protéines de capside, glycoprotéines de péplos (pour les virus enveloppé). Le mécanisme de cette réplication virale varie selon que le génome est à ARN ou à ADN. Mais, dans tous les cas, c’est par des ARN messagers viraux que les génomes viraux transmettent leur information et donnent leurs ordres à la machinerie cellulaire. La stratégie de multiplication est dépendante de la nature du matériel génétique : ADN ou ARN, bicaténaire ou monocaténaire, segmenté ou non, circulaire ou linéraire. Au centre et en trait gras, la voie classique que l’on observe chez toutes les cellules

Le transfert du matériel viral à travers la membrane cellulaire Exemple : Picornaviridae Insertion d’une partie

3. Etapes tardives : matura- tion, assemblage, libération

  • a. Maturation :

+ Maturation des protéines vi- rales après traduction - Protéolyse -> protéines fonc- tionnelles (réplicases, protéines de structure) - Glycosylation dans appareil de Golgi + Migration aux sites de réplica- tion, d’assemblage, à la surface cellulaire

b. Assemblage :

Les protéines de structure s’auto-

assemblent en capsomères puis en nu- cléocapside par intégration du génome répliqué. L’assemblage a lieu au niveau du :

- Noyau (virus à ADN : Adénovirus, Her- pès) - Cytoplasme (virus à ARN : Picornavi- rus, ADN pox) -> anomalies morphologiques de la cel- lule : inclusions contenant des virions

Le transfert du matériel viral à travers la membrane cellulaire Exemple : Picornaviridae Insertion d’une partie
  • c. Libération :

+ Virus enveloppés : libération par BOURGEONNEMENT Ces virus acquièrent leur enveloppe par bourgeonnement à partir de la membrane cellulaire (celle-ci peut-être : la nucléaire interne, membrane de Golgi, membrane endoplasmique, MP externe) + Virus nus : libération par LYSE Après accumulation des virions en quantité importante, il y a rup- ture de la cellule hôte et libération des particules virales complètes et matures. Elles vont alors trouver une nouvelle cellule hôte pour perpétuer le cycle.

Conséquence de la multiplication virale pour la cellule infectée

  • 1. Mort de la cellule : infection lytique

Si la structure et la fonction cellulaires sont gravement

perturbées par l’accumulation de matériel viral, la cellule meurt soit par : nécrose ou apoptose. Tout le problème est de savoir si ces cellules peuvent être rempla- cées par d’autres cellules au sein de l’organisme.

  • 2. Tolérance de l’infection : infection tempérée

Le génome viral et le génome cellulaire se partagent le potentiel de

synthèse cellulaire : le virus et la cellule coexistent selon un com- promis acceptable => Modus vivendi

  • 3. Transformation cellulaire maligne

La cellule se multiplie de façon anarchique. La cellule infectée ac- quérant des caractères généralement attribués aux cellules cancé- reuses (perte de l’inhibition de contact). Exemples : HPV, hépatite virale B et C

Virus

Membrane à travers laquelle s’effectue le bourgeonnement

HSV

Nucléaire interne puis Golgi

Poxvirus

Golgi

Flavivrus

Membrane endoplas- mique

Orthomyxovirus

Membrane plasmique interne

Paramyxovirus

MP externe

Rhabdovirus

MP externe

Retrovirus

MP externe

c. Libération : + Virus enveloppés : libération par BOURGEONNEMENT Ces virus acquièrent leur envelo ppe

MÉCANISMES GÉNÉRAUX DES INFECTIONS VIRALES

Introduction

La Pathogénèse virale est l’ensemble des manifestations cliniques dues à une infection virale. L’action pathogène résulte de : l’action directe du virus sur l’organisme ou la réponse de l’organisme à l’infection virale. La virulence sera donc liée :

Au virus lui-même : quantité de virus, organes ou cel- lules cibles, cytopathogénicité Ou à l’hôte : réponse adoptée ou pathologique qui dé- pendra de l’âge, la nutrition, l’état humoral, la race

  • 2. Les muqueuses

    • a. L’oropharynx et le tractus intestinal :

+ Ingestion d’eau ou d’aliments souillés + Porte d’entrée pour de nombreux virus + Seuls les virus résistants peuvent infecter les cellules du tube digestif + Certains se multiplient dans les cellules du tractus intestinal et sont responsables d’une infection localisée (gastroentérites) + D’autres diffuseront via le sang ou la lymphe vers un organe cible (entérovirus) ou donneront une infection systémique

Propagation du virus dans l’organisme :

L’Entrée du virus dans l’organisme : Conditionne le mode de transmission du virus

1. La peau

La peau est une barrière naturelle assurant une protection efficace. Elle peut être franchie par les virus lors des lésions superficielles (Herpesviridae, Papillomaviridae), de morsures (rage, herpes simien type B), de piqûres ou blessures accidentelles AES (HBV et virus delta, HCV, HIV, CMV), des piqûres de moustiques ou des morsures de tiques (arbovirus) Plusieurs virus peuvent se multiplier dans les cel- lules de la peau : Herpesviridae, Poxviridae, Papillo- maviridae.

Mécanismes d’entrée au niveau du tractus in- testinal :

Les virions sont incorporés par endocytose dans les cellules M des plaques de Peyer et libérées au ni- veau de la membrane basales. Les virions traver- sent les cellules épithéliales par transcytose. Ce mécanisme a été montré pour HIV au niveau du rectum.

  • b. Muqueuses respiratoires :

b. Muqueuses respiratoires :
b. Muqueuses respiratoires :
  • c. Muqueuses génitales :

+ La pénétration est possible par les micro- traumatismes de cette muqueuse.

+ Les HPV s’y multiplient et sont respon- sables d’une infection locale. + Les HSV s’y multiplient et diffusent par les voies nerveuses. + HIV et HBV peuvent pénétrer dans l’orga- nisme par cette voie sans se multiplier dans les cellules épithéliales de la muqueuse génitale.

  • d. Muqueuses conjonctivales :

+ l’ADV-8 est transmis par les instruments ophtalmiques et les piscines, donne une con- jonctivite saisonnière + l’ADV-37, HSV-1, virus de la vaccine et l’en- térovirus-70 donnent des viroses oculaires.

