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LABORATORIO DE INGENIERA BIOQUMICA III

PRCTICA No. 5
FERMENTACIN Y PRODUCCION ENZIMTICA EN BIORREACTORES
Cada equipo de alumnos montar un reactor de los siguientes:

Reactor por lote


Reactor Intermitente Alimentado
Reactor Empacado, Fluidizado con recirculacin

Esta prctica tiene como duracin 72 a 96 horas y al final los alumnos analizan sus datos
con las herramientas tericas que han aprendido, comparte y compara datos entre
equipos y obtiene sus conclusiones. El alumno comprobar como la manera de poner en
contacto a los sustratos y microorganismos influye en la productividad. Verificar que hay
diferencias tambin entre los sistemas con clulas inmovilizadas y libres
OBJETIVO
Llevar a cabo una fermentacin en biorreactores continuos y semicontinuos con
diferentes configuraciones evaluando las caractersticas de cada sistema utilizado.
Medir la produccin enzimtica de un hongo termoflico
Comparar la productividad y rendimiento en cada reactor

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MATERIALES
Celdas de Acrlico (Profesor)
Espectrofotmetro
Gradilla
Tubos de ensaye de vidrio

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Horadador
Microesptula
Bomba Peristltica (profesor)
Parrilla Elctrica

Tubos de Ephendorf de 1000L

Soporte Universal

Probeta de 50 mL
Vaso de precipitados de 1000 mL
Canastilla para Autoclave y Vlvula
Micropipeta de 100-1000L
Micropipeta de 10-100L
Piceta con agua destilada
Vortex
Matraz aforado de 25 mL
Palangana
Matraz Kitazato de 1 L

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Tubos de Vidrio
T de Vidrio
Papel Seda
Puntas para Micropipeta (profesor)
Parafilm
Mangueras de ltex
Pipetas pasteur
REACTIVOS
2,6 dimetoxifenol (2,6DMP) (profesor)
Acido
2,2-Azinobis
etilen
benzen
sulfonico
Reactivo de Bradford (profesor)
Fosfato monobasico de potasio
Fosfato dibsico de potasio
ALUMNOS
Cinturones de plstico
Jeringas de 5mL
Tijeras
Franela
Maskintape y Plumn con tinta Indeleble

Matraz Erlenmeyer de 2 L
Matraz Kitazato de 125 mL
Tapones de Hule
Agitador Magntico
Cristalizador
Nuez de sujecin
Pinzas de Tres dedos
Columna de Vidrio

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LABORATORIO DE INGENIERIA BIOQUIMICA III

PREPARACIN DE SOLUCIONES (traer clculos de la soluciones)


(UN ALUMNO DE CADA EQUIPO SE PRESENTARA AL LABORATORIO PREVIO A LA PRACTICA )
A. 1000 mL de Solucin amortiguador de fosfatos 50 mM, a pH 6.0.
B. Solucin de Sustrato enzimtico2: 10 mL de solucin de Acido 2,2-Azinobis etilen
benzen sulfonico (ABTS) 10mM, en amortiguador de fosfatos a pH 6.0
C. Inmovilizacin de Clulas: Mezclar el contenido de un matraz semilla de hongo (que el
profesor proporcionar) con 100 mL de solucin isotnica estril en el matraz de 250
mL. En un vaso de precipitados de 1000 mL poner a ebullicin 250 mL de agua
destilada y disolver poco a poco 7.5 g de Agar, sin que se forme espuma. Dejar enfriar
hasta 50C en un bao a temperatura controlada y llevar el inoculo a esta misma
temperatura. Mezclar suavemente ambos en el vaso de precipitados, sin producir
burbujas. Por otro lado mantener agua destilada a 15C en un cristalizador que es
colocado en bao de hielo en una palangana. Llenar una pipeta Pasteur despuntada
con la mezcla y verter gotas en el recipiente con el agua fra, formando perlas de
tamao y forma regulares, agitando el agua para evitar que las perlas se peguen.
Eliminar las perlas que floten en la superficie y recuperar las perlas por decantacin o
por filtracin. Lavar dos o tres veces con solucin salina estril y mantenerlas en esta
solucin. Esta cantidad de biomasa inmovilizada es suficiente para los reactores
empacado fluidizado y de mezcla completa para esta prctica y la siguiente.
PROCEDIMIENTO
Primera parte (sesion 1): Montar previamente el equipo de acuerdo a los siguientes
esquemas, cuidando de revisar conexiones y el transporte de fluido. En este reactor un
equipo trabajar con biomasa libre y otros con biomasa inmovilizada (ver practica 4,
seccin de inmovilizacin de clulas)
REACTOR INTERMITENTE ALIMENTADO/BIOMASA INMOVILIZADA O LIBRE:

