Tcnicas de ADN recombinante

Clonado de genes
Objetivo: Aislamiento y amplificacin de un gen de inters para su posterior
manipulacin gentica
Pasos:
1. Aislamiento y fragmentacin de la fuente de ADN: ADNg (genmico), ADNc
(copia), producto de PCR.
2. Insercin del fragmento de ADN en un vector de clonado.
3. Introduccin y amplificacin del vector recombinante en un organismo husped.

Enzimas de restriccin (ER)

5-GATC-3

5-GGATCC -3

5-AGATCT-3

3-CCTAGG-5

3-TCTAGA-5 3-CTAG-5

Bam HI

Bgl II

Dejan extremos compatibles

Sau 3AI
Patrn de digestin del ADN con
ER en gel de agarosa

Vectores para el clonado de genes

Componentes bsicos de un vector de clonado plasmdico de E. coli

Estrategia de clonado en plsmido

Pasos:
1. Construccin de vector recombinante.
2. Transformacin de clulas competentes.
3. Plaqueo en medio selectivo con antibitico (para
seleccionar las bacterias que adquirieron el plsmido) +
IPTG y X-Gal (para identificar las bacterias que tienen
el plsmido con inserto)

4. Validacin de la presencia de inserto

mediante:
a. digestin de plsmidos de colonias + con
ER y anlisis en gel de agarosa.
b. amplificacin del inserto a partir de las
colonias (colony PCR) y gel.

Seleccin de recombinantes (screening azul-blanco): -complementacin

Otros Vectores de clonado

Fagos filamentosos (M13). Clonado en la forma

replicativa (RF, doble cadena circular) de fagos
filamentosos (M13).
Producen ADN simple cadena

Phagemids (pBs). Combina propiedades de

plsmidos y fagos filamentosos. Posee ori de fago
filamentoso (F1, M13) y ori de plsmido (pUC).
Producen ADN circular doble cadena o simple
cadena.

Vector-T: Plsmido con extremos 5- T simple cadena.

Permite clonar productos de PCR que contienen A simple cadena en extremo -3, sin previa
digestin del vector con ER.

Vector mixto (shuttle vector)

Se puede amplificar en dos organismos diferentes.
pMDS99. Posee un ori para replicacin en bacterias (ori P15A) y otro para la
replicacin en haloarqueas (ori pHV2). Tiene dos marcadores de seleccin:
Kanamicina R para bacteria y Mevinolina R para haloarqueas.

Construccin y anlisis de
genotecas de ADN genmico

En bacterifago
Capacidad de clonado ~ 25 kbp

Bibliotecas de csmidos
Digestin parcial del ADNg
con ER de corte frecuente
(Sau3A)

Purificacin de fragmentos
de ADNg del tamao
deseado

Anlisis (screening) de genotecas

1. Por hibridacin con sondas especficas

2. Con anticuerpos (inmunoscreening)
3. Screening funcional. Ej. Deteccin de halos de protelisis
4. Transposon tagging. Generacin de bacterias mutantes usando Tn, preparacin de
genoteca de la mutante y screening del gen mutado por hibridacin usando como
sonda secuencias del Tn. Usado para identificar genes relacionados con la virulencia
en bacterias patgenas.
5. Por complementacin de una mutacin.

Approximate maximum length of

DNA that can be cloned into
vectors
Vector type

Cloned DNA (kb)

Plasmid

20

lambda phage

25

Cosmid

45

P1 phage*

100

BAC (bacterial artificial chromosome)

300

YAC (yeast artificial chromosome

1000

Bacs y Yacs usados para construir genotecas apropiadas para la secuenciacin de

genomas completos de un microorganismo

Expresin heterloga de protenas recombinantes

El gen clonado se expresa en un tipo celular diferente al organismo de origen.
Propsito: Obtener cantidad suficiente de la protena de inters para su caracterizacin y/ o
para su aplicacin biotecnolgica.

Elementos tpicos de un vector

de expresin
La secuencia nucleotdica del inserto se
debe clonar en fase con el codn de
inicio de la traduccin (ATG) del vector.

Expresin en bacterias. (E. coli)

Ventajas:
- Fisiologa y gentica muy conocida
- Fcil manipulacin en laboratorio
- Relativo bajo costo
Desventajas:
No produce muchas de las
modificaciones post-traduccionales
requeridas para la expresin de
protenas de eucariotas

- IPTG

+ IPTG

Plsmido de expresin pET

Promotor T7 y operador lac (regin reguladora)
rbs: sitio de unin al ribosoma
Sitios mltiples de clonado dentro del gen lacZ
(NdeI contiene codn inicio traduccin ATG)
His-tag: cola de polihistidina + codn stop (TGA)
Terminador transcripcional T7

Clonado y expresin del gen de una proteasa extracelular de arquea halfila (Nep)
en dos sistemas heterlogos:
a. E coli (bacteria)
b. Haloferax volcanii (arquea halfila extrema)
E. coli Rosetta (DE3)

Gen de inters: nep

pET-24b(+)
nep::His6
Nde I
Bpu 1102 I
Hind III
Nde I

Hfx. volcanii DS70

Bpu 1102 I

pJAM
nep::His6

Anlisis de colonias recombinantes

- PCR
- crecimiento en placas con casena
- Actividad azocaseinoltica

Se analiza la expresin
de la protena de inters
por SDS-PAGE y
determinacin de
actividad proteasa

Expresin de nep en E. coli

SDS-PAGE y tincin con azul de Coomassie de las protenas celulares (C) y del
medio de cultivo (M) de E. coli recombinante conteniendo el plsmido pET-nepHis6

La protena recombinante se sintetiz eficientemente en E. coli pero no

se secret ni present actividad enzimtica

Expresin del gen de la proteasa extracelular Nep de arquea halfila (Natrialba

magadii, Nm) en un sistema heterlogo haloarqueano (Haloferax volcanii, Hv)

La protena recombinante se sintetiz y secret eficientemente en H.v. y

present actividad enzimtica

Manipulacin de genes bacterianos

Tcnicas de mutagnesis dirigida. Permite cambiar

bases en la secuencia nt de un gen.

Usos: determinar actividad biolgica de protenas con sustituciones de AA conocidas.
Mediante PCR

Mutagnesis sitio dirigida usando un oligo sinttico

El inserto se clona en un
vector que produzca copias
simple cadena del inserto
(fago M13) necesarias para
usar como templado.

Cassette mutagnesis y
disrupcin gnica

Cassette: fragmento de ADN

sinttico, lleva gen resistencia a Ab. Se
usan para reemplazar o interrumpir un
gen y generar una mutacin.
Disrupcin gnica por cassette
mutagnesis
Se anula la funcin de un gen dado por
mutagnesis por insercin. Genera
mutacin knockout (KO).
En procariotas (haploides) las clulas
KO son viables slo si el gen no es
esencial.
El plsmido con el cassette se linealiza
para impedir su replicacin en la
bacteria transformada, por la tanto, las
clulas resistentes surgen por RH y
poseen slo una copia del gen (la
mutante por insercin)