HPV= Human Papillomavirus HSV= Herpes simplex virus : virus de l’herpès HIV= human immunodeficiency virus

Diffusion dans l’organisme :

1. Diffusion loco régionale :

L’infection peut être localisée au niveau de la porte d’entrée (peau et muqueuses) ou diffu- ser aux tissus proches :

+ Le tractus respiratoire pour la grippe, rhi- novirus, RSV + Digestif pout les rotavirus, calicivirus, adé- novirus entériques

2. Diffusion généralisée :

À partir du site d’entrée et souvent d’une ré- plication initiale loco régionale, les virus diffu- sent vers d’autres tissus ou organismes par voie hématogène ou neuronale.

a. Voie hématogène :

+ À partir du site de pénétration, le virus emprunte les ca- naux lymphatiques afférents et migre jusqu’aux ganglions lymphatiques régionaux où ils peut se multiplier. + Via les canaux lymphatiques efférents puis le canal thora- cique, ils atteignent la circulation sanguine systémique où il est responsable d’une première virémie de faible intensité. + Certains virus se multiplient dans les cellules de l’endothé- lium vasculaire ou dans les cellules (monocytes, LB, LT, rare- ment des érythrocytes). Ils sont ensuite souvent libérés dans le plasma. Ainsi, la virémie peut être plasmatique (particules virales libres dans le plasma) et/ou cellulaire (virus intracel- lulaire). + La dissémination du virus entraîne une virémie secondaire avec des concentrations virales plus importantes. + La virémie est un phénomène dynamique avec en perma- nence une production et une élimination. Les cellules du sys- tème réticuloendothélial de la rate, du foie, des poumons et des tissus lymphoïdes jouent un rôle important dans l’élimi- nation du virus. Ils peuvent aussi être le lien de multiplica- tion virale secondaire. + Dans la majorité des cas, la virémie est de courte durée (quelques jours) disparaissant avec l’apparition des anticorps neutralisants. + Dans certains cas, la virémie persiste, la cause peut être :

- La formation de complexes immuns (virus-Ac) qui conser- vent l’infectivité initiale des virus - Un phénomène de tolérance qui peut apparaître lorsque l’infection a eu lieu in utero avant la maturation du système immunitaire : exemple les infections à HBV ou rubéole.

b. Voie neuronale : voie de dissémination utilisée soit exclu- sivement (rage, certains réovirus), soit une alternative à la voie hématogène (HSV). La pénétration du neurone s’effectue selon les mécanismes décrits pour les autres cellules. A l’intérieur du neurone, le virus se déplace grâce aux sys- tèmes de transport de la cellule selon un sens rétrograde dans les nerfs sensitifs ou antérograde dans les nerfs mo- teurs.

Polymorphisme de l’expression clinique 1. Selon l’intensité de la symptomatologie La manifestation pathologique d’une infection virale
Polymorphisme de l’expression clinique 1. Selon l’intensité de la symptomatologie La manifestation pathologique d’une infection virale

Polymorphisme de l’expression clinique

1. Selon l’intensité de la symptomatologie

La manifestation pathologique d’une infection virale

est un phénomène variable d’un virus à l’autre. Mais pour beaucoup de virus, c’est un phénomène relative- ment rare, la plupart des infections seront asympto- matiques.

2. Selon le virus

Infections aiguës :

+ Localisées : au niveau des tissus de la porte d’entrée (gastroentérites, rhinites, condylomes) + Généralisées : grippe, atteintes neurologiques ou cardiaque des entérovirus, HIV Infections persistantes avec périodes de latence et de récurrences : Herpesviridae Infections persistantes d’évolution progressive : rou- geole dans le cadre de la PESS Infections chroniques :

avec infection aiguë suivie d’une évolution lente vers une maladie plus grave (cirrhose et carcinome hépa- tique pr HBV et HCV // SIDA pr HIV) Infections lentes : sans manifestations cliniques ou biologiques lors de la primo-infection

3. Les barrières :

  • a. Barrière hémato-encéphalique :

S’oppose à la diffusion virale, elle est formée par les cellules endothéliales des capillaires sanguins et est caractérisée par l’existence de jonctions ser- rées. Les prolongements astrocytaires associés aux cel- lules endothéliales participent à la formation de la BHE. Le plexus choroïde : L’épithélium choroïde est com- posé d’une rangée de cellules épithéliales jointes par des jonctions serrées créant ainsi une barrière.

  • b. Passage transplacentaire :

+ Prénatal : rubéole, CMV, parvovirus B19, VZV (virus varicelle-zona)=> embryopathie, foetopathie + Périnatal : HSV, HBV, HIV, CMV, VZV, HPV? CMV= cytomégalovirus => infection du Nné généra- lisée ou non

+ Postnatal : HTLV, HIV, HBV, CMV HTLV = Virus T-lymphotropique humain => infection du nourris- son

Organes cibles

Organe dont l’atteinte au cours de l’infection virale donne les signes cliniques caractéristiques de la maladie. Facteurs de tropisme : sensibilité, permissivité

Voies d’excrétion + Tractus respiratoire : toux, éternuement (rougeole, grippe, variole) + Peau : liquide vésiculaire HSV + Selles : entérovirus, VHA, rotavirus + Urine : R.O.R, HBV, CMV, arénavirus + Sperme : HIV, HBV, CMV + Lait : CMV, oreillons, rétrovirus

Facteurs intervenant dans la pathogenèse

1. Facteurs liés au virus

+ Quantité de virus, voie d’inoculation, cytopatho- génicité, tropisme + Échappement du virus à la réponse immuni- taire :

  • - Latence

  • - Variabilité génétique

  • - Inhibition de l’expression du CMH + Résistance aux antiviraux + Bases moléculaires de pathogénicité

    • - Souches atténuées

    • - Augmentation de la virulence

2. Facteurs liés à l’hôte

+ Déficits immunitaires primaires ou acquis (transplantations, SIDA) + Âge, grossesse, état hormonal, malnutrition + Réponse immunitaire vis-à-vis de l’infection : ma- ladies auto-immunes, bronchiolites à VRS (virus respiratoire syncytial)

VACCINATION ANTIVIRALE

Généralités

Introduction

La vaccination est un moyen de prévention efficace en santé publique. Elle permet l’élimi- nation ou l’éradication de certaines infections épidémiques

Définition

Immuno prophylaxie active spécifique à une maladie infectieuse virale ou bactérienne, donnant une protection différée et durable.

Principe

Introduction dans l’organisme d’une prépara- tion antigénique dérivée d’un agent pathogène spécifique (ou apparenté à celui-ci), capable

d’induire, chez un sujet réceptif, une réaction immunitaire protectrice vis-à-vis de cet agent.

