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PROCEDIMENTO

OPERACIONAL PADRO

Padro n:
POP.LAB.005
Estabelecido em:
05/2016
N da Reviso: 01

ATIVIDADE: Exame Parasitolgico de Fezes


RESPONSVEL: Biomdica Franciele

Exame de fezes
1- Receber as fezes em recipiente adequado.
2- As amostras devem ser correta e completamente identificadas com: o nome do
paciente; idade, nmero de identificao do laboratrio; hora da colheita e hora da
chegada da amostra ao laboratrio.
As instrues, sobre a coleta de fezes devem ser claras e passadas ao paciente.
importante verificar se o paciente as entendeu, pois na coleta adequada que se inicia a
qualidade do exame parasitolgico.
3- Para um trabalho rotineiro em Parasitologia recomendvel que se realize trs
exames parasitolgicos em dias alternados.
4- Todos os parasitas observados devem ser relatados pelo nome cientfico, incluindo
gnero e espcie, quando possvel, e o estgio que esto. Determinados elementos
celulares (GV, GB ou outras clulas), fungos ou cristais de Charcot-Leyden devem ser
assinalados de modo semiquantitativo como: poucos cristais, moderados ou muitos.
Tambm, devero constar os mtodos executados e a consistncia das fezes.
5- Fezes lquidas devem ser examinadas dentro de 30 minutos; semi-slidas dentro de 1
hora e formadas dentro de 24 horas. Se o exame for realizado depois de 24 horas a
amostra deve ser mantida em conservadores tais como: formol a 10%, lcool
polivinlico (PVA); o MIF conservador muito difundido composto de mertiolato ou
mercurocromo, iodo e formol e o SAF que um fixador usado para conservar cistos e
trofozotos.
A proporo utilizada de trs partes de qualquer um dos conservadores para uma parte
de fezes. Essa mistura deve ser bem homogeneizada.
* O formol e o MIF preservam ovos, cistos e trofozoitos para exames a fresco; PVA e o
SAF preservam trofozoitos para colorao permanente.
Formol a 10%
Formol comercial 10ml.
Soluo salina a 0,85% 90ml.

Fixador lcool Polivinlico (PVA)


Utilizada para conservar e transportar fezes lquidas. A proporo adequada de 2 a
3ml. de fezes para 8 a 10ml.de soluo de PVA.
*Bicloreto de mercrio,
Soluo aquosa saturada 312ml.
lcool etlico a 95% 156ml.
cido actico glacial 25ml.
** PVA em p 20g.
Glicerina 7,5ml.
* Preparar o bicloreto de mercrio dissolvendo 130 a 140 g. de sal em 1000 ml de gua
destilada. Aquea para dissolver, aps o resfriamento filtre e estoque em uma garrafa.
** Coloque o PVA em p no lcool agitando lentamente. Aquea a 75C (banho Maria)
e agite at que a soluo fique transparente. Acrescente os outros reagentes e deixe
esfriar. Guarde em um frasco fechado e use conforme a necessidade. Decante a soluo
sem suspender o sedimento.
MIF
gua destilada 250ml.
Sol. mercuriocromo a 1:500 250ml.
Formol 25ml.
Glicerina 5ml.
SAF
Acetato de sdio 1,5g
cido actico 2,9ml.
Formol 40% 4,0ml.
gua destilada 92,5ml.
5- Rejeitar fezes contendo meio de contraste para Raios X (sais de brio), somente
colher as fezes 5 a 10 dias aps a ingesto de sais de brio.
6- No administrar purgativos tais como: leo mineral, leo de castor ou supositrios,
porque impossvel pesquisar protozorios.

