Departamento de Bioqumica y

Biologa Molecular
Biologa Molecular 2016
Profesores Daniela Seelenfreund y Sergio Lobos

Informe Trabajo Prctico

Curso Biologa Molecular 2016

Integrantes
Felipe Len
Amparo Nez
Fecha
22-04-2016

Introduccin
Los mtodos tradicionales de extraccin de DNA comenzaron a desarrollarse en
los aos 50 y consistan de 5 etapas principales: homogenizacin del tejido,
lisis celular, separacin de protenas y lpidos, precipitacin y redisolucin del
DNA. Si bien actualmente estos mtodos se encuentran en desuso, siguen
siendo tiles para aislar material gentico. Digestin de clulas o tejido se
suele realizar con proteinasa K en presencia de EDTA, mientras solubilizacin
de membranas y denaturacion de protenas se realiza con detergentes como el
SDS. Los cidos nucleicos obtenidos luego se extraen con solventes orgnicos y
RNA contaminante de digiere con RNasa. Los mtodos de extraccin manual
requieren de la preparacin de variadas soluciones y debido a esto puede
tomar horas e incluso das obtener una muestra pura de DNA. A partir de los
aos 90 se introdujeron al mercado kits de extraccin de DNA, los que
permitieron reducir en gran manera el tiempo de extraccin y a la vez
permitieron obtener muestras de DNA de alta pureza. Debido a las ventajas
que ofrecen los kits de extraccin estos son cada vez ms utilizados dejando de
lado los mtodos clsicos de extraccin. [1][2]
Durante la dcada del 70 y 80 ocurri un rpido avance en el conocimiento de
la expresin gnica, uno de los principales factores que contribuyeron a esto
fue la tecnologa de DNA recombinante. La base de esta tecnologa es la
habilidad para poder manipular el DNA in vitro mediante enzimas cuya
actividad es conocida y puede ser controlada para realizar cambios especficos
en las molculas de DNA. Una de estas enzimas son las endonucleasas de
restriccin cuyo uso ha facilitado enormemente el aislamiento y manipulacin
de los genes individualmente. Estas enzimas son capaces de unirse al DNA y
cortar ambas hebras en una secuencia especifica (o cerca de esta), por lo
tanto, si tenemos una secuencia conocida de DNA podemos predecir donde la
enzima realizar el corte. Existen 3 tipos de enzimas de restriccin, tipo I, II y
III. Los tipos I y III no ejercen un control estricto sobre donde se producir el
corte una vez unido a la secuencia de DNA, por lo tanto, resultan menos tiles
puesto que no se sabe con certeza que fragmentos de DNA se obtienen. Las
enzimas de restriccin del tipo II no tienen esta desventaja ya que siempre
cortan en el mismo lugar, debido a esto son las que ofrecen los fragmentos de
DNA ms reproducibles y por lo tanto son las ms utilizadas.[3]
El objetivo de este trabajo prctico fue conocer las tcnicas de extraccin
manual de DNA vegetal y animal, que si bien ya no son muy utilizadas nos
permiten entender la lgica del proceso de aislamiento de DNA, visualizar los
resultados de estas extracciones mediante electroforesis en gel de agarosa y
finalmente, familiarizarse con el uso de enzimas de restriccin, apreciar el
efecto que estas tienen sobre el material gentico y entender su mecanismo de
accin.
Se realiz una extraccin manual de DNA animal y vegetal, las cuales provean
de una muestra de saliva y coliflor, respectivamente. Posteriormente se pas a

evaluar su pureza mediante mtodos espectrofotomtricos y a observar sus

patrones de migracin en un gel de agarosa.
Ambas muestras, junto con un plasmidio fueron digeridas por la enzima de
restriccin de tipo II BamHI y se observaron sus patrones de migracin en el gel
de agarosa con el fin de observar el efecto que tena la enzima de la restriccin
sobre las muestras. El plasmidio digerido fue pBAD/ArcA.

