Thiago Henrique Moreira da F

EXTRACO LQUIDO-LQUIDO ASSISTIDA POR

SALTING-OUT PARA A CARACTERIZAO QUMICA DE
PLANTAS

Orientadores: Paulo J. Almeida, Jos A. Rodrigues

Co-orientadores: Manuela M. Moreira, Ins M. Valente, Lus M. Gonalves
2013/2014

Agradecimentos

Agradeo:

Primeiramente minha famlia pelo empenho demonstrado ao longo do meu

percurso acadmico, sempre me incentivando nos momentos mais difceis e
comemorando nas vitrias alcanadas ao longo desse percurso.
Ao grupo de investigao QuAQuA (Qumica Analtica e Qualidade Alimentar)
pelo incentivo e disponibilidade fornecida ao longo do perodo de realizao deste estudo
e pelos novos conhecimentos que me permitiram adquirir na realizao do mesmo.
CAPES, pela bolsa de estudos concedida, a fim de buscar melhoras na
formao de futuros professores brasileiros, tornando possvel a realizao deste estudo e
a aquisio de novos conhecimentos e experincias fruto do programa de intercmbio PLI
2012/14.
Universidade Federal de Mato Grosso Campus Araguaia em conjunto com a
Universidade do Porto, onde tive o apoio dos melhores professores que me despertaram
um apreo enorme pela cincia.

Resumo

O efeito do salting-out consiste na adio de sal numa soluo e utilizado para vrios
fins, dentre eles a precipitao de protenas em sistemas biolgicos e a separao entre
solventes orgnicos miscveis em gua, sendo o ltimo devido a interaco que os
electrlitos efectuam com a gua, diminuindo a interaco gua-solvente orgnico,
originando a separao de fases. Tendo em vista esse efeito, a extraco lquido-lquido
assistida por salting-out (SALLE) uma tcnica de extraco de compostos que aparece
como alternativa extraco lquido-lquido (LLE) convencional, pelo fato de no
utilizar solventes nocivos sade, assim como a capacidade de obter compostos
orgnicos com maior polaridade.
O estudo realizado baseou-se no efeito do salting-out e nas nas vantagens da SALLE,
tendo como objectivo principal a extraco dos compostos do F. vulgare (funcho) para a
fase orgnica, realizando estudos de optimizao das variveis que influenciam
directamente na extraco dos compostos (massa de amostra, tipo de sal, concentrao do
sal, tempo de extraco e proporo de solvente) e posterior anlise da fase obtida por
HPLC-DAD e identificao dos compostos por HPLC-MS. O funcho uma planta de
origem mediterrnea, com grande utilizao na culinria devido as propriedades
aromticas e tambm tem grande uso como frmaco caseiro actuando contra vrios tipos
de infeces. Possui tambm propriedades antioxidantes, antimicrobianas, carminativas,
eupticas, etc., fatos esses que justificam o estudo dessa planta.

NDICE
1.

INTRODUO....................................................................................8
3

1.1

FUNCHO.......................................................................................8

1.2

PROPRIEDADES............................................................................8

1.3

EXTRAO................................................................................10

1.3.1

EXTRAO LIQUDO-LIQUDO ASSISTIDA POR SALTING-OUT. .11

PARTE EXPERIMENTAL

2.

MATERIAIS E MTODOS....................................................................13
2.1

AMOSTRA..................................................................................13

2.2

EQUIPAMENTOS.........................................................................13

2.2.1

HPLC-DAD (CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA

DETECO POR UV/VIS)...................................................................13

2.2.2

SISTEMA DE HPLC-DAD-MS/MS PARA A IDENTIFICAO DE

COMPOSTOS EXTRADOS DO FUNCHO...............................................13

2.2.3

BALANA ANALITICA...........................................................14

2.2.4

AGITADOR MECNICO..........................................................14

2.2.5

CENTRFUGA........................................................................14

2.2.6

SISTEMA DE PURIFICAO DE GUA MILIPORE.....................14

2.3

MATERIAIS.................................................................................14

2.4

REAGENTES...............................................................................14

2.5

PREPARAO DAS SOLUES PADRO.......................................15

2.6

PADRO INTERNO......................................................................15

2.7

SEPARAO CROMATOGRFICA.................................................16

2.8

SEPARAES CROMATOGRFICAS PARA OS ENSAIOS POR HPLC-

DAD-MS/MS........................................................................................17
3.

RESULTADOS E DISCUSSO..............................................................18
3.1

ESTUDO DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS.................................18

4

3.2

ESTUDO DA INFLUNCIA DO TIPO DE SAL, CONCENTRAO DO

SAL, VOLUME DE SOLVENTE E MASSA DE AMOSTRA............................22

3.2.1

ESTUDO DOS TIPOS DE SAIS..................................................23

3.2.2

ESTUDO DA CONCENTRAO DO SAL...................................24

3.2.3

ESTUDO DO VOLUME DE SOLVENTE E DA MASSA DA AMOSTRA

24

3.3

OTIMIZAO DOS RESULTADOS (desenho experimental)...................26

3.4

IDENTIFICAO DOS PICOS CROMATOGRFICOS POR HPLC COM

DETEO POR ESPETROMETRIA DE MASSA (MS)..................................29

3.5

MTODO DA CURVA DE CALIBRAO..........................................31

3.6

REPETIBILIDADE E REPRODUTIBILIDADE DA EXTRACO...........32

3.6.1 REPETIBILIDADE DA EXTRAO..................................................32

3.6.2

REPRODUTIBILIDADE..............................................................33

3.7

MTODO DA ADIO DE PADRO................................................34

3.8

COMPARAO DO MTODO DA CURVA DE CALIBRAO COM O

MTODO DA ADIO DE PADRO........................................................35

3.9

QUANTIFICAO........................................................................36

4.

CONCLUSO....................................................................................38

5.

