FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES.

CUAUTITLN
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS
SECCIN DE BIOQUMICA Y FARMACOLOGA HUMANA
BIOQUMICA DIAGNSTICA
LABORATORIO DE GENTICA MOLECULAR

GRUPO: 2602
INFORME DE LA PRCTICA
6: AMPLIFICACIN DE UN FRAGMENTO DE DNA POR PCR
EQUIPO NMERO IV.
PRESENTAN:
DAZ QUIROZ MARA SOLEDAD
HERNNDEZ GMEZ MARJA ZOE
OLIVER ALMARZ CRUZ ALEJANDRO
ASESORES.
M. en C. NYDIA BERENICE GONZLES NGELES
QFB. ALEJANDRO GUTIRREZ GARCA
Dra. ANA PAOLA ROJAS MEZA
FECHA DE ENTREGA: 13 DE MAYO DE 2016

AMPLIFICACIN DE UN FRAGMENTO DE DNA GENMICO EXTRADO POR

PERCLORATO DE SODIO POR PCR
Cruz A. Oliver, Mara S. Daz, Marja Z. Hernndez1
1

Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Facultad de Estudios Superiores Cuautitln, Seccin de

bioqumica y Farmacologa Humana, Gentica Molecular.

Palabras clave:

RESUMEN

PCR, gen, amplificacin gentica,

temperatura de gradiente, primers,

La tcnica de PCR funciona amplificando un fragmento de DNA, auxiliada de la enzima

DNA polimerasa, esta ayuda a fabricar una cadena de DNA complementaria a la otra ya
existente. Para el presente estudio se determin la Temperatura de alineamiento (Ta)
mediante la tcnica de PCR de gradiente de temperaturas. La intencin de determinar la
Ta para poder amplificar el fragmento del gen SUFR1 que constaba de 380 pares de
bases (pb) partiendo del DNA genmico, permiti saber cules eran las condiciones
ptimas de trabajo. Gracias a la electroforesis se obtuvo el fragmento del gen SURF1,
arrojando una Ta optima de 60C

Key words:
PCR, gen, genetic amplification, temperatura
gradient, primers.

ABSTRACT
The PCR technique works amplify a DNA fragment, aided enzyme DNA polymerase, this
helps make a complementary DNA strand to the other existing. For the present study the
annealing temperature (Ta) is determined by the PCR temperature gradient. Intended to
determine the Ta to amplify the SUFR1 gene fragment consisting of 380 base pairs (bp)
starting from genomic DNA, which were allowed to know the optimal working
conditions. Thanks to electrophoresis SURF1 fragment gene was obtained, yielding an
optimal Ta of 60 C

INTRODUCCIN
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa, abreviada como PCR se emplea como una tcnica en donde se
amplifica in vivo fragmentos de DNA y fue diseada por Kary Mullis en 1984, el cual gan el premio Nobel
de Qumica gracias a esta idea en 1993.
Aunque las tcnicas de clonacin molecular son indispensables para la investigacin bioqumica moderna, la
PCR, a menudo es ms rpida y conveniente para amplificar un DNA especfico. Pueden amplificarse
segmentos de hasta 6kpb con esta tcnica (). En la tcnica de PCR, la muestra de DNA se separa en cadenas
simples y se incuba con DNA polimerasa, dNTP y dos cebadores de oligonucletidos cuyas secuencias
flanquean el segmento de DNA de inters. Los cebadores dirigen la DNA polimerasa para que sintetice cadenas
complementarias del DNA diana. () En cada ciclo, las cadenas de DNA dplex se separan por calor, los
cebadores se aparean con sus segmentos de DNA complementarios y la DNA polimerasa dirige la sntesis de las
cadenas complementarias.1
En la acualidad la PCR es una tcnica muy utilizada en investigacin biomdica, diagnostico en laboratorios
especializados y en estudios de evolucin biolgica. Son no tables su aplicacin en el estudio de medicina
forense y paternidad. Pero quizs el campo de mayor aplicacin y utilidad es en el diagnostico de enfermedades
infecciosas, activas o silentes. En especial, aquellas enfermedads cuyo diagnostico aun son difciles por los
mtodos convecionales, tal es el caso de Leishmania sp, Trypanosoma cruzi, VIH, Virus de la Hepatitis B y C,
Citomegalovirus, Papilomavirus, Brucella, entre otros3

MATERIALES Y MTODO
SUJETO DE ESTUDIO
El sujeto reclutado fue un hombre de 23 aos de edad cuyo DNA fue extrado de glbulos blancos mediante la
tcnica de perclorato de sodio, con una concentracin final de 20 ng/l.

