Plsmido

Dibujo esquemtico de un plsmido en una bacteria: en rojo, el ADN del

cromosoma; en azul, los plsmidos.
Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico circular que se
replican y transmiten independientes del ADN cromosmico. Estn presentes
normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en
organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao vara desde 3 a 10 kb. El
nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola
copia hasta algunos cientos por clula. Los vectores plasmdicos permiten
clonar ligandos de DNA exgeno de hasta 4 kb ya que un tamao mayor a ste
dificulta la clonacin en estos vectores. El trmino plsmido fue presentado por
primera vez por el bilogo molecular norteamericanoJoshua Lederberg en
1952.1
Las molculas de ADN plasmdico, adoptan una conformacin tipo doble hlice
al igual que el ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran
fuera de los mismos. Se han encontrado plsmidos en casi todas las bacterias.
A diferencia del ADN cromosomal, los plsmidos no tienen protenas asociadas.
En general, no contienen informacin esencial, sino que confieren ventajas al
hospedador en condiciones de crecimiento determinadas. El ejemplo ms
comn es el de los plsmidos que contienen genes de resistencia a un
determinado antibitico, de manera que el plsmido nicamente supondr una
ventaja en presencia de ese antibitico.
Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de
insertarse en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el
cromosoma y se sitan en su interior, con lo cual, automticamente la
maquinaria celular tambin reproduce el plsmido. Cuando ese plsmido se ha
insertado se les da el nombre de episoma.
Los plsmidos se utilizan como vectores de clonacin en ingeniera
gentica por su capacidad de reproducirse de manera independiente del ADN
cromosomal as como tambin porque es relativamente fcil manipularlos e
insertar nuevas secuencias genticas.

Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o

dos genes que les confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar
clones recombinantes. Hay otros mtodos de seleccin adems de la
resistencia a antibiticos, como los basados en fluorescencia o en protenas
que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos mtodos de
seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologa, debido a la
fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de
antibiticos en los organismos modificados genticamente.
ndice
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1Resistencia a los antibiticos

2Epsomas

3Tipos

4Aplicaciones

5Extraccin del ADN plasmdico

6Conformaciones

7Referencias

8Vase tambin

9Enlaces externos

Resistencia a los antibiticos[editar]

Los plsmidos a menudo contienen genes o paquetes de genes que les
confieren una ventaja selectiva, lo que les da la habilidad de hacer a la
bacteria resistente a los antibiticos.
Cada plsmido contiene al menos una secuencia de ADN que sirve como un
origen de replicacin u ORI (un punto inicial para la replicacin del ADN), lo
cual habilita al ADN para ser duplicado independientemente del ADN
cromosomal. Los plsmidos de la mayora de las bacterias son circulares, pero
tambin se conocen algunos lineales, los cuales reensamblan superficialmente
los cromosomas de la mayora de eucariotas.
Epsomas[editar]
Un epsoma es un plsmido que puede integrarse por s mismo
al ADN cromosomal del organismo husped. Por esta razn, puede mantenerse
en contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada divisin celular

del husped y volverse parte bsica de su mapa gentico. Este trmino no se

usa ms en plsmidos, debido a que ahora est claro que una regin homologa
con el cromosoma elabora un plsmido dentro de un epsoma.
Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Estos
son usados para transferir genes desde un organismo a otro y tpicamente
contienen un marcador gentico confiriendo un fenotipo el cual puede ser
seleccionado a favor o en contra. La mayora tambin contienen un
polivinculador o sitio de clonado mltiple (MCS), el cual es una pequea regin
que contiene los sitios de restriccin ms comnmente usados, permitiendo
una fcil insercin de fragmentos de ADN en ese lugar.
Tipos[editar]
Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra
bacteria. Los plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan
complejos procesos de conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos
a otra bacteria. Los plsmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar una
conjugacin, de all que ellos pueden transferirse nicamente con la asistencia
de los plsmidos conjugativos y lo hacen por accidente. Una clase intermedia
de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un subtipo de genes
requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un plsmido
conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una clula simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero
normalmente plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que
solo uno de ellos sobrevive en la lnea celular, debido a la regulacin de las
funciones vitales de los plsmidos. Por lo tanto, los plsmidos pueden ser
diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.
Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases principales:

Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de

conjugarse.

Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden

constituir resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente
conocidos como Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de
los plsmidos.

Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la

produccin de) colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.

Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias

inusuales como tolueno o cido saliclico.

Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.

Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales.

Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria,
debido a la divisin celular pueden perderse en una de las bacterias
segregadas.
Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte
Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en
conjunto un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta. Las clulas hija
que retienen una copia del plsmido sobreviven, mientras que una clula hija
que falla al integrar el plsmido muere o sufre una reducida tasa de
crecimiento debido al veneno que obtuvo de la clula padre. Este es un
ejemplo de plsmidos como el ADN replicante.
Aplicaciones[editar]
Los plsmidos sirven como una importante herramienta en laboratorios de
gentica e ingeniera bioqumica, donde son comnmente usados para
multiplicar (hacer muchas copias de) o como genes particulares expresos.
Muchos plsmidos estn disponibles comercialmente para dichos usos.
El gen a ser replicado se inserta en copias de un plsmido el cual contiene
genes que hacen clulas resistentes a un antibitico en particular. En el paso
siguiente el plsmido es insertado en la bacteria por medio de un proceso
llamado transformacin. Luego, la bacteria es expuesta a un antibitico
particular. Solo la bacteria que toma copias del plsmido sobrevive al
antibitico debido a que el plsmido lo hace resistente. En particular, los genes
protectores son expresados (usados para hacer protena) y la protena
expresada evita la accin del antibitico. De esta forma, los antibiticos actan
como un filtro que seleccionan nicamente la bacteria modificada. Ahora, estas
bacterias pueden ser cultivadas en largas cantidades, cosechadas y el
plsmido de inters puede ser aislado.
Otro uso importante de los plsmidos es fabricar grandes cantidades de
protenas. En este se deja crecer la bacteria que contiene el plsmido que
encierra al gen de inters. Solo como la bacteria produce la protena que le
confiere si resistencia a los antibiticos, este tambin puede ser usado para
producir protenas en grandes cantidades desde el gen insertado. Esta es una
forma barata y fcil de producir genes o protenas que este codifica de forma
masiva, como por ejemplo insulina, o inclusive antibiticos.
Extraccin del ADN plasmdico[editar]
En el maxiprep se cultivan volmenes mucho ms grandes de bacterias en
suspensin. Esencialmente, este es un escalado de la preparacin mini-prep, el

cual es seguido por una purificacin adicional. Esto resulta en una cantidad
relativamente grande (0,5 -1 mg) de ADN plsmido muy puro.
En los ltimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar
la extraccin plasmdica a varias escalas, purezas y niveles de automatizacin.
Conformaciones[editar]
El ADN plsmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las cuales
(para un tamao dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante
electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad
electrofortica (velocidad para un voltaje dado), del ms lento al ms rpido:

Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario.

Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron
cortados o porque el ADN era linear in vivo. Usted puede modelar este
como un cordn que no se ha conectado as mismo.

circular relajado: ADN que interacta completamente con ambos

filamentos sin cortar, pero que ha sido enzimticamente relajado.
Usted puede modelar este dejando un cordn relajado y luego
conectndolo a s mismo.

superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o

superenrollado (ver ms abajo), pero que tiene regiones sin unir que lo
hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva
alcalinidad durante la preparacin del plsmido.

ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin

cortar, y con forma de remolino, resultando en una forma compacta.