TRABALHOS FUTUROS.....................................................................39

6.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................41

ndice de Figuras

Figura 1 Planta de funcho em diferentes estados fenolgicos..........................................8

Figura 2 Pincipais compostos presentes no F. vulgare.....................................................9
5

Figura 3 Esquema dos diferentes procedimentos...........................................................19

Figura 4 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase inicial..................................19
Figura 5 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica...............................20
Figura 6 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase inicial..................................20
Figura 7 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica...............................20
Figura 8 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase inicial.................................21
Figura 9 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica...............................21
Figura 10 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica.............................21
Figura 11 Representao dos picos cromatograficos utilizados para obteno da rea
total....................................................................................................................................22
Figura 12 Variao da rea total em funo do tipo de sal............................................23
Figura 13 Variao da rea total em funo da concentrao de Sulfato de amnio
(NH4)2SO4..........................................................................................................................24
Figura 14 Variao da rea total em funo da massa de amostra..................................25
Figura 15 Anlise das variveis (ANOVA)....................................................................27
Figura 16 Resposta superficial Tempo de extrao em funo da percentagem se
solvente..............................................................................................................................28
Figura 17 Resposta superficial Concentrao do sal em funo da percentagem de
solvente..............................................................................................................................28
Figura 18 Resposta superficial Concentrao do sal em funo do tempo de extrao
...........................................................................................................................................28
Figura 19 Picos cromatogrficos identificados no HPLC-MS.......................................29
Figura 20 Equao da reta obtida para os padres utilizados pelo mtodo da adio de
padro.................................................................................................................................35
Figura 21 Cromtograma obtido a partir da anlise do alecrim.......................................39
Figura 22 Cromtograma obtido a partir da anlise do pau darco..................................39
Figura 23 Cromtograma obtido a partir da anlise do tomilho.......................................40
Figura 24 Cromtograma obtido a partir da anlise do funcho (caule verde)..................40

ndice de Tabelas

Tabela 1 Concentrao das solues padro estoque.................................................15

Tabela 2 Condies cromatograficas utilizadas no HPLC.............................................16

Tabela 3 Condies utilizadas no detetor de MS para os estudos de identificao dos

compostos extrados por GDME........................................................................................17
Tabela 4 Gama de valores utilizados para cada varivel e seus respctivos resultados
(rea total)..........................................................................................................................26
Tabela 5 Resultados optimizados...................................................................................29
Tabela 6 Identificao dos picos cromatogrficos pelo HPLC-MS...............................30
Tabela 7 Resultados obtidos pelo mtodo da curva de calibrao.................................31
Tabela 8 rea total/ rea padrao interno para as diferenes amostras de cada ensaio.....32
Tabela 9.............................................................................................................................33
Tabela 10 Concentrao dos padres utilizados no mtodo da adio de padro..........34
Tabela 11 Comparao entre o mtodo ca curva de calibrao e adio de padro.......36
Tabela 12 Concentrao dos compostos de acordo com o mdodo de quantificao
utilizado.............................................................................................................................37

1. INTRODUO
1.1 FUNCHO
Originrio do Mediterrneo, o Funcho (Foeniculum vulgare Mill.) uma planta
aromtica que pertece a famlia das Apiaceaes podendo ser anual, bienal ou perene
7

dependendo da variedade, sendo encontrada em duas subespcies, a piperitum (sementes

amargas) e a vulgare (sementes doces) (Diaaz-Maroto et al., 2006). Atualmente
cultivada em em todo mundo nas regies temperadas e tropicais (He; Huang, 2011). A
doura das sementes da subespcie vulgare faz com que seja conhecida em algumas
regies como erva-doce e essa caracterstica propicia a sua utilizao como aromatizante
em alimentos desempenhando um papel fundamental na dieta dos pases mediterrneos
(Diaaz-Maroto et al., 2005). Os bulbos, os brotos novos, as folhas e os frutos maduros so
utilizados como remdios caseiros contra diversos sintomas de infeces gastrointestinais
e respiratrias (He; Huang, 2011).

Figura 1 Planta de funcho em diferentes estados fenolgicos

1.2 PROPRIEDADES
Atualmente h crescente interesse da indstria e pesquisa cientfica com plantas
aromticas e medicinais, por causa da atividade antimicrobiana e antioxidante que essas
contm, devido principalmente presena de fitoqumicos, como flavonides,
terpenides, carotenides, etc. (Singh et al.,2006).
O F. vulgare contm atividade biolgica acentuada devido presena de vrios
compostos volteis (leo essencial) e no volteis com essa atividade (He; Huang, 2011).
Os principais componentes de leos essenciais do funcho so, o anetol, a fenchone e o
estragol, tendo propores variadas de acordo com o estado fenolgico da planta e a
origem da mesma (Diaz-Maroto et al.,2006; Telci et al., 2009).
8

Figura 2 Pincipais compostos

presentes no F. vulgare

O F. vulgare desempenha
papel importante na proteo dos
humanos contra os efeitos do
estresse oxidativo, atuando como
antioxidante natural, devido a presena de compostos fenlicos presentes no leo
essencial, como, cido cafeoilqunico, cido rosmarnico, quercetina entre outros. O uso
medicinal do F. vulgare baseia-se na utilizao do leo essencial do fruto e/ou planta
seca, contendo no mnimo 20mL/Kg de leo essencial e um teor mnimo de 80% de
anetol para ser classificado como frmaco. O leo contm propriedades carminativas e
eupticas, que aliviam colicas abdominais, contm propriedades expectorantes contra
asma e bronquite, atuando tambm como purgante (Rather et al., 2012; Tinoco; Martins;
Cruz-Morais, 2007).
Alm do uso medicinal, o F. vulgare um antimicrobiano natural de suma
importncia na indstria alimentar de forma a garantir a segurana alimentar e a
despreocupao dos consumidores devido ao fato de substituir produtos qumicos
sintticos na preveno da deteriorao dos alimentos, causados por micoorganismos,
dentre eles, Staphylococcusaureus, Staphylococcusalbus, Bacillussubtilis, Salmonella
typhimurium, Pseudomonas aeruginosa, Shigella dysenteriae e Escherichia coli (Diao et
al., 2014).
Em pases industrializados, as pessoas gastam cerca de 95% do tempo em ambientes
fechados, aumentando assim, o risco de infeco por caros, no qual as principais
doenas alrgicas aos seres humanos so asma brnquica, rinite e dermatites. A utilizao
do F. vulgare como acaricida natural tambm importante, pelo fato de poder substituir
acricidas como o Benzoato de Benzilo, que contm elevada toxicidade, alm de
apresentar melhores resultados no combate contra D. farinae e D. pteronyssinus, que so
os principais e mais abundantes caros causadores de doenas alrgicas (Lee, 2004). O F.
vulgare tambem mostra levada toxicidade para algumas espcies de mosquitos, agindo
9

como inseticida natural, verificando aps duas horas de exposio a morte da metade da
populao que se encontra no segundo estgio larvrio submetidos a uma concentrao
de 40mg/L do leo essencial (He; Huang, 2011) .

