dao sensorial neurona CSF-1 derivado de la proliferacin microglial inducida y dolor DAP12

dependiente.
Aunque microglia han sido implicados en el dolor neuroptico inducido por la lesin del nervio,
la manera en que lesiona las neuronas sensoriales se involucran microglia sigue siendo poco
clara. Se encontr que la lesin del nervio perifrico induce la expresin de novo de factor
estimulante de colonias 1 (CSF 1) en las neuronas sensoriales lesionados. CSF 1 fue
transportada a la mdula espinal, donde se dirige el receptor de CSF1 microglial (CSF1R). Cre
mediada por la supresin de la neurona sensorial del nervio Csf1 previno completamente la
lesin inducida por hipersensibilidad mecnica y reduce la activacin y proliferacin microglial.
En contraste, la inyeccin intratecal de CSF1 induce hipersensibilidad mecnica y la
proliferacin microglial. lesin del nervio tambin upregulated CSF1 en motoneuronas, en la
que se requiere para el asta ventral de activacin y proliferacin microglial. Aguas abajo de
CSF1R, se encontr que se requera la DAP12 adaptador de protenas de membrana microglial
para ambos asociados con lesiones del nervio e intratecal upregulation CSF1 inducida de
genes microgliales relacionados con el dolor y el dolor subsiguiente, pero no para la
proliferacin microglial. As, tanto CSF1 y DAP12 son objetivos potenciales para la
farmacoterapia de dolor neuroptico

El dolor neuroptico es una condicin de dolor crnico severo que se caracteriza por
hipersensibilidad mecnica en curso, donde estmulos normalmente inocuos provocan
intensa pain1,2. Dado que las farmacoterapias tradicionales son en gran medida
ineficaces contra dolor3 neuroptico, contina la bsqueda de mecanismo (s) por el
cual el dao del nervio provoca dolor. En la actualidad existe un consenso considerable
dao a los nervios que altera circuitos de transmisin del dolor en la mdula espinal
dorsal horn2 y que la microgla, los macrfagos del tejido residente en el CNS4,5, son
importantes contribuyentes a este proceso 6-9. Lo que subyace a la activacin de la
microglia, sin embargo, todava no est claro. Cabe destacar que, a pesar de activacin
de la microglia se demostr con facilidad despus de un dao a la rama perifrica de la
neurona sensorial primaria, la microgla parecan no responder a seccin de la rama
central, a saber, la root10 dorsal (Fig. 1a). Por lo tanto, las neuronas sensoriales
heridos en los ganglios de la raz dorsal (DRG) deben liberar una seal que se
comunica con y activa la mdula espinal microglia 1
Aunque una gran cantidad de estudios han buscado factores de neuronas sensoriales
derivados, todava no est claro cmo las neuronas lesionada iniciar la activacin de la
microgla. Por ejemplo, fractalquina (CX3CL1), una quimiocina que se escindi de la membrana
de las neuronas sensoriales despus injury11 nervio perifrico, requiere la catepsina S (gatos),
una proteasa liberada por microglia ya activado 8. As, fractalquina puede contribuir al
mantenimiento de la, pero no puede ser la seal para iniciar, la activacin de la microgla.
Aunque se ha informado de la CCL2 y quimiocinas CCL21 ser inducida en las neuronas
sensoriales despus de la lesin del nervio 12,13, CCR2, el receptorpara CCL2, no se

expresa en microglia , y la supresin de CCL21 no tiene efecto sobre los nervios lesin
inducida por la activacin y proliferacin microglia . neurregulina-1 (NRG-1) tambin ha
sido implicado, pero NRG-1 no se induce en sensorial las neuronas despus de
injury15 nerviosas. Otro punto de vista sostiene que el ATP liberado despus de la
lesin del nervio se une al receptor purinrgicos P2X4 microglial para iniciar

activation6,16 microglia. Sin embargo, la activacin de la microglia inducida por la

