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Guin de Prcticas
Farmacologa I
Guin de Prcticas
ndice
Prcticas
1. Marco conceptual del laboratorio de Farmacologa............................................................9
2. Determinacin de la ventana de actividad biolgica y la dosis efectiva 50
en un sistema simulado........................................................................................... 13
3. Determinacin de la concentracin letal 50 (CL50)
del dicromato de potasio en Artemia salina..................................................................17
4. Determinacin de parmetros farmacocinticos en un modelo de vidrio................................. 23
5. Determinacin experimental de la dosis efectiva 50 (DE50) sedante en ratones....................... 29
6. Influencia de la va de administracin sobre la respuesta farmacolgica................................... 35
7. Excrecin renal de cido acetilsaliclico en voluntarios.......................................................39
8. Demostracin del efecto sinergista y antagonista en un sistema simulado................................ 43
9. Demostracin del efecto sinergista y antagonista en un sistema de rgano aislado..................... 49
Apndices
Apndice I. Tabla de conversin de proporcin a unidades Probit............................................57
Apndice II. Tcnicas de manejo e identificacin de animales de laboratorio (rata y ratn).............. 59
Apndice III. Formato de Consentimiento informado.............................................................65
Apndice IV. Instructivo para el uso del polgrafo Biopac System MP-100................................. 67
1.
La Farmacologa es una ciencia experimental por excelencia. Los mtodos utilizados para evaluar la seguridad y la
eficacia de los frmacos utilizan sistemas biolgicos que van desde fragmentos celulares o macromolculas aisladas
hasta poblaciones enteras. En gran parte del proceso de investigacin farmacolgica se utilizan animales de
laboratorio ntegros. Sin embargo, la creciente sensibilidad respecto a la prctica de la experimentacin en
animales en la investigacin y en la enseanza de las Ciencias Biomdicas, y la bsqueda de enfoques nuevos
en los aspectos prcticos de la misma son parte de un debate actual (Jukes y Chiuia, 2003).
La utilizacin de animales de experimentacin en la enseanza de las prcticas de diferentes asignaturas de las
Ciencias Biomdicas y en especial de la Farmacologa, ha venido siendo la metodologa ms empleada por
todos los profesores de esta disciplina. Gracias a la utilizacin de estos animales, los estudiantes han podido
apreciar los diferentes efectos y los principios de la accin farmacolgica. Entre las prcticas clsicas que se han
realizado en la mayora de los laboratorios de Farmacologa, algunas de ellas tienen un componente importante de
crueldad y son de poca aceptacin por algunos de los estudiantes. Una de las prcticas que no se puede aceptar
es la determinacin de la dosis letal 50 (DL50) en ratas o ratones, cuya utilidad est en duda como parmetro
para estimar la seguridad de los frmacos y sustancias nuevas. Es obvio que el uso de animales era el nico
mtodo del que disponan los profesores hace algunos aos para ensear esta materia. Pero en los ltimos aos
el avance de la informtica, de las tecnologas de la imagen y la disposicin de lneas celulares ha permitido el
desarrollo de numerosas alternativas que no requieren el uso de los animales para lograr los objetivos docentes
que se plantean en las prcticas de laboratorio de Farmacologa (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell,
2003; Eder et al., 2006).
Los mtodos utilizados en la investigacin, para la evaluacin de la seguridad y/o toxicidad y en la enseanza
estn en continuo progreso, ya que los cientficos estn en permanente bsqueda de posibles alternativas que
mejoren la calidad de su trabajo. Ello es debido, en parte, a la lgica evolucin de los conocimientos
cientficos y de sus aplicaciones tecnolgicas y, en parte, a consideraciones ticas, logsticas, econmicas,
sociopolticas y legales (Sterling y Rispin, 2002).
El nmero de animales utilizados en Europa con fines educativos es relativamente pequeo comparado con el
total empleado en investigacin y se ha venido reduciendo en los ltimos aos, pero a pesar de ello todava se
puede reducir ms. En Mxico, el uso de animales en docencia es alto, aunque no se cuenta con datos precisos
de cuntos se sacrifican en cada ciclo escolar. Por otro lado, la aplicacin de la Norma Oficial Mexicana
(NOM-062-ZOO-1999) ha sido lenta en los laboratorios de enseanza de las Ciencias Biomdicas. En
cambio, en el artculo 25 de la Convencin Europea para la Proteccin de los Animales Vertebrados utilizados
en Experimentacin y otros Fines Cientficos se especifica: aquellos procedimientos llevados a cabo con
fines educativos o de entrenamiento se deben restringir a los absolutamente necesarios para los fines relativos a
la enseanza y el entrenamiento y se permitirn nicamente si sus objetivos no pueden ser conseguidos por
mtodos audiovisuales u otros que sean suficientemente efectivos. En las legislaciones relacionadas con la
proteccin de los animales de todos los pases de la Comunidad Europea se considera fundamental aplicar el
principio de las 3Rs, promulgado por Russell y Burch en 1959 (Russell y Burch, 1959). Este principio indica
12
la necesidad de Reemplazar los animales de experimentacin por otros mtodos, siempre que sea posible y que
el nuevo sistema aporte el mismo grado de informacin, de Reducir el nmero de animales de experimentacin
cuando su uso sea necesario y se presente como el nico mtodo vlido y, finalmente, de Refinar las tcnicas
empleadas con los animales, con el fin de mejorar su eficacia o disminuir el dolor o el grado de sufrimiento
infligido (Van der Valk, et al., 1998; Vinardell, 2003).
En el caso de la docencia, se plantea el reemplazo de los animales de experimentacin por otros mtodos. Entre
los procedimientos propuestos se pueden citar:
4) Autoexperimentacin. Sin poner en riesgo en ningn grado la integridad y la salud de los estudiantes, se realizar
una prctica para observar algunos procesos farmacocinticos de un frmaco (cido acetilsaliclico).