EXAME MACROSCPICO
Procedimentos
1- Observar a consistncia da amostra.
Fezes moles ou lquidas sugerem a possvel presena de trofozotos de protozorios
intestinais. Cistos de protozorios so encontrados com mais freqncia em fezes
formadas. Ovos e larvas de helmintos podem ser encontrados tanto em fezes lquidas
quanto em fezes formadas.
2- Examinar a superfcie da amostra para observar a presena de proglotes de tnias,
ancilostomdeos ou oxiros adultos, por exemplo.
3- Examinar a amostra fecal com auxlio de um palito (sorvete) para verificar a presena
de outros helmintos adultos.
4- Examinar as fezes quanto presena de sangue e/ou muco.
a) sangue fresco (vermelho vivo) indica hemorragia aguda no trato intestinal.
b) muco sanguinolento sugere ulceraes e uma poro desse material deve, de
preferncia, ser examinada, ao microscpio, para a procura de trofozoitos.
Os vermes adultos, quando encontrados, devem ser imediatamente examinados e
identificados.
As tnias so identificadas especificamente pelo exame das proglotes grvidas. As
proglotes devem ser fixadas em formol a 10% e depois clarificadas por imerso em
glicerina ou soluo de lactofenol (1:1).
EXAME MICROSCPICO
Permite a visualizao de trofozoitos, cistos e oocistos de protozorios e de ovos e
larvas de helmintos.
recomendvel, como rotina, o emprego de 03 procedimentos distintos
a) exame direto a fresco, para observao dos movimentos do trofozoito,
b) tcnicas de concentrao de parasitas
c) um esfregao de fezes com colorao permanente

O exame pode ser quantitativo ou qualitativo. Os mtodos quantitativos so aqueles


nos quais se faz contagem de ovos para avaliao da carga parasitria. O mais
conhecido o de Stoll, mas, o mais empregado atualmente o de Kato-Katz.
Os mtodos qualitativos so os mais utilizados para a demonstrao da presena das
formas parasitrias. Freqentemente o nmero das formas parasitrias pequeno, assim
necessrio recorrer a processos de enriquecimento dessas formas para concentr-las.
Os principais mtodos de enriquecimento ou de concentrao utilizados so:
Sedimentao espontnea: mtodo de Hoffmann, Pons e Janer ou mtodo de Lutz.
Este mtodo permite o encontro de ovos e larvas de helmintos e cistos de protozorios;
Sedimentao por centrifugao: Mtodo de Blagg, conhecido por MIFC; Mtodo de
Ritchie, e o Coprotest. Usados para a pesquisa de cistos de protozorios e de ovos e
larvas de helmintos.
Flutuao: Mtodo de Willis. Indicado para pesquisa de ovos leves (ancilostomdeos).
Centrfugo-flutuao: Mtodo de Faust. Utilizado para pesquisa de cistos e oocistos de
protozorios e de ovos leves.
Concentrao de larvas de helmintos: Mtodo de Baermann-Moraes e o mtodo de
Rugai usados para pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.
As fezes enviadas ao laboratrio clnico devem ser submetidas a um desses mtodos
citados. Como no existe um mtodo capaz de diagnosticar, ao mesmo tempo, todas as
formas parasitrias o que se faz de rotina o emprego de um mtodo geral como o de
Lutz ou de Hoffmann, Pons e Janer (de fcil execuo e pouco dispendioso), um
especfico para cistos de protozorios e um para a pesquisa de larvas de helmintos.