lesin del nervio est intacto en nocaut P2X4
mice17, y la fuente de ATP despus de la lesin del nervio que une la
receptor nunca ha sido inequvocamente identified6
Adems de ser activado, la poblacin microglia se expande despus de la lesin del nervio 18.
Si esta expansin resultados de proliferacin de microglia local o de la infiltracin de monocitos
circulantes no est claro. Como ambos microglia residentes y monocitos infiltrantes expresan
marcadores comunes, dirigindose a la contribucin relativa de los residentes y la infiltracin de
clulas ha sido difcil. El uso de un modelo en el que la mdula sea sana es trasplantado a
receptores irradiados letalmente, una
estudio anterior lleg a la conclusin de que los monocitos circulantes se infiltran
en el SNC y contribuir a la expansin de la microglia
population19. Por otro lado, el uso de ratones quimricos generados por parabiosis, otro grupo
lleg a la conclusin de que la expansin microglia en el ncleo facial despus VII lesin (facial)
los nervios o en la mdula espinal en un modelo de ratn ALS procede exclusivamente de la
auto-renovacin de la microgla residente 20 . Independientemente de la fuente de la
proliferacin, ni la identidad ni el origen celular del factor (s) por el cual lesiona las neuronas
desencadenar la proliferacin microglia in vivo es conocida
Para abordar estas cuestiones, se realiz RNA-Seq y registramos una induccin significativa de
LCR 1 (es decir, el factor estimulante de colonias de macrfagos, MCSF) en el DRG heridos. La
regulacin positiva inducida por la lesin del nervio de LCR 1 se produjo no slo en las
neuronas sensoriales DRG lesionadas, sino tambin en las neuronas motoras del asta ventral.
El mtodo de eliminacin selectiva mediada por Cre de Csf1 de las neuronas sensoriales, se
encontr que se requera sensorial CSF1 neurona-derivada para el desarrollo del fenotipo dolor
neuroptico, as como para la proliferacin de microglia en el asta dorsal. Por ltimo, hemos
identificado una va aguas abajo crtico en microglia que incluye la protena adaptadora DAP12
membrana en la generacin de la lesin del nervio y el dolor neuroptico inducido por CSF1.
Sin embargo, asociados con lesiones del nervio y proliferacin microglial inducida por CSF1
eran DAP12 independiente

RESULTADOS
De novo induccin de CSF1 en las neuronas sensoriales lesionados
Para identificar los genes que estn regulados al alza en el asta dorsal y DRG
despus de la lesin del nervio y las seales a travs de los cuales lesionan las
neuronas sensoriales interactan con la microglia para producir dolor, que por primera
vez un anlisis de RNA-Seq despus de la lesin del nervio (Fig. 1a). Muchos estudios
han informado de cambios transcripcional despus de la lesin del nervio, pero pocos
de anlisis por GRD y la mdula espinal y la mayora se realizaron utilizando
microarrays 21,22. Encontramos una regulacin positiva marcada de Csf1 en el
DRG ipsilateral y de Csf1r en el cordn dorsal ipsilateral despus de la lesin del nervio
(Cuadro 1). Este hallazgo es particularmente importante, ya que CSF1 es un factor
esencial aadido al medio de cultivo para expandir la microglia in vitro 23, y CSF1R in
vivo es necesaria para development24 microglia. De hecho, Csf1r es uno de los
primeros genes expresados en progenitores de microglia en saco vitelino durante
development24,25 microglia

Cabe destacar que la expresin de IL-34, otro ligando CSF1R 26, no cambi (Cuadro
1). RT-PCR cuantitativa (QRT-PCR) confirm nuestra conclusin de que Csf1, pero no,
se indujo Il-34 en el DRG (Fig. 1b, c), y que Csf1r fue inducida en la mdula espinal
dorsal (Fig. 1d) despus de lesin del nervio.
Tras la hibridacin in situ para Csf1 mRNA (Fig. 2a) y la inmunotincin para la protena
CSF1 (Fig. 2b) revel que CSF1 fue inducida en las neuronas DRG que coexpressed
ATF3, un marcador de las clulas con los axones perifricos daados 27. De hecho,
despus de 1 d lesin del nervio, todas las neuronas DRG CSF1 + coexpresan ATF3 y
~ 80% de ATF3 + neuronas CSF1 coexpressed (Fig. 2b y. complementario Fig 1). La
induccin CSF1 se produjo en las neuronas DRG de pequeo y gran dimetro (Fig. 2b)
dentro de 18 h de la lesin nerviosa y persisti durante al menos 3 semanas
(complementario Fig. 1). Como no hemos podido detectar CSF1 en las neuronas DRG
en ausencia de lesin (Fig. 2b), llegamos a la conclusin de que la lesin del nervio
induce la expresin de novo CSF1 en las neuronas sensoriales heridos. Hemos
observado alguna inmunorreactividad CSF1 en las clulas satlite de la DRG, pero no
haba ningn cambio despus de la lesin del nervio (Fig. 2b).
CSF1 se transporta a la mdula espinal despus de una lesin nerviosa
Para determinar si neurona sensorial derivada de novo CSF 1 se transporta a la mdula
espinal, ligamos las races dorsales L4 y L5 (entre el DRG y la mdula espinal; Fig. 1a)
despus de la lesin del nervio perifrico y encontramos acumulacin de CSF1 en las ligaduras
(Fig. 2c). Co-expresin en las neuronas DRG y en el sitio de la ligadura de CSF1 y NPY
(complementario fig. 2a, b), un pptido que se regula positivamente en las neuronas
sensoriales lesionados 28, confirm el transporte intra-axonal de CSF1

