Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras para Su Biofuncionalización

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA

EN I N G E N I E R ~ AY TECNOLOG~ASAVANZADAS
UPIITA
"Sntesis de Nanopartculas Semiconductoras
para su Biofuncionalizacin"
Para obtener el ttulo de:
"Ingeniero en Binica"
Presentan:
Carolina Melchor Andrs
Eladio Jeset Velzquez Fragoso
Asesores:
Dr. en C. Jos Francisco Snchez Ramrez
M x i c o D.F.,JuniofOo
INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA
EN INGENIERA Y TECNOLOG~ASAVANZADAS
UPIITA
"Sntesis de Nanopartculas Semiconductoras
para su Biofuncionalizacin"
Para obtener el ttulo de:
"Ingeniero en Binica"
Presentan:
Carolina Melchor Andrs
Sinodales
ing. Carlos Ros Ramrez

Secretario
Asesor
Asesor
M x i c o D.F.,Junio2OlO

Unidad Profesional lnterdisciplinaria en Ingeniera y Tecnologas Avanzadas
Ingeniera Binica
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,,,,iita
Agradecimientos especiales
Al Instituto Politcnico Nacional.
A la Unidad Profesional Interdisciplinaria en Ingeniera y Tecnologas Avanzadas
A la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla
Al Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa Avanzada, Unidad Legaria
INSTITUTO POLITCNICO
NACIONAL
Unidad Profesional Interdisciplinaria en Ingeniera y Tecnologas Avanzadas
Ingeniera Binica
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upllta
Agradecimientos
Agradezco al Instituto Politcnico Nacional la formacin acadmica recibida a lo largo de los

ltimos ocho aos desde mis estudios de nivel medio superior hasta la fecha. Tambin quiero
agradecer el tiempo y dedicacin de mis profesores de la Unidad Profesional Interdisciplinaria
en Ingeniera y Tecnologas Avanzadas.
A nuestros asesores Dra. en C. Lilia Martinez y Dr. en C. Jos Francisco Snchez por su
tiempo y conocimientos compartidos con nosotros durante un ao.
A mi compaero Eladio porque formamos un equipo caracterizado por el respeto y el
compromiso.
Dedicatorias
Dedico este trabajo a mi familia porque siempre me apoyaron desde mi niez hasta mis
estudios superiores. Les agradezco a mis padres, Jernimo Melchor Gonzlez y Victoria
Andrs Santiago, su apoyo cario. Gracias por creer en mi y por quererme as como soy.
A mi hermano Jorge con quien en ocasiones no me llev bien pero siempre me ha alentado a
seguir adelante. Por ayudarme cada vez que acudo a l por un consejo. Desde pequeos
convivir con l ha sido una las mejores cosas de la vida.
A mi hermana Marycruz por haber sido y seguir siendo un gran apoyo para nuestra familia, es
una de las mujeres que ms admiro por su valenta y por no rendirse cuando se enfrenta a
situaciones adversas.
A Ral por compartir tu tiempo conmigo. Por dejarme formar parte de tu vida. Gracias por
acompaarme cuando sala tarde de la escuela. Gracias por tu cario, comprensin y apoyo
incondicional. Todos los momentos que hemos pasado juntos los atesorar en mi corazn.
A mis amigos: Jenny, Jos Manuel, Enrique, Ahuizotl y Daniel por brindarme su cario. Por
alentarme cuando me encontraba en situaciones adversas. Por apoyarme incondicionalmente.
Gracias por compartir su tiempo conmigo y por sus consejos. Tambin gracias por compartir
sus momentos felices y tristes conmigo, por confiar en m.
Carolina

Inneniera Binica
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u, ,ta
Agradezco a Dios, por darme la oportunidad de disfrutar de esta vida y este periodo que de una u otra
manera marca toda mi existencia, tanto por lo vivido en la UPIITA como fuera de ella, y pem~itetener otras
visiones del mundo en el cual estoy inmerso.
Agradezco a mis padres. en primer lugar por haberme dado la vida, por haber cuidado de mi durante tantos
aos, por brindarme las facilidades de estudiar una carrera que si bien al principio no saba ni de que se
trataba, me ha llenado de satisfacciones personales, esperando lleguen pronto las profesionales; gracias por
la comprensin mostrada haca mi carrera, por los desvelos derivados de la misma; gracias les doy por ser
su hijo; los quiero aunque no sepa como demostrrselos.
Dedico este trabajo, y la parte que me haya correspondido hacer a mi.farnilia, a quien quiero profundamente
pero en ocasiones no lo demuestro. Y lo dedico tambin a ti mi amor, a ti, Erandy Selene Morales Gonzlez,
a quien debo agradecer en mucho el final satisfactorio de este periodo, pues cuando pensaba que no haba
salida, tu siempre estuviste ah para mostrarme las opciones que yo no poda ver; porque estuviste cuando
ms te necesitaba y no quera ni senta pudiera confiar en nadie ms, porque he aprendido mucho de ti, y no
solo personalmente, si no tambin profesionalmente; porque me has mostrado otra cara de la vida. A ti con
quien he compartido momentos dificiles para ambos. Con todo mi amor y respeto.
A mis hermanas, a quienes en ocasiones dejaba de ver hasta por varios das a pesar de vivir en la misma
casa, quienes me hacan rer cuando no quera o estaban ah para escucharme cuando me dignaba a hablar,
ja ja. Gracias a Belem por ser mi confidente de muchas cosas. Gracias a Ayde por el apoyo mostrado
siempre. Gracias a Iris por ayudarme siempre que te lo peda, y a ti Rogelio, gracias por cuidar de mi
hermana y hacerla feliz aunque haya sido poco tiempo, porque s que juntos me hubieran ayudado a buscar
trabajo (no, no es cierto), pero s que estaras ah dispuesto a ayudar si lo necesitaba.
Agradezco tambin a mis asesores. A la Dra. Lilia por el apoyo incondicional brindado siempre, y al Dr.
Jos Francisco por sus conocimientos transmitidos y para realizar nuestro trabajo, adems de hacerme
pensar en muchas cosas ajenas al Trabajo Terminal.
Gracias a mis amigos Carolina, Csar, Cynthia, Lidia, Sunaina, Silvia, Sonia, Pablo. Esther, Jess, por
mostrarme las bondades del trabajo en equipo y brindanne su amistad. Gracias a Caro por soportarme todo
un ao y juntos lograr esta meta.
Al M. en C. Lucas Bravo, le tengo gran respeto y agradecimiento por su bondad, y ayudarme cuando ms lo
necesitaba. Al profesor Valentino por ayudarme de igual manera en un momento difcil. Al profesor
Ricardo Horta por mostrarme un camino a seguir profesionalmente. Agradezco a mis profesores de cuarto
semestre (No, David, Victor) quienes me brindaron grandes ideas e hicieron nacieran en mi muchas
pasiones por el conocimiento. A los maestros cuyas materias me fueron difciles, por ensearme que
siempre que uno quiera se puede superar cualquier obstculo.
Agradezco a Pablo por mostrarme el valor del raba.jo, y el valor de la confianza en uno mismo. Doy gracias
igualmente a la UPllTA en general, por ser como es. Dificil en muchas ocasiones pero no imposible.
Y por ltimo, quiero agradecer a una persona que siempre estuvo conmigo en todo momento y si no hera
por l no estuviera escribiendo esto. Me ha llenado de conocimiento, de satisfacciones, tambin de
decepciones, pero siempre me ha ayudado a seguir adelante y lograr los objetivos propuestos, as como
mostrarme que (como deca mi abuelito) las cosas no mandan, que hay que pelear por lo que se desea, que
querer es poder, que si te caes hay que levantarse, y que siempre hay otros caminos. Te agradezco y te
dedico esto Eladio. A ti, o sea a mi.
NACIONAL
Ingeniera Binica
,Api ita
ndice General
...
RESUMEN ........................................................................................................................vi11
ABSTRACT ............................................................................................ix
ABREVIATURAS ..................................................................................... x
..
GLOSARIO ............................................................................................ x11
Captulo 1. INTRODUCCIN......................................................................
1.1 Estado del Arte ........................................................................... 3
1.1.2 Nanobinica .................................................................. 5

1.1.3 Tipos de nanopartculas biomdicas ....................................... 5
1.1.4 Imagen tumoral in vivo ..................................................... 7
Captulo 11. OBJETIVOS ............................................................................. 9
2.1 Objetivo General ........................................................................ 10
2.2 Objetivos Especficos .................................................................. 10
Captulo 111. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .......................................... 1 1
Captulo IV . J U S T I F I C A C I ~ NDE LA INVESTIGACION ................................... 13
Captulo V . MARCO TERICO.................................................................. 15
5.1 Tcnicas de crecimiento de nanopartculas metlicas ..............................
5.2 Mtodos y condiciones experimentales de preparacin ...........................
5.2.1 Dispersiones Coloidales de Nanopartculas de oro ......................
. .
5.3 Nucleacin y crecimiento ..............................................................
5.4 Estabilidad de nanoparticulas .........................................................
5.5 Sntesis de nanopartculas semiconductoras .........................................
16
16
16
18
19
19
5.6 Anticuerpos .............................................................................. 21

