Seleccin de pptidos mediante

tecnologa de Phage Display que son

ligando de 3cTNFR2
Retamal Snchez Pedro Andrs; Laboratorio de Biofrmacos recombinantes, Departamento de Farmacologa,
Facultad de ciencias biolgicas, Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile.
Tutor: Dr. Oliberto Snchez Ramos.

El desarrollo de nuevas terapias farmacolgicas de vanguardia se ha acrecentado en las

ltimas dcadas gracias a la implementacin por parte de empresas biofarmacuticas del
conocimiento generado en ciencia bsica, permitiendo el escalamiento de nuevas terapias,
generando un nicho rentable y al mismo tiempo robusto en cuanto a produccin que en
combinacin han contribuido a un abaratamiento de costos en los tratamientos desarrollados, por
lo cual, siguiendo esta temtica, en este trabajo se realiz la expresin en clulas HEK-293 de la
protena 3cTNFR2, la cual combina la porcin extracelular del receptor de TNF Tipo 2 y el domino
de trimerizacin de colgeno tipo XV, generando una protena recombinante que fue purificada y
confirmada su identidad mediante ensayos de Western-Blot, determinndose la pureza relativa de
las purificaciones mediante densiometra con un valor sobre un 95%. Se realizaron rondas de
seleccin con fagos filamentosos que exponen sobre su superficie una biblioteca de pptidos
aleatorios como ligando de 3cTNFR2. Tras 5 rondas de seleccin y confirmacin mediante
titulacin en placas y ELISAs de las fracciones eluidas se comprob el enriquecimiento relativo de
las poblaciones de fagos seleccionados, permitiendo identificar pptidos que reconocen a 3cTNFR2
por medio de ELISA de los clones individuales y que son posibles candidatos para establecer
procesos de purificacin de afinidad basados en la interaccin de estos pptidos con 3cTNFR2.
Palabras claves: IMAC, Biofrmacos, Phage display, ELISA

Introduccin
Un biofrmaco es un producto farmacutico basado en protenas o cidos nucleicos utilizadas con
fines teraputicos o de diagnstico, y que son obtenidas a partir de organismos vivos modificados
genticamente, distintos a la fuente original (Walsh., 2004). Debido a su labilidad se administran por lo
general mediante va parenteral, ya que, si se administraran por va oral, se destruiran por los cidos y
enzimas en el estmago antes de alcanzar la va sistmica. (Banerjee., 1991). Los biofrmacos son, por lo
general, homlogos a las protenas humanas, o tienen un alto grado de similitud con las mismas, o son
macromoleculas que reaccionan con ellas. (Schllekens y col., 2002). El uso de biofrmacos se presenta
como una alternativa frente a las patologas que actualmente son tema central de la farmacologa, donde
las terapias disponibles funcionan como paliativos de la sintomatologa, controlando la enfermedad
ineficazmente (Gamboa., 2009).

La optimizacin de los bioprocesos mediante organismos recombinantes ofrece una amplia paleta de
opciones para la produccin de protenas nativas o para aquellas modificadas con nuevas y mejoradas
propiedades. Estas protenas recombinantes estn siendo producidas en la actualidad en industrias
farmacuticas.(Andersen y col., 2002), tanto asi en el ao 2002, cerca de 155 Biofrmacos desarrollados
por compaas farmacuticas haban sido aprobados. Los ltimos 10 aos, ms de 500 pptidos y
protenas teraputicas han sido aprobadas por las agencias lderes en regulacin de frmacos en el mundo
como la FDA y EMEA.(Walsh, 2004).
Un sistema de expresin lo conforma un organismo hospedero y un vector de expresin o fragmentos
de ADN que contienen los elementos gnicos necesarios para realizar los procesos de transcripcin y
traduccin en dicho organismo receptor (Martha Guerrero., 2004). La eleccin de uno u otro sistema
para expresar protenas de inters depende en gran medida de las caractersticas fsico-qumicas de la
protena a producir, su aplicacin posterior y el bioproceso que se emplear para su produccin.
(Demain., 2009), Actualmente se emplea una gran cantidad de hospederos como sistemas de expresin
para protenas de inters teraputico que van desde organismos unicelulares tales como bacterias, hongos,
levaduras y lneas celulares de mamferos o vegetales, hasta organismos completos como
animales.(Ferrer-Miralles, 2009).