Cualquiera que sea la modalidad que se realice, cada uno de ellos debe comprender las siguientes partes:
13
de desarrollo profesional.
Bibliografa
Eder C, Falkner E, Nehrer S, Losert U y Schoeffl H. (2006). Introducing the concept of the 3Rs
Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2 Edicin. InterNICHE.
Londres.
Meyer B, Ferrigni N, Putnam J, Jacobsen L, Nichols D, McLaughlin J. (1982). Brine Shrimp:
A convenient general bioassays for active plant constituents. Planta Medica. 45:31-34.
Londres.
Tallarida R. (2000). Drug synergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC.
EUA.
Van der Valk J, Dewhurst D, Hughes I, Atkinson J, Balcombe J, Braun H, Gabrielson K, Gruber
2.
I. Introduccin
Dentro de las Ciencias Biolgicas, entre ellas la Farmacologa, los animales muchas veces tienen un papel central
en las clases prcticas en el laboratorio. Cientos de millones son usados para experimentos o sacrificados para
su diseccin cada ao en todo el mundo.
La visin actual del uso de animales es una educacin completamente humana, donde los objetivos de la enseanza
son alcanzados usando mtodos alternativos, y donde la compasin, el respeto a la vida y el pensamiento crtico son
valorados y desarrollados. Es una visin donde los alumnos tienen libertad de conciencia y la relacin negativa con los
animales ha sido transformada al pensamiento positivo en lugar de hacer un uso daino (Jukes y Chiuia, 2006).
Un gran nmero de compuestos y frmacos cuenta con la determinacin experimental de los valores de
dosis efectiva 50 (DE50), dosis txica 50 (DT50) y dosis letal 50 (DL50). El clculo de este parmetro se
puede predecir mediante ecuaciones que explican el fenmeno farmacolgico (Tallarida, 2000). Utilizando
los valores descritos en la literatura es posible simular la adicin de diferentes dosis o concentraciones de
diferentes frmacos en un sistema en computadora, donde el alumno podr construir curvas dosis-respuesta y,
por lo tanto, determinar la DE50, sin el uso de animales de laboratorio.
II. Objetivos
Los objetivos de esta prctica son:
1. Determinar la ventana de actividad biolgica de frmacos mediante el uso de un sistema simulado.
2. Aprender el uso de un sistema simulado en computadora.
3. Calcular la DE50 de una serie de frmacos por medio de la ecuacin de Hill, con los datos obtenidos en
el sistema simulado.
III. Material
a) Software
Se utilizar el software SimCDR ver. 1.0 desarrollado ex profeso para la prctica por el M en C
16
IV. Procedimiento
a) Manejo del software SimCDR ver. 1.0
Para el uso adecuado del software se dividir su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente:
17
V. Anlisis de Resultados
1. Con los datos obtenidos en los experimentos simulados:
VI. Bibliografa
Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.
EUA.
Jukes N, Chiuia M. (2003). From Guinea Pig to Computer Mouse. 2 Edicin. InterNICHE.
Londres.
3.
I. Introduccin
Un bioensayo puede ser definido como cualquier prueba que involucra organismos vivos; a su vez, se puede
sealar como cualquier mtodo por medio del cual alguna propiedad de una sustancia o material, es medida en
trminos de la respuesta biolgica que produce. La relacin entre la respuesta biolgica y la dosis o la
concentracin de una sustancia activa se relaciona en la llamada curva dosis-respuesta. Esta vinculacin puede
darse de forma graduada o la respuesta puede ser de tipo todo o nada, tambin conocida como cuantal.
En esta prctica se realizar un experimento en que se analizar el segundo tipo de relacin curva dosisrespuesta, es decir, se analizar la curva dosis-respuesta cuantal, que debido a la forma en la que se realizar,
propiamente se debe referir como la curva concentracin-respuesta cuantal. Se utilizar como sistema biolgico
el crustceo Artemia salina en su forma adulta y como larva o nauplio, y como sustancia de prueba al
dicromato de potasio.
II. Objetivos
Los objetivos de esta prctica son:
1. Manejar un sistema biolgico alterno a los mamferos y roedores para la determinacin de una curva
concentracin-respuesta cuantal.
2. Realizar el clculo de la CL50 mediante el anlisis Probit.
III. Material
1. Utilizando Artemia salina adulta.
a) Material biolgico
De 100 a 200 ejemplares adultos de Artemia salina.
20
c) Reactivos
100 mL de disolucin de dicromato de potasio, K2Cr2O7 (50 mg/mL).
a) Material biolgico
Huevecillos liofilizados de Artemia salina.
c) Reactivos
100 mL de disolucin de dicromato de potasio, K2Cr2O7 (50 mg/mL).
Disolver 1.25 g de dicromato de potasio en 50 mL de agua destilada, una vez disuelto aforar a
un volumen de 100 mL con agua destilada.
500 mL de agua de mar artificial.
21
IV. Procedimiento
1. Utilizando la Artemia salina Adulta.
Artemia Salina
Volumen de la disolucin
de dicromato de potasio (mL)
0
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.6
2.0
22
23
V. Anlisis de resultados
1. Se tabulan los datos obtenidos en el siguiente cuadro:
REPETICIONES DEL EXPERIMENTO
CONCENTRACIN
(mg/mL)
ni
ri
ni
DATOS FINALES
ri
ni
ri
ni
ri
pi
yi
CONTROL
Nota: Recuerde que las concentraciones utilizadas varian de acuerdo al estado de madurez de la artemia utilizada.
VI. Bibliografa
Infante S y Caldern L. (1994). Manual de anlisis probit. Colegio de Posgraduados. Mxico.
McLaughlin J. (1991). Crow gall tumors on potato disc and Brine Shrimp lethality; two simple
bioassay for higher plant screening and fractionation. Methods in Plant Biochemistry. Volume 6.
Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA: 1-30.
Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.
New York.
