DETECCIN

ELECTROQUMICA
ETIQUETADO Y LIBRE DE
AMPLIFICACIN
DE
BACTERIAS RNA RIBOSOMAL
Los enfoques actuales para el
diagnstico molecular dependen en gran
medida de la amplificacin por PCR y
deteccin ptica, los mtodos que tienen
restricciones cuando se aplica a punto
de aplicaciones de cuidado (POC).
Se describe el desarrollo de un mtodo
y amplificacin libre de deteccin de
patgenos que supera el cuello de
botella de la preparacin de la muestra
compleja y tiene el potencial de ser
implementado como una prueba rpida
y eficaz, costes que facilite punto de uso
de la atencin. El ARN ribosomal es,
naturalmente, amplificado en clulas
bacterianas, que hace que sea un
objetivo prometedor para la deteccin
sensible
sin
la
necesidad
de amplificacin in vitro.
El uso de mtodos de microarrays
fluorescentes con objetivos de ARNr de
una gama de patgenos y una sonda
ptima fue seleccionado de un grupo de
candidatos. La especificidad de las
sondas fue investigadas en microarrays
de ADN utilizando la etiqueta
fluorescente objetivo de 16S rRNA. La
sonda de rendimiento ms alto de
especificidad se evalu en trminos de
sensibilidad y un lmite de deteccin de
20 pM se logr el microarrays de vidrio
fluorescentes. Esta sonda se transfiri a
un formato de punto final EIS y
especificidad que correlacionado con
datos de microarrays se demostr
excelente sensibilidad, fue facilitada por
el uso de sondas de ANP y grandes 16S
rRNA diana. Las investigaciones dieron
como resultado un formato de ensayo
EIS cintica alternativa que demostr
que el rRNA puede ser detectado en una
especie de manera especfica dentro de
10 a 40 min a temperatura ambiente sin
pasos de lavado.

Introduccin
Las enfermedades infecciosas tienen un
impacto importante en la salud pblica
causando aproximadamente 15 millones
de muertes cada ao, lo que representa
26% de la mortalidad anual en todo el
mundo. El diagnstico molecular obra
una parte integral para reducir el
impacto
de
las
enfermedades
infecciosas en salud pblica. En
particular, el punto de diagnstico para
el cuidado de infecciosa la enfermedad
tiene el potencial para mejorar los
resultados clnicos de atencin mediante
la optimizacin, las decisiones de
prescripcin, y la mejora de la eficiencia
de
la
atencin.
Tcnicas
de
amplificacin de cido nucleico diana
tales como la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) y amplificacin
isotrmica, mtodos de cationes como
por ejemplo, amplificacin isotrmica
mediada
por
bucle
(LAMP),
amplificacin dependiente de helicasa
(HDA), y crculo rodante amplificacin
(RCA) han adquirido un papel
sustancial en aplicaciones clnicas. A
pesar de PCR y PCR en tiempo real a
alcanzar el lmite de excelente
detecciones (LOD), los requisitos
instrumentales
y
operativos
emparejados con el (TTR) de tiempo
hasta el resultado de estas tcnicas son a
menudo para el punto de atencin
(PDA) aplicaciones prohibidas.
Biosensores electroqumicos tienen
atributos favorables para aplicaciones,
tales como la capacidad de ser de bajo
costo, porttil, y tienen el potencial para
la deteccin de blancos sin etiqueta.
El grupo de investigacin de Shana O.
Kelley utiliza amplificacin de la seal
basado en reabsorcin hacia el objetivo
hibridando
cido
nucleicos
y
amplificacin en la superficie de nano
estructurado micro electrodos para la
deteccin directa de Escherichia coli

mRNA por voltametra de pulso

diferencial y se combina este con la lisis
de
las
clulas
bacterianas
electroqumico. Varios grupos aplican
amplificacin de la seal enzimtica
utilizando peroxidasa de rbano picante
conjugada con fosfatasa alcalina unida a
los 16SrRNA hibridado mediante
biotinilado sondas de deteccin o para
la deteccin amperomtrica de ARN
bacteriano. Todos estos amplificacin
de la seal enzimtica requieren
mltiples etapas de incubacin y lavado
lo que los hace menos susceptibles de
aplicacin en un totalmente sistema
integrado de muestra y respuesta.
La espectroscopia de impedancia
electroqumica es una poderosa
herramienta para generar pruebas de
punto de atencin ya que es una
deteccin sin etiqueta, tecnologa que
permite la deteccin directa de los
objetivos vinculantes para inmovilizar
sondas sin el requisito de cualquier tipo
de objetivo etiquetado o an ms la
unin de sondas de deteccin. Esto hace
que un EIS mtodo de deteccin ideal
para ser integrado en verdaderamente
porttil de la muestra antes de la
respuesta. EIS ha demostrado la
deteccin multiparamtrica la capacidad
que permite la deteccin sin marcado de
cidos nucleicos, clulas enteras,
molculas pequeas y protenas en la
misma plataforma que demostrado
previamente por nosotros mismos. Este
gran potencial de biosensores basados
en estudio de impacto ambiental se
refleja en un creciente nmero de
publicaciones en los ltimos aos. La
mayora de estas publicaciones sin
embargo carecen de evidencia de
potencial aplicacin en el mundo real en
ajustes
clnicos,
ya
que
las
investigaciones se ejecutan con pocos
objetivos sintticos en lugar de muestras
clnicas.