1.3 EXTRAO

A utilizao das plantas pelo homem remonta a tempos antigos, como o imprio
romano e o imprio grego, usadas primeiramente como fonte de nutrientes descobrindose posteriormente as propriedades medicinais que elas continham por meio do uso do
leo essencial (Vinatoru, 2001). A extrao um passo fundamental para obteno do
leo essencial de qualquer planta medicinal, de modo a obter os compostos qumicos
responsveis por determinadas atividades caractersticos de cada planta (Sasidharanet al.,
2011).
H inumeras tcnicas para extrao do leo essencial das plantas, como a
hidrodestilao, a destilao a vapor, a extrao de Soxhlet, a extrao com fludo
supercrtico (SFE), extrao com solventes clssicos, micro-extrao em fase slida
(SPME), etc., sendo a escolha do melhor mtodo baseado na finalidade que se pretende
utilizar o extrato vegetal, por exemplo na indstria se utiliza principalmente a
hidrodestilao, a destilao a vapor e o SFE (Diaz-Maroto et al., 2005). A infuso talvez
seja vista como a forma mais utilizada para obteno do leo essencial, porm encontra
certas dificuldades quando se utiliza a fruta inteira devido localizao intracelular, por
outro lado, quando se tritura ou esmaga o fruto, o teor de leo essencial decresce com o
tempo (Bilia et al., 2000).

1.3.1

EXTRAO LIQUDO-LIQUDO ASSISTIDA POR SALTING-OUT

2. Extractionby
A extraco liqudo-liqudo (LLE) uma das tcnicas mais utilizadas no prSALLE
tratamento de amostras por ser uma tcnica de bastante eficiente na extraco de diversos
Agitation (1 min) and

compostos orgnicos. A separao baseada nas diferenas dos coeficientes de partio

dos analitos entre as fases aquosa e orgnica quando estas duas fases imiscveis entram

centrifugation (2 min, 6000

10
5 mL ACN +
1.4 g
rpm)
(NH4)2SO4

em contacto. Porm, apresenta algumas desvantagens devido a utilizao de grandes

quantidades de solventes orgnicos txicos prejudiciais sade e ao meio ambiente, alm
de ser uma tcnica muito trabalhosa (Anthemidis; Ioannou, 2009).
A extraco lquido-lquido assistida por salting-out (SALLE) pode ser uma soluo
para as desvantagens apresentadas pela LLE pelo fato de utilizar solventes orgnicos
menos txicos. Alm disso, dado que estes solventes so miscveis em gua e apresentam
uma elevada polaridade, permitem extrair das amostras compostos orgnicos de elevada
polaridade que so muitas vezes difceis de extrair com a LLE clssica.
O efeito salting-out baseia-se na adio de sal a uma soluo aquosa e utilizado
em Qumica Analtica para aumentar a volatilizao de analitos, a precipitao de
protenas e tambm aplicado para separar a gua de solventes orgnicos miscveis em
gua. Essa separao ocorre devido a adio de electrlitos soluo, fazendo com que
as foras de solvatao entre a gua e o solvente orgnico se enfraqueam devido a maior
afinidade das molculas de gua na solvatao dos electrlitos do que para a solvatao
do solvente orgnico, dando origem a um sistema bifsico. Para a ocorrncia desse efeito
a solubilidade do sal no solvente orgnico deve ser insignificante mas deve ser elevada
em gua de forma a maximizar as interaces entre os ies do sal e a gua. (Valente;
Gonalves; Rodrigues, 2013).

11

Parte experimental

2. MATERIAIS E MTODOS
2.1

AMOSTRA

As amostras de sementes de funcho secas (F. vulgare) utilizadas na realizao deste

estudo foram adquiridas no comrcio local, provenientes do Ervanrio Portuense.

2.2

EQUIPAMENTOS

2.2.1

HPLC-DAD (CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA

DETECO POR UV/VIS)
12

Principais caractersticas:

Unidade de gradiente quaternrio JASCO, modelo PU-2089 Plus;

Bomba quaternria JASCO, modelo PU-1580;
Detector de multplos comprimentos de onda JASCO, modelo MD-1510;
Unidade de desgaseificao JASCO, modelo DG-1580-54;
Amostrador automtico JASCO, modelo AS-950;
Interface JASCO, modelo LC-Net II/ADC;
Software de controle atravs do programa JASCO ChromPass Chromatography
Data System, verso 1.8.6.1.

2.2.2 SISTEMA DE HPLC-DAD-MS/MS PARA A IDENTIFICAO DE

COMPOSTOS EXTRADOS DO FUNCHO
Principais caractersticas:

Bomba com unidade de gradiente quaternrio Thermo Electron Corporation;

Injetor automtico Thermo Electron Corporation;

Detector espetrofotomtrico com rede de dodos;

Detector MS ion-trap quadrupolo com fonte de ionizao por electrospray (ESI)

Finnigan LCQ Deca XP Plus;

Programa XCalibur (verso 1.4) da Thermo Electron Corporation para o controlo

do sistema cromatogrfico, a aquisio e a anlise dos dados.

2.2.3 BALANA ANALITICA

Kern & Sohn GMbH, modelo ABJ 220-4m

2.2.4 AGITADOR MECNICO

IKA Works Inc., modelo RS 10 Control

2.2.5 CENTRFUGA
Hermle Labortechnik, modelo K 300 K
2.2.6

SISTEMA DE PURIFICAO DE GUA MILIPORE

13

 Direct-Q3 UV, para purificao de gua (gua ultrapura com resistividade no

superior a 18 M cm) utilizada para a preparao de solues e eluentes para
HPLC.

2.3 MATERIAIS
Micropipetas Gilson Pipetman
2.4

REAGENTES

Acetonitrilo- CH3CN (Panreac;HPLC-gradient grade);

Acetato de Amonio CH3COONH4 (Merck, 98,0 %);
cido cafeico C9H8O4 (Sigma-Aldrich, 98,0%);
cido clorogenico C16H18O9 (Sigma-Aldrich, 95,0%):
cido p-cumrico C9H8O3 (Sigma-Aldrich, 98,0);
Carbonato de Sodio anidro NaCO3 (Panreac, 99,5%);
Carbonato de Potssio K2CO3 (Merck, 99,0%);
Cloreto de Sdio NaCl (Sigma-Aldrich, 99,8%)
Di-hidrato de quercetina C15H10O7.2H2O (Sigma-Aldrich, 98,0%);
Fosfato monossdico NaH2PO4 (Pronalab, 98,4%);
Metanol CH3OH (FishesChemical grau analtico);
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (BDH Prolabo, 99,6%);
Sulfato de sdio Na2SO4 (Sigma-Aldrich, 99,0%);
Trans-anetol C10H12O (Sigma-Aldrich, 99%)
Xanto-humol C21H22O5 (Hopsteiner, 98%)

2.5

PREPARAO DAS SOLUES PADRO

As solues padro estoque dos compostos estudados foram preparadas em metanol

a partir das quantidades descritas na Tabela 1.