4.
I. Introduccin
La Farmacocintica es la rama de la Farmacologa que estudia el curso temporal de los frmacos a travs del
organismo. Comprende los procesos de absorcin, distribucin y eliminacin de los frmacos. Este ltimo, a
la vez, comprende los procesos de excrecin y biotransformacin.
La curva de concentracin en funcin del tiempo se utiliza para determinar los parmetros farmacocinticos. La
forma de la curva concentracin-tiempo y los indicadores que se calculan a partir de ella, dependen de la va de
administracin y del fluido biolgico en el que se lleve a cabo el muestreo y anlisis del frmaco. Despus
de una administracin intravenosa es posible determinar los parmetros farmacocinticos: constante de eliminacin
(k), volumen aparente de distribucin (Vd), concentracin plasmtica al tiempo cero (Cp), depuracin total
(ClT), rea bajo la curva (ABC) y el tiempo de vida media (t). Para cuando el frmaco se administra por
una va que requiere de un proceso de absorcin, es decir, el paso del sitio de aplicacin a la circulacin general,
se pueden calcular los parmetros farmacocinticos: constante de absorcin (ka), concentracin plasmtica
mxima (Cpmax), tiempo al que se alcanza la concentracin plasmtica mxima (tmax), adems de k, t y ABC.
En esta prctica, mediante el uso de un modelo de vidrio es posible hacer una simulacin de la administracin
del frmaco por va intravenosa o por otra que requiere de un proceso de absorcin. Tambin es posible simular
la toma de muestras en sangre y en orina y, con ello, realizar los clculos de los parmetros farmacocinticos
correspondientes a dichas simulaciones.
II. Objetivos
Los objetivos de esta prctica son:
1. Utilizar un modelo de vidrio para simular la administracin de frmacos por las vas intravascular y extravascular.
2. Calcular los parmetros farmacocinticos para la administracin intravascular y extravascular.
3. Comparar el comportamiento cintico del frmaco en funcin de la va de administracin.
III. Material
a) Materiales, cristalera y equipo
Dos vasos de precipitado de 500 mL con brazo recto
Pipeta graduada de 5 mL
26
Perilla
Dos vasos de precipitado de 500 mL
Un vaso de precipitado de 100 mL
Seis matraces volumtricos de 10 mL
Un matraz volumtrico de 25 mL
Una pipeta volumtrica de 1 mL
Dos placas de agitacin
Dos soportes universal
Dos pinzas con nuez
Un embudo de separacin de 1 L
Un anillo para soporte universal
Dos matraces Erlenmeyer de 250 mL
Un cronmetro
24 Tubos de ensayo
Cuatro litros de agua corriente
Dos barras magnticas de agitacin
Dos agitadores magnticos
Balanza analtica
Espectrofotmetro
b) Reactivos
Disolucin de Rojo Congo (4 mg/mL)
IV. Procedimiento
1. Va intravascular
27
b) Colocar agua corriente en el embudo de separacin, mantener el mismo volumen durante todo el
experimento.
c) Mantener la agitacin constante en el vaso de precipitado A.
d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.
e) Adicionar agua corriente al vaso de precipitado A, llevndolo a un volumen muy cercano para que se
inicie el goteo.
f) Adicionar 5 mL de la disolucin del colorante al vaso de precipitado A. El momento en que inicia el
goteo del vaso se toma como referencia para la toma de muestras.
g) Cuando inicia el goteo, inmediatamente se toma una muestra de 2 mL del vaso A.
h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A de acuerdo a los tiempos
indicados en el siguiente cuadro.
Tiempo
(min)
Control
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
60
75
90
120
Va intravascular
Vaso A
Absorbancia
Concentracin (mg/mL)
2. Va extravascular
a) Colocar el material de acuerdo al siguiente esquema:
28
b) Colocar agua corriente en el embudo de separacin, mantener el mismo volumen durante el experimento.
c) Mantener la agitacin constante en los vasos de precipitado.
d) Medir la velocidad de flujo del goteo y llevarla a un flujo constante de 20 mL/min.
e) Adicionar agua corriente a los vasos de precipitado, llevndolos a un volumen muy cercano para que
inicie el goteo.
f) Agregar 5 mL de la solucin del colorante al vaso de precipitado A. La hora en que inicia el goteo
del vaso A al B se toma como referencia para la toma de muestras.
g) Cuando inicia el goteo se toma una muestra de 2 mL del vaso A y del B.
h) Se deja correr el experimento y se toman muestras de 2 mL del vaso A y B de acuerdo al cuadro siguiente.
Va intravascular
Tiempo
(min)
Vaso A
Absorbancia
Vaso B
Concentracin
(mg/mL)
Absorbancia
Concentracin
(mg/mL)
Control
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
60
75
90
120
a) Realizar una curva estndar del pesando 1 mg del colorante, disolverlo en agua destilada, aforar a 10
mL y continuar como se indica en el esquema siguiente:
29
b) Leer las absorbancias de la curva estndar y de las muestras obtenidas en los experimentos en el
espectrofotmetro a una longitud de onda de 490 nm.
Tubo
Blanco
1
2
3
4
5
6
Absorbancia
c) Determinar la concentracin de las muestras interpolando el valor de las lecturas en la curva estndar.
V. Anlisis de resultados
1. Elaborar una grfica por cada va de administracin, considerando el logaritmo natural de la concentracin
[g/mL] contra tiempo [min].
2. Calcular los parmetros farmacocinticos t, Vd, k, ka, ClT, Cpmax, tmax ABC; segn la va de administracin
simulada.
3. Analizar la importancia de los modelos farmacocinticos in vitro y de los parmetros farmacocinticos
calculados
VI. Bibliografa
Gumtow R, Proudfoot J y Talada A (1989). An in vitro pharmacokinetic system for use in the
5.