Ingeniera de protenas: desarrollo e innovacin

En un intento por mejorar las propiedades farmacodinmicas y farmacocinticas de pptidos y protenas
teraputicas, se han desarrollados nuevos sistemas de liberacin de frmacos inyectables (Kompella y
col., 2001). Esto se puede lograr ya sea mediante la modificacin de la molcula en s misma (e.j. a travs
de la Pegilacin) o a travs de un cambio en la formulacin (e.j. formulaciones de liberacin controlada,
preparaciones liposomales) (Wacker y col., 2011). En cualquier caso, el objetivo principal es mejorar la
actividad teraputica de la droga. Las ventajas potenciales de las nuevas formulaciones se manifiestan en
un aumento de la duracin o prolongacin del tiempo de vida media plasmtica -que es a menudo un
prerrequisito para numerosos frmacos candidatos para su uso clnico-, una disminucin de los efectos
adversos, y una mayor adhesin al tratamiento por el paciente con la consiguiente mejora en su calidad de
vida (McLeod, H y Evans., 2001)
Oligomerizacin
Diferentes ensayos sistemticos in vivo de protenas teraputicas han proporcionado una confirmacin de
que el tamao es un parmetro importante en la farmacocintica y distribucin de estas molculas. Por
ejemplo, parece ser que molculas grandes como IgG (150 kDa) que reconocen antgenos de superficie
expresados por las clulas tumorales penetran en los tumores slidos muy lentamente, con una
distribucin no uniforme y una vida media srica muy larga (Holliger y col., 2005). Por el contrario,
pequeos fragmentos de anticuerpos o protenas pequeas monovalentes, con un tamao de 25-30 kDa
son mucho ms eficientes en la penetracin al tumor, pero son eliminados demasiado rpido y poseen
adems una pobre retencin en el tumor(Fin., 2003; Antonia Sj y col., 2003). Por ello es que muchos
investigadores han desarrollado nuevos formatos de protenas teraputicas en las que fusionando las
protenas, fragmentos de anticuerpos, porciones de receptores, etc, a dominios de oligomerizacin logran
establecer un equilibrio entre vida media y eficacia teraputica. Dado los numerosos ejemplos disponibles
es que la oligomerizacin surge como una alternativa atractiva para ser utilizada en la generacin de
protenas recombinantes fusionadas a un dominio de oligomerizacin.

Purificacin de protenas heterlogas

Antes de iniciar el proceso de purificacin de cualquier protena es necesario conocer su localizacin
celular una vez sea expresada para poder elegir correctamente la tcnica que ms se acomode a nuestra
situacin (Sassenfield., 1990). Las protenas que no son propias de la clula husped son conocidas en
el campo de la biologa como heterlogas, las cuales pueden ser expresadas como solubles o insolubles y
se pueden localizar en el espacio extra o intracelular, lo cual nos da una idea de que mecanismo es el ms
adecuado en su purificacin. El objetivo de la purificacin de una protena es extraer desde una mezcla, la
protena de inters con la cantidad mnima de contaminantes y en la concentracin adecuada. Hay
diversas tcnicas de purificacin de protenas, donde las principales son las electroforticas y
cromatogrficas(Fiedler y col., 2001). Cada una de estas tcnicas explota las diferencias en las
propiedades fisicoqumicas y bioqumicas entre la protena deseada y los contaminantes de la mezcla a ser
purificada.