En la mdula espinal, CSF1R se expresa slo en microglia

A continuacin, utilizando un reportero ratn CSF1R-GFP 29 y la inmunotincin para
CSF1R, encontramos que CSF1R se expresa exclusivamente en microglia de la
mdula espinal y es, en efecto upregulated despus de la lesin del nervio (Fig. 2d y
complementario Fig. 2c-f). El hecho de que no observamos un aumento
correspondiente CSF 1 en el asta dorsal sugiere que CSF1 se libera rpidamente
despus de su transporte al cordn.
CSF1 es necesario y suficiente para la activacin de microglia
Para investigar la relevancia funcional de CSF1 upregulation en las neuronas
sensoriales lesionados, hemos borrado Csf1 selectiva de las neuronas sensoriales (Fig.
3a, b) mediante el cruce de un ratn Csf1 floxed (LCR 1 Fl / fl) 30 con un Advillin-Cre
(Adv-Cre ) ratn en el que la recombinasa Cre slo se expresa en neuronas sensoriales
DRG 31. ni la morfologa ni la densidad de la mdula contralateral microglia cable a la
lesin del nervio difera de la de los ratones de tipo salvaje (Fig. 3c, d), lo que indica
que
desarrollo microglial no se vea comprometida en estos ratones. Sin embargo, el nervio
lesin inducida por la activacin de la microgla en el asta dorsal ipsilateral, como se
demuestra por el aumento de expresin Iba1, se redujo sustancialmente en estos
ratones (Fig. 3c, d y complementario Fig. 3a), a pesar de que la induccin ATF3 en las
neuronas sensoriales lesionados fue preservada (Fig. 3b). Para probar si CSF1 por s
misma provoca la activacin microglial in vivo, inyectamos CSF1 intratecal, una vez por
da
durante 3 das y se observ una marcada activacin de la microglia asta dorsal, que se
manifiesta como una mayor expresin Iba1 (Fig. 3e y adicionales Fig. 3b). En conjunto,

