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NTE INEN 1529-13 (1998) (Spanish): Control

microbiolgico de los alimentos.
Enterobacteriaceae. Recuento en placa por
siembra en profundidad

INSTITUTO ECUATORIANO DE NORMALIZACIN

Quito - Ecuador

NORMA TCNICA ECUATORIANA

NTE INEN 1 529-13:98

CONTROL MICROBIOLGICO DE LOS

ENTEROBACTERIACEAE. RECUENTO EN
SIEMPBRA EN PROFUNDIDAD.

Primera Edicin

First Edition

DESCRIPTORES: Productos alimenticios, anlisis microbiolgico, contaje, enterobacteriaceae.

AL 01.05-310
CDU: 614.31:579.67:579.84
CIIU: 9320
ICS: 07.100.30

ALIMENTOS.
PLACA POR

CDU: 614.31:579.67:579.84
ICS: 07.100.30

Norma Tcnica
Ecuatoriana
Opcional

CIIU: 9320
AL 01.05-310

CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS ALIMENTOS.

ENTEROBACTERIACEAE. RECUENTO EN PLACA POR
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

NTE INEN
1 529-11:98
1998-01

Instituto Ecuatoriano de Normalizacin, INEN Casilla 17-01-3999 Baquerizo Moreno E8-29 y Almagro Quito-Ecuador Prohibida la reproduccin

1. OBJETO
1.1 Esta norma describe el mtodo de recuento en placa por siembra en profundidad para
determinar el nmero de clulas viables de Enterobacteriaceae presentes en un gramo o
centmetro cbico de muestra.
2. ALCANCE

2.1 Este mtodo es indicado para productos que contengan una alta carga de Enterobacteriaceae.

3. DEFINICIONES

3.1 Enterobacteriaceae. Familia de microorganismos, cuyos miembros son bacilos Gram negativos
mviles por flagelos peritricos o inmviles, capsulados o no, no esporulados, aerobios y
anaerobios facultativos; fermentan la glucosa generalmente con produccin de gas, reducen los nitratos a
nitritos; son catalasa positivos, excepto un serotipo de shiguela; son oxidasa negativos,
comensales, saprofitos, o patgenos intestinales.
3.2 Recuento de Enterobacteriaceae. Es la determinacin del nmero de colonias tpicas de
3
Enterobacteriaceae que se desarrollan a partir de un gramo cm de muestra, utilizando medios
selectivos.
4. RESUMEN

4.1 Este mtodo se basa en la capacidad de las Enterobacteriaceae, de producir cidos a partir de
la glucosa, y utiliza la tcnica del recuento en placa por siembra en profundidad, en agar

cristal violeta-rojo neutro-bilis-glucosa (VRBG) o similar, y una temperatura de incubacin de 37 1 C.

5. MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO

5.1 Materiales. La vidriera debe resistir esterilizaciones repetidas y todo el material debe estar
perfectamente limpio y estril.
3

5.1.1 Pipetas serolgicas de punta ancha de 1, 5 y 10 cm graduadas en 1/10 de unidad.

5.1.3 Incubador regulable, rango de temperatura de 25 a 70 1 C.

5.1.4 Autoclave

(Contina)
DESCRIPTORES: Productos alimenticios, anlisis microbiolgico, contaje, enterobacteriaceae
-1-

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1998-01

5.1.5 Balanza de capacidad no inferior a 2.500 g y de 0,1 g de sensibilidad.

5.1.6 Contador de colonias
3

5.1.7 Frascos de boca ancha de 250, 500 y 1000 cm con tapas de rosca autoclavables.
5.1.8 pH-metro
5.1.9 Erlenmeyer de 500 y 1000 cm

5.1.10 Papel Whatman No. 2 en cuadrados o tiras pequeas.

5.2 Medios de cultivo y reactivos: ver NTE INEN 1529-1. Preparacin de medios de cultivo.
5.2.1 Caldo triptona soya (CTS).
5.2.2 Medio glucosa sal
5.2.3 Agar nutritivo
5.2.4 Agar cristal vileta-rojo neutro-bilis-glucosa (VRBG).
5.2.5 Solucin acuosa al 1 % de dihidrocloruro de tetrametil - parafenilen - diamina.
5.2.6 Vaselina lquida estril.
6. PREPARACIN DE LA MUESTRA