5.6.1 Mecanismo de accin de los anticuerpos ................................. 22
5.6.2 Anticuerpos monoclonales ..................................................23
5.7 Aptmero ................................................................................. 24
Captulo VI . DESARROLLO EXPERIMENTAL ............................................... 26
6.1 Preparacin de dispersiones coloidales de ........................................... 27
nanopartculas de oro a diferentes razones molares
6.2 Preparacin de dispersiones coloidales de nanopartculas .........................31
semiconductoras (InP. 111-V)
6.2.1 Preparacin de Miristato de Indio In(MA)3............................................. 34
6.2.2 Sntesis de nanocristales de InP ............................................ 36
de nanopartculas semiconductoras (InP, 111-V)........... 37
6.3 Biof~~ncionalizacin

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upi ita
Captulo VI1. RESULTADOS ..................................................................... -38

7.1 Nanopartculas coloidales de Oro ..................................................... 39
7.2 Estabilidad ...............................................................................47
7.3 Estabilidad electroesttica ............................................................. 48

7.4 Nanopartculas semiconductoras de InP............................................. 50
Captulo VIII CONCLUSIONES .................................................................. 52
Captulo IX REFERENCIA ........................................................................ 55
Captulo X APENDICE .............................................................................. 59

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upiita
ndice de Figuras
1.1 Seales de fluorescencia ..........................................................................8
5.1 Ilustracin esquemtica de los mtodos de preparacin de partculas ....................17
metlicas de tamao nanomtrico
5.2 Ilustracin esquemtica del proceso de sntesis de nanopartculas ....................... 17
metlicas de oro .
5.3 Ilustracin esquemtica de los tipos de estabilizacin ...................................... 19
5.4 Estructura de un anticuerpo ..................................................................... 21
5.5 Regiones CDR de un anticuerpo responsables del reconocimiento ....................... 22
de antgenos
5.6 Etapas del proceso de eliminacin de agentes extraos .................................... 23
6.1 Arreglo experimental de la sntesis de nanopartculas de oro ..............................27
6.2 Imgenes de diferentes tiempos de reaccin de dispersiones coloidales .................30
de nanopartculas de oro a una razn molar de [CS] 1 [HAuC14] = 2.25
6.3 Dispersiones coloidales de oro a obtenidas con diferente razones ........................ 31
molares de [CS] 1 [HAuC14]
6.4 Instalaciones del laboratorio de Ingeniera Ambiental de la BUAP ....................... 33
6.5 Lavado de materiallmaterial limpio ............................................................ 33
6.6 Colocacin del material en la cmara lateral de la caja de guantes ........................ 34
6.7 Sntesis del precursor ............................................................................ 35
6.8 Nanopartculas despus del proceso de centrifugado ....................................... 36
7.1 Espectro de absorcin en la regin UV-Vis de la solucin de oro con una .............. 39
razn molar [CS] / [HAuCI4] = 0.25
7.2 Espectros de absorcin en la regin UV-Vis de las solucin de oro ...................... 42
con diferente razn molar de [CS]/ [HAuC14]
7.3 Posicin de la RPS en funcin de la razn [CS] / [HAuC14]............................... 42
7.4 Micrografias de TEM ........................................................................... 43
7.5 Histogramas de frecuencias .....................................................................
45
7.6 Espectros de absorcin de las soluciones inicas de Au en diferentes ....................47

tiempos de reaccin
7.7 Espectros de absorcin en la regin UV-Vis de las soluciones de oro ................... 48
7.8 Presentacin del cartel: "Efecto de la Concentracin de Citrato en el ....................49
Control del Tamao de Nanopartculas de Oro"

Ineeniera Binica
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7.9 Constancias de la presentacin del cartel en el 1 er. Congreso Nacional.. ................ 50
de Ciencia e Ingeniera en Materiales

7.1 0 Constancias de la asistencia al curso "Microscopia Electrnica de.. ................... 50
Barrido y Microanlisis"
7.1 1 Espectro de absorcin de la dispersin coloidal de las nanopartculas.. ................ 51
de InP
7.12 Nanopartculas de InP, despus del centrifugado.. ....................................... .51
NACIONAL
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upiita
ndice de Tablas
6.1 Propiedades fsicas de los diferentes reactivos utilizados para sntesis de.. ........... ..28
nanopartculas de Oro (NAu)
6.2 Estabilidad y razn molar de las diferentes sntesis realizadas.. ......................... . 3 1

6.3 Propiedades fsicas de los diferentes reactivos utilizados para sntesis.. ..................32
de NInP
NACIONAL
Ingeniera Binica
upllta
RESUMEN
El presente Trabajo Terminal presenta el mtodo para obtener nanopartculas metlicas de oro
por la ruta coloidal, as como el control de su tamao por medio de la variacin en la
concentracin de Citrato de Sodio, esto como un primer acercamiento para sintetizar
nanopartculas semiconductoras del grupo 111-V.
Se propone un mtodo para realizar la biofuncionalizacin de nanopartculas semiconductoras
para utilizar aptmeros.
Palabras clave: Aptmero, nanopartczrla, bioniarcador, marcadores biolgicos
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Ingeniera Bibnica
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upiita
ABSTRACT
This Terminal Work presents a method of synthesis of metallic gold nanoparticles by the colloidal
route and their control size through the variation in the concentration of sodium citrate, this as a first
approach to synthesize semiconductor nanoparticles of group Ill-V.
We propose a method for the semiconductor nanoparticles biofunctionalization to use aptamers.
Keywords: Aptamer, nanoparticle, biomarker, biological mai-lcer

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ABREVIATURAS
Au
Oro
CDR
Complementary Determining Regions
COOH
Carboxilo
CS
Citrato de Sodio
DDT
Dodecanotiol
Fab
Antigen Binding Fragment
Fc
Crystallizable Fragment
HAuC14
cido clorourico
Ig
Inmunoglobulina
InAs
Arseniuro de Indio
In(MA)
Miristato de Indio
InP
Fosfro de Indio
1R
Infrarrojo
Molar
MA
cido Mirstico
mmol
Milimoles
NH2
Amino
nm
Nanmetros
NPB
Nanopartculas biofuncionalizadas
NInP
Nanopartculas de Fosfuro de Indio
OD
Unidades de Densidad ptica
ODE
Octadeceno
PDGF
Factor de crecimiento derivado de plaquetas
P(TMS13
Tris(Trimethy1silyl)Phosphine
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QD
Quantum Dots
RPS
Surface Plasmon Resonance
SELEX
Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichrnent
TEM
Microscopia Electrnica de Transmisin
UV
Ultravioleta
ZnS
Sulfro de Zinc
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GLOSARIO
Absorbancia. La absorbancia,A, es la cantidad de intensidad de luz que absorbe una

determinada muestra. Est definida como:
siendo I la intensidad despus de haber ocurrido la absorcin e 10la intensidad de la luz que se
hace incidir en la muestra.
Aptmero. Los aptmeros son macromolculas de cidos oligonucletidos o molculas
pptido. que se unen a molculas objetivo especficas.
Biomarcador. Sustancia sintetizada por el propio organismo presente en la sangre, en los
tejidos o en otros lquidos corporales que se utiliza para diagnosticar alguna enfermedad.
Bioconjugacin. Modificacin o acoplamiento de nanopartculas con molculas selectivas.
Sucede despus de la biofuncionalizacin.
Biofuncionalizacin. La biofuncionalizacin es la adicin de grupos funcionales bioafines en
la superficie de un material por mtodos de sntesis qumica.
Fotodegradacin. Rompimiento de molculas por accin de la luz.
Fluorescencia. La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es
expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catdicos o rayos X.
Nanobinica. Es una fusin de la biologa e ingeniera utilizando los avances de la
nanotecnologa.
Nanopartcula. Unidades ms grandes que los tomos y las molculas (1 a 100 nanmetros).
No obedecen a la qumica cuntica, ni a las leyes de la fsica clsica, poseyendo caractersticas
propias.
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lNST1TUTO POLITCNICON AClON AL

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Introduccin
Un trmino usado recientemente en el rea de la nanotecnologa es el de nanobinica [l], que
ha empezado a postularse como una de las reas prioritarias de desarrollo dentro de la misma
nanotecnologa.
La nanobinica es una fusin de la biologa e ingeniera utilizando los avances de la
nanotecnologa. Su principal objetivo es la bsqueda de la mimetizacin de sistemas
biolgicos para la construccin de nanodispositivos que ayuden a mejorar las condiciones de
vida. El inters por desarrollar esta nueva tecnologa, est impulsando la creacin y
explotacin de biomateriales a escala nanomtrica con propiedades diferentes hasta las
conocidas actualmente. Uno de estos biomateriales son las llamadas nanopartculas
biofuncionalizadas (NPB) cuyas propiedades fsicas, qumicas y biolgicas son, en la mayora,
diferentes a las existentes de los mismos materiales en bulto y atmico [2-91. Las NPB son
definidas como identidades cristalinas o amorfas con tamaos en el intervalo de 1 a 100 nm
con formas variadas que van desde esfricas hasta irregulares y con superficies modificadas
va molculas orgnicas y10 biolgicas selectivas para generar su interaccin con clulas
especficas. Para la biocon-jugacin directa con clulas biolgicas. las nanopartculas deben
presentar en su superficie, grupos reactivos tales como amino (-NH2), carboxilo (-COOH) o
mercapto (-SH). De esta manera, las nanopartculas pueden conjugarse con los ligandos
(partculas de un compuesto adhesivo que ligan y mantienen unidos dos elementos) bioafines
tales como anticuerpos monoclonales, pptidos, enzimas, cidos nucleicos o pequeas
molculas inhibidoras, formando hbridos inorgnico-orgnicos [lo-1 31.
Con el trmino biomaterial [14] se designa a los materiales utilizados en la fabricacin
de dispositivos que interactan con sistemas biolgicos y que se aplican en diversas ramas de
la medicina y biologa. Su utilizacin va desde transportadores de agentes bioactivos hasta su
empleo en sistemas que incrementen o reemplacen tejidos, rganos o miembros del cuerpo
humano.
En particular, las NPB tipo semiconductor del grupo 111-V son una clase de
biomateriales que presentan brillantez, resistencia a la fotodegradacin, espectro de emisin
agudo, emisin multicolor en el infrarrojo cercano y alta biocompatibilidad, que hacen de este
tipo de biomateriales fuertes candidatos para el desarrollo de nuevos marcadores biolgicos
fluorescentes para la deteccin de enfermedades como el cncer.