Bases immunologiques de la vaccination

Réponse cellulaire et humorale

Les macrophages phagocytent l’antigène et le présentent aux cellules immuno- compétentes :

+ LT : support de l’immunité à médiation cel- lulaire et de la mémoire immunologique

+ LB : qui se différencient en plasmocytes sé- créteurs d’immunoglobulines spécifiques IgM IgG IgA supports de l’immunité humorale

Réponse primaire et secondaire

Le premier contact avec l’antigène est suivi d’une réponse primaire caractérisée par une ascension différée et lente des anticorps qui culmine entre le 2ème et 4ème semaine à un niveau faible, pour décroître ensuite rapide- ment. Tout contact ultérieur, même très lointain, avec le même antigène induira une réponse secondaire, mettant en oeuvre la mémoire im- munologique thymodépendante, caractérisée par une ascension rapide (en quelques jours) importante et durable des anticorps protec- teurs (effet rappel).

Généralités Introduction La vaccination est un moyen de prévention efficace en santé publique. Elle permet l’élimi-

Objectifs généraux et évaluation des stratégies vaccinales

Objectifs généraux de la vaccination

Eradication ou contrôle de la maladie par le biais de pro- grammes de vaccination contrôles => objectif atteint pour la variole, la poliomyélite est candidate. Prévention contre l’infection ou prévention contre la maladie Objectif thérapeutique et non prophylactique : rage, peut être HIV

Evaluation des stratégies vaccinales

Vérifier que la préparation vaccinale est immunogène et non toxique Vérifier l’efficacité : comparaison du risque relatif de maladie dans la population vaccinée et non vaccinée

Classification

Vaccins vivants atténués : vaccins réplicatifs

Virus ou bactéries ayant perdu leur pouvoir pathogène, mais capables de se multiplier dans l’organisme, provoquent une véritable infection sans manifestations pathologiques Induisent une réponse immunitaire cellulaire et humorale Obtention : passage sur différents animaux ou des cellules et mutation génétique

Avantages

Inconvénients

Immunité naturelle humorale et cellulaire. Plus longue à protection rapide Faible dose d’Ag 1 seule injection Vaccins : bon marché Immunisent sans adjuvants

Mutation reverse à virulence Très sensibles à la chaleur Contre indiqués chez la femme enceinte et l’immunodéficient

Exemples :

* Vaccins bactériens : 1 seul commercialisé : BCG -> tubercu- lose, compté parmi les + tolérés (la meilleure voie = intrader- mique)

* Vaccins viraux :

+ Rougeole : souche schwarz + Oreillon : souche jeryl-lynn dans ROR + Rubéole : souche Wistal RA 27/3 M + Poliomyélite : vaccin oral => 3 types sauvages : 1, 2 et 3; 3 administrations sont nécessaires + Fièvre jaune : souche AMARIL 17D + Varicelle

Nouveaux vaccins :

Vaccins atténués empiriquement : varicelle (souche OKA), dengue, CMV (souche TOWNE), rotavirus (souche WC3) Vaccins obtenus par mutagénèse dirigée : shigellose, fièvre thyphoïde sont dispo // HSV et vibrion cholérique sont en voie de recherche Vaccins vivants recombinés : (chimériques) l’institut pasteur => un vaccin (voie orale) contre la shigellose fait l’objet d’es- sais chez l’Homme

Vaccins inactivés : vaccins non réplicatifs

+ On distingue :

  • - Suspensions virales : infectivité détruite par un agent chi- mique (formol ou betapropiolactone) ou physique (chaleur)

  • - Sous-unités virales avec fraction protéique ou polysacchari- diques

+ Ils induisent une immunité surtout humorale

Avantages

Inconvénients

  • - Facile à préparer

 
  • - Excellente innocuité

  • - Immunité surtout humo-

  • - Excellente conservation :

rale

stables à la chaleur (avantage

  • - Faible durée de protection

dans les pays chauds)

  • - Nécessité de plusieurs

  • - Peuvent être administrés à

doses ainsi que rappels

l’immunodéprimé, femme en-

(coût ++)

ceinte et peuvent être adminis- trés au nouveau né en présence

  • - Faible rentabilité de pro- duction

d’Ac maternels ce qui permet une vaccination précoce

  • - Adjuvants

Vaccins sous-unités protéiques : exemple vaccin de l’hé- patite B

A partir de 1985, la production de l’Ag HBs est assurée par génie génétique à partir de la levure de bière : Saccharomyces cerevisiae ou par des cellules de mammifères, les cellules CHO (Chinese Hamster Ovary)

  • 2. Vaccins sous-unités polysaccharidiques/ glycosidiques

Pas de coopération LB et LT Les LB produisent directement les Ac

Donc sont faiblement immunogènes (immunité est thymo- dépendante) Leur conjugaison à un AG protéique à réponse immunolo- gique T-dépendante

  • 3. Vaccins sous-unités conjugués

Fragments antigéniques de courte taille qui sont de nature saccharidique couplés chimiquement à une protéine porteuse (anatoxine tétanique ou diphtérique par exemple) ou à une autre structure, pour les rendre immunogènes Ex : vaccin contre la méningite et les infections à pneumo- coques notamment DTC-Hib, DTCPHib

Vaccins du futur

+ Associations vaccinales + Amélioration de vaccins existants

+ Nouveaux vaccins : VRS, Helicobacter pylori, ETEC, Lyme, Herpes, Papillomavirus + Exploiter l’immunité muqueuse :

  • - Immunité systémique : humorale, cellulaire

  • - Immunité muqueuse : cellulaire, IgA sécrétoires

Dans le but de mettre au point ces nouveaux vaccins, de nouvelles stratégies vaccinales ont été développées depuis 1980 :

+ Vaccins recombinants + Vaccins DNA + Peptides ou particules virales recombinantes

Virus entiers : grippe, hépatite A, poliomyé- lite, rage, méningo-encéphalite à tiques d’eu- rope centrale, encéphalite japonaise Sous-unités virales : grippe (Ag de surface), hépatite B (Ag de surface)

Cas particulier du vaccin de la rage : le

vaccin anti-rabique

Vaccins de 2ème génération préparés à partir de cultures cellulaires permettent une utilisa- tion prophylactique et thérapeutique Utilisation thérapeutique après appréciation

du risque de contamination et désinfection 5 injections : j0, j3, j7, j14, j28

+/- Ig antirabiques sous contrôle médical

(centre antirabique) Utilisation prophylactique chez les sujets ex- posés : vétérinaires, forestiers, personnes

ayant ou voyageant en zones d’enzootie ra- bique 3 injections : j0, j7, j28, 1 rappel à 1 an

puis tous les 5ans

Effets indésirables

+ Complications dues aux vaccins vivants, d’expression retardée

+ Des vaccins inertes, immédiats ou précoces relevant de réactions d’hypersensibilité ou d’effets toxiques + Complication mineure ou bénigne considé- rée comme acceptable