Materiales y mtodos
En el presente trabajo fueron utilizados tres muestras de DNA: una
correspondiente a la extraccin de DNA de saliva humana, otra a DNA extrado
desde una muestra vegetal y un plasmidio conocido.
Extraccin DNA de saliva
Se recolectaron aproximadamente 1,5 mL de saliva en tubos eppendorf
estriles y se centrifugaron a 3000 rpm por 10 minutos a temperatura
ambiente con el fin de precipitar las clulas. El pellet se recuper, y el
sobrenadante fue descartado, y se digiri con 700 uL de tampn de lisis y 35
uL de solucin de Proteinasa K (20mg/mL) y se incub por 20 minutos a 60 C
en bao termorregulado. El Tampn de Lisis corresponde a EDTA 10 mM, Tris 10
mM pH 8.0, NaCl 0,1 M y SDS 2,0 %. El EDTA forma un complejo con los
cationes bivalentes e impide el funcionamiento de las DNasas que requieren
Mg +2 como cofactor. El Tris es utilizado como buffer para mantener constante
el pH a 8.0, manteniendo ionizado los grupos fosfatos y estable la hebra de
DNA. NaCl ayuda a mantener constante la fuerza inica de la solucin
impidiendo que se produzca repulsin entre las hebras cargadas, lo que se
traducira en la desnaturacin del DNA. SDS (dodecilsulfato sdico) es un
detergente suave del tipo aninico que permite solubilizar membranas,
desnaturar protenas e inhibir la interaccin entre DNA y protenas histonas. La
proteinasa K es una proteasa obtenida del hongo Tritirachium album Limber y
es ideal para digerir protenas en muestras biolgicas cuando se quiere
purificar cidos nucleicos de alto peso molecular como el humano o el vegetal.
(En adelante este protocolo es el mismo que se utiliza para la muestra vegetal)
Se agregaron 600 uL de cloroformo-alcohol isomlico (24:1), se mezcl por
inversin para formar dos fases (una superior acuosa y una inferior orgnica) y
se centrifug a 6000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente para lograr
resolver mejor ambas fases. Se transfirieron 450 uL del sobrenadante a otro
tubo de centrfuga de 1,5 mL y se agreg la mitad del volumen (225 uL) de
solucin de NaCl 5M seguido de 2 volmenes (900 uL) de Etanol absoluto a -20
C. Se almacenaron las muestras toda la noche a -20 C. El DNA al estar
cargado negativamente por sus grupos fosfatos y al haber adquirido adems
una capa de cargas positivas provenientes del sodio en solucin presenta una