I. Introduccin
En esta prctica se utilizar un modelo sencillo basado en el comportamiento de los roedores al explorar un
ambiente extrao. El nmero de levantamientos sobre sus extremidades traseras est relacionado con un estado
de alerta. La disminucin en esta conducta por la accin de un frmaco est relacionado con una actividad
tranquilizante y en varios trabajos de investigacin se ha utilizado para medir el efecto sedante de los depresores
del Sistema Nervioso Central (Oliva et al., 2004; Ugalde et al., 2005; Gonzlez-Trujano et al., 2006).
En esta prctica se contempla determinar la DE50 sedante de pentobarbital sdico y del etanol, utilizando el
modelo de Cilindro de Exploracin en ratones.
II. Objetivo
El objetivo de esta prctica es:
1. Determinar la DE50 para el efecto sedante del pentobarbital y etanol en ratn, utilizando el modelo del
Cilindro de Exploracin.
III. Material
a) Material biolgico
Ratones ICR CD1 machos de 25-30 g de peso
32
c) Frmacos y reactivos
Anestesal (pentobarbital sdico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.
Disolucin de Pentobarbital sdico 3 mg/mL.
IV. Procedimiento
A. Efecto sedante de pentobarbital
Frasco vial
Dosis
(mg/kg)
Concentracin
(mg/kg)
Pentobarbital
(mg/kg)
Disolucin
salina
CONTROL
2.5
0.25
2.75
0.25
0.5
0.5
0.5
10
15
1.5
1.5
1.5
30
33
Peso (g)
Dosis
(mg/kg)
1
2
3
4
5
6
Admn.
0
6
12
18
24
30
Tiempo (h:min)
Inicio
Final
30
35
36
41
42
47
48
53
54
59
01:00
01:05
Nm. de
levantamientos
34
Frasco vial
Dosis
(mg/kg)
1
2
3
4
5
6
Control
500
1000
2000
2500
3000
Concentracin
(mg/mL)
0
50
100
200
250
300
Ratn
1
2
3
4
5
6
Peso (g)
Dosis (mg/kg)
Admn.
0
6
12
18
24
30
Tiempo (h:min)
Inicio
5
11
17
23
29
35
Final
10
16
22
28
34
40
Nm. de
levantamientos
35
V. Anlisis de resultados
a) Clculo de la DE50
1) Calcule el porcentaje de efecto por cada dosis, considerando que el nmero de levantamientos
promedio de los ratones control es igual al 0% de efecto.
2) Determine el modelo que siguen los datos obtenidos.
3) Calcule la DE50 para el efecto sedante de acuerdo al modelo determinado.
b) Clculo de la potencia relativa
1) Calcule la potencia relativa del efecto sedante entre etanol y pentobarbital. Con la relacin:
Potencia relativa del Etanol(Pr EtOH)=
DE 50 Pentobarbital
DE 50 Etanol
VI. Bibliografa
Gonzlez-Trujano M, Martnez A, Reyes A, Reyes B y Navarrete A. (2006). Palmitote isolated
from Annona diversifolia induces an anxiolytic-like effect in mice. Planta Medica. 72(8):703707
Tallarida R. (2000). Drug Synergism and Dose-effect Data Analysis. Chapman & Hall /CRC.
New York.
Ugalde M, Reza V, Gonzlez-Trujano M, Avula B, Khan I y Navarrete A. (2005). Isobolographic
analysis of the sedative interaction between six central nervous system depressant drugs and Valeriana
edulis hydroalcoholic extract in mice. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 57:631-639.
6.
Influencia de la va de administracin
sobre la respuesta farmacolgica
I. Introduccin
La respuesta farmacolgica se puede ver modificada en funcin de la va por la cual se administra el frmaco.
Esta transformacin puede consistir en un simple retraso en la accin y, en otros casos, puede cambiar o anular
totalmente el efecto. Algunos pueden sufrir alteraciones en el sitio de aplicacin, dando origen a nuevas
molculas que no necesariamente van a presentar la misma reaccin o van a seguir la misma farmacocintica.
En otros casos, debido a las propiedades fisicoqumicas, no es posible administrarlo por una va determinada,
por ejemplo, un frmaco no soluble en soluciones acuosas no es posible administrarlo por va intravenosa. Los
frmacos irritantes tambin limitan su aplicacin por alguna va determinada, as que la eleccin de la forma
de administracin ms adecuada es importante para lograr que se consiga el efecto deseado a una velocidad
y a una intensidad idneas.
En esta prctica se evaluar la forma en la cual la va de administracin modifica la respuesta de un frmaco
bien caracterizado como el pentobarbital, para el cual se medirn el perodo de latencia y la duracin del
efecto cuando se administra por distintos puntos.
II. Objetivos
Los objetivos de esta prctica son:
1. Determinar la influencia de la va de administracin en la accin farmacolgica del pentobarbital.
2. Explicar el significado del perodo de latencia de la accin farmacolgica del pentobarbital.
III. Material
a) Material biolgico
Cuatro ratas Wistar machos de 200-250 g de peso
38
c) Frmacos y reactivos
Anestesal (pentobarbital sdico 6.3 g/100 mL, uso veterinario). Pfizer.
Disolucin de Pentobarbital sdico 40 mg/mL.
IV. Procedimiento
1) Pesado y marcaje de animales
Cada grupo de trabajo recibir cuatro ratas. Marque a sus animales con el marcador de tinta indeleble,
pselos y registre el peso de cada uno.
Rata
Nm.
1
2
3
4
Peso
(g)
Volumen a
Tiempo de
Tiempo de
Va de
administracin administracin administracin
administracin
(mL)
(min)
(min)
Efecto
Inicio
(min)
Trmino
(min)
Duracin
(min)
39
V. Anlisis de resultados
a) Construya una grfica para el perodo de latencia y otro para la duracin del efecto en funcin de la
va de administracin.
b) Realice el anlisis estadstico correspondiente para indicar si hay o no influencia de la va de administracin
en el efecto del pentobarbital.