Exame direto a fresco


1- Colocar duas a trs gotas de salina a 0,85% em uma lmina de vidro.
2- Tocar com a ponta de um palito em vrios pontos das fezes, transferindo uma
pequena poro para a lmina de microscopia.
3- Espalhar as fezes, fazendo um esfregao e examinar ao microscpio. A espessura do
esfregao no deve impedir a passagem de luz.
4- Este mtodo indicado principalmente para a pesquisa de trofozoitos de protozorios
em fezes diarricas recm emitidas; para a identificao de cistos de protozorios e
larvas de helmintos cora-se a preparao com Lugol. O uso de lamnula facultativo.
Soluo de Lugol
Iodo 2g
Iodeto de potssio 4g
gua destilada 100ml
Mtodo de Lutz ou de Hoffmann, Pons e Janer (sedimentao espontnea).
1- Colocar aproximadamente 2g de fezes em um frasco de Borrel ou em um copo
plstico descartvel, com cerca de 5 ml de gua e dissolver bem com auxlio de um
palito de sorvete descartvel.
2- Acrescentar mais 20 ml de gua
3- Coar a suspenso (para isto, usa-se gaze cirrgica umedecida, dobrada em quatro, e
colocada em um coador de plstico pequeno) num clice cnico de 200 ml de
capacidade. Os detritos retidos na gaze so lavados co mais 20 ml de gua.
4- Completar o volume do clice com gua.
5- Deixar essa suspenso em repouso durante duas a 24 horas.
6- Desprezar o lquido sobrenadante cuidadosamente, homogeneizar o sedimento e
coletar uma poro do mesmo.
7- Colocar parte do sedimento numa lmina, corar com Lugol e cobrir com lamnula
(facultativo). Examinar no mnimo duas lminas de cada amostra.
Mtodo de MIFC ou de Blagg (sedimentao por centrifugao).
1- Coletar as fezes recm emitidas em lquido conservador de MIF.
2- Homogeneizar bem.

3- Coar a suspenso em gaze cirrgica dobrada em quatro num copo descartvel.


4- Transferir 1 a 2 ml do filtrado para um tubo cnico com capacidade para 15ml.
5- Acrescentar 4 a 5 ml de ter sulfrico e agitar vigorosamente (desengordura a
amostra fecal).
6- Centrifugar por um minuto a 1.500 rpm.
7- Com auxlio de um basto, descolar a camada de detritos gordurosos da parede do
tubo.
8- Inverter o tubo para desprezar o lquido e limpar as paredes com um basto contendo
algodo na extremidade.
9- Acrescentar ao sedimento gotas de Lugol.
10- Coletar 2 a 3 gotas do sedimento, cobrir com lamnula e examinar com as objetivas
10x e/ou 40x.
Mtodo de Ritchie modificado ou formol-acetato de etila.
1- 5 a 15g de fezes (uma colher de ch) de fezes recentes so homogeneizados em 10 a
15 ml de formol a 10%, em um frasco Borrel, com auxlio de um basto ou palito.
2- Coe a mistura com gaze umedecida e dobrada em quatro e a transfira para um tubo
cnico de centrfuga. (No coar amostra que contenha grande quantidade de muco.
Neste caso, centrifugar a mistura a 1500 rpm por 10 minutos, desprezar o sobrenadante
e examinar o sedimento).
3- A suspenso centrifugada, vrias vezes, a 500g (1500 rpm.) 1 minuto, at se obter
um sobrenadante claro.
4- O sobrenadante desprezado e o sedimento ressuspenso em 4 ml de acetato de etila.
Arrolhe o tubo e agite o tubo vigorosamente por 30 segundos. Retire cuidadosamente a
rolha do tubo, pois o vapor formado pode provocar um jato de detritos fecais. Esta etapa
remove as gorduras das fezes.
5-Centrifugar o tubo novamente. H formao de 4 camadas: a de acetato de etila (a
mais superficial); detritos fecais; formol e o sedimento contendo os parasitas (no fundo
do tubo).
6- Depois que a camada de detritos for retirada com um basto, todo sobrenadante
descartado, virando o tubo de centrfuga com movimento suave, mas de uma s vez.

