CRIOPROTECCION

Mtodos de eleccin o de conservacin a largo plazo. Son los mejores porque en ellos se paraliza el
crecimiento de las clulas microbianas, pero stas no han muerto. As se garantiza al mximo la
estabilidad gentica, por evitarse la aparicin de generaciones sucesivas. Aun as no se puede
descartar algn cambio originado por el mtodo preparatorio en s mismo. Los mtodos de
conservacin pertenecientes a este grupo son dos: Congelacin y liofilizacin.
Se congelan las clulas en suspensin en un lquido con un agente crioprotector y se guardan a
temperaturas inferiores a cero grados centgrados, con lo que el agua se congela. De esta forma, al
no disponer las clulas de agua en forma lquida, no hay crecimiento. Cuando se quiere trabajar con
las clulas as conservadas, se recuperan subiendo la temperatura. Este es el mejor mtodo de
conservacin desde todos los puntos de vista, pero tiene el inconveniente de requerir aparatos
especiales, y adems existe el peligro de que algn fallo del sistema produzca una subida no
deseada de la temperatura durante el almacenamiento. Tambin resulta ser el mtodo ms molesto
para realizar el envo de las cepas. Los cuatro factores que influyen en la viabilidad y estabilidad de
las clulas conservadas por este mtodo son los siguientes:

Edad de las clulas

Velocidad en la congelacin y descongelacin.
Temperatura de almacenamiento
Empleo de agentes crioprotectores.

Estas sustancias protegen del dao que se pueda producir en las clulas microbianas en el momento
de la congelacin. Existen muchos compuestos que se pueden utilizar como
crioprotectores, pero el que se utiliza con ms frecuencia es el glicerol, a una concentracin del 15
al 20%. Tambin se pueden utilizar el dimetilsulfxido etc. En su eleccin influye el tipo de
microorganismo que se quiera conservar.

CONTAMINACION:
Cmo se introduce una contaminacin en nuestro cultivo?
Operador
La manipulacin
La atmsfera
Las superficies
Los utensilios
Los medios y soluciones

Tipos de contaminacin
BIOLGICA

Bacterias:
Fcil de detectar a microscopa:
Formas motiles (cocos, bacilos..)
Origina cambios en el pH del medio
Origina turbidez en el medio
Control: penicilina/estreptomicina, gentamicina
No utilizar antibiticos, al menos durante algn tiempo, para su control
Eliminar los cultivos contaminados

Levaduras:
Fciles de detectar a microscopa.
Partculas redondeadas u ovoides formando cadenas
No causan cambios rpidos en el pH del medio
El medio se vuelve turbio
Pueden causar alcalinizacin del medio
Olor tpico a pan
Hongos:
Fcilmente observables a microscopa o incluso a simple vista.
No provocan cambios inmediatos en el pH del medio
Generalmente no son citotxicos
Esporas difciles de detectar
Blanquecinos, amarillentos o negros
Control: AnfotericinaB (Fungizone) o Nistatina

 Virus:
Difciles de detectar por su tamao
Requerimientos muy especficos (hospedero)
Peligro potencial para el operador al manipular cultivos infectados
El riesgo de manifestacin de virus latentes se incrementa con las modificaciones genticas y los
cambios en las condiciones de cultivo.
Para prevenir este tipo de contaminantes se recomienda:
Antes de utilizar la cabina: Apagar la lmpara UV, encender la luz, desinfectar las superficies con
el desinfectante apropiado, desinfectar y colocar el material necesario dentro de la cabina.
Manipular cada lnea celular por separado: No compartir medios de cultivo entre diferentes
lneas, manipular las lneas celulares con mayor capacidad de proliferacin las ltimas, verificar
peridicamente las propiedades del cultivo.

CURVA DE CONGELACION
AS: Se enfra por debajo de su punto de congelacin es inferior a 0 C.
SB: La temperatura aumenta rpidamente hasta alcanzar el punto de congelacin.
BC: El calor se elimina a la misma velocidad que en las fases anteriores.
CD: Uno de los solutos alcanza la sobre saturacin y cristaliza.

DE: La cristalizacin del agua y los solutos contina.

EF: La temperatura de la mezcla de agua y hielo desciende.
CONTEO CELULAR:

Cuantificacin celular es necesario para: la caracterizacin de lneas celulares, establecer

condiciones reproducibles de cultivo, consistencia de cultivos primarios.
Conteo celular: El numero clulas por ml = promedio del numero de clulas de los cuadros de
las esquinas x104. Si el conteo es muy alto se debe diluir la suspensin para evitar errores de
muestreo.