Presentacin de pptidos sobre fagos filamentosos

El concepto de presentar pptidos forneos en la superficie de bacterifagos filamentosos se introdujo
por G. Smith en el ao 1985 (Smith., 1985). La tecnologa de presentacin en la superficie de fagos
(Phage Display), se utiliza para presentar, enriquecer y madurar la afinidad de protenas o pptidos
pertenecientes a enormes bibliotecas compuestas de 108 a 1010 variantes distintas, sin utilizar por ejemplo
animales de experimentacin ni cultivos celulares costosos (McCafferty y col., 1990). La principal
ventaja de esta tecnologa es la conexin directa que existe entre el fenotipo experimental (la protena
expresada en la superficie del fago), y el genotipo empaquetado en la cpside viral (el ADN que codifica
para la protena presentada en la superficie del fago filamentoso). Para lograr esta conexin, la secuencia
codificante del pptido se fusiona al extremo 5 del gen codificante de la protena pIII de la cpside viral
del fago filamentoso M13, lo que lleva a la generacin de partculas virales que expresan la protena de
inters en su superficie. De esta forma, se da origen a las bibliotecas de fagos que expresan una enorme
diversidad de pptidos en su superficie. El ADN que codifica para dicha biblioteca de pptidos puede ser
fcilmente clonado tanto en el genoma del fago filamentoso (vector fgico) (Scott y Smith., 1990), o
insertado como un casete de expresin que codifique para la protena de fusin pIII-XX dentro de un
vector llamado fagemidio (McLafferty y col., 1993).
El vector fagemido es un vector que presenta los orgenes de replicacin para bacterias y fagos,
produce una gran cantidad de protenas de fusin y posee una mayor eficiencia de transformacin
comparada con el vector fgico. El origen de replicacin para fagos contiene una secuencia de
empaquetamiento que permite el empaquetamiento del genoma de ADN de simple cadena dentro de la
partcula viral (Russel y Mode., 1989). Despus de la transformacin de bacterias con el fagemidio, estas
son infectadas con un fago auxiliador que provee los elementos necesarios para el ensamblaje completo
del virus. Durante el ensamblaje de las partculas virales, las protenas de fusin pIII-XX compiten con la
protena pIII salvaje de por la incorporacin en la cpside viral. En los fagos salvajes existen de 3 a 5
copias de protena pIII, por tanto la mayora de los viriones presentaran una o ninguna copia de la
protena de fusin por fago (Scott y Smith., 1990).

Seleccin de fragmentos de anticuerpos a partir de bibliotecas de fagos filamentosos.

Se han diseado mtodos de seleccin diversos para la obtencin de pptidos contra una determinada
diana. En esencia la biblioteca de pptidos sobre fagos se enfrenta a la diana en ciclos de seleccin

repetidos que incluyen pasos de unin, lavados y elucin de los fagos unidos. Se infectan bacterias con
los fagos eluidos y se cultivan para producir los pptidos sobre la superficie de la partcula viral.
Con el objetivo de incrementar la probabilidad de obtener pptidos ligandos contra nuestra diana que
sena diversos y de elevada afinidad, se recomienda realizar entre dos y tres ciclos de seleccin y utilizar
tcnicas de alto flujo (ELISA, microarray, inmunoensayos sobre membranas de nitrocelulosa) para el
tamizaje y la identificacin de los pptidos seleccionados (Buckler y col., 2008). Se han diseado
mtodos de seleccin de fagos sobre soportes slidos basados en cromatografa de afinidad en columnas
que contienen la diana de inters acoplado (McCafferty y col., 1990) o sobre las protenas de inters
fijadas a placas de microtitulacin o a inmunotubos (Weisser y col., 2007). Si bien este tipo de seleccin
es uno de los ms comunes y exitosos, tiene un requisito fundamental: se requiere de la diana purificada.
Adems debe tenerse en cuenta que el contacto fsico protena-soporte slido pudiera afectar algunos
epitopos (desnaturalizacin) y como consecuencia los pptidos aislados pueden no reconocer a la protena
de inters nativa. Las estrategias de seleccin con la molcula diana en solucin previamente conjugado a
biotina son las ms eficientes (Parmley y Smith, 1989; Silacci y col., 2005).

Metodologa
En este trabajo se disea una protena quimrica 3cTNFR2 que contiene el dominio de trimerizacin del
colgeno XV y la porcin extracelular del receptor de TNF-a tipo 2 expresada en el medio de cultivo
celular de clulas HEK-293; Se realizan purificacines mediante cromatografa de afinidad a iones
metlicos (IMAC) por medio del uso de la cola de histidinas presente en la qumera. Se busc seleccionar
pptidos presentes en la superficie de la cpside viral de los fagos filamentosos M13 contra la protena
3cTNFR2, particularmente sobre el dominio de trimerizacin del colgeno con el fin de usar tales
pptidos en el desarrollo de un sistema de purificacin basado en la afinidad de estos pptidos contra el
dominio de trimerizacin.