METODOLOGA
Se encuentra especificada en el manual de Gentica Molecular del semestre 2016-II de la carrera de
Bioqumica Diagnstica.
Tcnica para la optimizacin de condiciones de amplificacin (PCR por gradiente), pgina 48 y 49.
Tcnica para la amplificacin del fragmento correspondiente a los exones 3 y 4 del gen SURF, pgina 49.

OBSERVACIONES Y RESULTADOS
El primer paso fue conocer las condiciones de PCR ptimas que permitiera la amplificacin del fragmento
correspondiente a los exones 3 y 4 del gen SURF1, mediante un gradiente de temperaturas de alineamiento en
un termociclador, con la adicin o no de formamida.

Se realiz una electroforesis en gel de agarosa al 1.2% para conocer experimentalmente la temperatura ptima
para la amplificacin del fragmento de inters. El resultado se muestra en la figura 1.
Asimismo, se realiz una comparacin de las temperaturas ptimas (Ta) y temperaturas de disociacin (Tm)
obtenidas por un mtodo bioinformtico y por medio de la frmula de Wallace. Los resultados se muestran en
la tabla 1.
Una vez establecida la temperatura ptima, se efectu la amplificacin del fragmento correspondiente a los
exones 3 y 4 del gen SURF1 en la muestra de DNA extrada por perclorato de sodio. Posteriormente se llev a
cabo une electroforesis en gel de agarosa al 1.2 %, con dicha muestra. El resultado obtenido se muestra en la
imagen 2.
Para corroborar que las condiciones de los reactivos fueran las adecuadas, se llev a cabo una electroforesis en
gel de agarosa al 1.2% bajo las mismas condiciones impuestas de la muestra de DNA genmico y el DNA
control. El resultado se plasma en la figura 3.
M 53 55 57 60 63 65

53 55 57
F

Figura 1. Fotografa de la electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de DNA genmico control para la
optimizacin de condiciones de amplificacin.
La fotografa fue tomada por el sistema generador de imgenes SmartView Pro.
Las temperaturas estn dadas en grados Celsius.
La letra M indica el carril del marcador de peso molecular, las temperaturas en la parte superior de la imagen son las
correspondientes a la etapa de unin de la muestra sin formamida. Las tres temperaturas expresadas en la parte inferior de
la imagen son aquellas adicionadas con formamida.
Se eligi la Ta experimental de 60 al tener slo una banda y no se notan productos inespecficos.

Tabla 1.Determinacin de Tm y Tapara la amplificacin del fragmento correspondiente a los exones 3 y 4 del
gen SURF mediante el mtodo experimental, bioinformtico y por la frmula de Wallace.
Mtodo

Tm Foward

Tm Reverse

Ta obtenido

Frmula de Wallace

64C

56 C

59C

Bioinformatico

63.38C

54C

58.38C

Experimental

60C

Tm se refiere a la temperatura donde el 50% del DNA esta desnaturalizado y es ideal para garantizar la hibridacin. Dicho
parmetro est dado con la secuencia de los primers foward y reverse, y por la regla de Wallace Tm = 2(A+T)+4(G+C).
Aunado a esto la Ta fue calculada mediante el Tm Foward por la frmula Ta=Tm-5.
En cuanto al mtodo bioinformtico los valores obtenidos de Tm y Ta se obtuvieron mediante la pgina de la NCBI.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primerblast/primertool.cgi?ctg_time=1463021458&job_key=UkmlH6EVCDE3AzMNUiMBc0kOM2JaES5n
En el mtodo experimental, se obtuvo la Ta basado en el PCR de gradiente, siendo sta de 60 C.

M 1

5 6

3 4

Figura 2. Fotografa de la electroforesis en gel de agarosa al 1.2% de DNA genmico de leucocitos

extrado por el mtodo de perclorato de sodio para la amplificacin del fragmento correspondiente a los
exones 3 y 4 del gen SURF.
La fotografa fue tomada por el sistema generador de imgenes SmartView Pro.
Las letra M corresponde a la corrida del marcador de peso molecular, los nmeros son los equipos de trabajo del
laboratorio de la materia. El carril de inters es el 4.

CN

CP

Figura 3. Fotografa de la electroforesis en gel de agarosa al 1.2% empleando un control negativo y un

control positivo.
La fotografa fue tomada por el sistema generador de imgenes SmartView Pro.
Las letras CN se refieren al control negativo y CP es el control positivo. ste ltimo indica que s se lleva a cabo la
reaccin.