estos resultados sugieren que la induccin CSF1 en las neuronas sensoriales

lesionados es necesario y que CSF1 por s misma es suficiente para el nervio lesin
inducida por la activacin de la microgla en el cuerno dorsal de la mdula espinal.
CSF 1 es necesario y suficiente para el dolor neuroptico
A continuacin pregunta si sensorial CSF1 neuronas derivadas tambin
contribuye al dolor neuroptico producido por lesin nerviosa. Adv-Cre-mediada Csf1
eliminacin de las neuronas sensoriales del nervio previno completamente la lesin
inducida por hipersensibilidad mecnica, la sello de dolor neuroptico 32 (Fig. 4a y
complementario Fig. 4a).
En estos ratones mutantes, el peso corporal (. 4b complementario Fig), la actividad
motora (complementario Fig. 4c), la respuesta a la estimulacin calor nocivo aguda
(complementario Fig. 4d, e), formalina pata trasera (inflamacin) inducida por el
comportamiento nocifensive (Fig complementaria . 4f), y los nmeros y las
subpoblaciones de neuronas DRG neuroqumicos (complementario Fig. 4 g, h) no
difieren de los ratones de tipo salvaje. En consonancia con una cantidad suficiente de
la contribucin a la CSF1
dolor neuroptico fenotipo, la inyeccin intratecal de CSF1 provoc hipersensibilidad
mecnica sustancial tanto en animales de tipo salvaje (Fig. 4b) y en los ratones en los
que Csf1 se elimin de las neuronas DRG (Fig. 4c). Tambin se registraron los cambios
morfolgicos en el cuerno dorsal de la microgla 2 h despus de CSF1 intratecal
(complementario fig. 5a),
as como una pequea, pero importante, aumento en la expresin Iba1 (Fig
complementario. 5b). De acuerdo con estos hallazgos, la minociclina inhibidor de la
microgla impidi la hipersensibilidad producida por CSF1 intratecal (Suplementario Fig.
5c). Cabe destacar que, aunque el receptor P2X4 se considera que es crtica para la
hipersensibilidad
despus de una lesin del nervio 6, intratecal CSF indujo 1-mecnica
hipersensibilidad persisti en ratones knockout P2X4 (Fig. 4d).
Por ltimo, CSF1 intratecal upregulated sustancialmente varios genes microgliales (Fig.
4f), incluyendo ITGAM (que codifica CD11b), CX3CR1, BDNF (que codifica el factor
neurotrfico derivado del cerebro) y CTSS (que codifica los gatos). Muchos de estos
genes han sido implicados en el desarrollo del dolor neuroptico 8,33. Cabe destacar
que los mismos genes microglia se upregulated en el dorsal de la mdula 1 das
despus de la lesin del nervio (Fig. 4e). Se concluye que la de novo induccin de
CSF1 en las neuronas sensoriales lesionados desencadena la expresin de genes
microgliales dolor neuroptico relevante en el dorsal de la mdula espinal, as como la
consiguiente condicin de dolor neuroptico
DAP12 media la regulacin positiva de genes microglial y dolor
Seguidamente se dirigi a la ruta de transduccin de seal aguas abajo de la CSF1R microglial.
Nuestro anlisis de ARN-Seq del dorsal de la mdula espinal ipsilateral a la lesin del nervio
revel una regulacin al alza sustancial de Tyrobp, el gen que codifica DAP12 (Tabla 1). Nos
centramos en DAP12, ya que es fundamental para la microgla adultos
5,34 funcionalidad y se induce en la microgla en el ncleo XII despus injury35 nervio

hipogloso. QRT-PCR mostr que la induccin Tyrobp era sustancial dentro de 1 d de la lesin
(Fig. 5a) y dur al menos 7 d (complementario Fig. 6a). CSF1 intratecal tambin inducida
Tyrobp (Fig. 5b), y, en particular, Tyrobp eliminacin 36 completamente lesin impedido

nervio y la hipersensibilidad mecnica CSF1 inducida intratecal (Fig. 5c, d), as como la
regulacin positiva de genes microglial (Fig. 5e, f), sin afectar a la induccin de novo de
CSF1 en las neuronas sensoriales (Fig complementario. 6b) . La hipersensibilidad leve
inducida por CSF1 en el Tyrobp - / - ratones (Fig. 5d) fue comparable a la producida por
una solucin salina vehculo tamponada con fosfato (PBS) en ratones de tipo salvaje
(Fig 4b.). La actividad motora y la respuesta a la estimulacin aguda calor nocivo en el
Tyrobp - / - ratones no difieren de las de los ratones de tipo salvaje (Fig complementaria
6c-e.). Concluimos que DAP12 se encuentra aguas abajo de CSF1R y es necesario
para la CSF1-CSF1Rregulacin al alza disparada de los genes relacionados con el dolor de la microgla y de
la
la consiguiente condicin de dolor neuroptico. Notablemente, DAP12 tambin se
requiere para nervio hipogloso expresin inducida por la lesin de las citoquinas proinflamatorias, incluyendo marcadores M1-fenotipo 35. Por ltimo, en la rata, se
encontr que los mecanismos de DAP12 tambin contribuyen al dolor neuroptico en
curso. Autotomy (automutilacin de una extremidad denervado) se considerar que
existe desde un dolor persistente comparable al dolor del miembro fantasma. Se
encontr que los niveles basales de la mdula espinal Tyrobp ARNm eran
sustancialmente ms altos en una cepa de ratas con alta autotomia (HA) 37
puntuaciones de los niveles Tyrobp en ratas que raramente desarrollan esta condicin (baja
autotomia, LA). Estas diferencias Tyrobp estaban presentes tanto antes como despus de la
lesin del nervio (Fig. 7 complementaria).
lesin del nervio induce la microgla auto-renovacin en la mdula espinal
Adems de establecer la condicin de dolor neuroptico, lesin de nervios perifricos se
expande la poblacin microgla de la mdula espinal. Si los resultados de esta expansin de la
infiltracin de monocitos circulantes o por auto-renovacin de la microgla local sigue siendo
controvertido. A pesar de la de genes perfil comparable de la microgla y los monocitos, algunos
genes (CSF1R y CX3CR1) se expresan en niveles ms altos en microglia; otros (Trem1 y
Trem3) se expresan exclusivamente en monocitos p38. Nuestro anlisis de RNA-Seq mostr
que, aunque se upregulated los genes microglia enriquecido en los genes especfico de los
monocitos permanecieron indetectables despus de la lesin del nervio (Cuadro 1). Se
confirm estos hallazgos RNA-Seq por QRT-PCR (Fig complementario. 8)
y llegan a la conclusin, de acuerdo con un estudio20 anterior, que los monocitos no se infiltran
sustancialmente la mdula espinal despus de una lesin nerviosa. Por el contrario, la
expansin de la microgla despus de la lesin del nervio implica la auto-renovacin de
microgla residenteCSF1 es necesaria y suficiente para la microgla autorrenovacin