La tasa de migracin de pequeos fragmentos lineales es directamente

proporcional al voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de
altos voltajes, grandes fragmentos migran continuamente a diferentes tasas.
Por lo tanto, la resolucin del gel decrece con el incremento del voltaje.
A un bajo voltaje determinado, la migracin de un pequeo fragmento lineal de
ADN est en funcin de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20kb)
migran a cierta tasa sin importar la longitud. Esto es debido a que las
molculas reptan desde el centro de la molcula siguiendo el sentido de la
matriz de gel.
La digestin restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos
purificados de plsmidos. Estas enzimas rompen especficamente el ADN en
ciertas secuencias cortas.

los plsmidos de bac

Jean-Pierre HERVEG*, Etienne DE PLAEN** y Maritza BAR

*Universit Catholique de Louvain, Unit GECE, Christian de DUVE Intitute of
Ludwig Institute of Brussels, Brussels, Belgium

Cuestiones para el examen

1. Qu es un plsmido, un episomo ?
2. Son los plsmidos dependientes del cromosoma bacteriano
para sus reproduccin?
3. definir "Transformar una bacteria una levadura"
4. Que quiere decir la palabra "transformar" para las clulas
eucariticas, salvo las levaduras?.

5. Cules son los mtodos utilizados para transformar las

bacterias?
6. Quese llama origen de replicacin?
7. Que es un plsmido recombinado?
8. Que es que marcador de seleccin?
9. Cul es el inters de colocar un gen en LacZ?
10. Definir " polilinker".
11. Definir la clonacin direccional.
12. A qu sirve la defosforilacin?

plano del curso

a continuacin

plan
A. Introduccin
..........1. los plsmidos y episoma (plsmidos F).
..........2. conjugacin, sexduccin y el plsmido R.
..........3. tipos de plsmidos
..........4. estructura de los plsmidos
..........5. transformacin
..........6. Los marcadores de seleccin
..........7. el replicn y el orgen de replicacin

..........2. insercin de un LacZa

..........3. clonaje direccional
..........4. desfosforilacin
C. El opron lactosa
..........1. la -galactosidasa:
..........2. el pptido alfa LacZ (lacZa)
..........3. los inductores: lactosa y IPTG:
..........4. el operador
..........5. La fijacin del represor-lac en el operador
..........6. la lactosa estorba al represor de reaccionar

..........8. clonacin y los sitios de clonaje

..........9. cualidades de un vector de clonaje
..........7. los otros gens del opern lactosa:
B. Algunas tcnicas de clonaje
..........1. insercin de un gen de resistencia

a continuacin

A. Introduccin
1. Los plsmidos de bacterias
Son molculas de ADN circular o lineal de 1 kb a 250 kb,
contienen de 2 hasta 30 genes. Los plsmidos se rplican y
se transmiten independientemente del cromosoma
bacteriano. La replicacin y la transcripcin de los
---------------------------plsmidos dependen de las protenas de la clula husped. Episoma: Si el plsmido posee la capacidad de insertarse
Los gens codificados por los plsmidos le donan ciertos
en el cromosoma bacteriano se le denomina episoma.
privilegios a la clula husped.
Dentro de este grupo de plsmidos se encuentran los
factores de fertilidad o plsmidos F, que regulan el
El nmero de plsmidos puede variar, dependiendo de su proceso de conjugacin bacteriana..
tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por clula.
Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por la

facilidad con la que se manipulan. Los plsmidos usados en

Ingeniera Gentica contienen uno o dos genes que les
confieren resistencia a antibiticos (marcadores seleccin)
y permiten seleccionar clones recombinantes

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a continuacin

2. Conjugacin, sexduccin
y plsmido R

La conjugacin bacteriana es un proceso por el que se

transfiere material gentico (un plsmido o el genoma
bacteriano) entre bacterias. La clula que aporta el material
gentico se llama donadora y aqulla que lo recibe
receptora.
La bacteria donadora debe tener un plsmido, el factor F,
que contenga la informacin gentica necesaria para la
formacin del pili sexual. Un pilus es un "tubo" que se
extienden desde la superficie de la clula bacteriana
donadora.

---------------------------El plsmido F contiene 25 genes que controlan la

produccin de los pilis.
Los pili se observan prcticamente solo en bacterias
Gram negativas y solo escasos organismos GramSe llama (F-) a las bacterias que no poseen el plsmido F,
positivos los poseen.
(F+) si poseen dicho factor en su citoplasma y (Hfr) (High
El plsmido R confiere, a las clulas que lo poseen,
frequency of recombination) si el plsmido F est integrado resistencia a los antibiticos o drogas. Un plsmido R
en su cromosoma (episoma), lo que aumenta la frecuencia puede llegar a tener hasta 10 genes que confieren
de la transferencia
resistencia y pueden transferirse a otra
bacteria por la conjugacin. El plsmido R pueden
La restriccin limita en todos los casos la conjugacin (ver el tambin ser transmitidos por virus, por ejemplo el fago
captulo sobre las enzimas de restriccin).