Tabela 1 Concentrao das solues padro estoque

Composto
cido cafeico
cido clorogenico
cido p-cumrico

Massa/ g V MeOH/ mL a
0,0497
0,0506
0,0502

25,00
25,00
25,00

Conc./mg.L-1 b
1988
2024
2008
14

Di-hidrato de quercetina
0,0504
Trans-anetol
0,0579
a
Volume de metanol, mL; b Concentrao, mg.L-1

25,00
25,00

2016
2316

As solues padro de trabalho foram obtidas a partir da diluio das solues

estoque numa mistura acetonitrilo-gua (1:1, v/v).

2.6

PADRO INTERNO

O padro interno utilizado foi uma soluo etanlica de xanto-humol 400ppm.

2.7

SEPARAO CROMATOGRFICA

A separao cropmatogrfica foi realizada temperatura ambiente numa coluna

cromatogrfica de fase reversa Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 m de tamanho de partcula)
e pr-coluna (4 x 3,0 mm) da marca Phenomenex. A fase mvel tinha en sua constituio
(A) metanol e (B) gua com 0,1% de cido frmico, utilizada em modo gradiente a 0,8
mL/min de acordo com as condies descritas na Tabela 2.
Tabela 2 Condies cromatograficas utilizadas no HPLC

Tempo/min
0
40
60
90
95
110
120

%A
10
30
45
100
100
10
10

%B
90
70
55
0
0
90
90

O volume de injeo de amostra foi de 20 L e o comprimento de onda utilizado

para a deteo dos compostos foi 280 nm.

15

2.8

SEPARAES CROMATOGRFICAS PARA OS ENSAIOS

POR HPLC-DAD-MS/MS

Para os ensaios por HPLC-DAD-MS/MS as separaes cromatogrficas foram

efetuadas numa coluna cromatogrfica de fase reversa Gemini C18 (Phenomenex) (150 x
4,6 mm; 3 m tamanho de partcula). As separaes cromatogrficas foram realizadas nas
mesmas condies utilizadas para as anlises por HPLC-UV mas a um fluxo de 0,4 mL
min-1 e um volume de injeo de 25 L. O detetor de MS foi utilizado em modo negativo
nas condies descritas na Tabela 3.
Tabela 3 Condies utilizadas no detetor de MS para os estudos de identificao dos compostos
extrados por GDME.

Temperatura do capilar
Corrente da fonte
Corrente do capilar
Fluxo do sheat gas (N2)
Fluxo do gs auxiliar (N2)
Intervalo de deteco

325 C
5,0 kV
4,0 V
40 unidades arbitrrias
15 unidades arbitrrias
1601601000 m/z

16

3. RESULTADOS E DISCUSSO

3.1

ESTUDO DE DIFERENTES PROCEDIMENTOS

Partindo do principio que diferentes solventes, ou propores de solventes,

influenciam na extraco dos compostos presentes numa amostra, o estudo experimental
iniciou-se de modo a verificar essa ocorrncia testando quatro procedimentos que se
distinguiam basicamente no tipo e na proporo de solvente utilizado para realizao da
extraco slido-lquido, retirando uma alquota dessa soluo inicial (fase inicial) para
analise (excepto para o procedimento 4) para observar quais picos apareciam em funo
do tipo e proporo de solvente e posteriormente procedeu-se aplicao do efeito
salting-out e anlise de uma alquota da fase orgnica.
Procedimento 1: inicialmente realizou-se a extraco slido-liquido com uma mistura de
10,00mL de gua-acetonitrilo (1:1, v/v) com 1 grama de amostra. Aps agitao
mecnica de 30 minutos e 2 minutos de centrifugao, uma alquota de 5,00mL da
soluo foi transferida para outro recipiente adicionando 0,7 gramas de Sulfato de amnio
((NH4)2SO4). Realizou-se novamente a centrifugao, obtendo-se a separao das fases
orgnica (superior) e aquosa (inferior);
Procedimento 2: inicialmente realizou-se a extraco slido-liquido com 10,00mL de
gua e 1 grama de amostra. Aps agitao mecnica de 30 minutos toda a soluo foi
transferida para um novo recipiente onde lhe foi adicionada 10,00mL de acetonitrilo e 1,4
gramas sulfato de amnio ((NH4)2SO4). Aps a centrifugao, obteve-se a separao das
fases orgnica (superior) e aquosa (inferior);
Procedimento 3: inicialmente realizou-se a extraco slido-liquido com 10,00mL de
acetonitrilo e 1 grama de amostra. Aps agitao mecnica de 30 minutos toda a soluo
17

foi transferida para um novo recipiente onde lhe foi adicionada 10,00mL de gua e 1,4
gramas sulfato de amnio ((NH4)2SO4). Aps a centrifugao, obteve-se a separao das
fases orgnica (superior) e aquosa (inferior);
Procedimento 4: inicialmente realizou-se a extraco slido-liquido com uma mistura de
10,00mL de gua-acetonitrilo (1:1, v/v), 1 grama de amostra e 0,7 gramas de sulfato de
amnio ((NH4)2SO4). Aps agitao mecnica de 30 minutos e 2 minutos de
centrifugao, obteve-se a separao das fases orgnica (superior) e aquosa (inferior).

Figura 3 Esquema dos diferentes procedimentos

Os cromatogramas obtidos para cada procedimento podem ser observados nas

figuras abaixo:
Procedimento 1:

18

80

mAU

P1_Faq_2.DATA [280,00 nm]

75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5

RT [min]
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

Figura 4 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase inicial

mA U

650

P1_Forg_US_1.DA TA [280,00 nm]

600
550
500
450
400
350

S T H 10,00
S P W 0,20

300
250
200
150
100
50
0

RT [min]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Figura 5 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica

Procedimento 2:
mAU

38
36
34
32
30
28
26
24
22
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
-2
-4
-6

P2_Faq_1.DATA [280,00 nm]

RT [min]
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

Figura 6 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase inicial

19

mA U

55

P2_Forg_US_1.DA TA [280,00 nm]

50
45
40
35

S T H 1 0 ,0 0
S P W 0 ,2 0

30
25
20
15
10
5
0

-5

RT [min]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Figura 7 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica

Procedimento 3:
14

mAU

P3_Faq_2.DATA [280,00 nm]

12

STH 10,00

10
8
6

SPW 0,20

4
2
0
-2
-4
-6
-8

-10
-12

RT [min]
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

Figura 8 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase inicial

18

mAU

P3_Forg_US_1.DA TA [280,00 nm]

16

S T H 1 0 ,0 0
S P W 0 ,2 0

14
12
10
8
6
4
2
0

-2
-4
-6
-8
-10
-12
0

RT [min]
10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

Figura 9 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica

Procedimento 4

20

600

mA U

P4_Forg_US_1.DATA [280,00 nm]