Seccin experimental
Cultivo bacteriano y el aislamiento de
ARN
Se sub cultivaron en agar sangre y se
incubaron durante la noche a
37 C en una incubadora de CO2. Se
recogieron las clulas bacterianas
durante el crecimiento semi logartmico,
cuando los niveles de ARN son en su
ms alto debido a la alta actividad
metablica, las clulas se inocularon en
una solucin salina y la densidad ptica
se mide utilizando un Densicheck.
Esto da a los valores en unidades
McFarland,
proporcional
a
la
concentracin celular de las bacterias en
la suspensin. E. coli DH10 cultivos
lquidos se prepararon mediante la
inoculacin de 2,5 ml LuriaBertani(LB) (10 g / L de Bacto-triptona,
5 g / L de extracto de levadura, 10 g /
LNaCl) con una colonia de E. coli
DH10 de una placa de agar LB y se
incubaron durante 16 horas a 37 C en
una
incubadora
con
agitacin.
Protocolos 4 y 7 de las bacterias eran
seguido con algunas modificaciones
menores. El ARN se estabiliza,
mediante la adicin de reactivo de
bacterias RNAprotect (Qiagen).
Esto evita la degradacin de transcritos
de ARN y la induccin de genes. Se
aadi la suspensin bacteriana (1 ml) a
2 ml de la estabilizacin de reactivos.
Despus de la centrifugacin y la
granulacin, las bacterias fueron
interrumpidas por lisis enzimtica y la
digestin de proteinasa K. Lysostaphin
se utiliz para las bacterias Grampositivas tales como S. aureus, mientras
que la lisozima se utiliz para Gramnegativos del fabricante tiempo de
incubacin recomendado con estas

enzimas lticas ha sido aumentado de 10

a 30 min, seguido de 10 minutos de
incubacin con Proteinasa K. La
temperatura de incubacin tambin se
ha incrementado a 37 C. ADN restante
se ha eliminado por digestin DNasa en
columna con DNasa 1. Despus de la
purificacin, el ARN se eluy de
columnas de centrifugacin en dos
alcuotas separadas de 30 mL. eluido
total
de
ARN
se
cuantific
espectrofotomtricamente.
Etiquetado de fluorescencia
ARN fue marcado con fluorescencia
utilizando Cy3 Label-IT cido nucleico.
Segn las instrucciones del fabricante
este kit se une covalentemente residuos
de Cy3 en un sitio distinto del utilizado
en el emparejamiento de bases y
adecuado para experimentos de
hibridacin.
Las imgenes de fluorescencia se
generaron con un Tecan LS Reloaded
escner de fluorescencia con la
excitacin a 532 nm y emisin a 575
nm. La cuantificacin de intensidad de
la seal de fluorescencia se realiz con
el Quantarray software utilizando el
histograma.
Un
mtodo
de
cuantificacin para el anlisis adicional,
la seal media de menos intensidad de
fondo local, se procesaron con Excel y
la media y estndar de desviacin de
todas las repeticiones se calcularon.
Limpieza
de
funcionalizacin

electrodos

Todos los electrodos se incubaron con

una solucin de1.5M durante 16 h en
una habitacin a temperatura de
30c. Los electrodos se lavaron en 50%

Mediciones de EIS
Mediciones de EIS del punto final se
realizaron utilizando un sistema de
electrodos con un electrodo de
referencia de Ag AgCl (3 M KCl) y un
electrodo contador de alambre de
platino conectado a un potenciostato
que ejecuta el software FRA.
Mediciones de EIS se realizaron a un
potencial DC de 0,19 V con una
amplitud de 10 mV rms usando una
gama de frecuencias entre 100.000 Hz y
0,1 Hz (15 frecuencias) en 0,1 mM. La
hibridacin se llev a cabo utilizando
50L de solucin de SrRNA durante 2
horas a 55C. Despus los electrodos de
hibridacin fueron lavados con 2 x SSC
y EIS tampn de medicin para 10 min
en cada uno. Los datos fueron
recolectados en forma de diagramas de
Nyquist y montado en el circuito
equivalente Randles bien establecida.
Los valores tenan errores normalmente
de 5.10%. Las Mediciones de EIS
cinticos se realizaron en la pantalla e
imprimen sensores conectados a un
potenciostato abierto con una amplitud
de 10 mV rms en 15 frecuencias en el
rango 100,000-0.1 Hz. Las soluciones
de la muestra de ARN ribosmico se
calentaron a 95 C durante 5 min, y se
transfiri a hielo durante 2 min antes de
la medicin.
Resultados y discusin
La fluorescencia
evaluacin
de
microarrays

basada en la
detector
de

En este trabajo se presenta el desarrollo

de un procedimiento basado en la EIS
para la deteccin de etiquetado y libre
de dirigir la amplificacin de rRNA para
especies bacterianas, la identificacin
basada en las especies inmovilizadas
sondas especficas mediante el empleo
de mtodos de microarrays fluorescente,
una sonda ptima se identific que
permiti sensible y especfica deteccin
de E. coli rRNA cuando se transfiere a
la plataforma de EIS, como representa
esquemticamente en la Fig. 1 .