Mtodos
Produccin y purificacin de 3cTNFR2.
Para la obtencin de la protena recombinante trimrica 3cTNFR2, qumera que combina la porcin
extracelular del receptor de TNF-a tipo 2 y el dominio de trimerizacin del colgeno XV, diseo que
optimiza la avidez del receptor por TNF y al mismo tiempo aumentando la vida media de la protena
quimrica mediante la trimerizacin otorgada por del dominio de oligomerizacin de colgeno XV. Se
trabaj con una lnea celular establemente transformada de clulas HEK-293 para el gen de inters que
controla la expresin estable de la protena quimrica diseada bajo control del promotor CMV, todo en
base a lo obtenido previamente en nuestro laboratorio. Se trabaj con el clon que expresa establemente la
protena de inters, lo cual fue monitoreado mediante el gen reportero EGFP (Enhanced Green
fluorescent protein de sus siglas en ingls) el cual expresa una protena mutante  construida a partir de la
GFPwt de Aequorea victoria, con las mutaciones Phe-64->Leu, Ser-65->Thr. Esta protena posee una
mayor intensidad de emisin que la GFPwt una vez que es excitada con luz a 488nm, lo que contribuye a
obtener mejores seales tanto para microscopa como citometra en clulas eucariticas. Se realiz la
adaptacin de las muestras obtenidas desde nuestro laboratorio para poder realizar la amplificacin de la
lnea celular establemente transformada. Por cuanto a su superior tasa de crecimiento y un alto nivel
productivo de 3c3TNFR2, se utilizaron clulas del clon 1 previamente obtenido como husped de la
produccin. Una vez descongelado el criotubo y adaptado el cultivo a las condiciones de crecimiento se

procedi a propagar el cultivo paulatinamente hasta obtener 20 placas de 100 mm con un 90% de
confluencia celular, y se inicio la cosecha de proteina en medio DMEM sin suero por 72 horas. Los
procesos de purificacin se llevaron a cabo mediante IMAC debido a que la protena quimrica hacia el
C-terminal presenta una cola de 6 residuos de histidinas (Porath y col., 1975); todo este procedimiento
se realiz siguiendo las instrucciones del proveedor de insumos para tal procedimiento (GE HealthCare.,
2012). La deteccin de la protena luego de la purificacin se determino mediante inmunodeteccin con
anticuerpos que reconocan la cola de 6 histidinas de acuerdo al Manual de Protocolos Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (Ausubel y col.,2003).
Experimentos de Phage Display
Biopanning
Una librera de pptidos de 10 aminocidos lineales expresados sobre la superficie de fagos filamentosos
fusionados a la protena pIII con una diversidad relativa de 1010 fueron obtenidos del laboratorio de
biofrmacos recombinantes y utilizados en 5 rondas de seleccin contra 3cTNFR2 inmovilizada en placas
de ELISAs (Enzyme-linked immunosorbent assay, de sus siglas en ingls) hasta alcanzar un
enriquecimiento de las poblaciones de fagos seleccionados, aislndose clones individuales para
posteriores anlisis. Todo lo anterior realizado bajo procesos metodolgicos estndar ya reportados
(Ferrieres y col., 2000; Clackson y col., 1994).
Screening
Placas de ELISA (Becton Dickinson) fueron recubiertas con 10 ug/ml/pocillo de la protena 3cTNFR2 en
un volumen total de 50 ul 100 mM de NaHCO3, pH 8,6 a 4C toda la noche. Los pocillos fueron lavados
con PBS al 0,1% Tween 20 y posteriormente bloqueados en buffer de bloqueo (PBS 0,1% Tween 20 y al
2% con leche descremada) por una hora a temperatura ambiente. Posteriormente se aadieron 50 ul de los
clones de fagos aislados y purificados desde las 5 rondas de seleccin, incubando las partculas virales
por 2 horas a temperatura ambiente. Los fagos unidos fueron detectados usando un anticuerpo conjugado
a peroxidasa contra el fago filamentoso M13 (Roche) dilucido en buffer de bloqueo en una razn de
1:5000. Luego de 2 horas de incubacin de las partculas virales, los pocillos recubiertos fueron lavados
en PBS y luego se aadi el sustrato de la peroxidasa. El resultado coloreado de la reaccin fue medido a
492 nm en un lector de microplacas automatizado (Bio-rad, USA) Usando como criterio de seleccin de
los clones 3 veces la absorbancia obtenida del blanco.(Stevens y col., 1995;Gan., 2013)