550
500
450
400
350
300

S T H 10,00
S P W 0,20

250
200
150
100
50

RT [min]

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

Figura 10 Cromatograma obtido a partir da anlise da fase orgnica

Observa-se de modo geral, que os resultados obtidos diferenciam-se entre si

basicamente devido a presena de alguns picos que aparecem na anlise inicial (anlise
da extraco slido-liquido) e devido a menor intensidade apresentada dos picos que so
comuns s duas anlises.
Analisando as figuras acima que referem-se s fases orgnicas, observa-se para o
procedimento 3 (Fig. 9) uma baixa capacidade de extraco dos compostos, no sendo de
interesse a sua utilizao. Nos demais procedimentos possvel concluir, quanto ao
nmero de compostos extrados, que ambos os procedimentos se mostraram satisfatrios,
porm quanto rea dos picos apresentadas, o procedimento 2 (Fig. 7) no mostrou-se
eficiente devido aos baixos valores apresentados. Entre o procedimento 1 (Fig. 4) e o
procedimento 4 (Fig. 10) verifica-se que em ambos os valores apresentados so
semelhantes, optando pelo procedimento 4 devido a facilidade de execuo experimental.

3.2

ESTUDO

DA

INFLUNCIA

DO

TIPO

DE

SAL,

CONCENTRAO DO SAL, VOLUME DE SOLVENTE E

MASSA DE AMOSTRA
Para estudar a influncia do tipo de sal, a concentrao do sal e a massa da amostra
recorreu-se utilizao da soma das reas dos picos cromatogrficos que eram constantes
em cada ensaio (rea total) (Fig. 11), obtidos na anlise da fase orgnica, de modo a
observar a variao ocorrida em cada estudo de forma a obter os melhores valores da rea
total.

21

Figura 11 Representao dos picos cromatograficos utilizados para obteno da rea total

3.2.1 ESTUDO DOS TIPOS DE SAIS

A partir da escolha do melhor procedimento, procedeu-se ao estudo do tipo sal

analisando sete tipos de sais, acetato de amnio (CH3COONH4), carbonato de sdio
(NaCO3), carbonato de potssio (K2CO3), cloreto de sdio (NaCl), fosfato monossdico
(NaH2PO4), sulfato de sdio (Na2SO4) e sulfato de amnio ((NH 4)2SO4), para verificar a
influencia que estes sais exerciam na rea total.

22

600
500
400
300
rea total / mAU min

200
100
0

Figura 12 Variao da rea total em funo do tipo de sal

Observa-se na figura acima que os carbonatos (CO 32-) apresentaram os valores mais
baixos da rea total, nos indicando que o aumento do pH da soluo pode afectar a
extraco (tpico no abordado no estudo), e o sulfato de amnio ((NH 4)2SO4) apresentou
melhor resultado da rea total, sendo assim o sal escolhido para o realizao do efeito
salting-out.

3.2.2 ESTUDO DA CONCENTRAO DO SAL

Aps seleccionado o sal, procedeu-se ao estudo da interferncia da variao da
concentrao deste sal na extraco, de forma a obter maiores valores das reas. No foi
seleccionado nenhum valor de concentrao do sal, pois como pode-se observar na figura
13, conforme a concentrao aumenta a rea total dos picos tambm aumenta, impedindo

23

a seleco da melhor concentrao apenas por analise da figura, sendo essa varivel
abordada mais adiante na optimizao dos resultados indicando seu melhor valor.

500
450
400
350
300

rea total dos picos/ mAU.min

250
200
150
100
50
0
0.45

0.6

0.7

Conc. (NH4)2SO4/ mol.dm-3

Figura 13 Variao da rea total em funo da concentrao de Sulfato de amnio (NH 4)2SO4

3.2.3 ESTUDO DO VOLUME DE SOLVENTE E DA MASSA DA

AMOSTRA

De acordo com o procedimento escolhido para realizao do presente trabalho

experimental (procedimento 4), observa-se que o volume total de soluo utilizado foi de
10,00mL, porm realizaram-se estudos de variaes no volume com a inteno de
verificar o seu efeito nos resultados, utilizando volumes de 5,00, 10,00 e 15,00mL. Foi
simultaneamente estudada a massa de amostra mais adequada para a extraco (variando
a massa entre 0,5 e 1,5 g). Para os volumes de 10,00 e 15,00mL, a extraco dos
compostos era tanto maior quanto maior a massa de amostra utilizada e menor o volume
de solvente. Por outro lado, para o volume de 5,00mL a nica massa para a qual foi
possvel realizar a extraco foi 0,5 g, dado que era a nica situao em que a amostra
ficava completamente submersa no solvente e em que era possvel observar com clareza a
24

formao das duas fases lquidas no final da extraco. Devido a esta limitao, foi
seleccionado um volume de 10,00 mL para o estudo da influncia da amostra na
quantidade de compostos extrada (Fig. 14).

500
450
400
350
300
rea do pico / mAU min

250
200
150
100
50
0
0.5

1.5

Massa da amostra/g

Figura 14 Variao da rea total em funo da massa de amostra

A figura apresentada acima corresponde a variao da massa com um volume fixo

de 10,00mL de solvente, dessa forma observa-se que a resposta obtida da rea total
aumenta at uma massa de 1,00g e mantm-se com a utilizao da massa de 1,50g. A
partir destes resultados verifica-se que a massa de 1,0 g seria a que resultaria numa
extraco mais eficiente. No entanto, a massa de 0,5 g facilita a execuo do
procedimento experimental.

3.3OTIMIZAO DOS RESULTADOS (desenho experimental)

Aps a realizao dos estudos iniciais para determinar o melhor procedimento, o

tipo de sal e a massa da amostra (parmetros fixos), procedeu-se utilizao do desenho
25

experimental com o intuito de analisar estatisticamente outras variveis que

influenciassem na extraco dos compostos do F. vulgare, dentre eles a concentrao do
sal, o tempo de extraco e a composio de solvente.
A utilizao do desenho experimental permite estudar os efeitos das variveis de
forma independente ou as interaces entre elas utilizando um nmero pequeno de
ensaios necessrios para o estudo. O desenho experimental utilizado foi o Central
Composite Design com trs variveis (Tabela 4), a proporo de solvente (X 1,%), o tempo
de extraco (X2, min) e a concentrao do sal (X 3, mol.dm-3), sendo do tipo 23, composto
por 19 experimentos: 8 pontos de um desenho factorial variando de 1,000, 6 pontos
axiais distncia de 2,000 do PC que era constitudo por 5 rplicas de forma a
estimar o erro experimental. A resposta experimental avaliada em cada estudo foi a rea
total indicada na tabela 4.