VI. Bibliografa
Rowland M y Tozer T. (1995). Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger, EUA.
Shargel L, Wu-Pong S y Yu A. (2004). Applied biopharmaceutics and Pharmacokinetics. 5th
7.
I. Introduccin
La eliminacin de frmacos comprende dos procesos: la excrecin y la biotransformacin. La excrecin
renal es la principal va como se desecha gran cantidad de frmacos. Cuando existe una disminucin en la
eliminacin por esta forma puede tener complicaciones importantes, ya que se debe modificar el esquema de
dosificacin y la dosis.
En esta prctica se determinar la eliminacin de un frmaco comn, el cido acetilsaliclico, cuantificando en
la orina la cantidad de salicilatos totales excretados despus de la administracin de dos tabletas de 500 mg
de este frmaco en voluntarios sanos.
II. Objetivos
Los objetivos de esta prctica son:
1. Identificar a la excrecin renal como uno de los procesos principales de la eliminacin de frmacos.
2. Determinar la eliminacin por excrecin renal del cido acetilsaliclico en voluntarios sanos, as como
identificar los factores que influyen en la misma.
III. Material
a) Sujetos de estudio
Criterios de inclusin: Voluntarios adultos jvenes sanos, de 18 a 20 aos de edad, de 55-65 kg
de peso, preferentemente del gnero masculino.
Criterios de exclusin: No entrarn en el grupo personas con problemas gastrointestinales (lcera
gastroduodenal, gastritis), historia de alergias, problemas en su funcin renal o intolerancia a salicilatos,
mujeres con problemas de hemorragias menstruales, ni sujetos que hayan tomado salicilatos en las
ltimas 24 horas. Cualquiera de estas contingencias debe ser informada al profesor.
Todos los voluntarios debern contar con el formato de Consentimiento informado, firmado por
el voluntario, un testigo y los profesores de laboratorio. El original lo entregarn a su profesor y
conservarn una copia (ver Apndice III).
42
c) Frmacos y reactivos
Agua potable
Tabletas de cido acetilsaliclico de 500 mg
Salicilato de sodio
Reactivo de Trinder para salicilatos
IV. Procedimiento
a) Preparacin y toma de muestras
Rotular cinco matraces Erlenmeyer (donde se colocarn las muestras de orina) y cinco tubos de ensayo
con los tiempos 0, 40, 60, 80 y 100 minutos. Anotar en el cuadro adjunto la hora en la cual se
realizarn cada una de las tareas.
Obtencin de la muestras se realizar de acuerdo con el cuadro siguiente.
43
Tiempo
(min)
Hora
Actividad a realizar
Desechar la primera orina.
Tomar 750 mL de agua potable.
Colectar la orina (mnimo 100 mL). sta ser la orina basal.
Medir su volumen y anotarlo.
40
60
80
100
1) Calentar a ebullicin los tubos de ensayo con las muestras durante 10 minutos.
2) Enfriar los tubos con agua fra
3) Aadir al tubo 2.5 mL de reactivo para salicilatos. La reaccin da un color cuantificable por
espectrofotometra a 525 nm.
4) Realizar una curva estndar pesando 10 mg de salicilato de sodio, disolverlo en agua destilada, aforar a
10 mL y continuar como se indica en el cuadro siguiente, utilizando matraces volumtricos de 10 mL:
44
Tubo nm.
Concentracin
(g/mL)
0.25
25
0.5
50
100
200
300
Absorbancia
Muestra
Tiempo
(min)
Blanco
40
60
80
100
pH
Volumen
(mL)
Absorbancia
Concentracin
(g/mL)
Cantidad excretada
de salicilatos (g)
Cantidad excretada
acumulada de
salicilatos (g)
V. Anlisis de resultados
1) Construya una grfica de cantidad excretada acumulada de salicilatos contra el tiempo y calcule la constante
de excrecin.
2) Calcule el porcentaje de frmaco excretado por orina en 100 minutos y comprela con la de otros
voluntarios.
VI. Bibliografa
Rowland M y Tozer T. (1995). Clinical pharmacokinetics. 3rd Edition. Lea and Febiger. EUA.
Shargel L, Wu-Pong S, y Yu A. (2004). Applied biopharmaceutics and pharmacokinetics. 5th
8.
I. Introduccin
Las lecciones prcticas son una parte importante de la enseanza de la Farmacologa en diversas reas como la
Medicina, la Enfermera y la Farmacia. Los experimentos in vivo e in vitro han sido ampliamente utilizados en
las lecciones prcticas para ayudar a los estudiantes a adquirir habilidades en los experimentos farmacolgicos,
reforzando su conocimiento aprendido con las clases tericas y los libros.
Aunque los experimentos tradicionales en animales vivos son invaluables, tienen desventajas: alto consumo de
tiempo, dinero y sacrificio de ejemplares; slo puede probarse un nmero limitado de frmacos en un tiempo
y requieren frecuentemente de un trabajo constante e intenso.
Una variedad de software ha sido desarrollado para la enseanza de la Farmacologa en pregrado y posgrado.
Evidencia previa ha mostrado que esta tcnica innovadora de enseanza, junto con los mtodos de enseanza
tradicionales, facilita al estudiante el aprendizaje y mejora su desempeo en esta disciplina.
En esta sesin, se utilizar un sistema de simulacin para construir curvas concentracin-respuesta de agonistas,
tal y como se realizaran en un modelo de rgano o tejido aislado.
II. Objetivo
Los objetivos de esta prctica son:
1. Demostrar el efecto concentracin dependiente de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.
2. Determinar el tipo de interaccin farmacolgica de la Atropina, Mepiramina y Tubocurarina sobre la
actividad de la Histamina y Carbacol en un sistema simulado.
III. Material
a) Software
Se utilizar el software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2 desarrollado por la Universidad
de Strathclyde, Escocia.