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Las NPB del grupo 111-V presentan un potencial de propiedades para resolver las
actuales limitaciones encontradas (menor detectabilidad en comparacin con los marcadores
radioinmunolgicos, toxicidad, ruido de fondo presente en las mediciones de fluorescencia) en
los tradicionales marcadores fluorescentes orgnicos (por ejemplo: fluorescena y los
derivados de la rodamina) y protenas desarrolladas genticamente. Actualmente las NPB tipo
semiconductor estn siendo utilizadas en una extensa variedad de aplicaciones biolgicas y
clnicas [l5-231.
En el campo de la sntesis, la habilidad para manipular controladamente el tamao de
las nanopartculas, por mtodos simples y sencillos, es actualmente uno de los principales
desafos de la nanotecnologia. Controlar su funcionalidad superficial (modificacin para
conseguir diferentes propiedades fsicas o qumicas), sin embargo, es de vital importancia para
desarrollar una nueva clase de marcadores biolgicos fluorescentes para aplicaciones en los
campos de la biologa y medicina [24-261.
Aunque ya existen marcadores biolgicos fluorescentes que emiten en las regiones
espectrales ultravioleta y visible, estos presentan problemas de interferencia espectral cuando
se desea la deteccin in vivo. Estas interferencias incluyen la atenuacin, inhibicin o
extincin de la seal por la absorcin de los te-jidos y lquidos circundantes, fotodegradacin,
florescencia de fondo y descomposicin debido a reacciones fotoqumicas con el medio
circundante. Una solucin a estos problemas de interferencia es la utilizacin de marcadores
activos (excitacin y deteccin) en la regin del infrarrojo-cercano (650-900 nm). En esta
"ventana transparente", la absorcin debido a los lquidos biolgicos y la autofluorescencia
celular no es significante.
1.1 Estado del arte

El cncer es uno de los principales problemas de salud pblica. De acuerdo con la
Organizacin Mundial de la Salud, esta situacin se ha tornado crtica y de no implantarse
diferentes estrategias de prevencin, para el ao 2030 se estima se presentarn mundialmente
1 1.8 millones de muertes por esa causa [27].
Las tcnicas empleadas actualmente para el diagnstico de cnceres en clnica son:
obtencin de imgenes (Rayos X, Resonancia Magntica Nuclear, Colposcopa), biopsia de
los tejidos y anlisis bioanaltico de los fluidos corporales. Sin embargo, todos ellos, por lo
regular, no son suficientemente sensibles y10 especficos para una deteccin temprana de la
mayora de los cnceres y sobre todo de los estados precancergenos. Adems. es difcil de
NACIONAL
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hacer el diagnstico de los cnceres analizando nicamente las alteraciones morfolgicas en

las clulas y tejidos. Algunos tumores slidos solamente se detectan cuando su tamao es de 1
cm. o ms de dimetro, lo que significa que su masa constituye millones de clulas y hay
posibilidad de metstasis en otros rganos.
Actualmente, en los anlisis clnicos para producir las imgenes pticas, se utilizan
materiales fluoroforos (por lo regular compuestos orgnicos, lantnidos, etc). Cuando un
fluroforo se excita con un cuanto de energa especifica (fotn). sus electrones cambian del
nivel bsico de energa a uno ms alto. Durante este proceso el electrn pierde una parte de
energa obtenida, generalmente debido a emisin de un fonn y como resultado se emite un
fotn de energa ms baja. Debido a este proceso de emisin de luz, el electrn de un estado de
energa elevada vuelve a su estado normal. Los fluoroforos se dividen en dos categoras
amplias: endgenos (los que se usan directamente in vivo) y exgenos (los que se usan in
vitro). Al segundo grupo pertenecen agentes contrastantes basados en nanopartculas [28].
1.1.1 Marcadores fluorescentes
Para una deteccin ptima, el marcador debe cumplir los siguientes requisitos:
La fluorescencia emitida debe poseer una elevada potencia radiante y se ha de
distinguir claramente del ruido de fondo.
La unin del marcador al anticuerpo o al antgeno no debe tener ningn efecto sobre
sus propiedades inmunolgicas.
El coeficiente de absorcin molar del marcador ha de ser lo ms grande posible y el
rendimiento cuntico en el solvente utilizado debe ser lo mayor posible o aproximarse a la
unidad, mientras que el ruido de fondo de la mayora de las muestras se debe a la dispersin de
la luz y a la fluorescencia de longitud de onda corta del suero o antisuero.
La mayora de los fluorforos o compuestos fluorescentes son compuestos orgnicos
con una estructura cclica.
Un ejemplo de esto es la fluorescena, sin embargo, a pesar de cumplir con los
requisitos mencionados para ser un buen marcador, es bastante susceptible a las interferencias
por el ruido de fondo y la dispersin de la luz provocadas por la muestra.
1C
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1.1.2 Nanobinica
Los nanomateriales, que miden 1-1 000 nm., permiten la interaccin con sistemas
biolgicos a nivel molecular. Tambin pueden facilitar importantes avances en la deteccin,
diagnstico y tratamiento de los cnceres humanos, dando lugar a una nueva disciplina: la
nano-oncologa [29,30].
Las nanopartculas se estn desarrollando activamente para obtener imgenes de
tumores in vivo, perfiles biomoleculares de biomarcadores de cncer y suministro especfico
de medicamentos. Estas tcnicas basadas en la nanotecnologa pueden ser aplicadas
ampliamente en el tratamiento de diferentes enfermedades malignas.
El uso de nanopartculas (no slo los puntos cunticos de diferentes tamaos sino
tambin las nanopartculas de oro), permiten la deteccin y cuantificacin simultnea de varias
protenas en pequeas muestras de tumores, que finalmente permitir la adaptacin del
tratamiento contra el cncer especfico de cada paciente a un perfil de protenas especficas del
tumor [3 11.
Diferentes aplicaciones de la nanotecnologa se estn investigando activamente en el
diagnstico de cncer por medio de imgenes.
Varios mbitos de la nanotecnologia se han utilizado para mejorar la transmisin de los
agentes de quimioterapia a las clulas cancerosas con el objetivo de minimizar los efectos
txicos en los tejidos sanos.
1.1.3 Tipos de nanopartculas biomdicas
Aunque el nmero de diferentes tipos de nanopartculas est aumentando rpidamente,

la mayora se pueden clasificar en dos tipos principales:
Partculas que contienen molculas orgnicas como principal material constituyente.
Partculas que utilizan elementos inorgnicos, por lo general los metales, como un
ncleo.
Liposomas, dendrmeros, los nanotubos de carbono, emulsiones, y otros polmeros son
un grupo importante y bien establecido de partculas orgnicas. El uso de estas nanopartculas
orgnicas ya ha producido resultados interesantes. Los liposomas se estn utilizando como
vehculos para la administracin de frmacos en diferentes tumores humanos, incluyendo el
cncer de mama.
5
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Dendrmeros, utilizados en la Imagen por Resonancia Magntica como agentes de

contraste, han ayudado a la visualizacin de los diversos procesos patolgicos. Conjugados
con agentes fannacolgicos y las molculas de orientacin, los nanovectores orgnicos son
potentes vehculos para suministrar frmacos y proporcionar una imagen selectiva de los
diferentes tipos de cncer humano.
La mayora de las nanopartculas inorgnicas comparten la misma estructura bsica, un
ncleo central que define la fluorescencia y las propiedades pticas, magnticas y elctricas de
la partcula, con un recubrimiento orgnico de proteccin en la superficie. Esta capa exterior
protege al ncleo de la degradacin en un entorno fisiolgico agresivo y puede formar enlaces
covalentes o electrostticos, o ambos, con agentes de carga positiva y las biomolculas de los
grupos funcionales bsicos, tales como las aminas y tioles.
Los puntos cunticos son nanopartculas fluorescentes con tamaos de 1-10 nm, que
contienen un ncleo de cientos de miles de tomos de los elementos del grupo 11 y VI (por
ejemplo, el Cadmio, el Teluro, el Zinc y Selenio) y grupo 111 (por ejemplo, Tntalo) y
elementos del grupo V (por ejemplo, Indio). Los puntos cunticos pertenecen a una nueva
clase de marcadores biolgicos luminescentes, que superan las limitaciones de los marcadores
orgnicos convencionales. La longitud de onda de la fluorescencia (color) depende del tamao
de la nanopartcula. Adems, los puntos cunticos de semiconductores son extremadamente
estables y pueden estar expuestos a ciclos de excitacin y fluorescencia durante varias horas
sin prdida de su eficiencia.
Algunas de sus ms importantes caractersticas son: anchos especficos de excitacin y
estrechos espectros de emisin, resistencia a degradacin metablica, altos coeficientes de
extincin y habilidad para ser conjugados con biomolculas. Recientemente, los puntos
cunticos de semiconductores estn siendo utilizados en estudios biolgicos para producir
imgenes luminescentes de clulas o reacciones bioquimicas. por ejemplo, la reaccin
antgeno-anticuerpo para el estudio de cnceres. Estas imgenes se producen de clulas
biolgicas bajo iluminacin con luz ultravioleta (UV) o visible y se pueden observar a travs
del microscopio ptico (ver Figura 1.1).
Las nanopartculas supermagnticas contienen un ncleo de metal (por ejemplo, hierro,
cobalto o nquel), que es magnticamente activo, y se utilizan como agentes de realce de
contraste para mejorar la sensibilidad de la Resonancia Magntica. Cuando las partculas
magnticas estn cubiertas con una capa exterior orgnica, tambin pueden ser conjugadas con
las biomolculas y se utilizan para suministrar los frmacos en el tratamiento del cncer. Los
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materiales magnticos basados en xido de Hierro han sido ampliamente utilizados en la