Tabela 4 Valores utilizados para cada varivel e seus respctivos resultados (rea total)

Exp.
1
2
3
4
5
6
7
8
9-13 (PC)

X1 (%)
40.0000
40.0000
40.0000
40.0000
60.0000
60.0000
60.0000
60.0000
50.0000

14
15
16
17
18
19

33.0000
50.0000
50.0000
50.0000
50.0000
67.0000

X2 (min.)
10.0000
10.0000
30.0000
30.0000
10.0000
10.0000
30.0000
30.0000
20.0000
Pontos axiais
20.0000
3.0000
20.0000
20.0000
37.0000
20.0000

X3 (mol.dm-3)
1.0000
2.0000
1.0000
2.0000
1.0000
2.0000
1.0000
2.0000
1.5000

rea total
101,5
78,5
148,0
94,4
94,6
51,7
153,2
127,4
107,6

1.5000
1.5000
0.6600
2.3000
1.5000
1.5000

109,1
67,3
191,8
90,5
166,4
79,6

A anlise dos resultados foi efectuada por meio do mtodo dos testes de
significncia (Fig. 15.), onde verifica-se atravs do p-value que a rea dos picos obtidos
na extraco influenciada pelo tempo de extraco e concentrao do sal devido
apresentarem os valores de p-value inferiores a 0,05. Quando as variveis so
estudadas em relao as suas interaces, observa-se uma falta de significado dos termos
26

(p> 0,05) sugerindo a ausncia de interaces entre as variveis na gama de valores

estudados. O mtodo utilizado considerado adequado quando o valor de p-value para
o modelo significativo (p <0,05) e para a falta de ajuste (lack of fit) no significativo
(p > 0,05), sendo ento o modelo utilizado considerado adequado, obtendo para o modelo
p= 0,0012 e para a falta de ajuste p=0,1915.

Figura 15 Anlise das variveis, mtodo dos testes de significncia (ANOVA)

O software utilizado permite-nos encontrar os valores ptimos das variveis

atravs da anlise da resposta de superfcie, indicando em imagens as regies onde se
encontram os valores ptimos na gama de valores estudados. Nas figuras abaixo pode-se
observar os resultados das anlises de superfcie efectuadas, sendo os valores ptimos
indicados pela presena de um ponto vermelho mais intenso na rea delimitada por uma
linha vermelha mais escura.

27

Figura 16 Resposta superficial Tempo de extrao em funo da percentagem se solvente

Figura 17 Resposta superficial Concentrao do sal em funo da percentagem de solvente

Figura 18 Resposta superficial Concentrao do sal em funo do tempo de extrao

28

Na tabela 5 encontram-se os valores finais obtidos a partir da anlise da resposta

superficial.

Tabela 5 Resultados ptimos

Variveis

Valores ptimos

Percentagem de solvente (%)

Tempo de extraco (min)
Concentrao do sal (mol.L-1)

50
37
0,7

3.4 IDENTIFICAO DOS PICOS CROMATOGRFICOS POR

HPLC COM DETEO POR ESPETROMETRIA DE
MASSA (MS)

Aps realizado o desenho experimental, procedeu-se a identificao de alguns dos

compostos extrados do F.vulgare por HPLC-MS de forma a quantificar alguns dos
compostos extrados. A identificao dos picos cromatogrficos foi realizada por
comparao com os espetros de massa de solues padro de alguns compostos e com
base em informao encontrada na literatura. Os picos obtidos e os resultados da
identificao podem ser observados na figura 19 e na tabela 6 respectivamente.

Figura 19 Picos cromatogrficos identificados no HPLC-MS

Tabela 6 Identificao dos picos cromatogrficos pelo HPLC-MS

Pico

/nm

[M-H](intensidad
e)

Fragmento
s MS2
(intensidad

Fragmentos
MS3
(intensidade

Composto

29

e)
163 (100),
325

)
119 (100)

515 (100),
583 (20),
601 (19)

353 (100),
191 (13)

191 (100),
179 (13)

cido 1,5di-Ocafeoilqui
nico

463 (100),
609 (29),
577 (19),
475 (16)
515 (100),
417 (78),
601 (54)

301 (100)

179 (100),
271 (40),
255 (25)

Quercetina (Bravo et. al

-3-O2007).
glucsido

353 (100),
203 (58),
299 (32),
317 (29),
255 (21),
470 (16)
557 (100),
515 (93),
395 (71),
439 (61)

191 (100),
173 (95),
179 (67)

cido 1,4di-Ocafeoilqu
nico

(Clifford et. al,

2005)

395 (100),
273 (40),
376 (18)

cido
malonil1,5-Odicafeoilq
unico
Quercetina
-3-Oglucurnid
o
(miquelian
ina)

(Gouveia;
Castilho, 2011)

290

371 (100)

323
(mx
),
290,
245
329
(mx
),
290,
245
257
(mx
),
350
329
(mx
),
290,
248

399 (100),
353 (66),
707 (50),
729 (33)

329
(mx
),
290,
245
257
(mx
),
353

601 (100)

477 (100),
955 (62)

301 (100)

179 (100),
273 (18),
257 (11),
229 (10)

260
(mx
),
344

461 (100),
507 (70),
529 (45)

285 (100)

257 (100),
267 (41),
163 (37),
229 (35)

Glucsido
do cido
cumrico
Derivado
de cido
clorognic
o
(Gouveia;
Castilho, 2011)

(Parejo et. al,

2004)

Canferol- (Kajdzanoska et.

3-Oal, 2010)
glucornid
o

30

A partir da tabela 6 observa-se que os compostos identificados por HPLC-MS

correspondem a derivados do cido cumrico, do cido clorognico, do cido cafeico e da
quercetina e canferol, sendo alguns dos compostos obtidos identificados por outros
autores. Os restantes picos cromatogrficos no foram ainda identificados e encontram-se
actualmente sob estudo. Dessa forma a quantificao de alguns dos compostos extrados
do funcho se deu de forma indirecta, utilizando padres dos polifenis correspondentes
(cido cumrico, do cido clorognico, do cido cafeico e da quercetina).

3.5MTODO DA CURVA DE CALIBRAO

Para da determinao dos compostos extrados do F. vulgare pelo mtodo da curva

de calibrao, utilizaram-se solues padro com concentraes de 1, 3, 5, 7 e 10 mg/L
de modo a obter as rectas de calibrao, que foram submetidas s mesmas condies
impostas s amostras, dentre elas a concentrao do sal, o tempo de agitao e
centrifugao, sendo os valores observados na tabela 7.