7- O sedimento homogeneizado, agitando o tubo entre os dedos. Uma gota de


sedimento fecal misturada com uma gota de Lugol e levada para exame ao
microscpio.
importante ressaltar que o acetato substitui o ter. mais seguro por no ser
inflamvel, porm, ele pode dissolver tubos de plstico. O acetato em excesso aparece
como bolhas quando se faz a lmina.
Coprotest
um processo simplificado e seguro de sedimentao por centrifugao.
O paciente adquire na farmcia o Coprotest que j vem com o conservador (formol a
10%), coloca as fezes no coletor, fecha o frasco e agita por 2 minutos para
homogeneizar e as envia para o laboratrio.
A amostra de fezes homogeneizada recolhida em um tubo de centrfuga, acrescenta-se
3 ml de acetato de etila ou ter, agita-se e a mistura centrifugada por 3 minutos.
Desprezando-se os detritos e o lquido sobrenadante e acrescenta-se uma gota de Lugol
ao sedimento. Duas ou trs gotas do sedimento so recolhidas numa lmina, cobertas
com lamnula e examinadas ao microscpio.
Mtodo de Faust (centrfugo-flutuao em sulfato de zinco)
1- Diluir 10g de fezes em 20 ml de gua
2- Homogeneizar bem.
3- Filtrar em gaze dobrada em quatro, num copo plstico, e transferir para um tubo de
Wasserman.
4- Centrifugar por um minuto a 2.500 rpm.
5- Desprezar o lquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em gua
6- Repetir as operaes 4 e 5 at que o sobrenadante fique claro.
7- Desprezar o sobrenadante claro e ressuspender o sedimento com uma soluo de
sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18 g/ml.
8- Centrifugar novamente por um minuto a 2.500 rpm.
9- Os cistos e os ovos leves presentes estaro na pelcula superficial; a mesma
recolhida com ala de platina, colocada numa lmina junto com uma gota de Lugol e
coberta com lamnula.
O material deve ser examinado imediatamente. O sulfato de zinco pode deformar os
cistos e os ovos.

Mtodo de Willis
1- Colocar 10g de fezes num frasco de Borrel ou no prprio recipiente onde esto as
fezes
2- Homogeneza-las com um pouco de soluo saturada de sal (NaCl) ou de acar
3- Completar o volume at a borda do frasco.
4- Colocar na boca do frasco uma lmina, que dever estar em contato com o lquido.
5- Deixar em repouso por 5 minutos.
6- Findo esse tempo, retirar rapidamente a lmina, deixando a parte molhada voltada
para cima.
7- Cobrir com lamnula, corar com Lugol e examinar com objetiva 10x.
Mtodo de Baermann-Moraes
1- Colocar 8 a 10g de fezes numa gaze dobrada em quatro sobre um funil de vidro,
contendo um tubo de borracha conectado extremidade inferior de sua haste.
2- Obliterar o tubo de borracha com um pina de Hoffman e adicionar, ao funil, gua
aquecida (45C) em quantidade suficiente para entrar em contacto com as fezes.
3- Deixar uma hora em repouso.
4-Colher 5 a 7 ml da gua em um tubo de centrfuga, abrindo-se a pina.
5- Centrifugar um minuto a 1.000 rpm.
6- Coletar o sedimento, corar com Lugol e examinar ao microscpio com objetiva 40x.
Mtodo de Rugai
1- Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolv-lo em ter gazes,
fazendo uma pequena trouxa.
2- Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, num clice de
sedimentao, contendo gua aquecida (45C), em quantidade suficiente para entrar em
contato com as fezes.
3- Deixar em repouso por uma hora
4- Coletar o sedimento no fundo do clice, com ajuda de uma pipeta.

