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Microscopa de fluorescencia

La microscopa de fluorescencia se basa en los mismos principios de ptica de la


microscopa comn, con diferencias en el manejo y el diseo relacionadas con la
generacin y transmisin de longitudes de onda adecuadas a los fluorocromos que se
quieren visualizar, ya sean propios de la muestra o de la coloracin utilizada
El fundamento de la tcnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o
compuestos fluorescentes, denominados fluorocromos, en fijarse a los anticuerpos
mediante un enlace qumico estable que no puede romperse durante el curso de la
reaccin inmunolgica.
Fluorocromos
Se encuentran diversos ejemplos de fluorocromos naturales, como algunas vitaminas,
esteroides, porfirinas, etc. Otros compuestos que fluorescen rodamina, auramina,
fluorescena, colorantes de acridina se utilizan en distintas tcnicas de tincin, como la
tincin de microorganismos cido-resistentes con auramina-rodamina en muestras de
tejido y esputo.
Fluorocromo

Longitud de onda de Longitud de onda


absorcin (nm)
de emisin (nm)
374-403
422-430
494
520

Cascade blue
Fluorescena
(FITC)
Rodamina (TRITC) 540
Naranja
de 460-502
acridina
Yoduro
de 536
propidio

570
526-650
617

Algunos de los principales fluorocromos empleados en inmunofluorescencia y sus


respectivos espectros de absorcin y emisin en valores aproximados.
La "cido-resistencia" se refiere a una propiedad fsica especfica de ciertas bacterias, es
decir, su capacidad de resistir la decoloracin del cido durante los procedimientos de
tincin. Estos organismos resistentes se denominan "microorganismos cido-resistentes",
y slo pueden ser coloreados para fines de visualizacin utilizando tincin cidoresistente.

Tincin de Ziehl-Neelsen
Tipos de tincin
Acido-Resistente

Tincin de Kinyoun

Tincin de auramina-rodamina

Tincin de auramina-rodamina
La tincin auramina-rodamina, a veces llamada tincin auramina-rodamina Truant, es una
tcnica utilizada para ver microorganismos acido-resistentes utilizando microscopa de
fluorescencia. Cuando los compuestos especficos son iluminados con luz de alta energa,
tienden a emitir una luz diferente, una frecuencia ms baja como resultado de la
exposicin. Esto se denomina fluorescencia. Los microorganismos acidorresistentes
emiten una fluorescencia de color amarillo rojizo con este mtodo.
La tincin auramina-rodamina podra no ser tan especfica de microorganismos cidoresistentes como la tincin de Ziehl-Neelsen o la tincin de Kinyoun, pero es ms
asequible y se utiliza a menudo como una herramienta de deteccin.
Aplicacin
Marcaje de molculas en clulas y tejidos para su caracterizacin e identificacin.
Estudio de clulas normales y patolgicas.
Estudios inmunolgicos.
Mineraloga.
Otra aplicacin importante de la microscopa de fluorescencia es la medicin de la
concentracin intracelular y de los cambios que sufre como consecuencia de estmulos de
algunos iones (molculas con carga elctrica), como el calcio (Ca2+), el in hidrgeno
(H+), el cloruro (Cl-), el sodio (Na+) y el potasio (K+).

Microscopio de fluorescencia
Esta imagen es un espcimen de la
clula PtK2 de un rin marsupial.

La microscopa de Barrido por Sonda (Scanning Probe Microscopy SPM).


Grupo de tcnicas microscpicas que se conocen genricamente como Microscopa de
Barrido por Sonda (Scanning Probe Microscopy SPM). Algunas de estas son:
Microscopa de Fuerza Atmica en contacto y no contacto (Atomic Force Microscopy
AFM-C, AFM-NC), Microscopa de Fuerza Magntica (Magnetic Force Microscopy MFM),
Microscopa de Fuerza Lateral (Lateral Force Microscopy LFM), Microscopa de
Modulacin de Fuerza (Force Modulation Microscopy FMM), Microscopa por Deteccin
de Fase (Phase Detection Microscopy.
La caracterstica ms sorprendente de estas tcnicas es que la resolucin lateral
alcanzada es hasta de fracciones de nanmetros, lo que implica amplificacin de campo
del orden de 8.000.000X.
La idea bsica de un sistema SPM es realizar un barrido de la muestra en un patrn de
rea cuadrado, con un elemento denominado sonda, el cual, dependiendo de sus
caractersticas particulares de composicin, forma, tamao y tipo de interaccin fsica,
permite captar diversas propiedades superficiales de la muestra bajo anlisis.
Aplicaciones
La amplia variedad de aplicaciones que se encuentran vinculadas a tcnicas SPM, la
convierten en una de las tcnicas microscpicas ms verstiles, que adems suministran
informacin poco convencional en comparacin con microscopa ptica o electrnica. En
la tabla 1 se presentan algunas aplicaciones asociadas a diferentes modos de operacin
de los SPM, y la informacin obtenida de la muestra.
Tcnica SPM
AFM

STM

Aplicaciones
Micro estructura de aleaciones,
definicin frontera de grano,
estructura de ADN, morfologa de
virus, reconstruccin atmica de
cristales, formas de crecimiento y
cristalizacin en capas, espesores
de pelculas delgadas, ultra
estructura en tejidos orgnicos,
micro
fibras
estructura
de
informacin en almacenamiento
ptico y otras.
Imagen de espacio real a escala
atmica
de
metales
y
semiconductores,
estructura
submicroscpica de aleaciones

Informacin obtenida
Morfologa,
tamao
de
grano, porosidad superficial,
altura de escaln, rugosidad
media y cuadrtica media,
dimensiones de estructura.

Morfologa,
distribucin
superficial de densidad de
estados electrnicos, mapas
de conductividad superficial.

metlicas y otras.
Irregularidades superficiales de
friccin en metales tribolgicos,
irregularidades en desempeo
mecnico
por
presencia
superficial de impurezas, frontera
de grano, estructura en MEMS y
otras.
MFM
Estructura
magntica
de
materiales
ferromagnticos,
diferencias en orientacin de
dominios
magnticos
en
columnas
estratigrficas,
orientacin de dominios en
materiales para almacenamiento
de datos (discos duros, cintas) y
otras.
FMM
Irregularidad
qumica
en
superficies
aleadas,
nanopartculas contaminantes en
slidos,
nanoinclusiones
superficiales
en
pelculas
delgadas,
transformaciones
qumicas localizadas causadas
por efectos trmicos en aceros, y
otras.
Espectroscopia (I-V), Medidas
de
gap
en
(F-D)
semiconductores, diferenciacin
de xidos superficiales, medidas
de
adhesin
superficial,
nanoindentacin de superficies
rgidas, nanodureza en metales y
cermicos.
LFM

Mapas de friccin,
contraste en bordes.

Respuesta
superficial.

alto

magntica

Mapas de variacin de
mdulo
de
elasticidad,
irregularidad qumica en
superficie.

Curvas I-V en
zonas
puntuales, densidad de
estados electrnicos, fuerza
de adhesin superficial,
fuerza en funcin de la
distancia punta muestra.

Microscopio
Sonda

de

barrido

por

Imagen topogrfica de pasos de clulas


de alta de una sola unidad de BaTiO3
(001) por STM

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