prctica clnica como agentes de resonancia magntica y en los estudios de expresin gnica,
las imgenes de la angiognesis, y el trfico celular.
Nanopartculas metlicas, en combinacin con molculas fluorescentes activas pueden
ser utilizadas para obtener imgenes mediante la resonancia magntica.
1.1.4 Imagen tumoral in vivo
En la actualidad, las nanopartculas magnticas estn llamando la atencin debido a si1

uso potencial como agentes de contraste para resonancia magntica. Las venta-jas clave de las
nanopartculas magnticas son: baja toxicidad, biocompatibilidad y elevado nivel de
acumulacin en el tejido objetivo. Aunque las partculas de metal como cobalto y nquel se
han propuesto, las nanopartculas magnticas que contiene un ncleo de xido de hierro se han
utilizado con ms frecuencia.
Las nanopartculas supermagnticas (3-1 0 nm) han sido desarrolladas como agentes de
contraste para resonancia magntica y utilizadas en el diagnstico clnico como un contraste
negativo por sus efectos en la reduccin de la seal en una imagen ponderada en T2 (tiempo
de relajacin transversal). Nanopartculas basadas en Bismuto han mejorado en los agentes de
contraste utilizado para la tomografia computarizada, se utiliza un recubrimiento externo de
polmero para proteger de la degradacin a las partculas y por lo tanto evitar los efectos
citotxicos del bismuto. Estas nanopartculas mostraron largo tiempo de circulacin en vivo
(es decir, ms de 2 h) [32].
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,,,,fa
Figura 1.1 (A) Seales de fluorescencia roja-naranja muestran un tiimor de prstata en ratones vivos en la
imagen superpuesta (izquierda) y un punto cuntico sin mezclar (a la derecha). (B) Aproximadamente 1 2
millones de puntos cuanticos de luz verde, amarillo o rojo (derecho) fueron inyectados por va subcutnea en tres
localidades adyacentes en el ratn y visualizadas con una lmpara de excitacin de tungsteno o mercurio de (a la
izquierda) [32].
1
C
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NACIONAL
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Objetivos
2.1 Objetivo General
Sntesis de nanopartculas semiconductoras del gurpo 111-V y proponer un mtodo para
bioconjugarlas, potenciando su uso como marcador biolgico de cncer.

2.2 Objetivos Especficos
1 .- Realizar sntesis de nanopartculas metlicas de Au y su caracterizacin.
2.- Realizar sntesis de nanopartculas semiconductoras de InP
3.- Proponer un mtodo para bioconjugar nanopartculas semiconductoras de InP con el 5'tiol-modyfied aptamer para su potencial uso como marcador biolgico de cncer.
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PLANTEAMXENTO
DEL PROBLEMA
'C
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"A, ,ta
Planteamiento del problema

Las actuales demandas, en el rea de biologa y medicina, para obtener informacin especfica
dentro de mezclas biolgicas complejas e in-vivo (es decir, en el paciente), ha conducido a
cientficos a desarrollar biomateriales de identificacin fluorescente con mejores propiedades
de sensibilidad, selectividad, estabilidad, operatividad y biocompatibilidad, manteniendo un
alto rendimiento de procesamiento. Aunque las nanopartculas semiconductoras del grupo IIIV son ideales para este gran desafo, su utilizacin est restringida por la falta de propiedades
superficiales adecuadas que les permita conjugarse con ligandos bioafines (como anticuerpos
monoclonales, pptidos, enzimas, cido nuclico o pequeas molculas inhibidoras) formando
hbridos inorgnico-orgnico. A pesar de los recientes progresos, todava queda mucho trabajo
por hacer para lograr la funcionalizacin superficial especfica de nanopartculas
semiconductoras.

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Justificacin de la Investigacin
El objetivo principal de la nanobinica es la bsqueda de la mimetizacin de sistemas
biolgicos para la construccin de nanodispositivos que mejoren la calidad de vida. El inters
por desarrollar esta nueva tecnologa, est impulsando la creacin y explotacin de
biomateriales a escala nanomtrica con propiedades diferentes hasta las hoy conocidas. Uno
de estos biomateriales son las llamadas nanopartculas biofuncionalizadas (NPB). Como
resultado de este trabajo se pretende obtener nanopartculas biofuncionalizadas, destinadas a la
deteccin de cncer de mama.
Por otro lado las actuales demandas de imagen biolgica en las reas de investigacin
(biologa) y medicina (hospitales) ha inducido el desarrollo de mejores y menos costosas
tcnicas de pruebas biomoleculares y agentes de contraste con una mayor sensibilidad,
selectividad, estabilidad, biocompatibilidad y sobre todo que no presenten problemas de
interferencia cuando se desea la deteccin in-vivo. Aunque ya se han realizado diferentes
aproximaciones de desarrollos en esta lnea, los biomateriales compuestos de nanocristales
semiconductores del grupo 111-V biofuncionalizados representan una alternativa para resolver
est desafo. Con el control de las propiedades pticas y de biofuncionalizacin de las NPB se
desarrollar tecnologa de marcadores biolgicos fluorescentes en la regin del infrarrojo
cercano para su aplicacin en el rea biomdica, como son el estudio de procesos
intracelulares a nivel de molculas individuales y para observaciones por tiempos prolongados
in vivo de eventos de trfico celular. En medicina. en la deteccin de tumores tempranos
(como el cncer de mama) y para el desarrollo de nuevos mtodos de diagnstico que
permitan en un fututo prximo el diseo de nuevos tratamientos teraputicos en personas.
Todo lo anterior tendr un impacto cientfico y sobre todo social, tanto por lo que hace
referencia a la ciencia bsica como por su gran variedad de aplicaciones tecnolgicas.

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M A R C O T E O R I C O
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Marco Terico
5.1 Tcnicas d e crecimiento d e nanopartculas metlicas
Recientes avances en la qumica coloidal han generado nuevos procesos sintticos para obtener
agrupaciones de tomos y10 molculas a escala nanomtrica. Por ejemplo, partculas metlicas
son obtenidas a partir de la reduccin de iones metlicos en presencia de diferentes solventes y
materiales orgnicos (ligantes, surfactantes o polmeros) que han permitido restringir su
crecimiento en la escala nanomtrica. Pero, el control del tamao, forma, homogeneidad,
composicin y estructura cristalina de tales nanoestructuras sigue siendo una de las principales
metas de la investigacin para el actual desarrollo de la nanotecnologa.
A continuacin se describen los mtodos experimentales utilizados para obtener

nanopartculas de oro (Au) en estado coloidal sin la presencia de algn tipo de estabilizador
orgnico. Se describen brevemente las tcnicas de caracterizacin utilizadas para tales
nanoestructuras. Para la preparacin de nanoestructuras de oro se utiliz el proceso ya
establecido de reduccin qumica utilizando al citrato de sodio como agente reductor y
estabilizador.
5.2 Mtodos y Condiciones Experimentales de Preparacin
5.2.1 Dispersiones Coloidales de Nanopartculas de oro
En general, se pueden seguir dos rutas para obtener nanopartculas metlicas de oro,
como se muestra en la Figura 5.1

a) mtodos fsicos
b) mtodos qumicos.
Los mtodos fsicos, tales como espurreo catdico, evaporacin trmica, trituracin mecnica
y ablacin lser involucran la subdivisin del oro en bulto hasta la escala nanomtrica [33].
Aunque estos mtodos son utilizados para preparar diferentes tipos de nanopartculas, tienen la
desventaja de ser poco efectivos para el control del tamao, forma, homogeneidad, estructura
y composicin.
En contraste, los mtodos qumicos como la reduccin qumica, reduccin fotoltica y
reduccin radioltica, juegan un mejor papel en la sntesis de las nanoestructuras metlicas de
oro con propiedades especficas. Adems, su versatilidad y sencillez para controlar el tamao,
forma, homogeneidad, estructura interna y composicin por medio de la variacin de las
condiciones experimentales, los hacen interesantes para este trabajo de investigacin.
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Alta
Para preparar los precursores atmicos que son subsecuentemente agregados a tamaos
nanomtricos, comnmente se usan soluciones de iones de oro los cuales son reducidos
empleando diferentes agentes reductores para reducir los iones a tomos en estado metlico.
Michael Faraday fue el primero en dar a conocer este mtodo qumico de preparacin.
Figrira 5.1. Ilustracin esquemtica de los intodos de pieparaciri de partculas metlicas de tamao
nanomtrico.
La reduccin de los iones de las correspondientes sales metlicas en tomos con