46
http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/2/OBSim%20V1.2%20Setup.exe
El software deber ser instalado en una PC o compatible con Microsoft Windows 98 posterior.
IV. Procedimiento
A) Manejo del software Organ Bath Simulation 2006 ver. 1.2
Para el uso adecuado del software se dividir su manejo por procedimiento con referencia al esquema siguiente:
a) Seleccione en Tissue type, el tejido Guinea Pig Ileum. Este tejido es el que ser colocado dentro de
la cmara de rgano aislado.
b) Oprima el botn New Experiment.
c) Oprima el botn Record, para comenzar la lectura dentro del rea de registro.
d) Seleccione y aplique frmacos de la lista de agonistas o antagonistas como se indica a continuacin.
47
48
f) Al terminar la curva, se oprime el botn Stop y se guarda el registro. Se calcula la fuerza de contraccin
por cada concentracin agregada.
g) Se realiza el mismo experimento, ahora con Carbacol (Carbachol).
Experimento 2.
Efecto de un antagonista en la curva concentracin respuesta de agonistas
49
V. Anlisis de resultados
1. Con los datos obtenidos del experimento 1
a) Construir las curvas concentracin respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno de los
antagonistas utilizados.
b) Calcular la CE50 para las combinaciones de Histamina y de Carbacol con los antagonistas utilizados de
acuerdo con modelo determinado en el experimento anterior.
c) Calcular cuntas veces se disminuy el efecto del Carbacol y de la Histamina por la presencia de sus
antagonistas.
d) Con las tres curvas concentracin-respuesta de los antagonistas a diferente concentracin, calcule la
potencia o pA2 del antagonista.
3. Con los datos del experimento 3
a) Construir las curvas concentracin respuesta de Histamina y de Carbacol con cada uno de los
antagonistas utilizados.
b) Determinar el modelo al que se ajustan los datos.
c) Calcular la CI50 (Concentracin Inhibitoria media) para las combinaciones de Histamina y
de Carbacol con los antagonistas utilizados, de acuerdo con modelo determinado en el inciso
anterior.
50
VI. Bibliografa
Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non-specific assays. Methods in
Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261-280.
Tallarida R. (2000). Drug sinergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC,
EUA.
9.
I. Introduccin
Las preparaciones de tejidos u rganos aislados son comnmente usadas para estudiar los efectos de un
frmaco sobre un tipo especfico de receptores. Estas preparaciones son tambin utilizadas para bioensayos,
caracterizacin de receptores especficos o sus subtipos, para determinar la curva concentracin-respuesta de
un agonista y para estudiar el antagonismo entre un frmaco y otro nuevo descubierto.
El leon de cobayo ha sido una preparacin in vitro utilizada para estudiar cambios mediados por receptores,
para identificar nuevos receptores, y para determinar la variacin en especies producidas por frmacos anticolinrgicos. Varios receptores, incluyendo los de histamina, los GABArgicos y adrenorreceptores se pueden
estudiar en este tipo de preparaciones.
La preparacin de leon de rata puede ser usada para ensear los conceptos bsicos del bioensayo y para
demostrar la actividad espasmoltica de frmacos colinrgicos y anticolinrgicos. Las ventajas de esta preparacin son su bajo costo y fcil implementacin y manejo.
En esta prctica se utilizar la preparacin de leon de rata para determinar el efecto del Carbacol y Atropina
sobre los receptores colinrgicos presentes en la preparacin.
II. Objetivos
Los objetivos de esta prctica son:
1. Demostrar el efecto concentracin dependiente del Carbacol en leon de rata.
2. Determinar el tipo de interaccin farmacolgica de la Atropina sobre la actividad del Carbacol en leon
de rata.
III. Material
a) Material biolgico
Una rata Wistar hembra de 200-250 g de peso, con ayuno de 12 h y libre acceso al agua.
52
3.7
c) Reactivos
Disolucin Krebs-Henseleit (KHS).
Composicin en mM: NaCl 118, KCl 4.7, MgSO4.7H2O 1.2, CaCl2 2.5, KH2PO4 1.2,
NaHCO3 25, glucosa (C6H12O6) 11.
Cantidades de las sales para preparar 1000 mL de disolucin Krebs-Henseleit (KHS)
D-glucosa
C6H12O6
1.998 g
Sulfato de magnesio heptahidratado
MgSO4 l 7H2O
0.2956 g
Dihidrogenofosfato de potasio
Cloruro de potasio
Cloruro de sodio
Hidrgenocarbonato de sodio
EDTA disdico dihidratado
Cloruro de calcio dihidratado
KH2PO4
KCl
NaCl
NaHCO3
C10H14O8N2Na2 l 2H2O
CaCl2 l 2H2O
0.1632 g
0.351 g
6.903 g
2.1 g
0.0117 g
0.3677 g
Se disuelven todas las sales, una por una, en aproximadamente 500 mL de agua destilada. Disolviendo al
ltimo el cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin signos de precipitacin se lleva a un volumen de
1000 mL con agua destilada.
La disolucin KHS deber tener un pH de 7.4 a 37C y se mantendr con burbujeo constante de gas
carbgeno (95% O2 y 5% CO2). Si presenta precipitacin deber prepararse nuevamente.
Disoluciones de Carbacol (1x104, 3x105, 1x105, 3x106 y 1x106 M).
53
Se pesan 1.692 mg de sulfato de atropina, se disuelven agua destilada y se afora aun volumen
de 10 mL (disolucin Stock). A continuacin se sigue el esquema de diluciones como se indica:
IV. Procedimiento
54
3) Disecar una longitud aproximada de 1012 cm de leon, lavarlo con disolucin KHS hasta que la
luz intestinal quede libre materia orgnica.