Tabela 7 Resultados obtidos pelo mtodo da curva de calibrao

y = mx+b a
y=(1,49 0,03)x + (0,2059 0,1479)

r2
0,999

LDb
0,291

LQc
0,970

y=(0,42 0,01)x + (0,0414 0,0405)

1
0,999

0,286

0,952

cido p- cumrico

y=(2,59 0,07)x + (-0,1165 0,4152)

1
0,998

0,576

1,921

Anetol

y=(1,08 0,05)x + (-0,0459 0,2975)

7
0,993

0,953

3,175

Quercetina

y=(0,54 0,03)x + (0,1039 0,1731)

9
0,991

1,113

3,708

Composto
cido Cafeico
cido Clorognico

6
a

Equao da curva de calibrao; y = rea do pico, mV min; m = declive desvio padro, L/mg; x =
concentrao, mg/L; b = ordenada na origem desvio padro, mV min.
b
Limite de deteco
c
Limite de quantificao

31

3.6

REPETIBILIDADE
EXTRACO

REPRODUTIBILIDADE

DA

3.6.1 REPETIBILIDADE DA EXTRAO

A repetibilidade de uma mtodo analtico de grande importncia pois garante

que a metodologia seja vlida, com isso espera-se que os resultados obtidos da repetio
dos ensaios, realizados em condies contantes pelo mesmo operador e utilizando o
mesmo equipamento, tenha um coeficiente de variao (CV%) inferior a 10% para
garantir a repetibilidade.
Para obter os valores do CV% foram realizados 3 ensaios em dias diferentes,
sendo cada ensaio constitudo por 5 amostras. Os resultados obtidos so apresentados na
tabela 8.

Tabela 8 Ensaios de repetibilidade

Amostra
1
2
3
4
5
Mdia
Desvio Padro
CV%

rea total/ rea padro interno

Ensaio 1
Ensaio 2
Ensaio 3
159,4
145,2
130,0
150,0
144,6
145,9
10,7
7,3

256,9
248,5
219,3
250,5
236,5
242,3
14,9
6,1

171,5
189,8
202,6
218,0
213,9
199,2
18,9
9,5

A partir dos resultados obtidos, observa-se que o mtodo repetvel devido aos
valores de CV% estarem dentro do limite do valor estabelecido anteriormente (inferior a
10%), sendo a repetibilidade do processo de extraco confirmada.

32

3.6.2 REPRODUTIBILIDADE

A reprodutibilidade de uma metodologia analtica tambm uma determinao

importante de forma a analisar a variao da mdia dos valores obtidos nos diferentes
ensaios, neste caso os valores correspondem rea total dos picos cromatogrficos, sendo
realizados em dias diferentes. Os valores apresentados na tabela 9 correspondentes aos
ensaios de reprodutibilidade, levam em considerao a mdia dos valores obtidos para
cada amostra de repetibilidade apresentados na Tabela 8.

Tabela 9 Ensaios de reprodutibilidade

Ensaio

rea total/ rea padro interno

1
2
3
Mdia
Desvio Padro
CV%

145,9
242,3
199,2
195.8
43
22

Observa-se que o mtodo no reprodutvel, ou seja, no reproduz a mesma

resposta nos diferentes ensaios devido ao valor do coeficiente de variao (CV%) obtido
ser muito superior ao valor estabelecido (inferior a 10%), no sendo confirmada a
reprodutibilidade do processo de extraco.

33

3.7

MTODO DA ADIO DE PADRO

Para obteno da equao da recta pelo mtodo da adio de padro, efectuou-se a

preparao de 5 padres com concentraes crescentes dos compostos, podendo os
valores serem visualizados na tabela 10.

Tabela 10 Concentrao dos padres utilizados no mtodo da adio de padro

Composto

Branco

Concentrao/ (mg/L)
Padro 1
Padro 2
Padro 3

Padro 4

c. Cafeico

2,517

5,035

7,552

10,030

c. Clorogenico

4,979

9,999

14,978

19,997

c. p-cumrico

1,004

2,008

2,999

3,999

Anetol

2,501

5,003

7,504

10,005

Quercetina

2,517

4,995

7,496

9,990

Na figura 20 observa-se as rectas obtidas para o mtodo da adio de padro,

podendo observar a eliminao de um ponto na representao correspondente ao cido
clorognico, devido ao distanciamento deste ponto da linha de tendncia afectando no
valor do r2.

34

Figura 20 Equao da reta obtida para os padres utilizados pelo mtodo da adio de padro

3.8

COMPARAO DO MTODO DA CURVA DE

CALIBRAO COM O MTODO DA ADIO DE PADRO

A comparao entre os mtodos de quantificao um ponto importante num

trabalho de investigao, pois permite escolher qual mtodo mais apropriado realizao
da quantificao dos compostos. A escolha do mtodo se baseia na ocorrncia ou no do
efeito de matriz, sendo utilizado o mtodo da curva de calibrao quando no
35

constatado esse efeito e por sua vez, o mtodo da adio de padro utilizado na
presena do efeito de matriz. Dessa forma, a escolha do melhor mtodo deu-se com base
na comparao entre varincias (teste F) e a comparao entre os declives (teste t) obtidos
pelos dois mtodos (Tabela 11).

Tabela 11 Comparao entre o mtodo ca curva de calibrao e adio de padro

Composto

Comparao entre CCa e ADb

Varincias (teste F) Declives (teste t)

c. Cafeico
Iguais
c. Clorognico
Diferentes
c. p-cumrico
Iguais
Anetol
Iguais
Quercetina
Iguais
a
Curva de calibrao; b Adio de Padro

Iguais
Diferentes
Iguais
Iguais
Diferentes

Para os compostos que obtiveram igualdade das varincias e dos declives em

comparao entre os dois mtodos analticos (cido cafeico, cido p-cumrico e anetol)
conclui-se que estes no sofrem efeito de matriz, sendo possvel a quantificao pelo
mtodo da curva de calibrao. J nos compostos que obtiveram alguma diferena quer
na varincia quer no declive, indica-nos que estes compostos sofrem efeito de matriz,
sendo possvel a sua quantificao apenas pelo mtodo da adio de padro.

3.9 QUANTIFICAO

Tendo como base as informaes obtidas na comparao entre os dois mtodos

analticos, efectuou-se a quantificao de alguns dos compostos extrados do F. vulgare
de acordo com o mtodo estabelecido, sendo apresentados na tabela 12. Alguns
compostos extrados no foram quantificados por apresentarem valores baixos de rea.
Tabela 12 Concentrao dos compostos de acordo com o mtodo de quantificao utilizado

Mtodo da curva de calibrao

Composto

rea do pico/ rea PIa

Conc./ mg/g

Desvio Padro

cido cafeico

0,71

0,007

0,002

cido 1,5-di-O-

15,50

0,204

0,003
36

cafeoilquinico
cido malonil-1,5-Odicafeoilqunico

20,74

0,274

0,004

cido p-cumrico

5,00

0,039

0,003

4,43

0,082

0,008

Anetol

Mtodo da adio de padro

cido clorognico

12,29

0,290

0,03

Quercetina

0,43

0,027

0,008

Padro interno

4. CONCLUSES

Atravs dos resultados adquiridos a partir da SALLE possvel confirmar a

aplicabilidade dessa tcnica na extraco dos compostos orgnicos presentes no F.
vulgare.