valencia cero es un mtodo prctico para sintetizar nanopartculas de oro en un lquido base.
La reduccin de iones metlicos por agentes reductores en sistemas coloidales, es un de los
mejores mtodos para la preparacin de nanopartculas de oro. El mtodo de Turkevich ha
sido ya un procedimiento estndar para preparar nanopartculas de oro en agua. Este mtodo
involucra (a) la reduccin de los iones a tomos metlicos con citrato de sodio, (b) la
formacin de ncleos, y (b) un posterior proceso de crecimiento como se muestra en la Figura
5.2.
In
Metlico
Citrato de
Sodio
",
tomos con O
valcncili cero
$"
*
C?
0
Nanopartcula
Meaca
e"
Ncleo
"Creclrnlento"
Figura 5. 2 Ilustracin esquemtica del proceso de sintesis de nanopartculas metlicas dc oro.
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5.3 Nucleacin y Crecimiento

La formacin de ncleos y el sucesivo crecimiento, son dos procesos independientes en
que se basa la sntesis de las partculas nanomtricas y son los principales responsables de los
cambios en parmetros como estructura, forma, tamao, homogeneidad, composicin y
consecuentemente en las propiedades pticas, trmicas, electrnicas y catalticas de tales
nanoestructuras. Las velocidades de nucleacin y crecimiento son determinadas bsicamente
por las probabilidades de colisiones entre:
La primera clase es la responsable del proceso de nucleacin y las dos ltimas del
proceso de crecimiento. Cuando la velocidad de reduccin es tan alta que casi todos los iones
son reducidos antes de la formacin de los ncleos, y las probabilidades de colisiones entre
tomo-tomo son mayores que las otras dos, el tamao de las partculas resultantes es
monodisperso y determinado por el nmero de ncleos formados al inicio de la reaccin. As,
todos los parmetros de reaccin (temperatura, tiempo, concentracin de los reactantes, orden
en la cual los reactantes son adicionados a la solucin, impurezas, por citar solo algunas) que
promuevan la creacin de un gran nmero de ncleos y que reduzcan la velocidad de
crecimiento, facilitarn la formacin de partculas coloidales de oro monodispersas y de
tamao nanomtrico. Por ejemplo, sistemas reductores con alta afinidad a los iones metlicos
son efectivos para incrementar la velocidad de nucleacin. En cambio, sistemas reductores con
baja afinidad hacia los iones metlicos, son ideales para disminuir la velocidad de crecimiento.
Habitualmente, para que las partculas finales tengan tamaos pequeos y caractersticas
uniformes, debe satisfacerse la siguiente condicin general: la nucleacin y crecimiento deben
ser procesos completamente separados en el tiempo.
Las ventajas del mtodo de reduccin qumica son:
Es reproducible.
Las partculas obtenidas son nanomtricas y homogneas.
La estructura, tamao y forma de las particulas pueden ser controladas variando
simplemente las condiciones experimentales de preparacin, tales como: el tipo y
concentracin de reductor, contenido de los iones metlicos, temperatura, y agitacin.
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Las dispersiones coloidales son estables por meses y presentan extraordinarias

propiedades para diversas aplicaciones.
Se pueden preparar partculas monometlicas y bimetlicas.
5.4 Estabilidad de nanopartculas
La estabilidad de un sistema coloidal de nanopartculas puede darse por dos tipos (Figura 5.3):
Estabilidad estrica. Esta ocurre mediante la absorcin de molculas de cadena larga
en la superficie de la partcula (ejemplo polmeros), la cual dificulta la floculacin por
aumento de estabilidad.
Estabilidad por carga o electrosttica. Este tipo de estabilidad ocurre cuando por
absorcin de cargas (iones) en la superficie de la partcula, la estabilidad de un sistema
puede ser alterada, tan solo modificando la concentracin de sales disueltas o variando
el pH de la solucin.
20
01
Y
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d.
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6
C
Estabilidad estrica
g"
Estabilidad electroesttica
Figiira 5.3 Ilustracin esquemtica de los tipos de estabilizacin.
5.5 Sntesis nanopartculas semiconductoras
Las sntesis de nanopartculas de InAs e InP son anlogas. Todos los pasos de la
reaccin y la manipulacin de los reactivos se llevan a cabo bajo atmsfera controlada de gas
Argn o en una caja seca. Los nanocristales producidos son cristalinos y altamente solubles en

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una variedad de disolventes orgnicos. como hexano, tolueno y piridina. Las partculas tienen
dimetros que van de 2-1 0 nm., con estrechas distribuciones de tamao. Las superficies de los
nanocristales pueden ser modificadas con una variedad de ligandos incluyendo las aminas,
tioles y fosfinas [35].
La aplicacin ms prometedora de los nanocristales semiconductores coloidales
(quantum dots o q-dots) es como emisores en el etiquetado biomdico.
Quantum dots de Cd-Se (Cadmio-Selenio) han sido desarrollados para tales usos. Sin
embargo, CdSe es restringido en el medio ambiente y tiene poco futuro en la industria. Entre
todos los semiconductores 11-VI y 111-V, el Fosfuro de Indio es probablemente el nico que
puede ofrecer un compatible, o incluso ms amplio, rango de emisin de color similar al de los
quantum dots de CdSe, pero sin toxicidad intrnseca ya que el InP no tiene ni los elementos de
clase A (Cd y Hg), ni los elementos de clase B (As y Se). Los problemas respecto a la calidad
de quantum dots de InP incluyen la baja eficiencia de emisin, mal control en la distribucin
del tamao, ba-ja estabilidad. Adems, el procedimiento de sntesis para quantum dots de InP
es ms complicado que el de los nanocristales de CdSe.
Los esquemas existentes para la sntesis de quantum dots de InP y de otros del grupo
111-V son comple.jos y no flexibles. Dicha complejidad podra jugar un papel clave en la
determinacin de las propiedades deficientes de los quantum dots de InP. En esquemas tpicos
de sntesis de quantum dots de InP, la mezcla de reaccin debe ser bombeada al vaco durante
varias horas.
La reaccin tambin necesitara varios das, o los quantum dots resultantes tendran un
rango de tamao limitado. Cuando los cidos grasos fueron usados como ligandos, la longitud
de la cadena y la concentracin de ligandos de cidos grasos fueron limitadas en un rango
estrecho, y generalmente la temperatura de la reaccin necesitaba ser mayor a 250".
Si la sntesis pudiera llevarse a una temperatura inferior, se podra realizar la sntesis
sin este proceso de desgasificacin tan tedioso. La sntesis usando una temperatura menor de
reaccin resulta bastante favorable desde un punto de vista operativo y tambin es ms
eficiente en el uso de la energa. Para hacer que el carboxilo de Indio reaccione lo suficiente
para la formacin de Fosfuro de Indio. son necesarios los reactivos de activacin. Aminas
grasas han sido utilizadas como reactivos comunes de activacin y ligando para me-jorar
propiedades de emisin de quantum dots del grupo 11-VI. Por otra parte, las aminas seran
necesarias para el crecimiento eficiente de la coraza de ZnS en la superficie del InP. Sin
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embargo slo las aminas grasas con una cadena pueden ser utilizadas debida a la baja
temperatura requerida. Las aminas grasas se han introducido junto con P(TMS)3 para suprimir
an ms la formacin de In203.
5.6 Anticuerpos
Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son un tipo de protenas denominadas

glicoprotenas. Funcionan como la parte especfica del denominado complejo receptor de
clulas B (BCR) reconociendo al antgeno a nivel de la membrana del linfocito B, y como
molculas circulantes secretadas por las clulas plasmticas procedentes de la activacin,
proliferacin y diferenciacin de clulas B.
Estructuralmente estn formados por dos cadenas polipeptdicas pesadas H (del
trmino anglosajn "Heavy", pesado) y dos cadenas ligeras L (del tnnino anglosajn "Light",
ligero) unidas entre s mediante enlaces covalentes (ver Figura 5.4). Las cadenas ligeras
consisten en una regin variable (VL) y una constante (CL) mientras que las pesadas presentan
una regin variable (VH) y tres constantes (CHl, CH2, CH3). Funcionalmente podemos
distinguir dos porciones en los anticuerpos: una de ellas implicada en el reconocimiento y
unin al antgeno denominada regin Fab (por sus siglas en ingls antigen binding Fragrnent)
y otra implicada en las funciones de los anticuerpos y en su vida media en sangre, llamada
regin Fc (por sus siglas en ingls crystallizable Fragrnent).
Figura 5.4 Estructura de un anticuerpo.
Existen cinco clases diferentes de anticuerpos, que se diferencian entre s por una serie de
cambios estructurales que les confieren diferentes funciones en el organismo.
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5.6.1 Mecanismo de accin de los Anticuerpos
La principal funcin biolgica de los anticuerpos es unirse a cualquier sustancia

extraa o antgeno, que haya entrado al organismo, con el fin de facilitar su eliminacin. Las
regiones de un antgeno que son reconocidas especficamente por los anticuerpos se
denominan determinantes antignicos o eptopos. Un antgeno puede presentar diferentes
eptopos y por tanto provocar la produccin de una amplia gama de anticuerpos por parte de
diferentes linfocitos B.
Las regiones concretas donde se produce el reconocimiento por parte de un anticuerpo
hacia un eptopo concreto, se llaman regiones CDR (Complementary Determining Regions).
Hay tres regiones CDR (regiones determinantes de complementariedad o hipervariables)
denominadas CDRI, CDR2 y CDR3 y se localizan todas ellas en las regiones o dominios
variables de cada cadena (ligera y pesada) del anticuerpo. (Figura 5.4)
Las regiones CDR confieren a las inrnunoglobulinas una enorme especificidad y diversidad.
Figura 5.5 Regiones CDR de un anticuerpo responsables del reconociniieiito de antigenos.
Los anticuerpos realizan una doble funcin dentro de la respuesta inmune del
organismo cuanto lo invade un agente externo. Por un lado, se unen especficamente a una
amplia variedad de antgenos y, por otro lado, se unen a un nmero limitado de molculas y
clulas efectoras del Sistema Inmune.