5-Corar as larvas com Lugol e observ-las com o maior aumento para identific-las.
Fezes diarricas (as larvas morrem muito rapidamente) ou coletadas em conservador
no se prestam para esses mtodos.
Mtodo de Kato-Katz (Mtodo de Kato modificado por Katz e cols.).
1- Preparar uma soluo de verde de malaquita de acordo com a seguinte frmula:
Glicerina 100 ml
gua destilada 100 ml
Verde malaquita a 3% 1 ml
Essa soluo conserva as fezes e clarifica as formas parasitrias.
2- Cortar papel celofane semipermevel em pedaos de 24 mm por 30 mm e deix-los
mergulhados na soluo de verde-malaquita por pelo menos 24 horas.
3- Colocar, sobre um papel, uma pequena quantidade da amostra fecal.
4- Comprimir as fezes com um pedao de tela metlica (marca Ibras, n 120, fios e
trama: 0,09mm) ou similar de nilon.
5- Retirar as fezes que passaram para a parte superior da tela e transferi-la, com o
auxlio de um palito, para o orifcio (6 mm de dimetro) de um carto retangular de
plstico, colocado sobre uma lmina de vidro.
6-Aps encher completamente o orifcio, retirar o carto cuidadosamente, deixando as
fezes (42 mg) sobre a lmina.
7- Cobrir as fezes com o papel celofane. Inverter a lmina sobre uma folha de papel e
comprimi-la.
8- Aps uma hora, examinar ao microscpio contando os ovos presentes na preparao.
9- O nmero de ovos encontrados, na preparao fecal, multiplicado por 23,
corresponder ao n de ovos por grama de fezes.
Na rotina laboratorial usa-se, com maior freqncia, o mtodo qualitativo. Assim, no
h necessidade de se utilizar o carto retangular.
Este mtodo indicado para pesquisa de ovos de S. mansoni, A. lumbricoides, T.
trichiura e Ancylostomidae. Cistos de protozorios no so visualizados nessa
preparao.
No possvel a execuo deste mtodo em fezes diarricas.
Outros procedimentos de diagnstico.
Mtodo de Henriksen e Pohlenz (pesquisa de oocistos)
Nos ltimos anos, parasitas intestinais como: Cryptosporidium parvum, Isospora belli e
os microspordeos vm causando doenas diarricas graves em pacientes
imunodeprimidos. Como esses parasitas podem ser de difcil identificao pelos
mtodos usuais de rotina, impe-se utilizao do mtodo de colorao cido-resistente
para a sua pesquisa.
Para execuo desse mtodo, as fezes (frescas, preservadas em formol a 10% ou em
SAF) devero ser previamente concentradas pelo mtodo de MIFC ou de acetato de
etila, aumentando-se o tempo de centrifugao para 10 minutos. Fezes preservadas em
PVA no apresentam bons resultados. Mtodos de sedimentao pelo formol-ter ou
centrfugo-flutuao com soluo saturada de sacarose ou soluo de Sheather tambm
so utilizados para concentrar os oocistos.
1- Preparar um esfregao delgado com parte do sedimento obtido aps centrifugao.
2- Deixar secar a temperatura ambiente.
3- Fixar com lcool metlico por 5 minutos.
4- Deixar secar a temperatura ambiente.
5- Corar com o corante de Kinyoun (a frio), durante uma hora.
6- Lavar em gua corrente.

7- Diferenciar com soluo aquosa de cido sulfrico a 2% (30 segundos a um minuto)


at que no saia mais corante da lmina.
8- Lavar em gua corrente.
9- Corar o fundo com soluo de verde malaquita a 5%, por 8 minutos.
10- Lavar em gua corrente e secar.
11- Examinar com objetiva de imerso.
Corante de Kinyon (soluo salina de fucsina fenicada)
Soluo A
Fucsina bsica 1,5g
lcool etlico a 95% (v/v) 100ml

Soluo B
Fenol (fundido a 44C) 5g
gua destilada deionizada q.s.p. 100ml
Soluo corante
Soluo A 10ml
Soluo B 90ml
Filtrar a soluo e armazenar a temperatura ambiente. Estvel por um ano.
Pesquisa de trofozotos de T, vaginalis
Trichomonas vaginalis encontra-se entre os mais prevalentes dos protozorios,
propagando-se pelo contato sexual. Geralmente, o diagnstico da vaginite por T.
vaginalis feito identificando o parasito na secreo vaginal. Os trofozotos
apresentam-se com movimentos de contoro com auxlio dos flagelos muito ativos.
So vistos em preparaes, fresco, de secrees vaginais em cerca de 60% das
mulheres infectadas.
A tcnica empregada consiste na coleta de um pouco de secreo vaginal, recolhida
preferivelmente com pipeta grossa e aps colocao do especulo. A secreo
misturada com soro fisiolgico em uma lmina, cobrir com lamnula e examinar ao
microscpio.
Nos homens, uma preparao a fresco do material obtido por raspado com uma ala de
platina da uretra anterior revela o microorganismo em cerca de 60% dos casos. A
pesquisa tambm feita no sedimento urinrio. A massagem prosttica antes da coleta
da urina para a cultura da Trichomonas a abordagem diagnstica mais sensvel.
Se os parasitos forem pouco abundantes e o exame a fresco negativo, deve-se semear o
material no meio de cultura. Como os flagelados sobrevivem pelo menos 24 h na
secreo vaginal diluda com soluo de Ringer, no necessrio fazer a semeadura
imediatamente. Inocular no tubo de cultura o sedimento obtido por centrifugao.
Aconselha-se suspender a aplicao local de quaisquer desinfetantes ou de
anticoncepcionais de natureza qumica alguns dias antes da coleta. A cultura o mtodo
mais sensvel de diagnstico e existem, atualmente, kits comerciais.