Celda

Bomba
Peristltica

Biomasa
Inmovilizada

REACTOR EMPACADO FLUIDIZADO CON RECIRCULACION


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Lecho de
Biomasa

Salida y Muestreo
Alimentacin
estril

Bomba
Peristltica

Bomba
Recirculacin

REACTOR LOTE O BATCH CON BIOMASA INMOBILIZADA O LIBRE

jeringa
Filtro

Celda

Biomasa
Inmovilizada

Segunda Parte (sesin 2): Inoculacin y Arranque de los Biorreactores


Agregar las perlas de agar preparadas al reactor en una cantidad que represente 20% del
volumen til para el reactor de intermitente y el reactor por lote. El reactor empacado
requiere al menos 2/3 partes del volumen de perlas de agar.

Para los reactores de biomasa libre inocularlos con 250 mL de un cultivo de hongos que
proporcionar el profesor. Completar el llenado con medio de cultivo estril, y alimentar
el reactor por medio de una bomba peristltica a 5 mL/min, e iniciar la agitacin en el
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caso del reactor de mezcla completa y Batch. Preparar la cantidad de medio suficiente
para mantener los reactores con alimentacin continua por lo menos 72 horas.
Muestreo
Para los reactores continuos tomar muestras cada dos horas a la salida y para el reactor
por lote, a travs de una jeringa acoplada a un filtro estril, tomar 1 mL de muestra y
almacenarlo en congelacin para su determinacin posterior. Hay que tener cuidado de
etiquetar cada muestra y anotar el tiempo de fermetancin a la que fue saliendo.
Tercera Parte (sesin 3): Medicin de la Actividad Enzimtica
Para cada una de las muestras medir la actividad enzimtica, utilizando como sustrato
una solucin de ABTS 5 mM y amortiguador de fosfatos a pH 6.0. Tambin determinar la
cantidad de protena total producida de cada una de las muestras obtenidas de los
reactores a travs del mtodo de Bradford, utilizando la metodologa de la practica 1
(DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECFICA DE LA ENZIMA LACASA).
PREREPORTE
Cada equipo entregar al profesor los resultados de las absorbancias del Ensayo
Enzimtico y de la protena cuantificada por tiempo de fermentacin para cada reactor.
RESULTADOS Y DISCUSIN
a)

Con los resultados obtenidos para cada reactor, obtener la grfica la actividad
enzimtica especfica de la enzima respecto al tiempo.
b)
Aplicar la ecuacin logstica de produccin y graficar los datos contra el tiempo
c)
Comparar la productividad y eficiencia enzimtica (Y E/X) en cada reactor
d)
Predecir si la enzima en constitutiva o vinculada al crecimiento
e)
En ANEXOS: Mostrar en forma adecuada y entendible todos los clculos efectuados
para las secciones a, b y c.
CUESTIONARIO
1. Describir los distintos tipos de reactores biolgicos
2. Describir el reactor que esta operando y compararlo con el reactor ideal ms cercano
3. Aplicaciones industriales del tipo de reactor utilizado
4. Balances de Materia y Ecuaciones de operacin de cada reactor
BIBLIOGRAFA
1) Aiba S., Humphrey A. E. y Millis N. F. (1973) Biochemical Engineering, Second Edition.
Academic Press Inc. London.
2) Segel C. (1976) Enzyme Kinetics. Edition, John Wile & Sons. NY, USA.
3) Wang D. I., Cooney C. L., Demain A. L., Dunnill P., Humphrey A. E. and Lilly M. D.
(1979) Fermentation and Enzyme Technology. John Wiley & Sons. NY. USA.
4) Levenspiel O. (2009) Ingeniera de las Reacciones Qumicas, tercera edicin. Limusa.
Mxico.

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