Una bacteria receptora recibe ADN de la clula donante.

Una vez que el fragmento de ADN de la donante est dentro
de la clula receptora es posible la recombinacin: el ADN
de la donante se alinea con el de la receptora y por
entrecruzamiento (crossing over) se intercambian genes,
P1: un error de encapsidation del fago P1 permite la
pasando a formar parte del genoma.
integracin del plsmido en el capside.
Una variante de la conjugacin es la sexduccin. En la
sexduccin un trozo definido de material gentico de la
donadora es transferido como parte de un plsmido
conjugativo.

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a continuacin

3. Tipos de plsmidos:
Podemos clasificar los plsmidos basndose en su funcin.
a. "Fertility - (F) plasmids" son capaz de conjugacin.
b. " Resistance - (R) plasmids " contienen los gens que pueden
construir una resistencia contra antibiticos o venenos.

Plasmids que existe slo como una copia sola en cada

bacteria es, sobre la divisin de clula, en el peligro de
ser perdido en una de la bacteria de segregar. Tal
copia sola plasmids tiene los sistemas que intentan
activamente distribuir una copia a ambas clulas de
hija.

c. "Col-plasmids" contiene gens que codifican colicinas, protenas

que pueden matar otra bacteria.
d. " Degrative plasmids " permiten la digestin de sustancias
inslitas como el toluole o el cido salicylico.
e. " Virulence plasmids " giran la bacteria en un patgeno.

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a continuacin

4. estructura de los plsmidos

Las formas de ADN
Los plsmidos se encuentran principalmente en forma
superenrollada en las bacterias. Las formas de ADN pueden
visualizarse en el microscopio electrnico como crculos
relajados o superenrollados.
Adems, pueden identificarse por electroforesis o por
centrifugacin. En estos casos, la estructura compactada
del ADN superenrollado aumenta su migracin
electrofortica y su velocidad de sedimentacin, lo cual
permite diferenciarlo del ADN circular relajado o del ADN
lineal.

Algn plasmids incluye un sistema de aficin. Ellos

producen tanto veneno duradero como su antdoto
efmero. La clula que mantiene una copia del plasmid
sobrevivir, mientras la clula sin el plasmid morir
porque esto se queda sin el antdoto dentro de poco.

Las topoisomerasa I y II
A diferencia de la topoisomerasa 1, la ADN girasa, corta las dos
La topoisomerasa II tiene la propiedad de transformar un ADN
cadenas de la doble hlice del ADN; y acta en la replicacin
circular relajado en superenrollado. Este proceso implica pasar de
del ADN. Mientras, la topoisomerasa 1 corta una cadena del
una forma sin almacenamiento de energa a una forma con alto
ADN para aliviar el superenrrollamiento, y acta durante la
contenido energtico, y por lo tanto es necesaria la presencia de
transcripcin del ADN.
adenosinatrifosfato (ATP) como donante energtico. Por el
contrario, la transformacin de ADN superenrollado en relajado
________________________
con subsecuente liberacin de energa es catalizada
almacenamiento, m: storage, warehousing
directamente por la topoisomerasa I sin necesidad de ATP. La
relajar verbo transitivo: to relax
ADN girasa es una de las topoisomerasas I.
electroforesis: separacin de partculas en suspensin con la
ayuda de un campo elctrico.
La ADN girasa
centrifugacin: separacin de partculas en suspensin con
La ADN girasa, como las topoisomerasas, tiene una funcin muy
la ayuda de un campo gravitacional.
importante en la modulacin del estado topolgico del ADN, pues
regula su estructura superhelicoidal.