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Figiira 5.6 Etapas del proceso de eliminacin de agentes extraos.
En el mecanismo de eliminacin de agentes extraos al organismo, los anticuerpos

tienen como funcin el reconocimiento especfico de los antgenos (ver Figura 5 3 ,
provocando la respuesta inmune (etapa 3), y el reclutamiento de diferentes clulas y molculas
del organismo que sern capaces de destruir y eliminar al antgeno (etapa 4). Un solo antgeno
puede presentar diferentes eptopos en su superficie, es decir, puede estimular la produccin
de diferentes anticuerpos, cada uno de los cuales es especfico para un eptopo concreto. Una
sustancia extraa que contenga diferentes eptopos al entrar en el organismo provocar la
produccin de anticuerpos procedentes de diferentes clones de linfocitos B. Este tipo de
anticuerpos con diferente capacidad de reconocer y unirse al antgeno se denominan
anticuerpos policlonales. Mientras que los anticuerpos monoclonales son especficos para un
solo eptopo y estn producidos por un nico clon celular. Gracias a los avances que han
experimentado disciplinas como la Protemica y la Genmica, ha sido posible identificar y
caracterizar nuevas molculas que desempean fiinciones importantes en el desarrollo de
ciertas enfermedades autoinmunes, vricas e incluso el cncer. Las caractersticas de los
anticuerpos monoclonales hacen de ellos unos agentes teraputicos potentes y prometedores.
5.6.2 Anticuerpos Monoclonales

Hasta el desarrollo de los anticuerpos monoclonales en el ao 1975, el uso de los
anticuerpos en diagnstico y10 terapia se centraba nicamente en la utilizacin de sueros
inmunes convencionales. Estos sueros son obtenidos a partir de distintas especies animales y
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contienen, entre otros muchos compuestos, una mezcla de anticuerpos producidos por distintos
clones de linfocitos B, por lo que se denominan anticuerpos policlonales. Estos anticuerpos
reconocen en mayor o menor medida el antgeno pero con distinta especificidad y afinidad
cada uno de ellos. En cambio, los anticuerpos especficos para un solo epitopo y producidos
por un nico linfocito B y sus clones, se denominan anticuerpos monoclonales.
Un anticuerpo monoclonal es aquel que reconoce especficamente una parte del
antgeno, es decir un eptopo concreto, y que es producido por un clon de linfocitos B.
Por las propiedades que poseen los anticuerpos, han sido empleados en terapia desde
que la FDA en 1986 aprob el primer anticuerpo monoclonal para el tratamiento del rechazo
del transplante de rin. Los anticuerpos monoclonales, por tanto, son empleados en terapia
para el tratamiento de diversas enfermedades formando la familia de frmacos denominados
anticuerpos monoclonales teraputicos. Debido a la especificidad de unin que poseen los
anticuerpos, son empleados en la localizacin y eliminacin de patgenos infecciosos como el
virus respiratorio sincitial (VRS). Tambin se utilizan como terapia en la deteccin de clulas
concretas del organismo como por ejemplo clulas tumorales, incluso en la inhibicin de
procesos inflamatorios.
5.7 Aptmero
Los aptmeros son macromolculas de cidos oligonucletidos o molculas pptido,

que se unen a molculas dianas especficas. Los aptmeros normalmente se crean mediante la
seleccin aleatoria de 15 a 70 nucletidos de longitud, pero tambin existen aptmeros
naturales en riboswitches. Los aptmeros pueden ser utilizados tanto en la investigacin bsica
y clnica con fines como los medicamentos macromoleculares. Tambin se pueden combinar
con ribozimas a hendirse a si mismo en presencia de su molcula objetivo. Estas molculas
compuestas tienen una investigacin adicional, industrial y aplicaciones clnicas.
Los aptmeros pueden ser clasificados como:
a) Aptmero ADN o ARN. Se componen de lneas generalmente cortas de oligonucletidos.
b) Aptmero pptido. Se componen de un dominio pptido variable corto, que se adjunta en
ambos extremos a una protena de andamiaje.

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Los pptidos se diferencian de las protenas en que son ms pequeos (tienen menos de
diez mil o doce mil Daltons) y que las protenas pueden estar formadas por la unin de varios
polipptidos y a veces grupos prostticos. Un ejemplo de polipptido es la insulina, compuesta
de 55 aminocidos y conocida como una hormona de acuerdo a la funcin que tiene en el
organismo de los seres humanos.
Una de las propiedades de aptmeros ARN es la capacidad de formar estructuras
complejas. Mediante la fornlacin nica y de estructuras secundarias que confiere alto grado
de especificidad de su molcula objetivo. Ellos son capaces de detectar cambios estructurales
muy pequeos en su molcula objetivo, tales como la presencia o ausencia de metilo o un
grupo hidroxilo. La seleccin de aptmeros es un proceso in Vitro llamado Evolucin
Sistemtica de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX por sus siglas en ingls).
Aptmeros de ARN pueden ser generados para cualquier objetivo de protenas, debido a esto,
el procedimiento SELEX no depende de un sistema in vivo y muchas complicaciones con el
sistema animal pueden ser resueltas.

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DESARROLLO
EXPERICMENTAL
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Desarrollo Experimental
6.1 Preparacin de dispersiones coloidales de nanopartculas de oro a diferentes razones
molares
La sntesis de las dispersiones coloidales de nanopartculas de oro fueron preparadas por el
mtodo de reduccin qumica utilizando al citrato de sodio como sistema reductor, el cual ha
mostrado ser un mtodo de bajo costo, puesto que no necesita de equipos de alto vaco o de
algn otro aditamento sofisticado.
El arreglo experimental de la sntesis de nanopartculas de Au, como se muestra en la
Figura 6.1, consta de una panilla de calentamiento la cual posee un regulador que controla la
velocidad de agitacin y la temperatura en el reactor. En un extremo, se suspende un
termmetro que mide la temperatura alcanzada en el sistema de reaccin. Un matraz de bola
con tres bocas es utilizado como reactor. En un extremo es colocado un termmetro que mide
la temperatura de la reaccin. El otro extremo es utilizado para introducir la solucin
reductora, y finalmente en el centro del matraz se coloca un sistema refrigerante necesario
para el proceso de reflujo. Los componentes del reactor siempre fueron limpiados tenazmente
antes de ser usados.
Figura 6.1 Arreglo experimental de la sntesis de nanopartculas de oro
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Utilizando este arreglo experimental se prepararon las dispersiones coloidales de

nanopartculas de oro a diferentes razones en nmero de moles de [CS] / [HAuCI4] sin la
presencia de algn agente estabilizador.
Las propiedades fsicas y10 qumicas de los reactivos utilizados en la preparacin de las
nanopartculas de oro se resumen en la Tabla 6.1
o cloro
Alfa Aes
Citrato de sodio
2-
--
Pdilipore
Agui
Tabla 6.1 Propiedades fsicas de los diferentes reactivos utilizados para sntesis de NAii
Para llevar a cabo la sntesis de dispersiones coloidales de nanopartculas de Au se

utiliz el mtodo de reduccin qumica. Para tal efecto, se prepar una solucin precursora de
cido clorourico (0.033 mmol HAuC14 en 300 m1 de agua) disolviendo los cristales de
HAuC14 en agua. La solucin inica, inicialmente present un color amarillo, como se muestra
en la Figura 6.2 (a). 50 m1 de solucin precursora fueron puestos a reflujo a 100 "C y en
agitacin sobre una parrilla de calentamiento como se muestra en la Figura 6.1 . Entonces 2 m1
de una solucin de CS a diferentes concentraciones fue adicionada y puesta en reflujo por 1 h.
Inmediatamente al inicio de la reaccin, la solucin se torno incolora solo por algunos
instantes. En aproximadamente 10 seg. la coloracin de la solucin cambio a azul y luego a
color prpura indicando la formacin de los ncleos de oro. En unos pocos minutos la
solucin present un color rojo-rub caracterstico de dispersiones coloidales de partculas de
Au de tamao nanomtrico [34]. La terminacin de la reaccin toma unos minutos o decenas
de minutos dependiendo de la concentracin del CS utilizado. Estas caractersticas de cambio
de color fueron observadas para razones molares de [CS] 1 [HAuC14] en el intervalo de 0.25 a
2.25 y se presentan en la Figura 6.2. Estos resultados son consistentes con los obtenidos por
otros autores 1.2.3.4 Para mayores valores de razones molares no se observ la presencia del