alta insolubilidad en etanol y, por lo tanto, precipit instantneamente cuando

se agreg el etanol.
Al da siguiente se centrifugaron los 2 tubos a 3000 rpm en una centrifuga
Mikro 22R por 3 minutos y luego 3 minutos ms a 6000 rpm, todo a
temperatura ambiente para precipitar el DNA. Se descart el sobrenadante y se
lavaron los precipitados con 500 uL de etanol 76% a 4C para retirar impurezas
y se volvi a centrifugar a 6000 rpm por 5 minutos a temperatura ambiente. Se
sec el precipitado de cada muestra en SeedVac (al vaco) a 43C. Se
resuspendi el pellet en 100 uL de agua destilada que contena 1 ul de RNasa
a una concentracin de 10mg/mL y se incub por 30 minutos a 37C en bao
termorregulado. La RNasa sirve para degradar el RNA interferente que podra
estar acompaando al DNA.
Extraccin de DNA vegetal.
Se cort una pequea porcin coliflor (cabeza de la flor) y se moli en un
mortero. Se agreg 800 uL de tampn de extraccin y la muestra fue
traspasada a un tubo eppendorf de 1,5 mL. Se incubo a 60C durante 20
minutos y se enfri a temperatura ambiente. El tampn de extraccin est
compuesto de EDTA 20 mM, Tris-HCl 100 mM pH 8,0 y NaCl 1,4M, aunque
estos compuestos tambin se encuentran en el buffer de lisis, en este buffer
las concentraciones son mayores debido a que las muestras vegetales poseen
ms clulas y adems estas clulas poseen pared celular lo que les confiere
ms resistencia a la lisis. El tampn de extraccin posee adems CTAB 2,0% y
b-mercaptoetanol. El CTAB (Bromuro de cetiltrimetilamonio) es un detergente
catinico que solubiliza polisacridos, como por ejemplo los de la pared celular
y el b-mercaptoetanol es un agente reductor que desnatura protenas
rompiendo sus puentes disulfuros [7].
De aqu en adelante el protocolo es el mismo que en la extraccin de DNA
animal.
Determinacin de la concentracin y pureza del DNA.
La concentracin de DNA presente en cada muestra fue determinada mediante
espectrofotometra, midiendo la absorbancia a 260nm (peak de las bases
nitrogenadas), la absorbancia a 280nm (peak de los residuos aromticos) y a
230nm (peak de absorbancia de azucares). Estas determinaciones fueron
realizadas por el equipo nanodrop. La relacin 260nm/280nm dar cuenta de la
pureza de la solucin de DNA.
Electroforesis de DNA en geles de agarosa.
Se realiz electroforesis en geles de 0,8% de agarosa a 85 V hasta ver una
adecuada separacin de las bandas. Se carg, por cada muestra 1 uL de gel
red ms 1uL de tampn de carga ms 5 uL de DNA. Se realizaron 2

electroforesis, una para DNA genmico y otra para DNA digerido. El gel red es
un agente fluoroforo que se intercala en el DNA y emite una seal fluorescente
que se puede medir, cuando est unido al DNA, el gelred en la actualidad es
mucho ms usado que el bromuro de etidio, dado que es menos mutagnico.
Digestin de las muestras.
Se digiri el DNA genmico de una de las muestras de DNA de saliva humana y
DNA vegetal de coliflor. La enzima elegida para digerir fue BamHI, una enzima
endonucleasa que reconoce el palndromo 5G GATCC3 / 3CCTAG G5 y que es
expresada por bacterias de especie Bacillus amyloliquefaciens [6]. La digestin
se llev a cabo agregando en un tubo Eppendorf, 11uL de H2Odd, 2 uL de
tampn 10x, 5 uL de la muestra de DNA genmico, y 2 uL de enzima BamHI.
Digestin de plasmidio
El plasmidio elegido fue pBAD/arcA, que es un plasmidio pBAD- TOPO con un
inserto del gen arcA. Este plasmidio tiene un tamao de alrededor de 4,6kpb y
presenta multiples sitios para la digestin con diversas enzimas de restriccin
[9]. Fue digerido con la enzima BamHI, que reconoce el palndromo
5G/GATCC3 - 3CCTAG/G5 [6] y que para este plasmidio va a generar 2 sitios
de corte (cortes predecidos segn secuencia del plasmidio) [9].
Controles
Se realizaron controles negativos para cada tipo de DNA utilizado, como son
controles no llevaban muestra DNA y fueron utilizados para descartar
contaminacin de las muestras con DNA.

Resultados y Discusin
Determinacin de la concentracin y pureza del DNA
Se midi la concentracin de DNA presentes en las muestras vegetal y
humana, adems se realizaron mediciones de absorbancia a 260nm, 280nm y
230 nm. Tabla 1 muestra absorbancia obtenida a las distintas longitudes de
onda y concentracin de cidos nucleicos obtenidos para cada muestra.
Tabla 1. Concentracin de DNA y valores de absorbancia a 260nm,280nm y
230nm de muestras vegetal y animal.
Muestra
Control DNA
humano
DNA saliva
Control DNA

Concentracin
acidos nucleicos
[ng/l]