  • - Réaction locale (précoces avec les vaccins

inactivés ou différée BCG)

  • - Épisode fébrile pendant 1 à 3 jours (précoce

avec les vaccins inactivés ou différé avec les

vaccins vivants)

  • - Convulsions hyperthermiques (avec les vac- cins anti-coquelucheux et anti-rougeoleux)

  • - Éruption

  • - Arthralgies, arthrites (chez adulte avec vac- cin rubéole, Hépatite B)

  • - Parotidite, réaction méningée (vaccin anti-

ourlien) + Les accidents :

  • - Liés au vaccin anticoquelucheux (inactivé

complet) : syndrome des cris persistants,

choc, convulsions,

  • - Liés à la vaccination anti-polyomyélitique orale : paralysies

  • - Bécégites généralisées pouvant compliquer

le BCG quand il est inoculé à un sujet por-

teur d’une immunodéficience congénitale ou acquise

Voies d’administration Voie intradermique : BCG à face externe du bras Voie intramusculaire : deltoïde ou face antéro- latérale de la cuisse Voie sous cutanée : deltoïde ; recommandée pour vaccins viraux et vaccins polysacchari- diques (Hib, pneumocoque) Voie orale : polio orale

Varicelle : personnes en contact avec les nourrissons et petits enfants Rage : vétérinaires, gardes-forestiers et gardes-chasses, personnel des abattoirs Hépatite A : personnels des crèches et écoles, personnels en contact des eaux usées et alimentation de collectivité Leptospirose : recommandée pour vétéri- naires, bouchers, employés d’abattoirs Brucellose : conseillée pour les employés d’abattoirs Anti méningocoque tétravalent : A, C, Y, W. pélerins + Vaccins inutiles en cas d’infection ulté- rieure : antiourlien, antirougeoleux, antiru- béoleux, antipolio inj, antihépatite B et A + Vaccins CI chez l’Immunodéprimés : BCG et VVA

Indications et contre indications

Vaccins à indications généralisées

Ce sont les vaccinations qui sont recommandées à l’ensemble de la population

Elles visent des maladies considérées comme des priorités de santé publique à cause de leur fréquence et/ou gravité. Au Maroc, comme partout dans le monde, un calendrier des vac- cinations est régulièrement publié qui entre dans le Pro- gramme National d’Immunisation (PNI)

Vaccination de l’enfant allergique

+ Vaccins préparés sur oeuf embryoné sont CI chez les aller- giques à l’oeuf + Pas de vaccination lors d’une poussée évolutive de la mala- die + Le vaccin ne doit pas contenir un ATB + Prescrire un anti-histaminique, sauf pour le BCG

Vaccination de l’enfant malade/voyageur

+ Splénectomisés, drépanocytaires homozygotes : vaccination pneumococcique est nécessaire ; à renouveler tous les 5 ans + BCG est CI : SIDA ; les autres VVA : controversé // eczé- ma : BCG en dehors des poussées + Voyageur : mettre à jour DTCP, BCG, Hémophilus. Vaccin de fièvre jaune (voyage international) à partir de 1an + Vaccins recommandés : HVA, typhoïde: à partir de 2ans, HVB, méningiocoque A et C à partir de 18 mois

Vaccination de l’adulte

+ Mise à jour : tétanos, polio, HVB, rubéole, jusqu’à 45ans. A partir de 65ans : grippe tous les ans

Personnel de santé

+ Mise à jour des vaccinations anti-tétanique, du polio (tous les 10ans), Hépatite B, grippe, varicelle et ROR (non immunisés) + La polio orale et la variole sont CI à l’entourage des patients im- munodéprimés + Vaccination anti-typhoïde pour personnel de labo + Contact direct avec malade atteint de méningite C : vaccination urgente

Vaccination de la femme enceinte

Vaccins possibles sans risque : polio inj, HB, grippe, antirabique, antitétanique, anti méningococcique, anti cholérique Vaccins contre indiqués : polio orale, rougeole, rubéole, ourlien Les autres sont déconseillés

LA CHIMIOTHÉRAPIE ANTIVIRALE

Introduction

Substance virucide : substance visant à obtenir la mort ou l’élimination des micro organismes et/ ou l’inactivation des virus Substances virostatique : inhibiteurs de la répli- cation virale, sans élimination ni mort du virus

Voies d’administration Voie intradermique : BCG à face externe du bras Voie intramusculaire : deltoïde ou

Activité comparée de quelques produits désinfectants

 
 

Gram

Gram

Myco-

Spores

Champignons

Virus

+

-

bactéries

et levures

Eau de javel

+++

+++

-

+

++

+

Aldéhydes

+++

+++

++

++

++

++

Alcool à 70°

++

++

++

0

-

-

Chlorhéxidine

+++

++

+++

0

+

?

Antiseptiques et désinfectants

Les antiseptiques et désinfectants sont des substances virucides agissant par contact direct avec les virions présents sur la peau

(antiseptique), le matériel ou les surfaces. Ils ne remplacent ja- mais les mesures d’hygiène uni- verselles. Finalement, l’objectif est de prévenir le danger biolo- gique. Pour prévenir le risque bio-

logique, il faut connaître le dan- ger à posséder la carte d’identité de l’agent pathogène à manipuler

et connaître son niveau de sécuri-

té biologique situé entre 1 et 4.

Classement des agents biologiques pathogènes selon le groupe de risque d’infection

Niveau de sécurité bilogique/Level L

Niveau

Exemple

L1

Risque faible

Bacillus subtillis

L2

Risque modéré

Virus de la rougeole

L3

Risque fort

Virus de la rage

L4

Risque très fort

Virus de la variole SRAS Coronavirus Virus Ebola

Inhibiteur de la pénétration du virus

Mode d’action des drogues bloquant la péné tration des Picornaviridae

Mode d’action des drogues bloquant la pénétration des Picornaviridae

Picornaviridae : Ple ́ conaril

Picornaviridae : Pléconaril

Inhibiteurs de la fusion du HIV : T20 fuseon :

Inhibiteurs de la fusion du HIV : T20 fuseon :

Antiviraux :

Les antiviraux sont des substances virostatiques qui ne sont actifs in vivo que sur des virus en phase de multiplication, et inactifs sur les virus quiescents. La majorité des antiviraux inhibent l’action d’enzymes spécifiques.

