UNIVERSIDAD NACUONAL FEDERICO VILLAREAL

BIOLOGIA MOLECULAR I - 2016

CUESTIONARIO
1. Explique la funcin del EDTA, SDS y NaCl para extraccin de ADN

Sodio como detergente

SDS

Se usan diferentes formas de sodio en la extraccin de

ADN. El dodecilsulfato sdico, o SDS, es un detergente
que contiene sodio. Tiene la frmula qumica de
C12H25NaO4S, donde Na es sodio. Los detergentes se
usan para romper las paredes y membranas celulares.
Trabajan al golpear qumicamente agujeros en las
membranas o pareces celulares.
Una vez que los agujeros se golpean en las membranas,
stas pueden deshacerse mecnicamente, como con una
licuadora. Despus de eso, es ms fcil obtener los
contenidos de la clula, incluido el ADN.

A menudo es deseable precipitar el ADN plsmido para

poder concentrar su cantidad en solucin y para poder
llevarlo de regreso a una solucin que estabiliza su
estructura qumica. La sal que se utiliza para precipitar el
ADN plsmido puede ser cloruro de sodio o acetato de
sodio, por ejemplo, pero tambin puede ser acetato de
amoniaco o cloruro de litio.

Sodio en la precipitacin
del ADN
NaCl (cloruro de sodio)

El ADN, por otro lado, tiene altas cargas negativas. La

carga altamente negativa de la molcula de ADN es
neutralizada por los iones de sodio positivos en la
solucin. Esta neutralizacin de cargas negativas de ADN
permite que se precipite en alcohol. Sin la sal, el ADN
permanece cargado negativamente y estar en la parte
acuosa de la solucin.
Si esta mezcla se centrifuga, el ADN plsmido precipitado
se volver un perdign en el fondo del tubo. La porcin de
agua puede retirarse y el ADN puede regresar a la
solucin, o resuspenderse, en una solucin diferente en la
concentracin deseada.

Sodio como parte de la

solucin amortiguadora

El ADN normalmente se resuspende en una solucin que

contenga Tris y EDTA. Esto se llama solucin
amortiguadora. EDTA (por sus siglas en ingls) significa
cido etilendiaminotetraactico, y por lo general est en
el laboratorio como una sal disdica, Na2C10H16N2O8.
Los amortiguadores se usan para prevenir cambios
drsticos del pH, y en este caso, la solucin Tris/EDTA
mantiene el ADN en una solucin con un rango de pH
alrededor de 7.0 a 9.0

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2. Qu son la lisozima y la mutanolisina?

La lisozima, tambin llamada muramidasa, es una enzima de 14,4 kilodalton que
daa las clulas bacterianas catalizando la hidrlisis de las uniones beta 1,4 entre
los residuos de cido N-acetilmurmico y N-acetil-D-glucosamina en un
peptidoglicano. La lisozima es abundante en numerosas secreciones como la
saliva, las lgrimas y el moco. Est presente tambin en los grnulos
citoplasmticos de los neutrfilos polimorfonucleares PMN. Una gran cantidad de
esta enzima puede hallarse en las claras de huevo.
En el caso de la mutanolisina funciona de manera similar en otro tipo de
organismos como hongos.

3. Cul es la diferencia entre extraccin y purificacin de cidos nucleicos?

La extraccin consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y se
basa en las caractersticas fisicoqumicas de la molcula. El ADN est constituido
por dos cadenas de nucletidos unidas entre s formando una doble hlice. Los
nucletidos estn integrados por un azcar (desoxirribosa), un grupo fosfato y una
base nitrogenada (adenina, guanina, timina o citosina). La unin de los nucletidos
ocurre entre el grupo fosfato y el azcar, mediante enlaces fosfodister, dando
lugar al esqueleto de la molcula. Las bases de cadenas opuestas se unen
mediante puentes de hidrgeno y mantienen estable la estructura helicoidal.
Los grupos fosfato estn cargados negativamente y son polares, lo que le confiere
al ADN una carga neta negativa y lo hace altamente polar, caractersticas que son
aprovechadas para su extraccin. Los grupos fosfato tienen una fuerte tendencia a
repelerse, debido a su carga negativa, lo que permite disolver al ADN en
soluciones acuosas y formar una capa hidratante alrededor de la molcula. Pero,
en presencia de etanol, se rompe la capa hidratante y quedan expuestos los
grupos fosfato. Bajo estas condiciones se favorece la unin con cationes como
Na+ que reducen las fuerzas repulsivas entre las cadenas de nucletidos y
permiten que el ADN precipite Por otro lado, la carga neta negativa del ADN le
permite unirse a molculas y matrices inorgnicas cargadas positivamente.
4. Cul es la diferencia entre ADN genmico y ADN cromosmico?
ADN genmico
Secuencia de ADN cromosmico de un
gen o segmento de un gen que incluye
la secuencia de ADN que no codifica
as como las regiones codificantes.
Tambin se llama as el ADN que ha
sido aislado directamente de la clula o
cromosomas o las copias clonadas de
todo o parte del ADN