Meio de Kupferberg
Empregado na cultura e isolamento de Trichomonas vaginalis.
Tripticase (BBL) 20,0 g
Cistena (cloridrato) 1,5 g
Maltose 1,0 g
gar 1,0 g
gua destilada q.s.p. 950,0 ml.
1- Aquecer a mistura em banho-maria, at a dissoluo do gar, acertar o pH a 6.
2- Filtrar ( quente) em papel de filtro de porosidade adequada (Reeve-Angel n 845, p.
ex.) e juntar 0,6 ml de uma soluo de azul de metileno a 0,5% para servir de indicador.
3- Depois de resfriar ligeiramente (em torno de 45 C), reajustar o volume para 50 ml,
com gua destilada, em pH 6.
4- Distribuir o meio em tubos de ensaio (colocando 9,5 ml em cada um) e esteriliz-los
em autoclave.
5- Depois de resfriarem naturalmente, adicionar a cada tubo 0,5 de soro humano estril.
Pesquisa de Leishmania spp.
Nas Leishmanioses Tegumentares devem ser pesquisados os parasitos mediante bipsia
ou raspagem das leses cutneas ulceradas, especialmente na borda da lcera, junto
base, aps a completa limpeza da leso. Melhor ainda e mais cmoda a puno da
borda inflamada, bem como das leses no ulceradas, mediante aspirao com agulha
fina. Tambm se pode injetar um pouco de soro fisiolgico no tecido lesado e aspir-lo,
em seguida, para preparar uma lmina fixada e corada.
As lceras novas so ricas de parasitos que, depois, vo se tornando raros. Os
amastigotas sero vistos no interior dos macrfagos ou espalhados na lmina, quando
estes se rompem.

Com o material de bipsia faz-se impresso ou imprint (por aposio) sobre lminas
de microscopia e cor-la com Giemsa, para exame ao microscpio ou se utiliza para a
preparao de cortes histolgicos.
Na Leishmaniose visceral o encontro do parasito constitui requisito bsico para o
diagnstico. A sorologia til para uma triagem de casos, quando for difcil demonstrar
a presena de leishmnias, geralmente, no incio da infeco ou em formas benignas e
autolimitantes.
O material para exame pode ser coletado de vrios rgos como:
1- Puno das vsceras. Os parasitos podem ser encontrados no material aspirado do
bao (98% dos casos do resultados positivos), da medula ssea (54 a 86% de positivos)
ou de linfonodos aumentados de volume (64% dos casos).
Alguns autores recomendam a puno do bao como mtodo de escolha, porm a
maioria prefere a puno do esterno (em adultos) ou da crista ilaca (em crianas), para
evitar os riscos de ruptura do bao e hemorragia interna.
Com o material aspirado, preparar esfregao em camada delgada na lmina de vidro,
fixar e corar com Giemsa ou por mtodo equivalente.
2- Sangue. Elas podem ser encontradas, eventualmente, no interior de moncitos,
devendo a pesquisa ser feita no creme leucocitrio, obtido por centrifugao de
amostras de sangue em tubo capilar. Fixar e corar com Giemsa.
3- Pele. Esta pesquisa no faz parte da rotina diagnstica, devido escassez de parasitos
na pele, exceto nos casos de leishmaniose drmica ps calazar (difusa). Com o material
obtido faz-se um esfregao ou, no caso de bipsia, uma impresso sobre lmina de
microscopia. O material fixado com lcool metlico e corado com Giemsa.
Cultura em meio NNN.
A escassez de parasitos sempre dificulta a sua busca ao microscpio assim, o material
suspeito como raspado de leso, sangue ou aspirado de puno (nos casos de
Leishmaniose Tegumentar e Visceral) deve ser semeado no meio NNN. Os meios de
cultura (incubados a 24 - 26C) devero ser examinados 5, 7, ou 10 dias depois; mas,
caso sigam negativos, repicar para novo meio aps 15 dias. A inoculao em animal de
laboratrio (hamster) bastante sensvel, porm no prtica porque requer meses para
positivar.