Les antiviraux actifs sur les étapes initiales

Inhibiteur de l’attachement du virus

Inhibiteurs de la liaison au co-récepteur CCR5 :

SCH-C : petite molécule se fixant dans une cavité hydrophobe de CCR5 et inhibant la liaison du virus (en essai clinique)

Inhibiteur de la décapsidation du virus

Inhibiteur de la décapsidation du virus
Inhibiteur de la décapsidation du virus
Inhibiteur de la décapsidation du virus

Les antiviraux actifs sur les étapes réplication/ transcription

Médicaments agissant sur la réplication des virus :

Cibles : intégrase, DNA polymérase, Reverse trans- criptase, Hélicase-primase, RNA réplicase

Inhibiteurs de l’intégrase :

+ Naphtyridines : le dernier représentant est le MK-0518 (phase III) + Hydroxyquinoléines : le GS-9137 en est le pre- mier représentant (phase II)

Inhibiteurs de DNA polymérase/Rétrotranscriptase :

+ Analogue nucléosidique :

La phosphorylation et l’incorporation des analogues à la place des bases nucléosidiques normales a pour consé-

quence : terminaison de l’élongation de la chaîne ADN ou incorporation d’un analogue mutagène perturbant la réplication et générant ainsi des produits non viables.

+ Analogue non-nucléosidique :

Inhibition de la RT en se fixant à proximité du site cata- lytique de l’enzyme.

Les antiviraux actifs sur les étapes tardives

Sur la maturation :

Anti-protéases ou inhibiteurs de protéase : Atanazivir Exemple : la protéase HIV est cru- ciale pour la maturation de la poly- protéine GAG et donc pour l’assem- blage des protéines virales.

Sur la libération :

Neuraminidase des virus grippaux : alors que les protéines de surface des virus grippaux sont très variables :

+ Le site actif des neuraminidases grippales est toujours très conservé + La neuraminidase grippale est essentielle à la multiplication virale et la libération des nouveaux virus et constitue alors une cible idéale pour l’intervention antivirale. Exemple d’inhibiteur de la neuraminidase : Zanamivir (Relenza), Osel- tamivir (Tamiflu), Actifs sur les virus grippaux de type A et B

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE

Introduction

Le diagnostic virologique est un en- semble de principes, de méthodes et de stratégies visant à détecter, à quantifier, à suivre et à identifier précisément les infections virales humaines.

Infection sévère (ex : encéphalite vi- rale) Infection survenant sur un terrain ImmunoDéprimé (ex : fièvre chez un transplanté « CMV » ) ou sur un ter- rain fragile (ex : bronchite asthmati- forme « RSV » ou gastro-entérite en période néonatale « Rotavirus ») Confirmation de l’origine virale d’une infection justifiant un traite- ment (ex : herpès génital récidivant)

Diagnostic direct : Détection du virus ou de ses composants dans fluides bio- logiques ou tissus Diagnostic indirect : = diagnostic séro- logique = Sérodiagnostic = détection d’Ac anti-viraux, produits/organisme infecté

dans sérum ou autre fluide biologique

Suivi de grossesse Détermination du statut immunitaire d’un sujet avant de le vacciner. Suivi de l’évolution d’une infection virale prolongée et de son traitement (ex : infection à HCV, HBV ou HIV) Accident par exposition au sang (AES) Identification d’une épidémie Criblage virologique des dons de sang,

organes, tissus ou cellules.

du diagnostic virologique

Principales

indications

Diagnostic direct / indirect + N’apportent pas les mêmes informations + Ne doivent pas être systématiquement

pratiquées ensemble

+ La sérologie est basée sur la réaction élémentaire Ag-Ac :

- Détection d’une protéine virale : Ac de référence -> Diag. direct - Détection d’un Ac sérique : protéines virales de référence - > Diag. indirect

Éléments ± robustes

Éléments

beaucoup

plus fragiles

Ac, Ag extracellulaires, ADN, vi- rus nus résistants dans le milieu extérieur

Virus infectieux desti- nés à culture, surtout virus enveloppés, Ag intracellulaires, ARN

Les conditions de conservation et de transport ont peu d’influence sur la fiabilité des analyses : pré- lèvements peuvent être conservés à +4°C pendant plusieurs jours

Les délais de conserva- tion sont plus courts et le transport doit se faire dans un milieu de transport et réfrigéré à

et transportés à température am- biante.

+4°C.

 

Diagnostic direct

Diagnostic indirect

Pra-

Plus complexe

Plus simple

tique

 

Échantillons biolo-

Sérum facile à obtenir

 

giques

de

nature

et à conserver

différente

Inter-

Plus simple

Plus complexe

prétat

Résultat positif -

Ex : variation physio-

ions

 

> infection virale

logique chez le nou-

d

e

s

productive

veau né chez qui des

résul-

Sensibilité et

Ac maternels peuvent

tats

 

spécificité de la technique utilisée

persister jusqu‘au 18mois ou variation pathologique chez l’ID

LE DIAGNOSTIC DIRECT : DETECTION DU VIRUS/CONSTITUANTS

Isolement du virus

Microscopie

Détection d’Ag

Détection du

électronique

génome

 

Sur animal de labo-

 

Immunocytodia-

Hybridation sans

a m p l i f i c a t i o n

ratoire

gnostic ELISA

amplification

Sur oeuf embryonné Sur cultures cellu- laires :

Immunodiffusion (bandelette, sa- vonette)

H y b r i d a t i o n après

· ECP

Agglutination des

(PCR

et

ses

va-

· Immunocytodia-

particules

riantes)

 

gnostic

Latex

Séquençage

 

Mise en évidence du virus

Culture virale

Le virus est un parasite intracel- lulaire obligatoire. Par consé- quent, La culture ne peut être obtenue que sur des cellules vi- vantes. La culture virale est la mé- thode de référence : on va isoler le virus, l’identifier et le purifier => obtention d’une souche virale

Trois sources de cellules vivantes

 

Cellules en culture +++

Animal de

OEuf de poule

laboratoire

embryonné

Seul système utilisé en pratique

Peu utilisé en

Exceptionnel

courante

routine.

Très

utilisé

Base du diagnostic virologique.

Actuellement,

dans passé

Chaque virus possède un tro-

grand

(virus

 

grip-

pisme cellulaire propre => il

intérêt dans

paux)

 

n’existe pas de système de cul-

la réalisation

Actuellement,

ture cellulaire universel (un seul

des modèles

il

est

utilisé

type de cellules ne va pas faire

expérimen-

pour

la

pro-

pousser tous les virus)

taux.

duction de vac-

Par conséquent, un laboratoire de virologie doit entretenir un minimum de 2-3 lignées cellu- laires permettant la réplication du plus grand nombre de virus pathogènes pour l’homme.