A260

A280

A260/A2
80

A260/A2
30

2,3

0,045

0,075

0,61

0,13

47,6
1,3

0,952
0,027

1,016
0,071

0,94
0,38

0,21
0,04

vegetal
DNA coliflor

75,8

1,516

0,855

1,77

0,98

La relacin Abs 260/280 de muestra humana indica que esta no se encontraba

pura ya este valor se debe encontrar entre 1,7 y 1,9. Valor menor a 1,7 indica
que probablemente la muestra se encuentre contaminada con protenas o
fenol. En cuanto a la muestra vegetal la relacin de Abs 260/280 es 1,77 y esto
indica que la mayora de la muestra es DNA, pues este valor se encuentra
dentro del rango 1,7 y 1,9.
Abs 260/230 debera encontrarse entre 2 y 2.2 Valor obtenido en muestra
humana y vegetal fueron menor a este y podra estar indicando contaminacin
con EDTA, carbohidratos o fenol.
Muestra humana y vegetal fueron sometidas a electroforesis (Figura 1) muestra
humana corresponde a carril 8 y muestra vegetal corresponde a carril 9. Carril
8 muestra una banda levemente ms marcada a alto peso molecular que
correspondera al DNA. Se aprecia un chorreo a lo largo de la banda y adems
una banda gruesa y tenue a bajo peso molecular la cual corresponde a
contaminacin. Contaminacin probablemente corresponde a protenas y fenol
ya que Abs 260/280 tiene un valor 0,94.

*: muestras pertenecientes a nuestro grupo.

Figura 1. Electroforesis de DNA genomico en gel de Agarosa. Carril 1 corresponde a

estandar de peso molecular. Carriles 10 y 11 corresponden a controles negativos de
DNA humano y vegetal, respectivamente. Carril 8 corresponde a DNA humano y carril 9
corresponde a DNA vegetal.

Chorreo observado se puede atribuir a degradacin del DNA. El DNA es estable

qumicamente, sin embargo, es fsicamente frgil. Debido a que su largo es
mucho mayor que su dimetro se requiere de pequeas cantidades de fuerza
para romper la doble hebra, en este caso el flujo hidrodinmico producido por
pipetear o agitar la muestra result en una fragmentacin del DNA [2].
Se observa en la figura 1 que nuestra muestra de DNA genmico vegetal que
est en el carril nmero 9 presenta una banda superior intensa que da cuenta
de la presencia de DNA. Adems, se puede ver que la banda tiene un leve
chorreo, esto puede ser debido a la manipulacin de la muestra, lo que
ocasiona que el DNA se fragmente al azar por un proceso mecnico.
Posteriormente ambas muestras se sometieron a digestin con enzima de
restriccin BamHI. El plsmidio pBAD/arcA fue tambin sometido a ensayo de
restriccin y las 3 muestras fueron luego visualizadas en un gel. (figura 2).

*: corresponden a muestras de nuestro grupo

Figura 2. Electroforesis de DNA digerido en gel de agarosa..Carriles 1 y 2 son

estandares de peso molecular. Carril 13 es DNA vegetal sin digerir, 14 DNA vegetal
digerido, 15 DNA humano sin digerir, 16 DNA humano digerido, 17 plasmidio digerido y

carriles 23 y 24 corresponden a controles negaitvos de DNA vegetal y humano

respectivamente.