Meio de NNN (Novy, McNeal e Nicolle) para leishmnias.


um meio difsico, compreendendo uma base nutritiva slida e inclinada de garsangue de coelho e uma poro lquida, resultante da gua de condensao que se
acumula durante o resfriamento do meio, onde crescem os flagelados.
Em um balo de vidro, misturar:
Cloreto de sdio 6 g
Agar 14 g
gua destilada 900 ml.
Aquecer at dissolver o gar. Distribuir a mistura em frascos de cultura e esteriliz-los.
Assim podem ser mantidos temperatura ambiente at a ocasio de usar, quando cada
recipiente ser colocado em banho-maria para que a gelose se funda. Deixar que a
temperatura do meio de cultura atinja cerca de 50C e adicionar sangue de coelho
desfibrinado na proporo de 15%, agitando suavemente para assegurar mistura
completa. Deixar solidificar, mantendo os tubos inclinados. Ao lquido de condensao
deve-se adicionar antibitico (gentamicina p.ex.) para prevenir contaminao
bacteriana.
Meio LIT
Este meio, que serve para tripanossomos e leishmnias, designado pelas iniciais de
Liver Infusion Tryptose. Quando usado para cultura de leishmnias, ele deve constituir
a fase lquida do meio, sobre uma base slida do meio NNN.
Em um balo de vidro de 1.000 ml, colocar
NaCl 4,0 g
KCl 0,4 g
Na2 PO4 8,0 g
Glicose 2,0 g
Triptose 5,0 g
Infuso de fgado 5,0 g
gua destilada 800,0 ml.
A infuso de fgado (Liver infusion da Difco ou Oxford) dissolvida em banho-maria,
durante 10 minutos em ebulio. Filtrar em papel de filtro. Acertar o pH para 7,2 com
soluo de HCl 2N. Ao filtrado, juntar 100 ml de soro bovino e colocar em banho-maria
a 68C durante uma hora. Deixar esfriar e adicionar 20 ml de hemoglobina de boi.
Para conserv-lo, conveniente distribuir o meio em frascos de Erlenmeyer de 125 ml
(30 ml por frasco) e guard-lo em freezer. Antes de us-lo, descongelar temperatura
ambiente e fazer o teste de esterilidade em estufa a 28C.

Mtodo de Graham ou da fita gomada (swab anal)