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color azul y prpura durante la formacin de las nanoestructuras. Para determinar las
cantidades de reactivos en gramos realizamos los siguientes clculos:
Para determinar la cantidad de Citrato de sodio necesario utilizamos la siguiente frmula:
n=
peso
peso molecular
Donde:
n= nmero de moles= (3)(0.033 mmol)= 0.099 mmol
y el peso molecular del Citrato de Sodio es: 258.0 1795
Por lo tanto el peso de Citrato de Sodio es:

peso= n*peso molecular
peso= (0.099)
* (258.0 1795)= 25.549 mg
m.'
'al
d.,.
$a 8
Natzrre 1973,24/,20.
J. Phys. Chem. 1985,89, 1074.
4
J. Colloid Interface Sci. 1994, 165,97.
29
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Figura 6.2 Imgenes de diferentes tiempos de reaccin de dispersiones coloidales de nanopartculas de oro a una
razn molar de [CS] 1 [HAuC14]= 2.25 : a) solucin de HAuCI?, b) O segundos (inicio de la reaccin), c) 3 seg,
cc) 9 seg. (formacin de ncleos de oro), d) 12 seg, 15 seg. (proceso de coarsening) y e) 20 minutos(formacin
de nanopartculas de oro).
Para estudiar el efecto de la razn molar [CS] 1 [HAuCI4] en las propiedades de las
dispersiones coloidales de nanopartculas de oro, se prepararon diferentes soluciones
coloidales de Au, ver Tabla 6.2, manteniendo siempre constante el contenido de iones
metlicos. Las soluciones resultantes fueron entonces puestas a reflujo a 100 O C por 1 h con la
razn de concentracin de CS correspondiente. Las dispersiones coloidales as obtenidas son
homogneas y estables por meses. Para una razn de [HAuCId] 1 [CS] = 110.25 no se presenta
la formacin de nanoestructuras de Au. En la Figura 6.3 se presentan las imgenes de las
correspondientes dispersiones coloidales de Au. Se puede observar claramente la variacin de
color (violeta+rojo rubi+azulado)
con el aumento del contenido del CS utilizado en la
reaccin. Esta variacin del color es indicativa de la formacin de nanopartculas con

diferentes tamafios 1361.
NACIONAL
e
2.31 1
, +;,,
1+
i abla 6.2
Estabilidad y razn molar de las diferentes sntesis realizadas.
La formacin y estabilidad a la aglomeracin de las partculas coloidales es mostrada como +

(estable) o - (inestable).
- [HAuCl,] / [Citrato de Sodio]
7--
Tnninfio tle P:irticula
Figura 6.3 Dispersiones coloidales de oro a obtenidas con diferente razones molares de [HAuC14]/[CS].
6.2 Preparacin de dispersiones coloidales de nanopartculas semiconductoras (InP, III-
V)
La sntesis de nanocristales semiconductores se realiz en las instalaciones del laboratorio de
Ingeniera Ambiental perteneciente a la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla. Se
utiliz una caja de guantes para poner tener una atmsfera controlada (inerte), mediante gas
Argn. Tambin fue necesaria una bomba de vaco para realizar el intercambio y control de la
atmsfera dentro de la caja de guantes (ver Figura 6.4).
El esquema de sntesis utilizado est basado en el presentado por Liang Li y Peter
Reiss [37]. Dicho esquema fue desarrollado para quantum dots de InP a temperaturas
relativamente bajas y es muy similar a los desarrollados para nanocristales de Cd-Se,
incluyendo el disolvente, ligandos, los precursores, y la, no necesaria, desgasificacin a fondo.
La posicin del pico de absorcin del inP podra estar continuamente entre 390 y 720 nm bajo
este rgimen de sntesis. El rango de tamao accesible de una reaccin fue sintonizado con
facilidad por la concentracin de las aminas, la concentracin y la longitud de la cadena de los
)~
de Indio), y la temperatura de reaccin
cidos grasos utilizados para disolver I ~ I ( A C (Acetato
(por debajo de 200 O C). Las propiedades fsicas y10 qumicas de los reactivos utilizados en la
preparacin de las nanopartculas de InP, se resumen en la Tabla 6.2.
v
INSTITUTOPOLITCNICO
NACIONAL
Ingeniera Binica
Acetato de Indio
-
A-
upiita
sigmaAldrich
cid
ico
SigmaAldrich
225.37
"
Aldrich
1-dodecanoiol
1-0ctadecenc
44
Estearato de zinc
H?(CH~)I~COOI?~
97
SigrnaAldrich
90
SigmaAldrich
-
90
Riedel
Haen
Tabla 6.3 Propiedades fsicas de los diferentes reactivos utilizados para sntesis de NInP
de
NACIONAL
Ingeniera Binica
,,,,,,ta
Figura 6.4 a) Instalaciones del Laboratorio de Ingeniera Ambiental BUAP. b) Instalacin de alimentacin de
Argn. c) Caja de Guantes. d) Bomba de Vaco.
Figura 6.5. Izquierda: lavado de material. Derecha: material limpio.
33
NACIONAL
lneenieria Binica
A-
upllta
Se lav el material y se limpi el equipo necesario (esptula, 2 vasos de precipitados de

20 ml, reactor, enfriador, balanza, soporte universal, pinzas de sujecin, parrilla de
calentamiento, termmetro, matraz con tapn, probeta graduada de 20 ml., vaso de
precipitados de 100ml) ver Figura 6.5. A continuacin se coloc este material, as como los
reactivos, dentro de la cmara lateral de la caja de guantes; posteriormente se elimin el are
atmosfrico de la cmara mediante la bomba de vaco, para eliminar cualquier impureza que
pudiera afectar la reaccin; una vez realizado lo anterior, se procede a llenar la cmara con gas
Argn, para homogeneizar la atmsfera con la caja de guantes y poder pasar los materiales y
reactivos a la misma. Esta operacin se realiz tantas veces fue necesario, debido al tamao de
la cmara lateral, que no permite introducir todos lo necesario en un solo paso. Figura 6.6.
Figura 6.6 Colocacin del material en la cmara lateral de la caja de guantes.
Una vez teniendo el material, el equipo y los reactivos dentro de la caja de guantes, se
inici con la mezcla de reactivos, para lo cual se pesaron los reactivos necesarios para la
sntesis del precursor: Miristato de Indio.
6.2.1 Preparacin de Miristato de Indio III(MA)~
2 mmol de acetato de Indio fueron mezclados ba-jo una atmsfera inerte con 8 mmol de
cido mirstico (MA) y 20 m1 de ODE (1-octadeceno) en un matraz de 2 cuellos de 50 m1
equipado con un condensador. La mezcla fue calentada a 100-120C y puesta a reflujo por una
hora al vaco para obtener una solucin pticamente clara; posteriormente el vacio se llen con
Argn siendo enfriado a temperatura ambiente. Figura 6.7.
Para determinar la cantidad en gramos de los reactivos se procedi de la siguiente
forma para calcularla, utilizando para ello los pesos moleculares referidos en la tabla 6.2.
NACIONAL
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A-
",,iita
Para determinar la cantidad en gramos de Acetato de Indio:

1mmol AcIn
+ 291.95 mg
2 mmol AcIn 3 X1
XI = (2 mmol)( 291.95 mg)/(l mmol) = 0.5839mg

Para determinar la cantidad en gramos de cido mirstico:
1 mmol MA
+ 228.37 mg
5 mmol AcIn 3 X2
X2= ( 5 mmol)( 228.37 m&/( l mmol) = 1.1438mg
Figiira 6.7. a) Pesando los reactivos; b) Colocacin del cido mirstico y el I -0ctadeceno en el reactor; c) Sntesis
del precursor; d) Aplicacin de vaco a la cmara de guantes

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upiita
6.2.2 Sntesis de nanocristales de InP

Para la sntesis se requirieron 0.1 mmol de miristato de Indio, preparado a partir de
acetato de indio y cido mirstico (MA), 0.1 mmol de estearato de zinc, 0.1 mmol de
dodecanotiol (DDT), 0.1 mmol de tris(trimetilsi1il)fosfina (P(TMS)3 y 8 ml de 1-octadeceno
mezclados bajo una atmsfera inerte en un matraz de 2 bocas equipado con un condensador.
La mezcla fue calentada a una temperatura entre 230C-300C. La temperatura se mantuvo
durante un tiempo determinado (5 min - 2 hrs) para hacer crecer los nanocristales de InP con
coraza de ZnS. Durante el incremento de temperatura, se observ un cambio de color de
incoloro a verde a 60-80C, indicando que P(TMS)3 comenz a reaccionar con el precursor de
Indio. Para aislar los nanocristales, la mezcla de la reaccin fue enfriada hasta temperatura
ambiente, y un volumen equivalente de una mezcla de cloroformo/metanol (1: 1 vol:vol) as
como 10 equivalentes de etanol fueron aadidos; posteriormente se centrifug a 14000 rpm,
colocando la solucin en cinco vieles (se coloc uno extra con agua para compensar al
momento de centrifugar). Una vez centrifugadas las nanopartculas, se decant la solucin. Se
agregaron 2 m1 de etanol por viel; se trataron en el limpiador ultrasnico para disolver las
partculas en el etanol y se volvi a centrifugar. Este proceso se realiz por tres ocasiones, de
manera que se fueron limpiando las muestras. El precipitado resultante fcilmente podra estar
disperso en diferentes disolventes orgnicos, incluido el hexano, tolueno o cloroformo. Figura
6.8.
Figura 6.8 Nanopartculas despus del proceso de centrifugado
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6.3 Biofuncionalizacin de nanopartculas semiconductoras (InP, 111-V)