37

A optimizao das variveis permitiu-nos aumentar a eficincia da extraco,

obtendo os compostos em maior concentrao. As anlises efectuadas por HPLC-MS
permitiu-nos identificar alguns dos compostos extrados, sendo alguns compostos no
identificados devido a complexidade estrutural e dificuldade na anlise dos espectros de
massa dos mesmos, retirando informaes a cerca das propriedades que estes
desempenham no F. vulgare, sendo algumas propriedades como por exemplo o poder
antioxidante confirmado pela presena dos derivados da quercetina e do cido cafeico.

5. TRABALHOS FUTUROS

Atravs do estudo da (SALLE) e dos benefcios encontrados, verificou-se que

uma tcnica de extraco de compostos eficaz e que pode ser aplicado na abordagem de
outros tipos de amostras a fim de obter seus respectivos compostos. Dessa forma, o
trabalho efectuado procurou abordar tambm outras amostras como o alecrim, o pau
38

darco, o tomilho e o funcho (caule verde), submetidas s mesmas condies optimizadas

para as sementes de funcho, apresentando resultados interessantes (figuras abaixo) que
podero ser aprofundados futuramente.

mAU

alecrim_1.DATA [280,00 nm]

550
500
450
400
350
300
250

STH 10,00

200
150

SPW 0,20

100
50

0
RT [min]
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

Figura 21 Cromatograma obtido a partir da anlise do alecrim

85

mAU

pau d'arco_1.DATA [280,00 nm]

80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
STH 10,00

25
20
15

SPW 0,20

10

5
0

-5

RT [min]
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

Figura 22 Cromatograma obtido a partir da anlise do pau darco

39

210

mAU

tomilho_1.DATA [280,00 nm]

200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
90
80
70
STH 10,00

60
50
40

SPW 0,20

30
20
10

RT [min]

-10
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

120

Figura 23 Cromatograma obtido a partir da anlise do tomilho

130
125
120
115
110
105
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
-10

funcho rama_1.DATA [280,00 nm]

SPW 0,20

STH 10,00

mAU

RT [min]
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100

105

110

115

Figura 24 Cromatograma obtido a partir da anlise do funcho (caule verde)

6. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
40

Anthemidis, A. N., Ioannou, K. I. G. (2009). Recent developments in homogeneous and

dispersive liquid-liquid extraction for inorganic elements determination. A review.
Talanta, 80, 413421.
Bilia, A. R., Flamini, G., Taglioli, V., Morelli, I. & Vincieri, F. F. (2002). GC-MS analysis
of essential oil of some commercial Fennel teas. Food Chemistry, 76: 307310.
Daz-Maroto, M. C., Daz-Maroto, H. I. J., Snchez-Palomo, E., & Prez-Coello, M. S.
(2005). Volatile components and key odorants of fennel (Foeniculum vulgare Mill.) and
thyme (Thymus vulgaris L.) oil extracts obtained by simultaneous distillation-extraction
and supercritical fluid extraction. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53, 5385
5389.
Daz-Maroto, M. C., Prez-Coello, M. S., Esteban, J., & Sanz, J. (2006). Comparison of
the volatile composition of wild fennel samples (Foeniculum vulgare Mill.) from Central
Spain. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 54, 68146818.
He, W., Huang, B. (2011). A review of chemistry and bioactivities o a medicinal spice:
Foeniculum vulgare. Journal of Medicinal Plants Research, 5, 35953600.
Lee, S. H. (2004). Acaricidal activity of constituents identified in Foeniculum vulgare
fruit oil against Dermatophagoides spp. (Acari: Pyroglyphidae). Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 52, 28872889.
Sasidharanet, S., Chen, Y., Saravanan, D., Sundram, K. M. & Latha, L. Y. (2011).
Extraction, isolation and characterization of bioactive compounds from plants extracts.
African Journal of Traditional, Complementary and Alternative Medicines, 8, 110.
Singh, G., Maurya, S., Lampasona, M. P. & Catalan, C. (2006). Chemical constituents,
antifungal and antioxidative potential of Foeniculum vulgare volatile oil and its acetone
extract. Food Control, 17, 745752.
Telci, I., Demirtas, I., & Sahin, A. (2009). Variation in plant properties and essential oil
composition of sweet fennel (Foeniculum vulgare Mill.) fruits during stages of maturity.
Industrial Crops and Products, 30, 126130.
Tinoco, M. T., Martins, M. R., & Cruz-Morais, J. (2007). Actividade antimicrobiana do
leo essencial do Foeniculun vulgare Miller. Revista de Cincias Agrrias, 30, 448-454.
Vinatoru, M. (2001). An overview of the ultrasonically assisted extraction of bioactive
principles form herbs. Ultrasonics Sonochemistry, 8, 303313.
41

Valente, I. M., Gonalves, L. M. & Rodrigues, J. A. (2013). Another glimpse over the
salting-out assisted liquid-liquid extraction in acetonitrile/water mixtures. Journal of
Chromatography A, 1308, 5862.
Gouveia, S., Castilho, P. C. (2011). Characterisation of phenolic acid derivatives and
flavonoids from different morphological parts of Helichrysum obconicum by a RPHPLCDAD-()ESI-MSn method. Food Chemistry, 129, 333-344.
Parejo, I., Jauregui, O., Sanchez-Rabaneda, F., Viladomat, F., Bastida, J. & Codina, C.
(2004). Separation and characterization of phenolic compounds in fennel (Foeniculum
vulgare) using liquid chromatography-negative electrospray ionization tandem mass
spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52, 3679-3687.

Bravo, L.,Goya, L. & Lecumberri, E. (2007). LC/MS characterization of phenolic

constituents of mate (Ilex paraguariensis, St. Hil.) and its antioxidant activity compared
to commonly consumed beverages. Food Research International, 40, 393-405.

Clifford, M.N., Knight, S. & Kuhnert, N. (2005). Discriminating between the Six Isomers
of Dicaffeoylquinic Acid by LC-MSn. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53,
3821-3832.

Kajdzanoska, M., Gjamovski V. & Stefova, M. (2010). Hplc-dad-esi-msn identification

of phenolic compounds in cultivated strawberries from Macedonia. Macedonian Journal
of Chemistry and Chemical Engineering, 29, 181-194.

42