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5. transformacin
Transformar una bacteria una levadura, consiste en
introducirle en ella una molcula de ADN extranjero (Avery,
McLeod y McCarthy, 1944).
http://www.ucm.es/info/genetica/grupod/Basemol/base_molecular_de_la_herencia.htm

Para plsmidos de 3 kb, una transformacin eficz

produce alrededor de 10+8 colonias/mg de ADN
plasmdico superenrollado.
Electroporacin:
Es un procedimiento que consiste en someter las
bacterias suspendidas en agua a una diferencia de
potencial elevado para perforar temporalmente la pared

celular.
Para las clulas eucariotas (salvo las levaduras), no se
dicetransformar pero transfectar (transformar una clula
eucariota quiere decir hacerla eterna o hacerla cancerosa).

Otros mtodos de transformacin:

Utilizan por ejemplo liposomas (son ms costosos).

La eficiencia de la transformacin es inversamente

proporcional a la talla del plsmido. Para identificar las
bacterias transformadas, se utilizan marcadores de
seleccin proporcionados por plsmidos.
Los marcadores de seleccin ms utilizados son los
Transformacin con CaCl2 + choque trmico:
gens de resistencia a antibiticos, como la ampicilina, la
Consiste en aadir plsmidos a las bacterias tratadas con
CaCl2 y de someterlas a un breve choque trmico (42C). La tetraciclina, el cloramfenicol y la kanamicina. Como
regla, las bacterias transformadas se cultivan siempre
utilizacin de otras sales que CaCl2 y la adicin de iones
en presencia del antibitico para evitar que la bacteria
metlicos aumenta la eficiencia de la transformacin.
pierda el plsmido que se le ha introducido.
Existen varios mtodos para introducir un plsmido en una
clula (transformar una bacteria). Cada uno es en s una
receta y cada uno tiene una propia.

6. Los marcadores de seleccin

Como regla, las bacterias transformadas se cultivan en
Para identificar las bacterias transformadas, se utilizan marcadores presencia del antibitico para evitar que la bacteria pierda
el plsmido que se le ha introducido.
de seleccin proporcionados por plsmidos.
Los marcadores de seleccin ms utilizados son los gens de
resistencia a antibiticos, como la ampicilina, la tetraciclina, el
cloramfenicol y la kanamicina.

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a continuacin

7. el replicn y el orgen de
replicacin
El elemento gentico que controla el nmero de copias del
plsmido se encuentra en una regin del ADN plasmdico que
incluye el orgen de replicacin. El orgen de replicacin y los
elementos de control asociados definen la unidad gentica
llamada replicn .

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a continuacin

8. Clonacin

Clonado en bacterias es (en biologia molecular)

insertar un segmento de ADN extrangeros en un
vector de clonaje:
vector,
El principio de la clonacin en biologia molecular consiste en
transformar las bacterias con este vector y seleccionar
insertar un segmento de ADN extranjero en una molcula

pequea capz de replicarse automtica. A se tipo de

molcula de ADN se lo denomina vector de clonaje.

las bacterias transformadas.

plsmidos recombinados:
Los plsmidos son excelentes vectore de clonaje. Puede ser
-------------------------------"cortado" con una dos enzimas de restriccin puede
Clonacin: Quiere decir multiplicacin
incorporrsele un fragmento de ADN que ha sido previamente
ori: orgen de replicacin.
cortado usando mas mismas enzimas de restriccin. Los
f1 ori: orgen de replicacin del fago f1. Serva antao
plsmidos as modificados se los denomina plsmidos
para la secuenciacin
recombinados. En ste estado, se los introduce entonces en
una bacteria donde sern replicados.

a continuacin

1. El inserto de un segmento de ADN extranjero en un plsmido: 2. transformacin de bacterias por el plsmido.

pGEM-13Zf(+) Vector sequence reference points.

Sitio de initiacin la transcripcin por la RNA polimerasa T7
Sitio de initiacin la transcripcin por la RNA polimerasaSP6
Promotor de la RNA polimerasa T7 (nt 31633)
Promotor de la RNA polimerasa SP6 (nt 49-68)
sitio de clonaje (nt 1143)
codon inicial operon lacZ (nt 90)
secuencia 30003160 de lac Z (nt 76323)
operator 1de lac (nt 10126)
beta-lactamase coding region (nt 12472107)

Las ARN polimerasas T7 y SP6.