Resultados
Expresin y purificacin de 3cTNFR2
Luego de la amplificacin de la lnea establemente transformada de clulas HEK-293 para la
expresin de la protena 3cTNFR2 (Fig1) se procedi a obtener desde el medio de cultivo sin suero
cosechado luego de 72 horas de produccin la protena de inters, la cual se purific mediante IMAC
siguiendo el proceso de la purificacin a 280 nm con lo que se obtuvo el cromatograma correspondiente
del proceso (Fig 2 A) y se detect mediante ensayos de SDS-PAGE e inmunoreactividad (Fig 2 B y C) .
La concentracin de la protena purificada se determin mediante ensayo de cido bicinconnico (BCA)
estimndose una concentracin de 300 ug/ml totales.

Campo claro

Superposicin Campo oscuro

Figura 1. Amplificacin lnea celular establemente transformada para la expresin de 3CTNFR2. En la figura se
muestran los campos obtenidos por microscopa de los estados de crecimiento de la lnea celular amplificada hasta alcanzar
una confluencia de 90%. De arria hacia abajo y de izquierda a derecha se muestra el progreso en la proliferacin del cultivo
celular de HEK-293 establemente transformada para 3cTNFR2.

Fig 2. Purificacin y deteccin de 3cTNFR2. (A) Cromatograma de purificacin mediante cromatografa de

afinidad a iones metlicos para la protena 3cTNFR2. PNU: Corresponde a la protena no unida a la matriz.
Lavado: realizado a una concentracin de imidazol de 40 mM. Elucin: utilizando una concentracin de imidazol
de 250 mM. (B) Gel SDS-PAGE al 12% con tincin de azul coomassie. Ensayo que muestra la presencia de la
protena a la altura esperada con el patrn de glicosilaciones que aumentan su talla molecular. La banda se de
evidencia en el ltimo carril correspondiente a la fraccin de elucin. (C) Inmunodeteccin mediante anticuerpo
anti-His ( 1:5000) y anti-mouse (1:10.000) asociado a fluorescencia. Se observa que toda la protena quedo
retenida en la columna al no observarse banda reactiva en el UN (No Unido). En la fraccin de lavado se aprecia que
parte de la protena sali en parte con el buffer de lavado, sin embargo no es considerable en comparacin a lo
eluido en la ltima fraccin.

Rondas de seleccin de la biblioteca de fagos filamentosos con pptidos en su superficie

5 rondas de seleccin se realizaron para obtener un enriquecimiento relativo de las poblaciones de
fagos filamentosos seleccionados en los procesos de Biopanning, lo que se determin de acuerdo a
clculos obtenidos luego de cada ronda de seleccin con el ttulo viral de los fagos eludos en placas de
medio LB agar slido. Las titulaciones realizadas muestran un enriquecimiento a partir de la cuarta ronda
de seleccin de la biblioteca utilizada lo que en conjunto a los ensayos de ELISA policlonal de cada ronda
de seleccin confirman los resultados observados en las titulaciones realizadas (Fig3).

Figura 3. Ttulo de fagos filamentosos por rondas de elucin y ELISA policlonal. (A) Titulacin de fagos eluidos en cada
ronda de seleccin. Se realizaron diluciones seriadas en base 10 a los fagos obtenidos de las selecciones respectivas. Se
sembraron en placas Agar/2xYT/amp y se contaron las colonias crecidas.(B) ELISA policlonal de los fagos eluidos en cada
paso de seleccin. Los fagos obtenidos en las selecciones fueron amplificados y se utilizaron contra 3cTNFR2 En placas de
ELISA cubiertas con la protena en estudio a una concentracin de 10 ug/ml. La deteccin se llevo a cabo por absorciometra
en base al anticuerpo utilizado anti-M13 Asociado a HRP.