A continuacin pregunta si tambin se requiere la expresin de novo de CSF1 en las

neuronas sensoriales del nervio perjudicados por la lesin inducida por la microgla
auto-renovacin in vivo. En primer lugar confirm un informe anterior de que la lesin
del nervio 18 desencadena la proliferacin de microglia asta dorsal, como lo demuestra
la incorporacin de BrdU anlogo de timidina en CSF1R que expresan

microglia (Fig. 6a). Todas las clulas del asta dorsal BrdU expresadas CSF1R
3 d despus de la lesin del nervio (Fig. 6a), lo que indica que estas clulas en
proliferacin se originan de microglia residente, es decir, la proliferacin refleja
microglial auto-renovacin. Tenga en cuenta que se produjo la proliferacin despus de
la microglia CSF1 se indujo. No se detectaron proliferacin de microglia en el asta
dorsal al da 1 despus de la lesin (Fig. 6b), cuando CSF1 induccin en las neuronas
sensoriales se observa fcilmente (Figs. 1b y 2a, b). En particular, la supresin mediada por
Cre-Adv del LCR 1 de neuronas DRG eliminado en gran medida la proliferacin inducida por la
lesin del nervio asta dorsal microglia (Fig. 6c y complementario Fig. 9a). proliferacin microglia
Por ltimo, la inyeccin intratecal de CSF1 tambin indujo en el asta dorsal
(Fig. 6e y complementario Fig. 9c) comparable a la provocada por la lesin del nervio (Fig. 6a,
b). Concluimos que sensorial CSF1 neurona derivado es necesario y que CSF1 por s misma
es suficiente para la proliferacin de microglia / auto-renovacin en el asta dorsal.
DAP12 no se requiere para la proliferacin de microglia in vivo
Dado que DAP12 se requiere para la proliferacin inducida por CSF1 de los macrfagos
derivados de mdula sea in vitro 39 y que se encuentra aguas abajo de la mdula espinal
CSF1R microglial en la regulacin de la expresin gnica microglial relacionada con el dolor in
vivo (Fig. 5e, f), se espera que DAP12 tambin
media la proliferacin de microglia in vivo. Para nuestra sorpresa, sin embargo,
Tyrobp supresin alterada ni lesin nerviosa ni CSF1 inducida dorsal horn intratecal
proliferacin microglial (Fig. 6d, e y complementario Fig. 9b, d). Por lo tanto, aunque asociados
con lesiones del nervio y
inducida por la induccin de genes CSF1 microglia y la consiguiente condicin de dolor
neuroptico son DAP12 dependientes, asociados con lesiones del nervio y la proliferacin
inducida por CSF1 microglia / auto-renovacin implica una va DAP12-independiente.
CSF1 se induce en motoneuronas lesionadas
A medida que el nervio citico contiene los axones sensoriales y motoras, la transeccin
daa tanto a las neuronas sensoriales DRG y ventral neuronas motoras del asta 27
(Fig. 1a). En cuanto a las neuronas sensoriales, se observ marcada CSF1
induccin en axotomizadas (ATF3 expresar) motoneuronas (Fig. 7a, b).
La induccin CSF1 motoneuronal ocurri dentro de 18 h de la lesin y persisti durante al
menos 3 semanas (. Complementario figura 10). Prcticamente todas las neuronas motoras
que expresan ATF3 coexpressed CSF1, incluso 3 semanas despus de la lesin del nervio
(Fig. 7b y. Complementario Fig 10). Estos resultados son muy diferentes de los informes
previos que encontraron ningn cambio en CSF1 (ref. 40) o una induccin de CSF1 en la
microgla, no neurons41, en el ncleo motor facial despus de la lesin del nervio VII. Es
importante destacar que se encontr que la activacin inducida por la lesin del nervio asta
ventral microglia (mejorado inmunotincin Iba1) y la inmersin microglial de las neuronas
motoras se produjeron solamente alrededor de los cuerpos celulares de las motoneuronas y las
dendritas en el que la expresin CSF1 aument (Fig. 7D, E). Y as como sensorial CSF1
neurona derivado es transportado intraxonally (Fig. 2c y complementario Fig. 2b), por lo que el
CSF1 motoneuronal inducida tambin se transporta en los axones que salen de la mdula
espinal (Fig. 7e). De hecho, se observ acumulacin de CSF1 en el sitio de la lesin del nervio
perifrico (Fig. 7f). Por lo tanto, CSF1 se induce en ambos sensoriales y neuronas motoras
lesionadas y se transporta el axn al cuerno dorsal y a la periferia, respectivamente.