4) Cortar segmentos de aproximadamente 1 cm de largo y colocarlos en disolucin KHS, con burbujeo continuo
de gas carbgeno.
c) Montaje de la preparacin
1) Cada preparacin se suspender en una cmara para rgano aislado con ganchos de alambre
de nicromel, que se incrustan en el tejido. Uno de los extremos se fija a la cmara y el otro al
transductor de fuerza conectado al Polgrafo Biopac System, de acuerdo a las siguientes figuras:
55
2) Cada cmara deber contener 10 mL de solucin KHS con burbujeo constante de gas carbgeno
a una temperatura de 371 C.
3) El tejido se somete a una tensin inicial de 1 g dejndolo estabilizar por 20 minutos, con un
lavado intermedio a los 10 minutos.
4) Realizar dos estimulaciones con 100 L de Carbacol (1x10-4 M) a intervalos de 20 minutos,
con un lavado intermedio a los 10 minutos Despus de cada estimulacin se lava el tejido con
solucin KHS dos veces para eliminar al Carbacol.
Nota: La concentracin real en la cmara de rgano aislado es 100 veces menor debido a la
dilucin (1:100).
Actividad
Inicio
(Oprimir el botn Start)
Lavado con KHS
Estimulacin 1 y
Lavado con KHS
Lavado con KHS
Estimulacin 2 y
Lavado con KHS
Lavado con KHS
Lavado con KHS
Inicio de las evaluaciones
Concentracin de Carbacol
1x106 M
3x106 M
1x105 M
3x105 M
1x104 M
2) Despus de evaluar se lava el tejido por dos veces con disolucin KHS dejando reposar por
periodos de 10 minutos entre cada uno.
e) Efecto de la Atropina en la accin del Carbacol
1) Estando estable el tejido, se registra una lnea basal durante 5 minutos y se adicionan 0.1 mL de
Atropina 1x106 M.
2) Se deja incubar el tejido con la Atropina durante 5 minutos y posteriormente se realiza la curva
acumulativa concentracin-respuesta, como se indic en el inciso e).
56
V. Anlisis de resultados
1. Para analizar los datos es necesario descargar el software AcqKnowledge 3.9 Demo en la siguiente
direccin electrnica:
http://www.biopac.com/Demos.asp?did=4&PCDemoResearch=Y
Es necesario registrase para descargarlo, y debe instalarse como indican las instrucciones del sitio web.
Con ayuda del software y de su profesor deber llenar el cuadro de datos anexa.
TABLA DE DATOS DEL EXPERIMENTO
EXPERIMENTO 1. CARBACOL
NM.
CONCENTRACIN
(M) CARBACOL
MUESTRA / CANAL
1
Basal
1
2
3
4
5
6
EXPERIMENTO 2. CARBACOL + ATROPINA (1X10-6 M)
NM.
CONCENTRACIN
(M) CARBACOL
MUESTRA / CANAL
1
Basal
1
2
3
4
5
6
57
d) Calcular cuntas veces se disminuy el efecto del Carbacol por la presencia de la Atropina.
e) Determinar el tipo de interaccin de la Atropina sobre la accin del Carbacol.
VI. Bibliografa
Samuelsson G. (1991). Assays for pharmacological activity: Non-specific assays. Methods in
Plant Biochemistry. Volume 6. Assay for bioactivity. Academic Press Limited, EUA, 261-280.
Tallarida R. (2000). Drug sinergism and dose-effect data analysis. Chapman & Hall/CRC, EUA.
Apndice I.
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
0.07
0.08
0.09
0.00
---
2.673
2.945
3.119
3.249
3.355
3.445
3.524
3.595
3.659
0.10
3.718
3.773
3.825
3.874
3.920
3.964
4.006
4.046
4.085
4.122
0.20
4.156
4.194
4.228
4.261
4.294
4.326
4.357
4.388
4.417
4.447
0.30
4.476
4.505
4.532
4.561
4.588
4.615
4.642
4.669
4.695
4.721
0.40
4.747
4.773
4.798
4.824
4.849
4.874
4.900
4.925
4.950
4.975
0.50
5.000
5.025
5.050
5.075
5.100
5.125
5.151
5.176
5.202
5.227
0.60
5.253
5.279
5.305
5.331
5.358
5.385
5.412
5.439
5.467
5.495
0.70
5.524
5.553
5.582
5.612
5.643
5.674
5.706
5.739
5.771
5.806
0.80
5.841
5.878
5.915
5.954
5.994
6.036
6.080
6.126
6.175
6.227
0.90
6.282
6.341
6.405
6.476
6.555
6.645
6.751
6.881
7.054
7.327
pi
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
0.97
6.88
6.896
6.911
6.927
6.944
6.960
6.978
6.996
7.014
7.034
0.98
7.054
7.075
7.097
7.121
7.145
7.171
7.198
7.227
7.258
7.291
0.99
7.327
7.366
7.409
7.458
7.513
7.576
7.652
7.748
7.879
8.091
Apndice II.
Para la inmovilizacin del ratn con el objetivo de administrarle un frmaco o sustancia, se proceder de la
siguiente manera:
Se toma al ratn como se explic anteriormente, y el peso del cuerpo del roedor es apoyado sobre la reja
de la caja (figura 3), se toma ahora la cola del ratn por medio del dedo meique y con los dedos ndice y
pulgar se toma de la piel de la nuca (figura 4 y 5). Se voltea y se levanta la mano, de manera que el vientre
quede expuesto (figura 6 y 7). Una buena inmovilizacin evita que el ratn se voltee o se mueva al momento
de la administracin.
62
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
63
Una vez inmovilizado el ratn se puede proceder a la administracin del frmaco o sustancia, teniendo
cuidado de sujetarlo firmemente.
Tcnica 1.
Se sujeta a la rata por la base de la cola con la mano derecha y con la izquierda se coloca el cuello de la rata
entre los dedos medio e ndice. La rata entonces es sujetada por las extremidades anteriores y el abdomen
sin hacer presin sobre el cuello (figura 9, 10 y 11). Se levanta la mano y la cola es sujetada con la mano
izquierda para dejar expuesto el vientre (figura 12 y 13). Se levanta la mano y la cola es sujetada con la
mano derecha para dejar expuesto el vientre.