Indispen- sable pour la multiplication de certains virus

cins.

 

Définition de la culture cellulaire

C’est la multiplication de cellules dans un milieu stérile, sur un support en verre ou plastique auquel elles adhérent pour former une couche monocellulaire ou une suspension.

AVANTAGES

INCONVENIENTS

  • - Pouvoir infectieux

Durée souvent longue: 48h-10j

  • - Sensibilité +++ Réfé- rence

  • - Coûts élevés en réactifs, équipe- ments, locaux et personnel

  • - Etude ultérieure des

  • - Difficultés techniques (cytotoxicité

caractéristiques fonc- tionnelles et structu-

des prélèvements, contamination bac- tériologique ou fongique)

rales de la souche vi- rale.

  • - Lecture subjective (dépend de l’expé- rience de l’opérateur)

  • - Etude de sensibilité

  • - Risque infectieux lié à l’amplification

aux antiviraux

du virus (nécessité d’un labo de haute

sécurité pour un confinement strict)

  • - La culture ne peut se faire que sur les virus cultivables.

Le prélèvement : (c’est une étape très im- portante parce que l’infectiosité du virus doit être conservée) + La qualité du prélèvement conditionne les chances d’isoler un virus + Tout type de prélèvement + Le plus précoce possible, pendant la phase aiguë de la maladie (excrétion virale maximale). + Doit se faire de préférence au niveau de l’organe cible si accessible ou sinon de la porte d’entrée (arbre respiratoire), du site d’excrétion virale (les urines), du site de multiplication primaire (le sang). + Préserver la viabilité lors de l’achemine- ment au laboratoire, à l’abri de la dessicca- tion (desséchement), chaleur, variations de pH, éviter toute pullulation microbienne. + Les prélèvements sont effectués à l’écou- villon (ressemble au coton-tige) : à déchar- ger dans milieu de transport contenant des ATB + Par contre, les échantillons de sang, urine, selles, LBA (lavage broncho- pulmonaire), LCR, biopsies d’organes sont recueillis dans un récipient stérile. + Au labo, en attendant la culture à 2-6°C + Si > 36h à congélation -80°C ou en azote

liquide parce que la conservation à -20°C

ne permet pas de conserver l’infectivité du

virus sur une longue période.

LE DIAGNOSTIC DIRECT : DETECTION DU VIRUS/CONSTITUANTS Isolement du virus Microscopie Détection d’Ag Détection du électronique

Deux catégories de cultures cellulaires

Cellules issues de tissus nor- maux = Diploïdes

Lignées continues = Hétéroploïdes

Cellules primaires et secondaires Origine humaine ou animale Prélevées sur des organismes adultes ou embryonnaires. Cultures de cellules épithélioïdes (morphologie polygonale) ou fibro- blastiques (fusiformes)

Capacité de prolifération infinie Proviennent soit de tumeurs malignes soit de la transforma- tion spontanée ou viro-induite de cultures primaires ou secon- daires

EFFET CYTOPATHIQUE INDUIT PAR LES VIRUS

+ Nappe cellulaire détruite + Foyers de lyse. + Cellules ballonisées ou au contraire rétractées + Une fusion des cellules avec formation de syncytiums

Microscopie électronique

Permet de visualiser les particules virales de 20 à 300nm dans le prélèvement (tissus, cellules, liquides acellulaires). Selon la morphologie et la taille des particules virales, on peut dé- terminer la famille virale précisément.

AVANTAGES

INCONVENIENTS

Détection de virus non culti- vables dans selles au cours des gastro-entérites (rotavirus, cali- civirus, astrovirus) Identification de nouveau virus lors de syndromes d’allure virale sans étiologie reconnue

Ne différencie pas morphologi- quement 2 virus de la même fa- mille (ex : HSV et VZV) Manque de sensibilité: cc vi- rales +++ dans prélèvement Equipement adéquat : coût, maintenance et technicité +++

Détection des Ag solubles viraux : (Dans liquides biologiques)

Techniques immuno-enzymatiques: EIA (Enzyme Immuno As- say) :

Le chef de file est l’ELISA: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay Principe : Ac antiviraux souvent monoclonaux fixés sur phase so-

lide (microplaque, bille de plastique, membrane de nylon mettent la capture de l’Ag viral. ELISA « sandwich » :

)

per-

  • 1. Adsorption (fixation) des Ac spécifiques de l’Ag viral sur un

support solide

  • 2. Adsorption du prélèvement (addition de l’Ag)

  • 3. Lavage (pour éliminer ce qui n’a pas été fixé aux Ac du support)

  • 4. Ajout d’un 2ème Ac spécifique de l’Ag recherché conjugué à

une enzyme

  • 5. Lavage

  • 6. Addition du substrat incolore de l’enzyme qui le transforme =>

d’où l’apparition d’une réaction colorée visible à l’oeil nu et qu’on

peut aussi mesurer au spectrophotomètre Applications :

Ag HBs, Ag de HVC, Ag p24 dans le sérum Ag des rotavirus, adénovirus, calicivirus et astrovirus dans les selles Ag des virus grippaux, RSV sur prélèvement nasal

Le virus est inoculé sur culture de cel- lules permissives à Réplication virale cytolitique : on réalise alors un examen direct (ED) quotidien, càd une détection à l’état frais (sans coloration) au micros- cope optique inversé (faible grossisse- ment)

On va rechercher une réplication virale cytolytique en observant des altérations morphologiques de la nappe cellulaire à

c’est ce qu’on appelle un effet cytopa- thique ECP

qui dépend à la fois du virus et de la lignée cellulaire utilisée. Si on détecte un ECP, on peut alors ré- aliser une coloration des cellules préle- vées et étalées sur lame pour visualiser des inclusions virales ou des altérations nucléaires et cytoplasmiques. Immunomarquage spécifique du virus et lecture au MO ou à fluorescence

Mise en évidence des constituants antigéniques du virus

+ Immunocytodiagnostic par immuno-

fluorescence (IF) ou immunoperoxydase + Détection des Ag solubles par :