Las ARN polimerasas T7 y SP6 son ADN dependiente ARN
polimerasas. Son muy especficos de sus promotores. Estas
dos enzimas permiten la sntesis de sondas ARN para cada
cadena del insert. Si ciertos nucletidos son marcados, las
sondas son tambin marcadas.
Los sitios de clonaje (polylinker):
Los sitios de restriccin (Not Im Sfi I y Hind III) han sido
obtenidas sin cambiar el nmero de los nts. Simplemente se
cambian el uno o el otro de ellos.

fago f1 regin (nt 25442999)

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a continuacin

3. seleccin de bacterias transformadas.

a continuacin

plsmidos deben contener marcadores genticos

9. cualidades de los plsmidos como Los
particulares, como gens de resistencia a antibiticos el
gen que codifica la -galactosidasa.
vector de clonaje

Los plsmidos deben contener tambin uno ms sitios de

restriccin nicos en una regin que no sea esencial para la

La mayora de los plsmidos en uso contienen un replicn

derivado del plsmido pMB1, inicialmente aislado de una
muestra clnica. En condiciones normales de cultivo, se
encuentra un mnimo de 15 a 20 copias de plsmido que
contienen el replicn en cada clula bacteriana.

a continuacin

B. Algunas tcnicas de
clonaje
1. insercin en un gen de
resistencia
Se puede clonar un fragmento de ADN en un gen de
resistencia a un antibitico, con la condicin de que el
plsmido porte al menos 2 gens de resistencia (como pBR
322).
En el ejemplo siguiente, el ADN plasmdico se corta con la

replicacin del plsmido.

Los plsmidos deben tener tambin sitios de restriccin
nicos en los gens codantes de marcadores selectivos. Esos
marcadores son inactivados cuando en ellos se inserta un
fragmento de ADN extranjero.

enzimaBam HI donde la secuencia de reconocimiento se

localiza en el gen de resistencia a la tetraciclina (tetr). El
vector digerido por Bam HI se une al fragmento de ADN "b"
cuyas extremidades han sido genradas tambin por la
enzima BamHI.
La ligacin se realiza por la ligasa de ADN T4 y ATP. El riesgo
de que un vector vaco se forme es bin elevado. El
producto de la ligado es transformado por la E. coli. Las
bacterias son sembradas en medio que contiene la
ampicilina. Entre las colonias que sobreviven a la
ampicilina, se encuentran plsmidos recombinados y
tambin vectores vacos que son recirculados sin inserto.

Para diferenciar los 2 tipos de transformados, se replican los

cultivos y se siembran en medios que contienen
antibiticos, ya sea ampicilina tetraciclina.
pBR322 es un plsmido comercial de este tipo. El
Las bacterias que no crecen en presencia de tetraciclina
sitio Bam HI y su posicin han sido escrita en rojo. Este
pero que crecen en presencia de ampicilina son las que
plsmido es un vector de 4361 bp. Ahora, es poco
contienen un plsmido recombinado. Este mtodo
utilizado, pero, a menudo, se citan en muchos artculos.
sinembargo es poco utilizado.

Vuelta al principio de la pgina

a continuacin

2. insercin en LacZ
Los plsmidos de tipo pUC contienen un segmento derivado
del opern lactosa de E. coli. Ese segmento codifica el
represor, el promotor, el operador y los primeros 146
aminocidos del genlacZ (el pptido alfa, un partes de la galactosidasa).
Polilinker:
Se ha insertado, entre los codones 5 y 6 de la secuencia
lacZa, un polilinker (regin con sitios de clonaje mltiples),
bsicamente una secuencia corta de ADN que contiene
entre 8 a 16 sitios de cortes nicos, por enzimas de
restriccin. El polilinker no modifica las ventanas de lectura,
sin que proporciona un lugar para la introduccin de un
nmero pequeo de aminocidos en la parte aminoterminal del pptido alfa sin cambiar sus propiedades.

