Académique Documents
Professionnel Documents
Culture Documents
Unlike standard DNA polymerases (such as Taq DNA polymerase), high-fidelity PCR
enzymes generally provide a 3' to 5' exonuclease activity for removing incorrectly
incorporated bases. High-fidelity PCR enzymes are ideally suited to applications
requiring a low error rate, such as cloning, sequencing, and site-directed
mutagenesis. However, if the enzyme is not provided in a hot-start version, the 3' to
5' exonuclease activity can degrade primers during PCR setup and the early stages
of PCR. Nonspecific priming caused by shortened primers can result in smearing on
Each PCR cycle consists of template denaturation, primer annealing and primer
extension. If the temperatures for annealing and extension are similar, these two
processes can be combined. Each stage of the cycle must be optimized in terms of
time and temperature for each template and primer pair combination.
Tidak seperti DNA polimerase standar (seperti Taq DNA polymerase), enzim PCRkesetiaan yang tinggi umumnya memberikan aktivitas 3 'ke 5' exonuclease untuk
menghapus basis tidak benar dimasukkan. enzim PCR tinggi kesetiaan ideal untuk
aplikasi yang memerlukan tingkat kesalahan rendah, seperti kloning, sekuensing,
dan mutagenesis situs-diarahkan. Namun, jika enzim tidak disediakan dalam versi
hot-start, aktivitas 3 'ke 5' exonuclease dapat menurunkan primer selama setup
PCR dan tahap awal PCR. priming nonspesifik yang disebabkan oleh primer
dipersingkat dapat mengakibatkan mengolesi pada kegagalan gel atau amplifikasi terutama ketika menggunakan jumlah rendah template. Perlu dicatat bahwa fungsi
proofreading sering menyebabkan enzim tinggi kesetiaan untuk bekerja lebih
lambat dari DNA polimerase lainnya. Selain itu, fungsi A-Selain diperlukan untuk UAlangsung atau TA-kloning sangat berkurang, sehingga kebutuhan untuk tumpul-end
kloning dengan ligasi lebih rendah dan efisiensi transformasi.
PCR bersepeda
Dalam teori, setiap siklus PCR menggandakan jumlah amplikon dalam reaksi. Oleh
karena itu, 10 siklus kalikan amplikon dengan faktor ~ 1000 dan seterusnya.
Setiap siklus PCR terdiri template denaturasi, annealing primer dan ekstensi primer.
Jika suhu untuk anil dan ekstensi mirip, kedua proses ini dapat dikombinasikan.
Setiap tahap siklus harus dioptimalkan dalam hal waktu dan suhu untuk setiap
template dan kombinasi pasangan primer.