  • - Techniques immuno-enzymatiques

  • - Agglutination des particules de latex

  • - Immunochromatographie

Immunofluorescence (IF) et immu- noperoxydase

Principe de l’IF : visualiser directe- ment la présence d’Ag viraux dans les cellules infectées à l’aide d’un Ac spéci- fique du virus à rechercher, le plus souvent monoclonal, marqué à la fluo- rescéine + IFD (=directe) : on utilise un seul Ac marqué par le fluorochrome qui se fixe directement sur l’Ag viral + IFI (=indirecte) : on utilise un 1er Ac non marqué mais spécifique du virus et un 2ème AC marqué par le fluoro- chrome. -> émission de fluorescence visible au microscope à fluorescence Immunoperoxydase: marqueur fluo- rescent est remplacé par une enzyme peroxydase + substrat de l’enzyme

Applications :

+ HSV et VZV sur lésions cutanées + CMV dans leucocytes + Virus respiratoires (VI, RSV, VPI…) sur sécrétions rhinopharyngées ou LBA

Agglutination

Principe : Ac anti virus fixés sur mi- crobilles. En présence du virus, ag- glutination visible àl’oeil nu. Avantage : réalisation très rapide, facile < 30min, se fait directement sur le prélèvement. Inconvénient : moins sensible que ELISA Applications : rotavirus et adénovirus dans les selles riches en virus

Particularité par rapport à ELISA

Dépôt du prélèvement sur une ban- delette. Applications : rotavirus et adénovirus dans selles, détection des virus respi- ratoires

Mise en évidence des constituants génomiques du virus

3 méthodes : hybridation molécu- laire et ses variantes, amplification génique, séquençage nucléotidique

Hybridation moléculaire et ses va-

riantes

Détection directe d’ADN ou d’ARN sur divers supports (tube, microplaque, membrane) par une sonde spécifique du génome viral recherché, sans am- plification.

Immunochromatographie

Immunochromatographie

BILAN : Mise en évidence des Ag viraux

Avantages

Inconvénients

Exécution rapide, simple. + Tests à la disposition de laboratoires d’analyses médicales non spécialisés en Virologie + Tests spécifiques + N’exigent pas que le virus soit infec- tieux (pas de conditions de transport par opposition à la culture virale) + Automatisation (EIA) + Tests unitaires

Coût ++ + Manque de sensibilité (prélèvement riche en virus) + ImmunoFluorescence: lec- ture en fonction de l’expé- rience de l’observateur

PCR Classique

PCR Classique

Les éléments utilisés pour faire une PCR :

Dans le tube à PCR : ADN, donc des désoxyribonucléotides

(bases: A-C-T-G) et des amorces qui vont encadrer la région à amplifier.

On place le tube dans le thermocycleur : un four dans lequel les variations de T° vont être très rapides. On ajoute la TAQ polymérase, des ions Mg2+ qui vont être des activateurs de la PCR et un tampon.

Amplification génique

Le chef de file de cette technique est la PCR (Polymérase Chain Reaction)

+ Reproduction d’une portion limitée du génome viral, grâce à des amorces et à l’action d’une ADN polymérase. + Cette PCR constitue une révolution du diagnostic virologique puisqu’elle a la spé- cificité des techniques d’hybridation et une sensibilité à celle de la culture cellulaire. + Applicable à tous les agents viraux

Extraction

+ D’ADN ou ARN à partir du prélèvement. + Plusieurs méthodes :

  • - En routine: extraction par adsorption des

acides nucléiques (chargés -) sur des parti- cules de silice chargées +, puis élution

  • - Extraction manuelle: colonnes d’extrac- tion

  • - Extraction automatisée

Une PCR doit absolument se faire à partir d’un ADN (donc si virus à ARN, une RT le transforme en ADN)

Etapes de la PCR

Dénaturation

Hybridation

Elongation

95°

40-65°

72°

Description

Cette forte T°

une

s é p a r a t i o n

On diminue la T° pour

En utilisant les désoxyribonucléotides présents

entraine

l e

q u e d’amorces

c o u p l e puisse

se

dans le tube PCR, la TAQ polymérase (une enzyme résistante à la T°) commence la polymérisation

des

2

brins

fixer chacun sur le brin

pour l’élongation du brin d’ADN complémentaire.

d’ADN.

complémentaire

Résultat final du 1er cycle : 2 molécules d’ADN

La PCR en temps réel = la PCR quantitative

Intérêt : mesure de la production de produits ampli- fiés au fur et à mesure de leur synthèse. Utilisation d’une sonde fluorescente dont le signal est évalué en continu sans ouverture du tube de réaction (à on évite de risque de contamination) Indications : définir le pc d’une infection, poser les indications d’un TRT, vérifier l’efficacité thérapeutique Quantification : utilisation d’une gamme étalon qui permet d’extrapoler à partir d’un signal de fluores- cence, la quantité d’acide nucléique cible

Cette sonde comporte 2 molécules : le Reporter (qui émet une fluorescence) et le Quencher qui absorbe cette fluorescence. Quand le R et le Q sont rapprochés, il n’y a pas d’émission de fluorescence. Quand le R et le Q sont éloignés (après hydrolyse de la sonde), il y a émission de fluorescence. La TAQ polymérase commence la polymérisation en ajoutant les désoxyribonucléotides. Une fois que la TAQ polymérase arrive à la sonde, elle va l’hydrolyser -> et on aura une émission de fluores- cence.

Avantages et inconvénients de l’amplification gé- nique en temps réel Avantages :

+ Sensibilité + Spécificité + Reproductibilité + Large gamme de linéarité de signal + Rapidité d’obtention des résultats + Bonne résistance aux contaminations (pas d’ouver- ture du tube réactionnel) Inconvénients : Coût +++

Etapes de la PCR Dénaturation Hybridation Elongation T° 95° 40-65° 72° Description Cette forte T° une
Etapes de la PCR Dénaturation Hybridation Elongation T° 95° 40-65° 72° Description Cette forte T° une
Etapes de la PCR Dénaturation Hybridation Elongation T° 95° 40-65° 72° Description Cette forte T° une

Séquençage nucléotidique

+ Caractérisation des acides nucléotidiques = étude

de la séquence des acides nucléiques (séquençage de Sanger) + Plusieurs objectifs :

  • - Typage moléculaire : reconnaissance au sein

d’une même espèce virale, d’ou sous-groupe parti-

culier / sa répartition géographique, son épidémio- logie ou son pouvoir pathogène, ex : génotypes HCV

  • - Reconnaissance de mutations dans gènes cibles

des antiviraux, associées à des phénotypes de résis-

tance, ex : HIV

  • - Reconnaissance d’une souche virale impliquée

dans un cas de transmission nosocomiale (HDC,

HIV) ou d’une épidémie communautaire

  • - Compréhension de l’évolution des virus dans le

temps, de leur relation phylogénétique et des condi-

tions de leur émergence

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT

Introduction-Définition

Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux, produits par l’organisme en réponse à l’infection virale C’est la détection d’Ac anti-viraux produits par l’organisme infecté dans le sérum ou autre fluide biologique + Sérologie ou diagnostic sérologique = détection d’Ac ou d’Ag + Diagnostic indirect = détection d’Ac + Réaction de base Ag-Ac