Complementacin alfa:
Se muta E. coli para que expriman la -galactosidasa sin el
peptide alfa. La enzima es entonces inactiva: las dos partes de la
-galactosidasa son necesarias para formar una enzima activa.
Estas bacterias no hidrolisan ni la galactosa, ni el compuesto
sinttico X-gal.
Cuando se transforma con un vector pUC estas bacterias, este
vector les aporta el pptido alfa, que les hace falta, provocando
lo que se llama la "complementacin alfa".
Las bacterias transformadas por este vector son fcilmente
reconocidas puesto que ellas forman colonias azules en presencia
de un substrato incoloro X-gal (5-bromo-4 -chloro-3- indolyl-b-Dgalactosida). Cuando X-gal es hidrolisado por la -galactosidasa
produce una substancia azul insoluble en presencia de IPTG (el
inductor de la expresin de la -galactosidasa ).
Si se inserta un fragmento de ADN extranjero en el polilinker, se
destruyen casi todas las entradas de lectura y se para la
complementacin alfa. Las bacterias con plsmido recombinante
forman colonias blancas, puesto que la -galactosidasa es
inactiva. Este mtodo de coloracin permite de identificar de
manera simple las bacterias con plsmidos recombinantes.

Vuelta al principio de la pgina

a continuacin

3. clonaje direccional
A pesar de que el vector ser transformado con poca
La mayora de plsmidos utilizados actualmente (como el vctor eficiencia, la mayora de las bacterias resistentes a la
ampicilina contendran el plsmido recombinado.
pGEM del ejemplo precedente) contienen polilinkers con varios
sitios de restriccin nicos que permiten varios usos
experimentales. Permite as tambin de encontrar sitios de
restriccin compatibles con las extremidades del fragmento a
clonar.
Por ejemplo, el vctor pUC19 puede ser digerido por BamHI y
HindIII y, luego de la digestin, el gran fragmento del vector
puede ser separado del pequeo fragmento correspondiente a
partir de un polinker, por electroforsis en gel de agarosa.
El vector puede unirse por ligado a un fragmento de ADN que
tiene extremidades compatibles con aquellas genradas por
BamHI y HindIII.
Las molculas de ADN circular obtenidas sont transformadas en
laE. coli. Las bacterias transformadas son identificadas por su
capacidad de resistencia a la ampicilina. En tanto que no halla
complementaridad entre las extremidades adhesivas BamHI y
HindIII del vector, la circularizacin de aquel no es posible.

Vuelta al principio de la pgina

a continuacin

4. defosforilacin
La T4 DNA ligasa cataliza la formacin de un enlace
fosfodister entre los nucletidos adyacentes solamente si Si a pesar de todo se decide clonar en un plsmido un
uno de los nucletidos contiene un grupo 5'-fosfato y el otro fragmento de ms de 10 Kb de talla, har falta tomar
un 3'-OH. Los 5'-fosfatos de las 2 extremidades de una
precauciones para limitar la recircularisacin del vector.
hebra linear de ADN en presencia de una fosfatasa
intestinal de ternero (CIP) alcalina de camarones (SAP) :
no permite ms la recircularizacin del vector. Si se une un
fragmento de ADN con las extremidades 5'-fosfato al vector
desfosforilado, se obtiene entonces una molcula de ADN
circular con 2 cortes. Esos cortes son reparados cuADNo el
plsmido recombinado se introduce en la bacteria. Como el
ADN plasmdico circular es ms eficientemente
transformado que el ADN linear, la mayora de
transformantes contendrn el plsmido recombinado.
Debido a la facilidad de uso, los plsmidos son los vectores
ms empleados en ingenra gentica. Son los vectores ms
eficientes de todos si el tamao del ADN a clonar es inferior
a 10 kb. Para fragmentos con tamao superior a 10 Kb, la
eficiencia de transformacin se hace demasiado dbil.