la proliferacin de microglia cuerno ventral es dependiente CSF1

Para investigar la consecuencia de la induccin CSF1 en motoneuronas lesionadas, cruzamos
Csf 1 ratn Fl / fl con un ratn nestina-Cre, en el que la recombinasa Cre se expresa en la
mayora de las neuronas del SNC ATF3 expresin inducida por la lesin del nervio 42.
axotomizados en motoneuronas no se vio afectada en estos ratones, pero la regulacin al alza
CSF1 en motoneuronas se redujo sustancialmente (Fig. 7 g). Slo ~ 30% de las motoneuronas
ATF3 + expres CSF1 (Fig. 7 g), en comparacin con el 100% de las motoneuronas ATF3 + en
ratones de tipo salvaje (Fig. 7b). La expresin residual de CSF1 en motoneuronas
presumiblemente refleja incompleta recombinacin mediada por Cre nestina en las
motoneuronas. En particular, la prevencin de la regulacin positiva CSF1 en motoneuronas
elimina en gran medida el nervio lesin inducida por la activacin de la microgla (Fig. 7 h) y la
proliferacin (Fig. 7i-k) en el asta ventral.
Las consecuencias topogrficos de eliminacin neuronal de Csf1 fueron impresionantes.
Supresin de Csf1 de las neuronas sensoriales (Adv-Cre; Fig. 3b) ni alterado por induccin
CSF1 neuronas motoras ni la activacin microglial asta ventral despus de la lesin del nervio
(figura 8a, b.). Ms bien, la reduccin de la activacin de los nervios microglia inducida por
lesiones se limit al cuerno dorsal, en el campo terminal de los aferentes lesionados (Fig. 8a,
b).
En contraste, la supresin de Csf1 de las neuronas del SNC (nestina-Cre;
Fig. 7 g) redujo notablemente la activacin de la microglia inducida por la lesin del nervio en el
asta ventral (Fig. 8c). Tenga en cuenta que la densidad de lnea de base microglial tambin se
redujo en estos ratones (Fig. 8a, c). A pesar de esta reduccin general, la induccin CSF1
inducida por la lesin del nervio se ha conservado en las neuronas sensoriales en estos
ratones (complementario Fig. 11), as como la activacin microglial cuerno dorsal (Fig. 8c).