En la figura 2 la muestra de DNA vegetal genmico y DNA vegetal digerido fue

cargada en el carril 13 y 14 respectivamente. Era de esperarse, que la banda
presente en el DNA sin digerir fuera ms intensa que la del DNA con digestin y
esto se observa claramente, esto se explica por la sola presencia de
fragmentos de DNA de alto nmero de pares de bases. En el carril que est a
continuacin, donde est la muestra de DNA vegetal digerido, se observa una
banda a la misma altura que en el carril anterior, pero esta vez mucho menos
intensa y con ms presencia de chorreo, esto debido que la enzima BamHI
corta el DNA de coliflor en una secuencia especfica y a que la longitud del DNA
es bastante grande, alrededor de 662Mpb [4] se producirn muchos
fragmentos de DNA de distinto tamao pues la enzima probablemente
reconozca varios sitios de corte, sin embargo parece ser que la enzima no fue
suficiente para cortar toda la cantidad el DNA pues se observa, aunque con
menor intensidad, una banda a la misma altura que el DNA genmico sin
digerir. Esto ltimo podra ser solucionado calculando la concentracin de
enzima necesaria para digerir cierta concentracin de DNA genmico conocida.
En relacin al DNA humano de la figura 2, el carril 15 corresponde al DNA
humano sin ser digerido y se pueden observar dos bandas tenues una a alto y
otra a bajo peso molecular. El carril 16 corresponde a DNA humano digerido, en
este carril se puede observar una banda a alto peso molecular similar a la del
carril 15 pero en este caso esta se encuentra ms intensa. La aparicin de esta
banda ms intensa en el carril 16 no es el resultado esperado ya que la
muestra que est siendo digerida no debera presentar una mayor cantidad de
DNA de alto peso molecular que la muestra que no est siendo digerida (carril
15), por lo tanto, en este caso se debera volver a realizar la digestin de la
muestra y el gel respectivo.
Bandas sin digerir que presenten chorreo se atribuye principalmente a
degradacin del DNA (carril 13 y 15), mientras que chorreo en muestras de
DNA que si fue digerido (carril 14 y 16) se debe a la gran cantidad de
fragmentos de ADN que gener la digestin. Este patrn de migracin es de
esperar cuando se digiere DNA genmico ya que este es de gran tamao y
enzima de restriccin es capaz cortar en muchos sitios y por lo tanto generar
fragmentos de DNA de variados tamaos que migran a distintas distancias.
El plasmidio pBAD/arcA digerido con la enzima BamHI fue cargado en el carril
nmero 17 en la figura 2. A simple vista puede observarse la presencia de 3
bandas, dos bandas intensas en el nivel superior y una banda menos intensa
en el nivel inferior. Los cortes predichos por la enzima para un plasmidio
circular de pBAB-TOPO originaran dos fragmentos de DNA de 118 y 4011 pb,
entonces una de las bandas superiores correspondera a la de 4011 pb y la
banda menos intensa ubicada en la parte inferior del gel correspondera al
fragmento de 118 pb. Parece raro observar la presencia de una tercera banda
en el nivel superior, creemos que esta puede deberse a 2 motivos, el primero

que parte del plasmidio no se digiri con la enzima BamHI y quedo de forma
circular, en el caso de que se tratase de DNA circular relajado correspondera a
la primera banda superior y en el caso de que fuese DNA circular
sobreenrrollado, correspondera a la segunda. El segundo motivo que podra
explicar la presencia de estas dos bandas es que haya habido presencia de
plasmidio lineal, dado que este al ser digerido va a otorgar fragmentos de
tamaos ligeramente distintos que el plasmidio circular, los fragmentos
predichos para este plasmidio linearizado son 1-239 (239 pb), 240-355 (116
pb), 356-4127 (3772 pb), por lo que la segunda banda del nivel superior
correspondera al fragmento de 3772 pb [9]. Para poder descartar cualquiera
de estos 2 motivos hubiera sido necesario realizar un control que corresponda
al plasmidio sin digerir y que este fuera cargado en el carril de al lado donde se
carg el plasmidio digerido.
Plasmidio sin digerir se puede observar en la figura 3. Se logran distinguir tres
bandas de las cuales la que tiene un menor peso molecular corresponde al
plasmidio sobre-enrrollado, la de en medio al plasmidio lineal y la de mayor
peso molecular al plasmidio relajado. Las diferencias de migracin que puede
tener un mismo plasmidio se debe a que las distintas formas que este adquiere
poseen distintos radios hidrodinmicos y por lo tanto migran distinto en el gel.
Plasmidio que ms migra es el que tiene un menor radio hidrodinmico, osea el
plasmidio sobreenrrollado.