6.1 Preparar la muestra segn uno de los procedimientos indicados en la NTE INEN 1 529-2. Toma y preparacin
de muestras.

7. PROCEDIMIENTO

7.1 Revitalizacin de las Enterobacteriaceae. Agitando de vez en cuando, mantener los tubos de las

diluciones decimales a temperatura del laboratorio (20 a 25 C), por dos horas. Esta etapa aplicar a
alimentos que han sufrido tratamientos de conservacin (qumicos o fsicos).
-1

7.1.1 Realizar las diluciones en caldo soya triptona a partir de la suspensin madre (10 ); utilizar una nueva
pipeta estril para cada dilucin.
7.2 Siembra. Utilizando una pipeta estril, de cada una de las diluciones decimales pipetear, por
3
duplicado, alcuotas de 1 cm en placas Petri adecuadamente identificadas. Iniciar por la dilucin de
menor concentracin.
3

7.2.1 Inmediatamente, verter en cada una de las placas inoculadas aproximadamente 20 cm de agar

'VRBG" previamente fundido y templado a 45 2 C.

(Continua)
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7.2.2 Delicadamente, mezclar el inculo de siembra con el medio de cultivo, imprimiendo a la

placa movimientos de vaivn, 5 veces en una direccin; hacerla girar cinco veces en sentido de las agujas de
reloj; repetir este proceso, pero en sentido contrario.

7.2.3 Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 37 C por 16 a 18 horas.

7.3 Recuento de colonias

7.3.1 Lectura. Pasado el tiempo de incubacin, si es posible, seleccionar las placas de dos diluciones
consecutivas que presenten entre 15 y 150 colonias caractersticas y examinar con luz
transmitida. Contar todas las colonias prpura, rodeadas generalmente de un precipitado tambin de color
prpura. Anotar el nmero de colonias y la respectiva dilucin.
7.3.2 Si en la mitad o en ms de la mitad de la superficie de las placas hay crecimiento
invasivo desechar la placa. Si menos de la mitad de la superficie est cubierta, contar las colonias en la parte
clara y extrapolar de tal manera que el nmero corresponda a la superficie total de la placa.
7.3.3 Si las placas de todas las diluciones contienen ms de 150 colonias, contar en las placas
inoculadas con la menor cantidad de muestra.
7.4 Seleccin de colonias. siempre que se requiere de ensayos confirmatorios, stos
deben ser realizados a partir de colonias previamente seleccionadas y purificadas.
7.4.1 Del total de colonias tpicas, presuntas, seleccionar las bien aisladas, en un nmero equivalente a la raz
cuadrada, con un mnimo de cinco.
7.4.2 A cada una de estas colonias inocularlas individualmente, en tubos que contengan agar nutritivo inclinado

o PCA. Incubar a 37 C por 24 1 h.

7.4.3 Hacer extensiones de stos subcultivos, comprobar su pureza (solo bacilos Gram negativos) y
utilizarlos para realizar pruebas complementarias.
7.5 pruebas complementarias
7.5.1 Prueba de la oxidasa: sobre un vidrio o dentro de una placa Petri colocar un cuadrado o tira de papel
filtro, humedecerlo con unas gotas de la solucin de dihidrocloruro de tetrametil para
fenilendiamina. Cuidadosamente, sobre este papel frotar un asa del cultivo 7.4.3, haciendo una
pequea raya. Es positiva si aparece un color prpura oscuro en 5 a 10 segundos. Las
enterobacterias tienen reaccin negativa.
7.5.2 Prueba de la utilizacin de la glucosa: en un tubo de medio glucosa sal, con aguja sembrar por
picadura el subcultivo en agar nutritivo (7.4.3); luego, cubrirlo con vaselina lquida estril. Incubar

a 37 C por 24 h. La reaccin es positiva si el color del medio cambia a amarillo. Las

enterobacterias tienen reaccin positiva. La mayora de las cepas producen gas.
7.5.3 Cuando se desea conocer otras propiedades de las cepas de enterobacterias aisladas se
debe realizar las respectivas pruebas bioqumicas.

(Continua)
-3-

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8. CALCULOS

8.1 Caso se realicen pruebas complementarias, calcular basndose en el nmero de colonias

confirmadas en relacin al nmero total de las colonias tpicas contadas (presuntas
enterobacterias) y si por lo menos, el 80% de las colonias tpicas sometidas a las pruebas
complementarias son confirmadas como Enterobacteriaceae, tomar el nmero de colonias tpicas
contadas en 7.3 como el nmero de enterobacterias por placa.