encubo con INTAC (C) en condiciones

controladas y con lavados de
astringencia (D) se llevan a cabo ,
seguido de la medicin EIS en una
celda electroqumica sistema de tres
electrodos convencional (E) . La
medicin de la EIS funcionalizado
fondo electrodo ( H) y la hibridacin
especfica ( I) se detecta como un
cambio en la resistencia de transferencia
de carga (ECA ) . Nuestra configuracin
EIS cintica ( F, G ) permite la
deteccin en tiempo real de rRNA
hibridacin con rapidez , utilizando
electrodos serigrafiados bajo costo sin
un requisito. rRNA especfico de
hibridacin ( G) provoca la repulsin de
las especies redox ferricianuro y el
cambio en la resistencia de transferencia
de carga (ECA) es proporcional a la
concentracin objetivo hibridado (I).
Mediciones cinticas espectroscopia
de impedancia electroqumica

Figura 1
Un breve esquema del proceso
experimental descrito en el documento,
Siguiendo en la seleccin de la sonda
silico, marcado con fluorescencia rRNA
que se aplica a un microarray poblado
con E. coli rRNA especfico (A), como
una pantalla de seleccin de la sonda.
Para el desarrollo del ensayo EIA, las
sondas resultaron ser de la ms alta
sensibilidad y especificidad para la
diana E. coli rRNA se aplican en
funcionalizacin del electrodo de oro
(B). El biosensor electrodo de oro se

Adems de las mediciones de punto

final tambin cintico se realiz
mediciones EIS donde se controla el
cambio verdadero de tiempo durante el
proceso de hibridacin. En este caso la
solucin estaba presente en el tampn
de medicin se repitieron de forma
continua durante la hibridacin sin
cambio de la solucin y adicin de
etapas de lavado despus de la
hibridacin
Este es un importante paso hacia una
prueba de punto de atencin en el lugar
para la bacteria y la identificacin de
especies. Estas pruebas se realizaron
con electrodos de oro serigrafiados que
contenan dos electrodos trabajando
junto con un contador de oro comn y
plata de referencia de cloruro en un solo
chip. En cada chip uno de los electrodos
de trabajo fue funcionalizado con un
mixto monocapa de la E. especfico
junto con mercaptohexanol, mientras
que el segundo electrodo de trabajo

estaba funcionalizado solamente con

mercaptohexanol. El mercaptohexanol
electrodo funcionalizado sirvi como un
control negativo que muestra el grado
de unin no especfico de molculas
diana al electrodo superficie.
Un aumento Rct fraccionada de mayor
que 100% se detect en P92 electrodo
funcionalizado
despus
de
la
hibridacin con E. coli rRNA ya dentro
de los primeros 10 min de
incubacin este aumento fue mucho
menor en los electrodos que se hibridan
con
las
no
complementaria P. aeruginosa rRNA,
donde un pequeo aumento de la Rct se
observ para las mediciones inicial
seguida por una casi seal sin
cambios. Esto demuestra el alto grado
de especificidad, que se obtuvo en estas
condiciones no rigurosas, con una
hibridacin a temperatura ambiente muy
por debajo de la temperatura de fusin
de la sonda de APN aplicada, y la
ausencia de cualquier paso de lavado.
Esto hace que la etiqueta libre de
deteccin directa rRNA un candidato
perfecto que no requiere el uso de un
marcador
de
enzima
para
la
amplificacin de la seal tal como se
utiliza
en
muchos
patgeno
amperomtrica
que
reduce
significativamente la complejidad de la

prueba y simplifica la integracin del

mtodo de deteccin en un microfluido.
Conclusin
Para la amplificacin de la muestra,
etiquetado o fragmentacin. La cintica
de ensayo EIA tiene la capacidad de
miniaturizacin y micro integracin de
cartucho fludico.
Secuencias
de
la
sonda
de
oligonucletidos para E. coli deteccin
de ARNr fueron identificados en la
literatura publicada e interrogado en
silico.
Las sondas fueron seleccionadas in
vitro mediante tcnicas micro basada en
fluorescencia de matrices. Sobre la base
de la especificidad de microarrays y
datos de sensibilidad, una la sonda fue
seleccionada para su aplicacin en
diagnstico molecular EIS el desarrollo
del ensayo. En ausencia de mejora de
especificidad
asociado
con
amplificacin de la diana, el enfoque
fue invertido en la despolarizacin
mostrando la capacidad para la
deteccin especfica, teniendo el
elevado nmero de copias rRNA diana.