Figura 3. Gel plasmidio sin digerir. Plasmidio utilizado en el prctico fue

pBAD/arcA
En este prctico la extraccin de DNA se hizo de manera manual, otro mtodo
utilizado para extraer DNA es la utilizacin de kits de extraccin comerciales.
Estos utilizan matrices inorgnicas compactas cargadas positivamente a las
cuales el DNA se une de manera selectiva y reversible mientras que las dems
biomolculas son removidas, posteriormente el DNA se libera de la matriz.
Estos kits tambin incluyen soluciones de lisis, unin y lavado, sin embargo,
estas no poseen fenol, cloroformo ni etanol, as disminuyendo el nmero de
posibles contaminantes. Kits de extraccin permiten disminuir el tiempo de
extraccin y garantizan una extraccin de alto pureza, ya que la recuperacin
del DNA y la eliminacin de contaminantes son muy eficientes. [2]
Cuantificacin de DNA a travs de Nanodrop realizada en este prctico es ms
rpida y necesita poca cantidad de muestra en comparacin con los mtodos
espectrofotomtricos comunes, sin embargo, existen otras tcnicas para
cuantificar DNA, tales como la fluorometria que ofrece mayor sensibilidad que
los mtodos espectrofotomtricos y permiten detectar hasta nanogramos de
DNA [3]. Esta tcnica tambin es ms selectiva y permite distinguir entre DNA
y RNA ya que suelen usarse sondas fluorescentes que solo emiten
fluorescencia cuando se encuentran unidos a su molcula blanco especifica. [8]

Comentarios
La realizacin de este prctico no fue del todo fcil, pero gracias a la
disposicin de todos los ayudantes y de la profesora quienes resolvieron todas
nuestras dudas, todo pudo ser finalizado con xito. Logramos aprender
tcnicas que son de uso cotidiano en los laboratorios de biologa molecular y
esto nos ayudar a enfrentar de mejor manera problemas bioqumicos, cuando
por ejemplo debamos planificar experimentos para la realizacin de una unidad
de investigacin o del mismo trabajo de tesis. Adems, ahora luego de
realizado el trabajo prctico nos parece mucho ms fcil entender los
conceptos tericos que estn detrs de cada experimento.

Referencias.
(1) Velzquez, L., Martnez, M., & Romero, A. (2014) Extraccin y purificacin
de ADN. Herramientas moleculares aplicadas en ecologa: aspectos
tericos y prcticos, 1.
(2) Maniatis, T., Fritsch, EF., & Sambrook, J. (1982). Molecular cloning: a
laboratory manual 3 ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor
Laboratory.
(3) Brown, TA. (2006). Genomes. Garland science.
(4) Arumuganathan, K. and Earle, ED. (1991). Nuclear DNA Content of Some
Important Plant Species. Plant Molecular Biology Reporter. 9(3): 211-215
(5) Guzman LM, Belin D, Carson MJ, Beckwith J. (1995). Tight regulation,
modulation, and high-level expression by vectors containing the
arabinose PBAD promoter. J Bacteriol. 177(14): 41214130
(6) Newman M, Strzelecka T, Dorner LF, Schildkraut I, Aggarwal AK. (1995).
Structure of Bam HI endonuclease bound to DNA: partial folding and
unfolding on DNA binding. Science. 269(5224): 656-63.
(7) Salavarrieta, P. (2002). Theory and Practice for the Extraction and
Purification of the Oil Palm DNA. Palmas. 23(3): 13-15
(8) Thermo Fisher Scientific. (2014). Comparison of fluorescence-based
quantitation with UV absorbance measurements Qubit fluorometric
quantitation vs. spectrophotometer measurements. Recuperado de
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/lifesciences/Laboratory%20Instruments/Files/1014/Qubit-fluorometricquantitation-vs-spectrophotometer-measurements.pdf
(9) Addgene. (s.f.). Analyze Sequence: pBAD-TOPO. Recuperado de
https://www.addgene.org/browse/sequence_vdb/1824/