8.2 Clculo del nmero (N) de unidades formadoras de colonias (UFC) de

Enterobacteriaceae por centmetro cbico gramo de muestra. Utilizar la siguiente frmula:
N=

nmero total de colonias contadas o calculadas

Cantidad total de muestra sembrada

N=

C
V (n1 + 0,1n 2 )d

En donde:
C = suma de las colonias de enterobacterias contadas o calculadas en todas las placas elegidas;
n1

= nmero de placas contadas de la primera dilucin seleccionada;

n 2 = nmero de placas contadas de la segunda dilucin seleccionada;

2

= dilucin de la cual se obtuvieron los primeros recuentos, por ejemplo 10- ;

= volumen del inculo sembrado en cada placa.

Ejemplo:
Volumen sembrado

= 1 cm

Dilucin 10

-2

= 160 y 140 colonias

Dilucin 10

-3

= 33 y 28 colonias

Nmero

160 + 140 + 33 + 28
1 (2 + 0,1 x2) 10 -2

361
0,022

= 16 409 expresar como 1,6 x 10

8.3 Redondeo de nmeros. El valor obtenido redondear a dos cifras significativas, de la siguiente
manera (NTE INEN 52):
8.3.1 Si el tercer dgito, empezando por la izquierda es menos de cinco, mantener inalterado el
segundo dgito y reemplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el valor calculado fuere 16
4
409, redondearlo a 16 000 y expresar como 1,6 x 10 . Si el tercer dgito, empezando por la
izquierda es superior a cinco, aadir una unidad al segundo dgito. Por ejemplo, si el valor obtenido
4
fuere 16 900, redondearlo a 17 000 y expresar como 1,7 x 10 .
(Contina)
-4-

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8.3.2 Si el tercer dgito empezando por la izquierda es igual a cinco y es seguido de por lo menos, un dgito,
aadir una unidad al segundo dgito y reemplazar por ceros los restantes. Por ejemplo, si el valor
4
obtenido fue 16 540, redondearlo a 17 000 y expresar como 1,7 x 10 . Si el tercer dgito es igual a cinco y no
le sigue otro (s) dgito (s), lo es solo por ceros, aadir una unidad al segundo dgito, si ste es
2
impar; si es par cero, conservarlo inalterado. Ejemplo, 175 redondear a 180 y expresar como 1,8 x 10 ; 16
4
500 redondear a 16 000 y expresar como 1,6 x 10 .

8.4 Presentacin de resultados

8.4.1 Presentar el resultado como nmero N de unidades formadoras de colonias UFC de

3
Enterobacteriaceae por cm g de muestra utilizando solo dos cifras significativas multiplicadas por
x
10 , donde x es la respectiva potencia de 10.

8.4.2 Si no hay desarrollo de colonias de enterobacterias en las placas de la dilucin ms

concentrada, presentar el resultado como nmero estimado (NE) de UFC de Enterobacteriaceae
menor que (<) 1,0 multiplicado por el respectivo factor de dilucin f. (valor inverso de la dilucin de la
-1
muestra). Ejemplo, si la dilucin ms concentrada corresponde a 10 , el resultado se presentar
as:
3

NE de UFC de Enterobacteriaceae/cm g = < 1,0 x 1,0

8.4.3 Si no hay desarrollo de colonias de enterobacterias en las placas sembradas con 1 cm de

muestra no diluida (producto original lquido), expresar el resultado de la siguiente manera:
3

NE de UFC de Enterobacteriaceae/cm = < 1,0 x 1,0

8.4.4 Si las placas sembradas con la dilucin menos concentrada (productos slidos o lquidos)
presentan ms de 150 colonias, expresar el resultado de la siguiente manera:
3

NE de UFC de Enterobacteriaceae/cm g = >al valor obtenido x f

Indicar entre parntesis la dilucin utilizada. Este resultado sirve como gua para decidir el nmero de
diluciones que se han de realizar en ensayos posteriores y, la decisin de aceptacin o rechazo de una partida
de alimentos debe basarse solo en valores N.

9. PRECISION DEL METODO

9.1 Repetibilidad del recuento de colonias y error personal.

9.1.1 Los resultados obtenidos por la misma persona al contar por segunda vez las colonias de una
misma placa, no deben variar en ms del 5% y del 10% cuando es realizado por otra persona.
9.1.2 El mtodo de clculo relacionando el nmero total de colonias contadas en las placas de dos
diluciones consecutivas con el total de la muestra sembrada, aumenta la precisin del resultado.
Sin embargo, solo por razones estadsticas, en el 95% de los casos los lmites de confianza para la tcnica del
recuento en placa vara de 16% a 52%, este intervalo se ampla para los recuentos de colonias menores de 15
por placa. En la prctica, se puede encontrar una mayor variacin, especialmente entre resultados obtenidos por
diferentes analistas.

