BIOQUMICA ESTRUCTURAL Curso 2015-2016

PRCTICA 1:
EXTRACCIN Y SEPARACIN DE PROTENAS DE ORIGEN ANIMAL Y
VEGETAL
OBJETIVOS
Mediante una electroforesis vertical en geles de poliacrilamida (PAGE), se
visualizar el patrn de protenas de diferentes muestras de origen vegetal y
animal. De esta forma, se podr observar la diferencia de los patrones
electroforticos dependiendo del origen del extracto. La prctica se realizar en
un da, y consta de dos partes:
1. OBTENCIN DE EXTRACTOS PROTEICOS
Cualquier muestra que contenga protenas, desde organismos procariotas a
eucariotas, muestras de tejidos, muestras de suelo etc., pueden ser analizadas.
En el caso de muestras procedentes de tejidos o clulas, stas pueden ser
fraccionadas por mtodos mecnicos, y sometidas a diferentes procesos de
lisis y centrifugacin para separar compartimentos celulares y orgnulos.
En esta prctica se obtendrn extractos de tejidos vegetales y animales, a
partir de hojas y races de Tabaco y de msculo de pescado de diferentes
especies, Salmn y Merluza.
2. ELECTROFORESIS VERTICAL: SDS-PAGE
Es una tcnica ampliamente utilizada en bioqumica y biologa molecular que
permite separar las protenas segn su movilidad electrofortica. Los extractos
de protenas se mezclan con SDS, un detergente aninico que desnaturaliza
las protenas, rompiendo las interacciones hidrofbicas que mantienen la
estructura secundaria y terciaria, pero sin alterar los enlaces disulfuro. Adems,
y muy importante, confiere carga negativa a cada protena en proporcin a su
masa. El tampn de carga que se aade al extracto de protenas antes de
hervir contiene tambin -mercaptoetanol, que es un agente reductor que
rompe los enlaces disulfuro y desnaturaliza las protenas antes de ser cargadas
en el gel; de este modo se garantiza que la muestra se separe en cadenas
polipeptdicas individuales y migre de manera proporcional a su masa (Figura
1).

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MIGRATION

SAMPLE

STACKING GEL (4%)

Tris HCl pH 6,7
RESOLVING GEL (10-15%)
Tris HCl pH 8,9

Figura 1: Esquema de una electroforesis vertical SDS-PAGE

El gel est formado por poliacrilamida. La poliacrilamida se trata de un polmero

sinttico, transparente, resistente y relativamente inerte, que puede prepararse
con un amplio intervalo de tamaos medios de poro, lo que permite separar las
protenas por su peso molecular. Los tamaos de poro disminuyen cuando
aumenta el porcentaje.

Figura 2: Patrn de migracin de protenas segn su peso molecular en diferentes

porcentajes de acrilamida.

El sistema discontinuo SDS-PAGE se compone de dos partes: gel

concentrador y gel separador. El gel concentrador (parte superior) es un gel de
poliacrilamida con tamao de poro grande (4%). Este gel est preparado con
un tampn de Tris/HCl pH 6,8, dos unidades de pH menor que el tampn de
electroforesis (Tris/glicina). El objetivo de este gel es retener y concentrar la
muestra para que todas las protenas comiencen a migrar a la vez en el gel
separador. El gel separador est formado por poliacrilamida de poro pequeo

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(10 al 15% de acrilamida) disuelta en tampn Tris/HCl

pH 8,8. En el gel

separador, las macromolculas se separan de acuerdo a su tamao (masa).

Dependiendo del porcentaje de poliacrilamida empleado se separa un rango u
otro de pesos moleculares. Para conocer el tamao de las protenas, se utilizan
marcadores de tamao molecular conocido (Figura 3).

Figura 3: Ejemplo de marcador de tamao molecular de protenas en KDa.

3. TINCIN Y VISUALIZACIN DE LAS PROTENAS

Una vez separadas las protenas, deben fijarse y teirse para poder ser
visualizadas. Existen diferentes tinciones para visualizar las protenas, una de
las que ms se utiliza es la tincin azul de Coomasie. Este colorante es de tipo
aninico, y se une a protenas de modo inespecfico. Su estructura es
predominantemente no polar, por lo que tradicionalmente se prepara (al
0,025%) en disolucin con metanol (40%) y cido actico (7%). Las protenas
del gel se fijan gracias al cido actico y al mismo tiempo se tien de color azul.

Figura 4: Patrn electrofortico

de protenas de diferentes
especies de pescado.

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MATERIALES
Tampn de extraccin de protenas: 40mM Tris HCl pH7,5; 50mM NaCl;
0,1% SDS; 5mM EDTA
Tampn de carga de Laemmli (3x): 62,5mM Tris pH 6.8; 2% SDS; 10%
Glicerol; -Mercaptoetanol 5%; Azul de Bromophenol (0,06%)
Tampn de electroforesis 10x: 2,5 M Glicina; 250 mM Tris pH 8,8; 1% SDS
Solucin de teido: : Azul de Coomassie (0,025%) en disolucin con metanol
(40%) y cido actico (7%)
Solucin de desteido: agua destilada y desionizada
Microcentrfuga
Hielo
Vrtex
Tubos plsticos de 1,5 ml, tambin conocidos como tubos eppendorf
Micropipetas y puntas
Equipo de electroforesis de protenas
Guantes
PROCEDIMIENTO
1. Obtencin de extractos proteicos.
- Homogeneizar las muestras (Tejido de planta / Trozo de pescado del tamao
de un guisante aproximadamente), primero en seco y luego con 500 l de
Tampn de Extraccin de Protenas. Este procedimiento se realizar a
temperatura ambiente hasta destruccin total del tejido.
- Centrifugar los tubos a 14.000 rpm durante 5 min.
- Recoger 100 l de sobrenadante aquoso y transferir a un tubo nuevo.
(Importante: evitar arrastrar grasa o pedazos de tejido con la punta de la
pipeta).
2. Preparacin de las muestras proteicas para SDS-PAGE.
- Extracto proteico Vegetal:
Mezclar 20 l y el volumen necesario de tampn Laemmli 3X para lograr una
concentracin final 1X.
- Extracto proteico de Pescado:

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Mezclar 8 l y el volumen necesario de tampn Laemmli 3X para lograr una
concentracin final 1X.
- Hervir a 95-100C durante 5 min.
- Centrifugar 1 min a 12.000 rpm para concentrar el todo el volumen de
muestra.
3. Electroforesis vertical.
-

Montar las cubetas de electroforesis vertical de protenas (Figura 1).

Cargar en los pocillos todo el volumen de las muestras obtenidas en el

procedimiento 1 y 2.

Cargar un pocillo con marcador de peso molecular de protenas (5 l).

Aadir tampn de electroforesis en la cubeta. Poner la tapa.

Correr la electroforesis a 120 V durante 2 horas aproximadamente.

4. Lavado y tincin del gel, y visualizacin de la electroforesis.

- Sumergir el gel en la solucin de Coomassie y mantener en agitacin suave
durante 30 min aproximadamente. Las bandas de protenas aparecern a los
10-15 min.
- Desteir el gel en agua destilada y desionizada durante al menos una hora.