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a continuacin

C. El opron lactosa

5. El represor-lac puede fijarse en

el operador

El ajuste espacial producido por la fijacin del represor-lac

en el operador no permite que la ARN polimerasa se una
1. la -galactosidasa:
al ADN y de comenzar la transcripcin del gen que
codifica la -galactosidasa. El represorlac es una protena
La E. coli no utiliza la lactosa como tal, sino cuando sta es
constitutiva codificada por el gen "i".
hidrolizada en glucosa y galactosa. La -galactosidasa
hidrolisa la lactosa a partir de un substrato sinttico
denominado X-gal. Si la galactosa no est presente en el
medio de cultivo, la E. coliexprime solamente muy poco de
-galactosidasa. En cambio, en presencia de lactosa,
exprime la -galactosidasa abundantemente. Es por sto
que se dice que puede regular la expresin de la galactosidasa. Cuando la -galactosidasa entra en contacto
con el producto X-gal, ella lo convierte en un producto
coloreado de azl. La -galactosidasa es codificado por el
gne LacZ.

2. el pptido LacZ alfa:

El pptido LacZ-alfa es la parte de la -galactosidasa que no
tiene actividad por s misma, pero que es necesaria para la

accin de la enzima. Existen cultivos comerciales de E.

coli a los cuales se les ha eliminado el gen del pptido alfa.
Cuando los plsmidos contenientes ste gen son
introducidos en sas bacterias, le donan el LacZ alfa que les
faltaba.

3. los inductores: lactosa y IPTG:

La lactosa cuando presente induce la expresin de -gal.
Existen tambin otros compuestos as capces de provovar
la misma respuesta inductrz. En el laboratorio, uno de los
ms utilizados es el isopropil- -D-tiogalactsido (IPTG). El
IPTG no es metabolizado.

4. el operador
6. la lactosa impide al represor de

El estudio de E. coli mutantes, incapces de modular la

produccin de la -galactosidasa conducieron a Monod y
reaccionar
Jacob a postular la existencia de un sitio de ADN cercano al
gen codificador de la -galactosidasa sobre el cual se fijara La lactosa se une al represor y le impide de liarse al
un represor. Es as, que el adjetivo operador fu donado.
operador. En presencia de lactosa el represor es
inactivado y el ARNm lac es transcripto. Si la lactosa es
eliminada del medio, el represor recupera su capacidad
de fijarse al operador y de impedir la transcripcin del
gen.

7. los otros gens del opron

lactosa:
los otros gens del opron lactosa:
El gen de E. coli que codifica la -galactosidasa (Z) se
encuentra adyacente a 2 otros gens implicados tambin
en el metabolismo de la lactosa
la lactosa permeasa: el gen lacY codifica la lactosa
permeasa que facilita la entrada de lactosa en la clula.
la thiogalactosida transacetilasa:
El gen lacA, codifica la thiogalactosida transacetilasa, una
enzima probablemente implicada en la eliminacin de
compuestos similares a la lactosa, pero que la galactosidasa no puede separar en metabolitos nutritivos.

Tipos De Plasmidos Y Su Significacion Biologica

Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra
bacteria. Los plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan
complejos procesos de conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a
otra bacteria.
Los plsmidos no-conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all
que ellos pueden transferirse nicamente con la asistencia de los plsmidos
conjugativos y lo hacen por accidente.
Una clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un
subtipo de genes requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un
plsmido conjugativo, transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una clula simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero
normalmente plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo
uno de ellos sobrevive en la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones
vitales de los plsmidos.
Por lo tanto, los plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de
compatibilidad.
Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases principales:
Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de
conjugarse.
Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir
resistencia contra antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como
Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plsmidos.
Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la
produccin de) colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.
Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales
como tolueno o cido saliclico.
Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.
Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales.
Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria,
debido a la divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas

Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte

Postsegregacional (PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en
conjunto un veneno de larga vida y un antdoto de vida corta.
Las clulas hija que retienen una copia del plsmido sobreviven, mientras que una
clula hija que falla al integrar el plsmido muere o sufre una reducida tasa de
crecimiento debido al veneno que obtuvo de la clula padre. Este es un ejemplo
de plsmidos como el ADN replicante.
Plsmido. (2016, 24 de enero). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de
consulta: 06:06, marzo 24, 2016 desde https://es.wikipedia.org/w/index.php?
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