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SeptiembreOctubrede2008

InformacionessobreAnlisisMicrobiolgicosporPCR

Inclusividad de los kits de deteccin de Salmonella

por PCR a tiempo real: estn todas las que son?
Introduccin

El uso de dianas
inadecuadas expone a un elevado
riesgo de obtener
resultados falsos
negativos
Salmofast incorpora dos seguros
contra la obtencin
de falsos negativos

La PCR a tiempo real es una tcnica cada vez

ms utilizada en el laboratorio de Microbiologa
agroalimentaria por su especificidad, su robustez y su rapidez, permitiendo la obtencin de
resultados en 18 horas. [1].
La eleccin de una diana correcta es un paso
critico en el desarrollo de cualquier sistema de
anlisis basado en PCR. Hasta la fecha, los
genes de eleccin para la identificacin de bacterias patgenas guardaban relacin con alguna
de sus caractersticas patognicas (ver tabla 1).
En el caso particular de Salmonella, el gen de
eleccin es el llamado invA [2], que codifica
para un factor relacionado con la capacidad de
esta bacteria de invadir el epitelio intestinal [3].
Est claro que estos genes son una buena eleccin pues se refieren a capacidades o atributos
propios de la bacteria en cuestin. No obstante,
la historia natural de estas bacterias y su constante relacin con el "hospedador" y sus mecanismos de defensa hacen que presenten una
fuerte tendencia a las mutaciones [4]. Estas
mutaciones, si son suficientemente numerosas
(variadas) pueden ser una fuente de inespecificidad, pues los primers usados son constantes
mientras que la diana es fuertemente variable.
Estas inespecificidades pueden incluso resultar
en falsos negativos.
Tabla1.Principalespatgenosylosgenesdiana
usadosmscomnmenteenPCR

invA, que la mayora de kits comerciales se

dejen en el tintero algunas otras variedades de
Salmonella, con lo que se aade un factor no
deseable de incertidumbre al anlisis por PCR
que contrarresta sus ventajas. Con el gen invA
como diana la posibilidad de ofrecer un resultado falso negativo es ms alta.

Figura1.FragmentodelaalineacindegeninvA
dedistintosaisladosdeSalmonellaentrelasposi
ciones1070y1140.Enazullapartedelasecuencia
queestabsolutamenteconservada.

Lasolucin
La utilizacin de la PCR a tiempo real exige
unos niveles de inclusividad mximos para
obtener la plena fiabilidad en el anlisis. Salmofast es un kit de deteccin que incorpora los
dos elementos necesarios para la fiabilidad
mxima de los resultados, es decir, incorpora
dos seguros contra la obtencin de falsos negativos. Por un lado se basa en una diana patentada por Microbial SL (EP 06120684.3) con unos
niveles de variabilidad interna prcticamente
nulos en las regiones complementarias a los
primers y la sonda [5]. Por otro lado, incorpora
un control interno de amplificacin [6] que nos
informa de la existencia de inhibidores de la
Polimerasa en la reaccin de PCR.

Cuando usamos
herramientas
basadas en PCR
para la deteccin
de bacterias
patgenas debemos Elproblema
Recientemente se ha comprobado que algunas
conocer la diana
cepas o variedades serolgicas de Salmonella Unejemplo
gentica, es decir,
no son detectadas por los sistemas de PCR a La cepa Montevideo de Salmonella enterica fue
real basados en el gen invA (figura 1). analizada con varios kits comerciales basados
el gen especfico de tiempo
Entre ellas podemos destacar algunos aislados en el gen invA como diana, en distintos termola bacteria a detec- del serogrupo Saint Paul (el sexto por orden de cicladores. Todos ellos ofrecieron resultados
prevalencia en toxiinfecciones alimentarias en negativos, poniendo de manifiesto diferencia en
tar
el mundo) o el serogrupo Montevideo. Es posi- la secuencia del gen invA complementaria a los
ble, dada la naturaleza poco conservada del gen primers y sondas usados.

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En cambio, el anlisis con Salmofast, que usa diana distinta,

ms integradora para todas las cepas de Salmonella , result
claramente positivo, con valores de Ct por debajo de 20, demostrando que el gen diana elegido est absolutamente conservado en la regin de complementariedad con primers y
sondas (figura 2).

plenamente complementarios. Por tanto, el uso de dianas

inadecuadas expone a un elevado riesgo de obtener resultados
falsos negativos. El kit Salmofast, de Microbial, presenta la
mayor inclusividad del mercado, detectando cepas como por
ejemplo Salmonella Saint Paul o Salmonella Montevideo, que
son pasadas por alto por las dems marcas disponibles actualmente en el mercado.
Por tanto, cuando usamos herramientas basadas en PCR para
la deteccin de bacterias patgenas debemos conocer:
1. La diana gentica, es decir el gen especfico de la bacteria
a detectar
2. El grado de conservacin gentica de la regin complementaria a los primers y sondas utilizados
3. La inclusividad del sistema utilizado. Debe ser lo ms
prximo posible al 100%. Deben estar incluidas en la lista
de positivos todas las cepas conocidas.
4. El sistema de extraccin de ADN usado y su eficacia, es
decir, la relacin genomas/clulas obtenida.
Bibliografa
[1]. Malorny, B., E. Paccassoni, P. Fach, C. Bunge, A. Martin, and R.
Helmuth. 2004. Diagnostic real-time PCR for detection of Salmonella in food. Appl. Environ. Microbiol. 70:7046-7052.
[2]. Chiu, C. H. and J. T. Ou. 1996. Rapid identification of Salmonella
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spvC, by an enrichment broth culture-multiplex PCR combination
assay. J. Clin. Microbiol. 34:2619-2622.
[3]. Galan, J. E., C. Ginocchio, and P. Costeas. 1992. Molecular and
functional characterization of the Salmonella invasion gene invA:
homology of InvA to members of a new protein family. J. Bacteriol. 174:4338-4349.

Figura2.CurvasdeamplificacindeunenriquecimientodeSal
monellaMontevideoenAPT

Conclusiones

[4]. Randall, L. P., N. G. Coldham, and M. J. Woodward. 2005. Detection of mutations in Salmonella enterica gyrA, gyrB, parC and
parE genes by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) using standard HPLC instrumentation. J. Antimicrob. Chemother. 56:619-623.
[5]. Laia Calv, L., A. Martnez-Planells, J. Pardos-Bosch and L. Jess

El desconocimiento de lo que hay en el interior de un kit para

Garcia-Gil. 2008. A new Real-Time PCR assay for the specific
la deteccin de Salmonella por PCR puede inducirnos a asudetection of Salmonella spp. targeting the bipA gene. Food Anal.
mir que est preparado para detectar todas las subespecies,
Methods 1:236242
cepas, aislados, serogrupos o variedades. El responsable del [6]. Hoorfar, J., N. Cook, B. Malorny, M. Wagner, D. De Medici, A.
laboratorio debe ser consciente de que esto no es as en la
Abdulmawjood, and P. Fach. 2003. Making internal amplification
control mandatory for diagnostic PCR. J. Clin. Microbiol.
mayora de casos, pues la diana gentica usada presenta varia41:5835.
ciones que hacen que los oligonucletidos usados no sean

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