DISCUSIN DE RESULTADOS
Controles
En cualquier PCR es muy importante utilizar siempre un control negativo (que contenga todos los reactivos
menos el DNA molde, en su lugar se agreg agua) y un control positivo (un DNA control que sabamos que
amplifica sin problemas bajo las condiciones establecidas). Este control es muy til para asegurarnos que los
reactivos ocupados se encuentran en condiciones apropiadas y para poder monitorear posibles
contaminaciones.2
Observando la figura 3. Se observa el control positivo con una sola banda, indicativa de la regin amplificada.
Se observa sin interferencias o productos inespecficos comparndolo con el control negativo. Se comprueba
que los reactivos y el termociclador son confiables para su uso y no se encuentran en mal estado.

Optimizacin de condiciones de amplificacin

El fin de dicha evaluacin es para demostrar la temperatura donde ocurra una buena amplificacin sin
interferencias.
Analizando la figura 1., en el caso de las muestras sin formamida a 53, 63 y 65C no hay nada en el carril y
por tanto no hubo polimerizacin. Dichas temperaturas no son las ptimas. Asimismo, se observ este
fenmeno en los carriles con las muestras con formamida, descartndose como opcin ideal para estar en la
muestra ni a las temperaturas establecidas. La formamida es un agente que ayuda a desnaturalizar la doble
cadena de DNA y estabiliza la cadena molde con el primer
En cambio, a 55 y 57C de las muestras sin formamida se observ mucha cantidad de material pero tambin
bastantes interferencias. Por lo tanto, no fueron seleccionadas como Ta.
A 60C se muestra una sola banda indicativa de la amplificacin y sin interferencias o productos inespecficos.
Es por esa razn que fue elegida como la Ta experimental.

Amplificacin del fragmento de inters

Lo ideal es que, al revelar el electroforegrama, slo se observe una banda indicativa de todas las copias de la
regin amplificada del gen, las cuales corren a la misma velocidad por ser iguales.
*Dos bandas: productos inespecficos (amplifica otra cosa, no esa regin)
*Analizar componentes de perclorato de sodio que cause interferencias. (sales y protenas afectan)
*El RNA no sale por que se degrad a los 94C

Se sabe que los mtodos tradicionales de extraccin del DNA son susceptibles de contaminacin, variacin y
errores por los mltiples pasos de manipulacin; al tiempo que se reduce el nmero de pasos en la extraccin y
se disminuye la posibilidad de contaminacin con ADN o ARN exgeno ().
Es por esto que Los reactivos utilizados para la extraccin fcilmente se acarrean con la muestra e interfieren
con aplicaciones posteriores.

CONCLUSIONES
No se logr obtener la amplificacin del fragmento correspondiente a los exones 3 y 4 del gen SURF,
esto se atribuye a la tcnica deficiente de extraccin de DNA, pues se encontraba contaminado, es por
esto que es de gran importancia realizar buenas prcticas pues Independientemente del mtodo de
extraccin que se utilice, lo importante es realizar cada paso con cuidado para obtener ADN integro y
puro que permita llevar a cabo las tcnicas posteriores
Para llevar a cabo una amplificacin de un fragmento de DNA, primero se debe disear primers, en
la actualidad el diseo de primers es sencillo con mtodos bioinformticos, tambin se deben conocer
las condiciones para una optimizacin adecuada de la amplificacin del fragmento de inters,
conociendo as la Ta ptima; en la experimentacin se logr comparar tres mtodos: bioinformtico,
experimental y la regla de Wallace, eligiendo la Ta experimental, cabe mencionar que los tres
mtodos arrojan valores similares.

REFERENCIAS
1

Voet D, Voet J. (2009). Fundamentos de bioqumica: la vida a nivel molecular. Buenos Aires: Mdica
Panamericana.
2

Serrato, A. (et. al.) (s.f.) PCR: reaccin en cadena de la polimerasa. Tomado el 11 de mayo de 2016 de
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/pcr.pdf
3

Frank J. (1998). Networking in Brucellosis Research II. Tokyo, Japan: The United Nations
University.
Strmer M., K. Kleesiek y J. Dreier. (2007). High-Volume Extraction of Nucleic Acids by Magnetic Bead
Technology for Ultrasensitive Detection of Bacteria in Blood Components. Clinical Chemistry 53: 104110.
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