(Continua)
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10. INFORME DEL ENSAYO

10.1 En el Informe del ensayo Indicar la norma de referencia, la temperatura de incubacin, los
resultados obtenidos, todas las condiciones operativas no especificadas en esta norma o aquellas
consideradas como opcionales y los incidentes que puedan haber influenciado en el resultado.
Adems, se debe Incluir toda la informacin necesaria para la completa Identificacin de la muestra.

(Continua)
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APNDICE Z

Z.1 DOCUMENTOS NORMATIVOS A CONSULTAR

Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 52:73

Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529.1:94
Norma Tcnica Ecuatoriana NTE INEN 1 529.2:94

Reglas para redondear nmeros

Control microbiolgico de los alimentos.
Preparacin de medios de cultivo.
Control microbiolgico de los alimentos. Toma y
preparacin de muestras

Z.2 BASES DE ESTUDIO

Norma Britnica BS 5763: Part 1: 1991 (ISO 4833: 1991) Methods for Microbiological Examination of Food and

Animal Feeding Stuffs. Enumeration of microorganisms. Colony count technique at 30 C. British Standards
Institution. London, 1991.
Norma Britnica BS 5763: Part 10: 1986 (ISO 7402 - 1985). Mic r obiologic al Examination of Food and
Animal Feeding stuffs. Enumeration of Enterobacteriaceae. British Standards Institution. London, 1986.
Norma Britnica BS 4285: Section 2.1: 1984 Microbiological Examination for Dairy Purposes. Section 2.1
Enumeration of microorganisms by poured plate technique for colony count. British Standards Institution.
London, 1984.
Norma Internacional ISO 5552: 1979. Meat and meat products. Detection and Enumeration of
Enterobacteriaceae (Reference methods). International Organization for Standardization. Switzerland, 1979.
Mossel, D.A.A., Moreno Garca B. "Microbiologa de los Alimentos',1ra. Edicin Espaola. Acribia, Zaragoza
- Espaa, 1982.
Centro Nacional de Alimentacin y Nutricin. "Mtodos de Examen Microbiolgico para Alimentos y Bebidas",
Normas recomendadas. Manual Prctico, Madrid 1976.
Mossel D.A.A, Quevedo F. "Control Microbiolgico de los Alimentos". Universidad Nacional Mayor de San
Marcos. Lima, Per.
ICMSF. "Microbiologa de los Alimentos 1 - Tcnicas del Anlisis Microbiolgico". Acribia Zaragoza Espaa.

-7-

1994-043

INFORMACIN COMPLEMENTARIA
Documento:

TITULO: CONTROL MICROBIOLOGICO DE LOS

Cdigo:
ALIMENTOS. ENTEROBACTERIA CEAE. RECUENTO EN
AL 01.05-310
PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD
ORIGINAL:
REVISIN:
Fecha de iniciacin del estudio:1992-10-08
Fecha de aprobacin anterior por Consejo Directivo
Oficializacin con el Carcter de
por Acuerdo No.
de
publicado en el Registro Oficial No.
de
NTE INEN 1529-13

Fecha de iniciacin del estudio:

Fechas de consulta pblica: de

Subcomit Tcnico: Control microbiolgico de los alimentos

Fecha de iniciacin: 1993-08-02
Integrantes del Subcomit Tcnico:

Fecha de aprobacin:1994-05-31

NOMBRES:

INSTITUCIN REPRESENTADA:

Dr. Ramiro Gallegos (Presidente)

Dr. Hugo Ayala

SUBDIRECTOR TECNICO
DIRECCION DE CERTIFICACION Y CONTROL
DE CALIDAD
DIRECCION DE PROTECCION AL
CONSUMIDOR
DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,
MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS
DIRECCION DE PROTECCION AL
CONSUMIDOR Y DIRECCION DE
NORMALIZACION
DIRECCION DE ENSAYOS QUIMICOS,
MICROBIOLOGICOS Y BROMATOLOGICOS

Ing. Enrique Troya

Bioq. Elena Larrea
Ing. Bolvar Cano

Dra. Hipara Navas S. (Secretaria Tcnica)

Otros trmites:
El Consejo Directivo del INEN aprob este proyecto de norma en sesin de 1995-01-10
Oficializada como: OPCIONAL
Registro Oficial No. 229 de 1998-01-06

Por Acuerdo Ministerial No. 0426 de 1997-12-29