Este mtodo utilizado para pesquisa de ovos de Taenia solium, T. saginata e de
Enterobius vermicularis. Esta tcnica deve ser feita pela manh, antes que o paciente
defeque ou tome banho, e repetida, em dias sucessivos, caso d negativo.
1- Fixar, em uma lmina, uma tira de 5 a 6 cm de fita durex transparente, colocando, nas
duas extremidades, tiras de papel de aproximadamente 4cm. (as quais serviro de
suporte para segurar e para identificao do material).
2- Destacar a fita da lmina e colocar sobre o fundo de um tubo de ensaio ou ao redor de
um abaixador de lngua com o lado aderente voltado para fora.
3- Afastar as ndegas e aplicar a superfcie aderente da fita na regio perianal, fazendo
movimento de vaivm para tocar o mximo possvel na mucosa perianal.
4- Remover a fita e distend-la sobre uma lmina de microscopia, com o lado aderente
voltado para baixo. Pressionar firmemente para evitar que fiquem bolhas de ar.
4- Examinar ao microscpio com objetivas 10x e 40x.
Colorao de trofozotos intestinais pela hematoxilina frrica (Tcnica modificada
por Corra e cols. 1994)
Reagentes
1- Lquido de Schaudinn (fixador)
Soluo saturada de bicloreto de mercrio 200 ml
lcool a 95% 100 ml
No momento de uso adicionar 2,5 ml de cido actico para cada 50 ml.
2- Almen de ferro a 2,5%
Triturar os cristais de almen de ferro em Graal e diluir aos poucos com gua destilada.
Completar o volume.

3- Hematoxilina a 0,5%
Hematoxilina 0,5 g
lcool a 95% 10 ml
gua destilada 90 ml
Diluir a hematoxilina no lcool e acrescentar a gua destilada. Aps 72 horas de
maturao, o tempo de exposio do material a ser corado, dever ser de trs minutos.
4- lcool-salicilato
lcool absoluto p.a. 100 ml
Salicilato de metila 100 ml
Tcnica
1) Filtrar as fezes, conservadas em Schaudinn ou SAF, em gaze dobrada quatro vezes.
2) Transferir cerca de 2 ml para um tubo e centrifugar por um minuto a 1.500 rpm.
3) Desprezar o sobrenadante, acrescentar soluo salina a 0,85%, homogeneizar e
centrifugar novamente.
4) Repetir a operao at obter um sobrenadante lmpido
5) Desprezar o sobrenadante e acrescentar, ao sedimento, duas gotas de soro humano
inativado.
6) Misturar bem e fazer esfregaos finos sobre lamnulas. A lamnula deve ser presa a
um suporte de borracha pequeno (pode ser utilizada a borracha que serve de rolha em
vidro de penicilina) por meio de um entalhe, para facilitar o manuseio e a identificao
do material. Desta forma, possvel a colorao de vrias amostras ao mesmo tempo.
7) Sem deixar secar o esfregao, colocar a lamnula com o esfregao voltado para baixo,
em uma placa de Petri contendo o fixador de Schaudinn com 5% de cido actico por 10
minutos.
8) Passar a lamnula com o esfregao voltado para cima para as placas de Petri
subseqentes, contendo os seguintes reagentes:

a) lcool 70% (para retirar o excesso de fixador) 2 minutos


b) lcool 70% iodado, isto , contento alguma gotas de tintura de iodo at atingir a cor
de vinho do porto (para reagir com o mercrio) 5 minutos
c) lcool 70% (para precipitar o mercrio) 2 minutos
d) lavar em gua destilada (para retirar o excesso de mercrio) 1 minuto
e) almen de ferro 2,5% (mordente que fixa o corante) 10 minutos
f) lavar em gua destilada (para retirar o excesso de ferro) 1 minuto
g) hematoxilina 0,5% (corante) 5 minutos
h) lavar em gua destilada (para retirar o excesso do corante) 5 minutos
i) almen de ferro 2,5% (diferenciador). Obs: O esfregao deve permanecer nessa
soluo at atingir uma colorao lils clara azulada.
j) lavar em gua destilada 1 minuto
k) lcool 70% (desidratar) 2 minutos
l) lcool 80% (desidratar) 2 minutos
m) lcool 95% (desidratar) 2 minutos
n) lcool absoluto (desidratar) 2 minutos
o) lcool-salicilato (para preparar o material para diafanizar) 2 minutos
p) salicilato de metila 2 minutos
9) Montar em lmina de vidro com blsamo-do-canad ou em resina sinttica com o
esfregao voltado para baixo.
10) Deixar secar e examinar com objetiva de imerso.

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