Identificacin de clones individuales de fagos que expresan pptidos en su superficie contra 3cTNFR2
Una vez concluidos los 5 pasos de seleccin, se realizaron diluciones seriadas de la ronda de
seleccin A5 con el fin de obtener colonias individuales, las que se evaluaron mediante ELISA para
detectar aquellos clones individuales que expresan pptidos con un evidente reconocimiento por
3CTNFR2. Como criterio de seleccin de clones positivos se consider aquellos que generaron una
absorbancia a 492 nm superior al doble de la absorbancia producida por la biblioteca no seleccionada
(Fig4).

Figura 4. Identificacin de clones positivos mediante ELISA de fagos de clones individuales. Desde la quinta ronda de
seleccin se aislaron clones individuales por medio de dilucin seriada de los fagos eluidos. Se recubri placa y media de
ELISA con la protena 3cTNFR2 a una concentracin de 10 ug/ml. Aquellos fagos capaces de reconocer a la protena
quimrica se identificaron mediante absorciometra a 492 nm usando un anticuerpo anti-M13 asociado a HRP. Aquellos
fagos individuales que mostraran ms del doble de la absorbancia medida en el control negativo fueron considerados como
clones reactivos y positivos contra 3cTNFR2.

Discusin
En la actualidad el desarrollo de anticuerpos y sus fragmentos y/o molculas con funcionalidad
similar son unos de los desarrollos biofarmacuticos que representan cerca del 30% del total de protenas
teraputicas usadas en estudios clnicos. Se ha demostrado que los dominios de unin antignicos de
anticuerpos de simple cadena ScFv, de sus siglas en ingls single chain Fragment variable, pptidos o
incluso fragmentos de receptores celulares son posibles de expresar en organismos como e.coli (Hudson
y col., 1988) con alta eficiencia y que adems estas protenas teraputicas son capaces de bloquear por
ejemplo sitios de unin celulares en la matriz extracelular, ejemplo de esto ha sido el uso de un ScFv
contra laminina que ha sido capaz de inhibir la angiognesis de tumores in vivo (Sanz y col., 2002).
Dentro de este trabajo, fue posible expresar y purificar la protena quimrica 3CTNFR2, la cual
previamente ha sido carcaterizada fisicoqumicamente en los laboratorios de biofrmacos recombinantes.
Se logr sostener la expresin constitutiva del clon establemente trasnformado para la produccin de esta
protena recombinante y aplicar los protocolos estndar de purificacin de protenas, salvo ciertas
modificaciones realizadas dentro de este procedimiento, debido a que se observ que durante los pasajes
del clon utilizado durante esta investigacin, hubo una disminucin de su capacidad productiva de la
protena estudiada. Mediante cromatografa de afinidad a iones metlicos (IMAC), se monitore el
proceso de purificacin utilizado a travs de un cromatograma asociado al estudio, lo cual fue seguido por
ensayos in vitro de western blot para corroborar la presencia de la protena estudiada, demostrndose que
fue posible expresar en el medio de cultivo de clulas superiores de forma soluble y pudiendo purificar
nuestra protena a partir de este, con lo cual no fue necesario adicionar pasos de purificacin extras puesto
que los niveles de pureza alcanzado superan el 95% (Figura 2). Considerando la pureza determinada de
los procesos de purificacin de esta protena en estudio mediante densiometra, y la fidelidad de su
obtencin (Figura 2), se disearon ensayos de seleccin con fagos filamentosos que expresan en su
superficie pptidos lineales, con los que mediante procesos de eluciones y astringencia de lavados fue
posible ir enriqueciendo una poblacin en particular y seleccionando en consecuencia aquellos que
presentaran una mayor afinidad por la protena expuesta, teniendo en cuenta la estructura de tal
macromolcula expresada. A la fecha se han diseado mtodos de seleccin diversos para la obtencin de
pptidos en contra de determinadas dianas. En esencia la biblioteca de pptidos sobre fagos se enfrenta al