DISCUSIN
Aunque existe un acuerdo general de que la microgla son importantes
contribuyentes al dolor neuroptico despus de una lesin de nervios perifricos, la
manera en que lesiona las neuronas sensoriales comunican y activar microglia para
producir esta condicin de dolor no se conoce. Hemos encontrado que las neuronas
sensoriales lesionados de novo expresan CSF 1 y transportado a la mdula espinal,
donde se dedica microglia a travs de una interaccin con CSF1R microglial. A travs
de una va de microglia DAP12-dependiente, CSF 1 a su vez upregulated genes
microgliales que han sido implicados en el fenotipo dolor neuroptico. neuron- heridos
CSF1 derivada tambin provoc una proliferacin de microglia / auto-renovacin
DAP12-independiente en la mdula espinal.
CSF1 heridos, la activacin de la microgla neuronas derivadas y el dolor
Aunque CSF1 es conocida por su efecto estimulante de colonias in vitro sobre la
microglia cultivadas 23, su papel in vivo es mucho menos entendido, en gran parte
debido a las limitaciones de los modelos disponibles in vivo en animales, en particular
la mutacin puntual op / op mouse43 Csf1. Teniendo en cuenta que este ratn tiene un
dficit sustancial en development24 microglia, no es ideal para el estudio de la
microgla functionality4 adulto. Adems, debido a la mutacin mundial Csf1 en estos
ratones, la contribucin de CSF1 de un tipo especfico de clula no se puede evaluar.
De hecho, aunque se ha informado de que la lesin inducida por el nervio activacin
microglial en el ncleo facial se atena en mice44 op / op, otro estudio concluy que la

fuente de la CSF1 desencadenamiento de la respuesta microglial era microglia 41, no

neuronas. Muy recientes estudios utilizaron la administracin sistmica de CSF1R
inhibitors45. Sin embargo, como la CSF1R tiene dos ligandos, CSF1 y IL-34 (ref. 26), la
accin del inhibidor no puede ser inequvocamente atribuido a Csf1 bloqueo. Adems,
la fuente de CSF1 relevante no puede ser determinada con este enfoque.
Se encontr que CSF1 se indujo notablemente y de forma selectiva en lesionada (ATF3 +)
neuronas sensoriales despus de la lesin del nervio y se transporta a la mdula espinal,
donde tambin se upregulated CSF1R. En particular, la eliminacin selectiva de las neuronas
sensoriales de Csf1 reduce sustancialmente los nervios asta dorsal de la activacin microglial
inducida por la lesin y evitar totalmente el fenotipo conductual del dolor neuroptico. Adems,
la inyeccin intratecal de CSF1 produce tanto mecnica activacin hipersensibilidad y microglia.
Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan, a lo mejor de nuestro conocimiento, la
primera evidencia de que la regulacin positiva de CSF1 en las neuronas lesionadas es el
contribuyente fundamental para el nervio lesin inducida por la activacin de la microgla y el
dolor neuroptico.
Una base importante para nuestra conclusin en cuanto a la contribucin esencial de la
neurona sensorial CSF1 derivados de vino de nuestra manifestacin simultnea de la
regulacin positiva de la mdula espinal de CSF1R microglial. En agudo contraste, aunque
CCL21 se informa upregulated en el DRG despus de injury13 nervio, ninguno de los
receptores de CCL21, a saber, CCR7 y CXCR3 (ref. 46), se expres en el cable dorsal, incluso
despus de la lesin del nervio perifrico (Tabla 1). De hecho, nuestro anlisis de RNA-Seq ni
siquiera poda confirmar la regulacin al alza de CCL21 en el DRG (Tabla 1). Finalmente,
aunque se ha sugerido que las neuronas expresan varias protenas de la membrana
(Por ejemplo, CD200) que inhiben la actividad microglia y que los resultados de activacin de
microglia de regulacin a la baja de estas inhibidora
proteins47, que no encontr ningn cambio en la expresin de sus genes correspondientes en
el DRG despus de una lesin nerviosa (Cuadro 1).