ADN cromosmico
Es el ADN que se encuentra
empaquetado en cromosomas con la
ayuda de protenas llamadas histonas
y se encuentra dentro del ncleo
celular

5. Para qu se realiza el macerado de la muestra biolgica?

La maceracin se usa para molerse finamente, tamizarse y mezclarse
homogneamente. Esta operacin debe hacerse rpidamente y con la mnima
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exposicin al medio ambiente. Evite su sobrecalentamiento durante el molido, por

lo cual materiales sensibles al calor debern ser molidos a mano. Este proceso es
para poder tener una muestra de una mezcla homognea y as obtener las
muestras lo ms puras posibles
6. Qu aplicaciones se permiten con las tcnicas de extraccin y
purificacin de ADN?

Son inmumerables las aplicaciones de estas tcnicas y quizs las ms usadas

hoy en dia, son la PCR seguida de una restriccin con enzimas y deteccin de
los fragmentos en un gel o seguidas de un gel de poliacrilamida que tiene ms
definicin para la separacin de fragmentos de pocas bases de diferencias.
Cuando se usa PCR y enzimas de restriccin se denominan PCR/RFLP (derivado
de variacin en la longitud de los fragmentos de restriccin en ingls).

Esta tcnica puede usarse entre otras cosas para deteccin de alelos de un
gen normales y mutados (enfermedades hereditarias) o para distinguir cepas
bacterianas o virales o alelos ms favorables para una caracterstica de inters
productivo para luego aplicarlo a la seleccin.

En el caso de los test de paternidad hoy en da se hacen por PCR seguida de

un anlisis de unos 9 VNTRs (numero variable de repeticiones en tandem) en
una misma reaccin seguida de la visualizacin en geles de poliacriliamda con
la ayuda de un secuenciador automtico.

Usos en la criminologa o medicina forense en este caso con Southern blot y

RFLP

7. Consulte otras tcnicas o kit de extraccin de ADN y explique el

fundamento de una de estas, especificando el uso de los reactivos claves
Cromatografa de adsorcin. Se basa en la adsorcin y desorcin de los
cidos nucleicos en presencia de sales caotrpicas. Bajo condiciones nativas, los
cidos nucleicos estn recubiertos de una capa hidratante de molculas de agua
que mantienen la solubilidad del DNA en soluciones acuosas. Con la adicin de
iones caotrpicos a los cidos nucleicos, se destruye esta ordenada estructura de
molculas de agua de la capa hidratante, por lo que las sales caotrpicas crean un
entorno hidrofbico alrededor del DNA. Bajo estas condiciones hidrofbicas, los
cidos nucleicos se unen perfectamente a la membrana de slica de las columnas,
mientras que las protenas, los metabolitos y otros contaminantes no se unen y,
por lo tanto, son eliminados de la muestra durante los pasos de lavado.
Posteriormente, los cidos nucleicos se eluyen de la membrana de slica mediante
tampones de elucin con baja concentracin de sales (ligeramente alcalinos) o
simplemente agua, ya que permiten recuperar la capa hidratante de los cidos
nucleicos, liberndolos as de la membrana. Con esta tecnologa, no se produce
ningn efecto sobre las molculas de los cidos nucleicos ya que la unin
intramolecular de los mismos no es de naturaleza hidrofbica. Con este rpido
proceso de purificacin mediante la tecnologa de la adsorcin-desorcin sobre
membranas de slica, se obtiene cidos nucleicos altamente purificados y listos
para usar en procesos posteriores como PCR, RT-PCR, QPCR, secuenciacion,
blotting, clonaje, etc.
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Ultrafiltracin. En esta tecnologa, la muestra se carga directamente sobre la

membrana de ultrafiltracin y mediante vaco o centrifugacin, se eliminan todos
los contaminantes mientras que la muestra con los cidos nucleicos permanecen
retenidos en la superficie de la membrana. Despus de un paso de lavado
opcional, se recuperan los cidos nucleicos aadiendo agua o un tampn
adecuado.
Bolas magnticas. Con esta tecnologa, los cidos nucleicos se unen
selectivamente a bolas paramagnticas en presencia de sales caotrpicas
mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. Los
cidos nucleicos purificados se eluyen de la solucin con las bolas paramagnticas
bajo condiciones de baja salinidad y estn listos para ser usados en posteriores
aplicaciones.

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