Despus de realizar la lectura detallada de artculos sobre biofuncionalizacin y
bioconjugacin de quantum dots para realizar marcadores biolgicos, se compararon las
ventajas y desventajas del uso de anticuerpos y de aptmeros. Optamos por plantear el
siguiente procedimiento para biofuncionalizar las nanopartculas semiconductoras:
Las sondas de nanopartculas de InP fueron sintetizadas por la derivacin de 5ml de
solucin de etanol de nanopartculas semiconductoras de InP con 2.5 OD de alcanotiololigonucletido (la concentracin final del oligonucletido es 3.6pM, disuelto en agua), la
mezcla heterognea se pone a reflujo durante 15 minutos, posteriormente se deja en reposo y
una vez que las fases sean separables y se retiran las molculas hiroflicas (Nanopartculas
InP-aptmeros). Despus de reposar durante 16 horas, la solucin es puesta a 0.1 M de NaC1,
buffer de 1OmM de fosfato (pH=7) y se deja reposar durante 40 h, seguida de centrifugacin
por lo menos unos 25 minutos a 14000 revoluciones por minuto para remover el exceso de
reactivos. Despus de retirar el supernatante, el precipitado rojo aceitoso es lavado con 5 m1 de
una solucin de stock de 0.1 M de NaCl y 10 mmol buffer fosfato se centrihga y se decanta; se
le agrega 5 m1 de una solucin de 0.3 M de NaCl y 10 mmol de buffer fosfato (pH=7), 0.01%
solucin cida.
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RESULTADOS
A-
u pllta
NACIONAL
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upllta
Resultados
7.1 Nanopartculas coloidales de oro.
Los espectro de absorcin en la regin UV-Vis de la soluciones de sal metlica de

HAuCI4 en H 2 0 es presentada en la Figura 7.1. La presencia de los iones de oro es revelada
por el pico de alrededor 216 nm. Con la adicin del sistema reductor citrato de sodio, el pico
de absorcin a 216 nrn decrece y desaparece como consecuencia de la reduccin de los iones
de oro a tomos metlicos. En este periodo, en general la solucin se vuelve transparente y
despus se torna azulado-violeta-rojo intenso debido a la formacin de partculas de oro de
escala nanomtrica. El espectro obtenido al final del proceso de crecimiento presenta una
banda caracterstica alrededor de 520 nm dependiendo de la razn [CS] / [HAuC14]
correspondiente a la resonancia del plasmon superficial (RPS) resultado de la oscilacin
colectiva de los electrones de conduccin del oro en las nanopartculas.
1.0
[Citrato] / [HAuCI,]
0.25
1
Iones de oro
(2 16 nm)
Longitud de onda (nm)

Figura 7.1 Espectro de absorcin en la regin UV-Vis de la solucin de oro con una razn molar
[CSII [HAuCI,] = 0.25
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A-
",,ita
La Figura 7.2 muestra los espectros de absorcin visible de las dispersiones coloidales
de nanopartculas de Au obtenidas a diferentes razones molares de [CS] 1 [HAuC14]. Para
todos los valores de razones de concentracin, se observo un solo mximo de absorcin. Estas
caractersticas, confirma la formacin de partculas esfricas de oro de escala nanomtrica.
[Citrato] 1 [HAuC14]= 0.5
O
RPS 530 nm
[Citrato] 1 [HAuCIJ = 0.75
0.50 -
RPS 525 nm
.m
-
5 0.25-
P
-
-0
d
A
300
400
500
[Citrato] / [HAuC14]= 1.0
0.50 -
0.50
RPS 524 nm
/-
m
.U
800
[Citrato] 1 [HAuCI4]= 1.3
700
600
RPS 523 nin
m
.-
4 0.25 -
2
0.25P
-
13
<
13
<
300
0.50
400
500
600
700
-?
S00
300
Longitud de onda ( m )
[Citrato] 1 [HAuCI,] = 1.7
0.50-
RPS518n1n
3
V
.m
-U
400
500
600
700
Longitud de onda ( m )
[Citrato] / [HAuCI,] = 2.0
r.
m
5
w
.-m
4 0.25 -
m 0.25 -
V1
<
0.00 7
Longitud de onda (nrn)
800
NACIONAL
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[Citrato] 1 [HAuCI4]= 2.7
[Citrato] / [HAuCIJ
0.10
upiita
3.0
0.50
Ci
RPS 51 9 nm
300
RPS 521 nrn
400
500
600
600
700
Y00
4.5
o
1
300
500
[Citrato] / [HAuCI,]
400
700
800
[Citrato] / [HAuC14]= 6.0
300
400
500
600
700
SO0
NACIONAL
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0.50 1
[Citrato] 1 [HAuCIJ]= 12.0

I
0.50
.mO-
.-m
O
C
RPS S22 nm
em 0.25 -
20.25 -
S:
V)
13
<
0.00.
300
A-
upllta
400
500
600
700
0.00.
300
800
400
Longitud d e onda (nm)
SO0
600
700
800
Longitud d e onda (nm)
Figura 7.2 Espectros de absorcin en la regin UV-Vis de las solucin de oro con diferente razn molar de
[CSII [HAuC14]
La posicin de la RPS varia en funcin de la razn molar [CS] / [HAuC14], se resume

en la Figura 7.3. De la grfica se observa una gran dependencia de la propiedad ptica en
funcin de la concentracin del CS utilizado en la preparacin de las dispersiones coloidales
de Au. Es claro observar que la posicin de la RPS se desplaza a menores longitudes de onda
(de 530 a 51 6 nm) conforme el valor de r aumenta de 0.5 a 2.0. Tal cambio puede ser asignado
a una reduccin del tamao. En contraste para valores de r mayores a 2.0, un desplazamiento a
mayores longitudes de onda es observado indicando el aumento del tamao de partcula de Au
en las dispersiones coloidales.
514!
. , .
.
4
. ,
. ,
.
10
12
[CS] 1 [HAuCI,]
Figura 7.3 Posicin de la RPS en funcin de la razn [CS] 1 [HAuCI,].
NACIONAL
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A-
",,iita
Las micrografias de TEM (Figura 7.4) confirman el tamao nanomtrico de las

partculas de Au y su respectiva homogeneidad.. Se observa que las partculas de Au son de
formas esfricas cuyos tamaos varan con el valor de r. La forma de las partculas es
conservada independientemente del valor de r .
Figura 7.4 Micrografias de TEM

Síntesis de Nanopartículas Semiconductoras para Su Biofuncionalización

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ing. Carlos Ros Ramrez

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Al Instituto Politcnico Nacional.

A la Unidad Profesional Interdisciplinaria en Ingeniera y Tecnologas Avanzadas

A la Benemrita Universidad Autnoma de Puebla

Al Centro de Investigacin en Ciencia Aplicada y Tecnologa Avanzada, Unidad Legaria

Agradezco al Instituto Politcnico Nacional la formacin acadmica recibida a lo largo de los

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1.1 Estado del Arte ........................................................................... 3

1.1.2 Nanobinica .................................................................. 5

5.6 Anticuerpos .............................................................................. 21

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Captulo VI1. RESULTADOS ..................................................................... -38

7.3 Estabilidad electroesttica ............................................................. 48

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

7.6 Espectros de absorcin de las soluciones inicas de Au en diferentes ....................47

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

7.9 Constancias de la presentacin del cartel en el 1 er. Congreso Nacional.. ................ 50

de Ciencia e Ingeniera en Materiales

6.2 Estabilidad y razn molar de las diferentes sntesis realizadas.. ......................... . 3 1

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We propose a method for the semiconductor nanoparticles biofunctionalization to use aptamers.

Keywords: Aptamer, nanoparticle, biomarker, biological mai-lcer

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1.1 Estado del arte

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Aunque el nmero de diferentes tipos de nanopartculas est aumentando rpidamente,

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materiales magnticos basados en xido de Hierro han sido ampliamente utilizados en la

En la actualidad, las nanopartculas magnticas estn llamando la atencin debido a si1

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Planteamiento del problema

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A continuacin se describen los mtodos experimentales utilizados para obtener

como se muestra en la Figura 5.1

La reduccin de los iones de las correspondientes sales metlicas en tomos con

Figura 5. 2 Ilustracin esquemtica del proceso de sintesis de nanopartculas metlicas dc oro.

5.3 Nucleacin y Crecimiento

Las dispersiones coloidales son estables por meses y presentan extraordinarias

Figiira 5.3 Ilustracin esquemtica de los tipos de estabilizacin.

5.5 Sntesis nanopartculas semiconductoras

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Los anticuerpos o inmunoglobulinas (Ig) son un tipo de protenas denominadas

Figura 5.4 Estructura de un anticuerpo.

5.6.1 Mecanismo de accin de los Anticuerpos