Una va CSF1R-DAP12 microglial media en el dolor neuroptico

Hay muchos genes microgliales que han sido implicados en el dolor neuroptico, pero
la vas a travs de las cuales se inducen estos genes despus de la lesin del nervio
sealizacin microglial an no se han definido completamente. Hemos encontrado que
la expresin de novo de CSF1 en las neuronas sensoriales se acopla a una va de
DAP12-dependiente. En particular, se encontr que esta va CSF1-CSF1R-DAP12 se
encuentra aguas arriba de los genes que son crticos microgliales
con el desarrollo del dolor neuroptico 6,48,49, incluyendo gatos, CX3CR1 (Figs. 4e, 5e
y f, f), P2X4, IRF8 y IRF5 (Fig. 12 Complementario).
Dado que DAP12 se encuentra aguas arriba de estos genes, se deduce que DAP12 la
orientacin debe ser considerado en la farmacoterapia del dolor neuroptico. Cabe
destacar que, aunque la va CSF1-CSF1R-DAP12 se encuentra aguas arriba de la
induccin del gen P2X4, CSF intratecal 1 indujo hipersensibilidad mecnica equivalente
en nocaut P2X4 y ratones de tipo salvaje (Fig. 4d). Se concluye que la sealizacin a
travs de microglial inicial CSF1R es P2X4 independiente
lesin del nervio induce CSF1 dependiente de la microglia autorrenovacin
Nuestro hallazgo de que microglial-especfico, en lugar de especfico de los monocitos, los
genes se upregulated en la mdula espinal despus de una lesin nerviosa es coherente con
un informe anterior de la infiltracin de monocitos no significativa despus de injury20 nervio.
Aunque se ha informado de que nestina-expresin de las clulas progenitoras microglia
contribuyen a la repoblacin microglia despus de la deplecin farmacolgica de microglia 45,
no se observ expresin de nestina en cualquiera de las clulas BrdU en proliferacin en

nuestro modelo (datos no mostrados). De hecho, todas las clulas BrdU + expresaron CSF1R
(Fig. 6a), lo que sugiere que la expansin de la poblacin de la microgla de la mdula espinal
despus de lesin del nervio resultados de la auto-renovacin de la microgla residente.
A lo mejor de nuestro conocimiento, sin embargo, poco se sabe acerca de la seal que activa la
microglia auto-renovacin in vivo, despus de la lesin del nervio perifrico o de hecho en
cualquier condicin neurolgica. Se encontr que CSF1 induce en lesionada sensorial y
motoneuronas es, de hecho, la in vivo
seal que transforma la microglia de un residente, estado homeosttico en uno de proliferacin.
Como no se requiere sealizacin CSF1R para microglia development25 embrionario, nuestros
resultados indican que la proliferacin de adultos microglia inducida por la lesin y la autorenovacin recapitula la va CSF1R mediada que es activa en clulas madre embrionarias. Sin
embargo, aunque se requiere DAP12 para la proliferacin inducida por CSF1 de los
macrfagos derivados de mdula sea en vitro39, encontramos que asociados con lesiones del
nervio y proliferacin de microglia inducida por CSF1 in vivo son DAP12 independiente.
Claramente, la va de transduccin de seales que opera en microglia adulto in vivo es muy
diferente de la va que los estudios in vitro han identificado a partir de macrfagos derivados de
mdula sea
activacin y proliferacin microglial inducida CSF1
la proliferacin basado en la auto-renovacin de activacin de la microgla despus de la lesin
del nervio se concluye normalmente de una mayor expresin de marcadores especficos de
microglia, en particular CD11b o Iba1, pero de la microglia tambin es una manifestacin
importante de su activacin. Distinguimos dos biomarcadores de la activacin de la microgla
(Fig. 13 Complementario). Dentro de 1 d de lesin del nervio, antes de la proliferacin de
microglia (incorporacin de BrdU) producido, documentamos una induccin DAP12
dependiente de los genes de la microgla, incluyendo muchos implicados en el dolor
neuroptico. Entre estos genes fueron CTSS, que codifica los gatos, la proteasa que es
liberada por microglia activada para escindir fractalquina de membrane8 neuronal, y BDNF, que
se registra para ser liberado de la microgla, lo que resulta en un cambio del gradiente de
aniones de las neuronas de transmisin del dolor 33 .
Este cambio reduce el control inhibitorio GABA, lo que contribuye a la hiperexcitabilidad
subsiguiente 50. Slo en 2 das despus de la lesin del nervio no detectamos el marcador
BrdU de la proliferacin microglial. A diferencia de la regulacin positiva de genes microglial, sin
embargo, ni los nervios asociados con lesiones ni la proliferacin de microglia CSF1 inducida
es DAP12 dependiente. Se concluye que la
la expresin de novo de CSF1 despus de la lesin involucra dos procesos microgliales
distintas, una va de DAP12 dependiente para el gen de microglia
la regulacin positiva y el consiguiente dolor neuroptico, y una va independiente de DAP12
para la proliferacin de microglia / auto-renovacin. Dado que la va dependiente de DAP12 es
de suponer que tambin contratado por la microgla recin generado, sugerimos que interfiera
con esta va reducir tanto el residente y la proliferacin de microglia contribucin al fenotipo
dolor neuroptico