Prélèvements

  • - Sérum +++ - Plasma - LCR - Urine

  • - Salive - Humeur aqueuse, vitrée - Liquide articulaire

+ Le plus tôt possible après le début de l’infection + Sérodiagnostic initial: référence au cours de l’évolu- tion + Site du prélèvement orienté par les signes cliniques + Transport: but = maintien de la fonctionnalité des Ac + Ac : éléments robustes è conservation à +4°C pendant plusieurs jours et transport à température ambiante + Congeler les échantillons de sérum : sérothèque

Techniques de diagnostic indirect

Agglutination

  • - Latex

  • - Hémagglutination

  • - Inhibition de l’hémagglutination (IHA) : Ac IHA inhibent la formation d’un Hémagglutinat

Lyse

  • - Fixation du complement

  • - Neutralisation : Séroneutralisation

Principe : Ac "neutralisants" car inhibent l’ECP viral Technique laborieuse nécessite un laboratoire de cul- ture cellulaire et un virus induisant un ECP rapide

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT Introduction-Définition Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux,
LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT Introduction-Définition Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux,
LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT Introduction-Définition Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux,

Immunoassays

Immunofluorescence Assay (IFA) Radioimmunoassay (RIA) Enzyme immunoassay (EIA)

LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT Introduction-Définition Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux,
LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT Introduction-Définition Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux,
LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE INDIRECT Introduction-Définition Diagnostic indirect : Détection des marqueurs immunologiques spécifiques, habituellement hu- moraux,

Enzyme immunoassay EIA

+ Bonne sensibilité et spécificité + Dosage qualitatif ou quantitatif + Distinction IgG IgM + Simple + Automatisable + Petit ou grand nb d’échantillons Ex : rubeole IgG, HIV, oreillons, rougeole IgG IgM…

EIA techniques manuelles : ELI- SA = Enzyme Linked ImmunoSor- bent Assay

EIA Techniques automatisées :

- Systèmes ouverts : microplaques EIA. Exemple ETIMAX. - Systèmes fermés

Interprétation :

Valeur seuil (VS) calculée par rapport aux contrôles + et - :

+ : DO > VS - : DO < VS douteux : DO = VS ± 10 ou

15%

EIA techniques manuelles : ELI- SA = Enzyme Linked ImmunoSor- bent Assay EIA Techniques automatisées :

Immuno-empreinte

+ Western-Blot (WB) + Immuno-Blot (IB) + RIBA : Recombinant IB Assay + SIA : Strip IB Assay Consiste à analyser la spécificité antigénique des Ac

Principe du WB : Fractionnement préalable des protéines virales a partir d’un lysat de cel- lules infectées (électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide) transfert sur un support ELISA (mais le support est une bandelette) Principe de l’IB : Dépôt directement sur membrane de protéines virales recombinantes et/ou des oligopeptides synthétiques

Immunofluorescence indirecte (IFI)

Avantages

Inconvénients

Rapide Coût raisonnable Distinction IgG IgM

Microscope à fluorescence Lecteur expérimenté Automatisation = 0 Utilise en 2° intention (confirmation) ou pour des analyses avec nombre d’échantillons limite

WESTERN-BLOT :

Principe

+ Détection Ac anti-HIV par immuno- empreinte

+ Permet de caractériser les anticorps dirigés contre chacune des protéines virales très spé- cifiquement

Electrophorèse sur Gel

+ 1e étape : dénaturation du virus (V) par un détergent ou autre agent (SDS) + 2e étape: séparation protéines du V (Ag) se- lon PM par électrophorèse sur gel de polyacry- lamide + 3e étape : transfert des protéines sur un bu- vard (blot) de nitrocellulose Incubation :

+ La bandelette de nitrocellulose est incubée avec le sérum du patient contenant (ou non!) les Ac anti-HIV + Les Ac spécifiques se lient aux Ag du blot + La bandelette est rincée pour éliminer les Ac non complexés Révélation :

+ Les C* (complexes) Ag/Ac sont révélés par un 2° Ac couplé à une enzyme + Le nouvel Ac se lie au C* lors de l’incubation et les Ac non liés sont rincés + Au contact du substrat de avec l’enzyme, une couleur apparaît Bandes témoins :

+ Contrôle positif : mise en contact des Ag du blot avec tous les Ac complexants emplace- ment sur le blot de chaque complexe + Contrôle négatif : sans présence Ac

Interprétation du Western Blot

+ Positivité certaine : Au minimum 2 Ac anti- env ET 1 Ac anti-gag ou anti-pol + Positivité probable : 1 Ac anti-gp24 ET 1 Ac anti-gp 160, 2 Ac anti-en

EIA techniques manuelles : ELI- SA = Enzyme Linked ImmunoSor- bent Assay EIA Techniques automatisées :
EIA techniques manuelles : ELI- SA = Enzyme Linked ImmunoSor- bent Assay EIA Techniques automatisées :
EIA techniques manuelles : ELI- SA = Enzyme Linked ImmunoSor- bent Assay EIA Techniques automatisées :
EIA techniques manuelles : ELI- SA = Enzyme Linked ImmunoSor- bent Assay EIA Techniques automatisées :

Cinétique des Ac

+ Infection résolutive: après la guéri- son, les Ac permettent un diagnostic rétrospectif (rougeole) + Infections latentes: les Ac signalent la présence du virus dans l’organisme (Herpesvirus) + Infections chroniques: présence d’Ac avec réplication persistante du virus (VIH, VHC)

Principales indications

Statut immunitaire

  • - Screening prénatal

  • - Screening pré et post vaccination

  • - Screening pré greffe

  • - Contact maladie contagieuse (ex : VZV femme enceinte)

Suivi :

  • - Femmes enceintes non immunes (Rubéole, CMV)

  • - Patients greffés (réactivations, infections post-greffe)

  • - Accident par exposition au sang AES

Diagnostic infection récente

  • - Virage des Ac: 2 sérums prélevés à 2 à 3 semaines d’intervalle

  • - Détection d’IgM spécifiques sur un sérum

Diagnostic infection congénitale

  • - Passage transplacentaire des IgG : reflet des Ac maternels

  • - Détection d’IgM

Epidémiologie, transfusion…