antgeno en ciclos de seleccin repetidos que incluyen pasos de unin, lavados y elucin de los fagos
unidos. Se infectan bacterias con los fagos eluidos y se cultivan para producir los pptidos sobre la
superficie de la partcula viral. Con el objetivo de incrementar la probabilidad de obtener pptidos
diversos y de elevada afinidad, se recomienda realizar entre dos y tres ciclos de seleccin y utilizar
tcnicas de alto flujo (ELISA, microarray, inmunoensayos sobre membranas de nitrocelulosa) para el
tamizaje y la identificacin de los pptidos deseados (Buckler y col., 2008), sin embargo, durante el
desarrollo de este trabajo, no se evidencio un erriquecimiento de las poblaciones de fagos en las primeras
3 rondas de seleccin que se recomiendan, lo cual podria estar relacionado con la complejidad de la
protena utilizada como diana, como tambien producto de la manipulacin de las tnicas que permiten la
seleccin. Adems debe tenerse en cuenta que el contacto fsico protena-soporte slido pudiera afectar
algunos dominos expuestos (desnaturalizacin) y como consecuencia los pptidos aislados pueden no
reconocer a la protena en estado nativo, dificultando su seleccin y consecuente falta de enriquecimiento
de la poblacin de fagos filamentosos.
Mediante 5 rondas de seleccin contra 3cTNFR2, se logr enriquecer la biblioteca con fagos que
expresan pptidos reactivos hacia 3cTNFR2 . A partir de la quinta ronda de seleccin se aislaron clones
individuales de fagos, cuya capacidad de reconocer especficamente a 3cTNFR2 fue corroborada
mediante ELISA. Teniendo en cuenta que la estructura tridimensional de esta protena quimrica presenta
tanto el dominio de trimerizacin del colgeno tipo XV y el dominio extracelular del receptor para TNF
tipo 2, la seleccin de los fagos que exponen pptidos ms afines, fue de cierta manera a ciegas, puesto
que no se sabe a que segmento se ha generado la seleccin por afinidad de estos pptidos, posiblemente
hacia el segmento que compromete la porcin del dominio extracelular del receptor para TNF tipo 2 o
bien hacia el dominio de trimerizacin utilizado.
Desde el punto de vista funcional, el poder seleccionar pptidos con afinidad hacia el domino de
trimerizacin sera una herramienta poderosa a la hora de desarrollar nuevas estrategias de purificacin
para las actuales y nuevas protenas quimricas obtenidas en nuestro laboratorio, permitiendo generar, un
sistema patentable y al mismo tiempo innovador, en el que se monten mediante el uso de los pptidos
seleccionados un sistema de purificacin por afinidad, que sea especfico para nuestras protenas
expresadas que cuentan con el elemento en comn del dominio de trimerizacin ya mencionado, sin
embargo, la aproximacin de poder lograr seleccionar pptidos con afinidad a esta protena en su
totalidad, permite un acercamiento hacia la obtencin de secuencias que muestren afinidad por algunas de
las zonas que son expuestas en esta macromolcula y que de algn modo nos acerquen a nuevos procesos
de purificacin adaptados a nuestros modelos desarrollados de protenas recombinantes.
Una de las proyecciones de este trabajo, sera determinar especficamente a que regiones se unen los
pptidos seleccionados en los procesos de biopannig en contra de la protena analizada, ya sea aplicando
anlisis bioinfomticos que modelen la interaccin de los pptidos obtenidos con nuestra molcula diana,
o incluso usando otra de las protenas expresadas en nuestro laboratorio que presente el dominio de
trimerizacin para hacer una discriminacin y contraste de los pptidos candidatos a unin contra el
dominio de trimerizacin como unidad de oligomerizacin y de posible base de purificacin posterior.

Conclusiones
1. El uso de clulas HEK-293 establemente transformadas para la expresin de 3cTNFR2, permiten
la expresin de esta protena recombinante en el medio de cultivo celular, en forma soluble.
2. El uso del tag de 6 residuos de Histidina hacia el C-terminal en la protena recombinante fue
capaz de identificar inmunoreactivamente la protena expresada como tambin permitir la
purificacin de esta mediante cromatografa de afinidad a iones metlicos (IMAC).
3. A partir de la biblioteca de pptidos lineales expresados en la superficie fagos filamentosos, se
puede aislar un considerable nmero de clones que expresan pptidos lineales distintos, reactivos a
3cTNFR2.

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