UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP

CAMPUS DE ASSIS
CURSO DE FARMCIA 5SEMESTRE

ELINE PICOLOTO CERON

C1194B2

TESTE ELISA (Ensaio de Imunoadsoro ligado Enzima)

DISCIPLINA: IMUNOLOGIA CLINICA
DOCENTE: PETERSON TERRAZAS

Assis
2016

INTRODUO
A quantificao da concentrao de antgenos e anticorpos feita
atravs dos mtodos imunolgicos e apresentam uma grande sensibilidade e
especificidade, tornando estes mtodos como padro na pesquisa e aplicaes
clinicas. E entre estas tcnicas um dos mais utilizados o ELISA, do ingls
Enzyme-linked immuno sorbent assay (Ensaio de Imunoabsoro Ligado a
Enzima) um mtodo eficiente que permite detectar quantidades de protena
da ordem de nanogramas.
um ensaio no qual, uma enzima, reage com um substrato produzindo
um produto colorido, o anticorpo especifico (monoclonal ou policlonal) ligado
quimicamente (covalentemente) a enzima, reconhecendo um antgeno alvo, se
estiver presente, o complexo anticorpo-enzima liga-se a ele e a enzima
catalisar a reao, portanto o produto colorido indicativo da presena deste
antgeno.
Simplificando esta tcnica se baseia em reaes antgeno-anticorpo
detectveis atravs de reaes enzimticas e a enzima mais utilizada para este
mtodo a peroxidase, que hidrolisa a gua oxigenada em gua e gs
oxignio, e mudando a cor ou a fluorescncia do complexo sinaliza a atividade
da enzima, que sinaliza a presena do segundo anticorpo e por fim detecta a
presena do antgeno procurado.
O mtodo diagnostico pode ser feito de quatro formas, sendo realizadas
a partir de amostras sorolgicas do paciente, indiretamente, diretamente, por
competio e sanduiche, como mostrado na figura abaixo:

A tcnica direta detecta os anticorpos, principalmente IgM, na amostra

analisada e evita a ao do fator reumatoide. O indireto revela anticorpos
presentes nesta amostra. Para a tcnica de Elisa sanduiche detectado
antgenos e para o Elisa por competio so revelados antgenos de baixo
peso molecular (monovalentes).
1 Elisa indireto
O Elisa indireto a forma mais simples, onde um antgeno aderido a um
suporte slido (placa de ELISA) preparado; a seguir coloca-se sobre este os
soros em teste (ex. soro humano), na busca de anticorpos contra o antgeno.
Se houver anticorpos no soro em teste ocorrer a formao da ligao
antgeno-anticorpo, que posteriormente detectada pela adio de um
segundo anticorpo dirigido contra imunoglobulinas da espcie onde se busca

detectar os anticorpos (humana, no caso), a qual ligada peroxidase. Este

anticorpo anti-IgG, ligado enzima denomina-se conjugado.
Ao adicionar-se o substrato apropriado para a enzima (isto , H2O2
dissolvida em uma substancia qumica que d uma reao colorida quando
H2O2 desdobrada). Os orifcios onde ocorreu a reao antgeno-anticorpo
apresentam uma colorao (varivel dependendo do substrato).
E a intensidade da cor no final da reao proporcional a concentrao
dos anticorpos presentes na amostra; e por isso este ensaio colorimtrico. A
leitura da intensidade da cor obtida em espectrofotmetros, adaptados
leitura de placas, e estes resultados so dados em Densidade ptica (DO), a
qual proporcional concentrao de anticorpos na amostra.
O passo a passo desta tcnica exemplificado como mostra as figuras
abaixo:

Este mtodo utilizado para o diagnstico de doenas

infectocontagiosas, onde a deteco de anticorpos IgG, IgA e IgE sejam
significativas, determinando se o paciente j teve ou no, contato com o agente
causador da doena em algum momento de sua vida, como por exemplo
diagnostico sorolgico da Doena de Chagas e da AIDS.
Para a deteco de anticorpo IgM recomendado utilizar o Elisa de
captura (sanduiche), pois o fator reumatoide um auto anticorpo geralmente da
classe IgM especifico para IgG, ele pode ligar-se na IgG especifica (contra o
antgeno teste) presente no soro do paciente, gerando assim um resultado
falso positivo caso use um conjugado anti-IgM, como o caso do Elisa indireto.
2 Elisa sanduiche
O mtodo de sanduche, ou captura, indicado para identificao de
antgenos, e este antgeno fica entre dois anticorpos. Assim, um anticorpo
primrio especfico ao antgeno adsorvido no poo da microplaca. Em
seguida o antgeno na soluo problema adicionado. Depois o segundo
anticorpo especfico ao antgeno marcado com uma enzima adicionado.
Esta enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromgeno mude
de cor. A presena de cor nos poos indica a presena do antgeno, e os poos
que no mudarem de cor indica a ausncia do antgeno em questo. A figura a
seguir mostra todo o procedimento desta tcnica:

Para que este teste se torne quantitativo necessrio a construo de

uma curva com os valores de densidade ptica obtidos a partir da reao com
quantidades conhecidas (padres) do antgeno a ser dosado.
empregado para dosagem de hormnios, marcadores tumorais e outras
protenas sricas, bem como para a deteco de antgenos virais e de outros
patgenos.
2.1 Elisa por captura
Neste tipo usa-se um anticorpo monoclonal especifico contra uma
determinada substancia para sensibilizar a placa. A reao vai determinar a
presena de um antigeno ou de uma substancia no soro teste. Como segue na
figura abaixo:

O resultado pode ser tambm apenas qualitativo, semi quantitativo e

quantitativo. A dosagem de citocinas, por exemplo, feita por este mtodo.
3 Elisa por competio
Outro mtodo o chamado ELISA de competio, em que a presena
de anticorpos em determinado soro revelada pela competio com um
anticorpo especfico (mono ou policlonal) dirigido contra o antgeno.
Igualmente, o resultado dado pela adio de um conjugado, porm
a colorao aparecer nos poos onde no havia anticorpos.
Neste mtodo primeiro se adsorve o anticorpo no poo da placa. Aps a
adsoro do anticorpo, uma soluo que possivelmente contm o antgeno
adicionada sobre os anticorpos adsorvidos. O prximo passo adicionar o
antgeno marcado com uma enzima. Os poos que no possuem o antgeno
primrio (da soluo problema) aderido ao anticorpo ficam coloridos, enquanto
que os poos que possuem antgenos aderidos aos anticorpos no mudam de
cor. O passo a passo desta tcnica observada na figura abaixo:

4 Elisa direto
uma tcnica utilizada para a deteco de antgeno, sendo assim, pegase uma placa contendo anticorpos para a patologia a ser analisada. Coloca-se
o soro do paciente nos poos da placa, se existir presena de antgenos, estes
se ligaro aos anticorpos presentes na placa, formando um complexo
anticorpo-antgeno. Depois realizada uma lavagem da placa, para a retirada
dos antgenos no ligados, adiciona-se um anticorpo para este antgeno,
formando um complexo anticorpo-antgeno-anticorpo.
Leva-se para a incubao e aps realiza-se outra lavagem da placa,
retirando assim os anticorpos que no formaro o segundo complexo. Adicionase um anti-anticorpo conjugado (por exemplo uma enzima como a peroxidase)
formando um terceiro complexo anticorpo-antgeno-anticorpo-anti-anticorpo
conjugado, lave-se novamente a placa, retirando o excesso de anti-anticorpo
conjugado, no ligado ao complexo. Quando o conjugado umaenzima,
adiciona-se um substrato para a enzima, este ao ligar-se a enzima do
complexo, forma um produto colorido. Como mostra a figura a seguir:

CONCLUSO
Podemos observar que o mtodo de Elisa ou ensaio imunoenzimtico
utilizado para diversos diagnsticos, inclusive para o vrus do HIV

REFERNCIA
DIAGNSTICO DO HIV. Disponvel em
<http://telelab.aids.gov.br/moodle/pluginfile.php/22167/mod_resource/content/1/
HIV%20-%20Manual%20Aula%205.pdf>.Acesso em: 26 de maio de 2016.

http://pt.slideshare.net/labimuno/ap10-elisa-presentation
http://pt.slideshare.net/labimuno/elisa-3454963