Figura 9.
Figura 10.
Figura 11.
64
Figura 12.
Figura 13.
Tcnica 2.
Se sujeta a la rata por la base de la cola con la mano derecha y con la mano izquierda se coloca el cuello de la rata
entre los dedos pulgar e ndice (figura 14 y 15), de manera que los dedos queden a la altura de las extremidades anteriores. Con el movimiento natural de la mano, se cierra sta de manera que las extremidades anteriores
de la rata queden cruzadas, se levanta y se sujeta la cola con la mano derecha para dejar expuesto el vientre
(figuras 16, 17 y 18).
Figura 14.
Figura 15.
Figura 16.
Figura 17.
Figura 18.
65
66
IV. Bibliografa
Short D y Woodnott D (editores). (1963). The A.T.A. manual of laboratory animal practice
Apndice III.
Apndice IV.
I. Materiales y reactivos
Polgrafo Biopac System MP-100A-CE
Gas carbgeno (oxigeno 95%-dixido de carbono 5%).
Disolucin Krebs-Henseleit (KHS)
C6H12O6
1.998 g
MgSO47H2O
0.2956 g
Dihidrogenofosfato de potasio
KH2PO4
0.1632 g
Cloruro de potasio
KCl
0.351 g
Cloruro de sodio
NaCl
6.903 g
Hidrgenocarbonato de sodio
NaHCO3
2.1 g
C10H14O8N2Na22H2O
0.0117 g
CaCl22H2O
0.3677 g
Preparacin: Se disuelven todas las sales en aproximadamente 500 mL de agua destilada. Disolviendo
en ltimo trmino al Cloruro de calcio. Una vez disueltas las sales y sin signos de precipitacin se lleva a un
volumen de 1000 mL con agua destilada.
Disolucin de Acetilcolina 3x10-5 M
Disolucin de Norepinefrina 1x10-6 M
Disolucin de Carbacol 1x10-4 M
70
II. Procedimiento
3. Se verifica que el nivel de agua del bao recirculador cubra la resistencia y la bomba. Se enciende y
deja estabilizar la temperatura en 371C. Este bao proporciona el flujo de agua que mantiene
la temperatura de la disolucin KHS a dicha temperatura.
71
para iniciar el programa AcqKnowledge, el cual registra los datos provenientes del Polgrafo.
5. Al comenzar el programa se abre la ventana que se ilustra enseguida.
6. Para comenzar la configuracin del polgrafo se selecciona en el men la opcin MP100, y posteriormente
la opcin Setup Channels que nos abrir una ventana emergente.
72
7. En la ventana emergente Input Channels, se activan los canales que se utilizarn seleccionando las casillas
Acquire, Plot y Values con para cada canal An.
y se oprime el botn
con el
9. En las casillas Scale value se colocan 0 (cero) y 2 (dos) y en Units se coloca g (gramos) como se muestra
a continuacin.
73
11. Continuando con la calibracin, se selecciona en el men la opcin MP100, y posteriormente la opcin
Setup Acquisition.
74
13. En la pantalla emergente Setup Acquisition, se seleccionarn las opciones Record and Save once to
Disk acquisition. Posteriormente se elegir Acquisition Sample Rate en 0.5 1.0 samples /second, y en
Total lengh se determinar el mximo en horas, como se muestra a continuacin.
14. El Polgrafo ya est calibrado y se puede seguir con el montaje del tejido.
1. Antes de montar el tejido se selecciona en el men del software AcqKnowledge la opcin MP100, y
posteriormente. Show Input Values.
75
2. Al seleccionar abrir una ventana emergente que muestra los valores que se registran en el Polgrafo.
En la ventana emergente se oprime el botn n y despus el de Options. En esta ltima se seleccionan Channel
numbers, Units y Values, y el tamao de letra adecuado para su visualizacin (se recomienda de 14-18
puntos). Al terminar se oprime el botn OK.
76
3. Se realiza la diseccin del tejido a utilizar de acuerdo a lo reportado en la literatura. En caso de leon o
trquea de cobayo o aorta de rata el tejido se cortar en anillos para su montaje.
4. Para aorta y traquea el tejido es sujetado por medio de ganchos de alambre Nicromel como se muestra
en la figura.
Para leon el tejido es montado de acuerdo a la siguiente figura, insertando el tejido en los ganchos:
5. Los ganchos junto con el tejido son colocados dentro de la cmara de rgano aislado previamente llena
con KHS y con burbujeo constante de gas carbgeno, como se muestra a continuacin.
77
6. Se le da una tensin a cada tejido de cada cmara, por medio del tensor del transductor de acuerdo con
el siguiente cuadro.
Tejido
Aorta de rata
Trquea de cobayo
leon de rata
Tensin
4.0 gramos
1.5 gramos
1.0 gramo
78
Scope Mode
(muestra todos los
canales juntos)
Chart Mode
(muestra cada canal
por separado)
EFECTO
Oprimir
sobre el eje
Y
Oprimir
sobre el eje
X
79
80
1. Una vez montados los tejidos se proceder a su estimulacin de acuerdo con el siguiente cuadro.
Tejido
Sustancia para
estimulacin
Concentracin
Aorta de rata
Norepinefrina
1x106 M
Traquea de cobayo
Acetilcolina
3x105 M
leon de rata
Carbacol
1X104 M
Actividad
15
30
40
50
60
70
80
III. Bibliografa
Estrada S, et al. (1999). Nitric oxide/c GMP mediates the spasmolytic action of 3,4-dihydroxy-
cavernosum and facilitates penile erection in rats. European Journal of Pharmacology. 458:83189.
Snchez-Mendoza M, et al. (2007). Mechanisms of relaxant action of a crude hexane extract