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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR
REA DE CONOCIMIENTO CIENCIAS AGROPECUARIAS

DEPARTAMENTO ACADMICO DE ZOOTECNIA
TESIS
AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIN DE BACTERIAS CON POTENCIAL
PATOGENO PARA OSTREIDOS
QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE

MEDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA
PRESENTA:
Daniel Israel Higuera Sandoval
Directora de Tesis:
Dra. Maurilia Rojas Contreras
Director externo:
Dr. Jos Manuel Mazn Suastegui
CD. UNIVERSITARIA, LA PAZ, B.C.S SEPTIEMBRE DEL 2014
DEDICATORIA
La presente tesis est dedicada a mis padres Enf. Armando Higuera y Arcelia Sandoval Cazares por
ser el pilar y motor, que gracias a su apoyo y sustento estoy subiendo un escaln ms en mi vida
profesional.
A mi hermano Dr. Armando Higuera Sandoval por su grandioso ejemplo que me ha transmitido, el
deseo de superacin en la vida profesional y aspiracin de alcanzar un sueo.
A mi hermosa hermana Aime Karina Higuera Sandoval tambin por estos maravillosos aos
viviendo juntos, solos, apoyndonos incondicionalmente en este arduo camino.
A mi maravilloso sobrino Daniel Armando que ha causado en mi corazn una revolucin de
sentimientos como el nuevo integrante de la familia.
A esta frase de mi padre que es una herencia ms para m vida diaria.
Si callamos la verdad siempre seremos sordos y ciegos
AGRADECIMIENTOS
Las instituciones en apoyo al conocimiento cientfico son las herramientas para el desarrollo de un
buen profesionista. Por tanto agradezco todo el apoyo brindado por la Universidad Autnoma de
Baja California Sur (UABCS), por permitirme ser parte de ella y proporcionarme el espacio para la
realizacin de este ideal.
Al Centro de Investigaciones Biolgicas del Noroeste (CIBNOR) y al Consejo Nacional de Ciencia
y Tecnologa (CONACYT) por admitirme en este grandioso proyecto as como por la beca otorgada
para desarrollar mi tesis.
Al CIBNOR Unidad Guerrero Negro as como al personal que labora, el cual nos dio un excelente
trato y buena compaa.
A mis directores de tesis Dra. Maurilia Rojas Contreras y Dr. Jos Manuel Mazn Suastegui por la
confianza, oportunidad y el aprendizaje que han dejado en m.
A la Ing. Alejandra Coso Castro por su enseanza, paciencia, tolerancia y tiempo dedicado a m en
esas maanas y tardes de arduo trabajo, con esa alegra que siempre transmita.
Al Ing. Gaspar a. Petitt Higuera por su colaboracin en este proyecto, por el apoyo brindado en la
identificacin de bacterias.
Al Dr. Ricardo Vzquez Jurez por su apoyo en el trabajo realizado en Guerrero Negro.
Sin olvidar y no menos importantes al Dr. Alfredo Guevara Franco y Dr. Marco Antonio Cadena
Roa que tambin forman parte de este crculo de conocimiento.
A mis compaeros y amigos del Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de los Alimentos, Ing.
Adriana Ramrez Arroyo, Ing. Macario Savn Amador que somos parte del mismo proyecto y un
complemento para mi tesis.
A la Dra. Emilia Rosas Lliteras Martnez por el ltimo impulso y futuras oportunidades en el
mbito profesional en la Habana, Cuba. A todos mis docentes que han formado parte de mi
educacin aportando su granito de arena.
ii
INDICE GENERAL
Dedicatoria
Agradecimientos.
II
ndice general.
III
Lista de tablas
Lista de figuras
VII
Resumen
VIII
1. Introduccin.
2. Justificacin
3. Objetivos.
3.1. Objetivo general
3.2. Objetivos particulares
4. Hiptesis.
5. Antecedentes.
5.1 Moluscos bivalvos en el contexto mundial
5.2 Ostricultura en Mxico
10
5.3 Ostricultura en Baja California Sur.
10
5.4 Riesgo sanitario asociado al cultivo y consumo de moluscos bivalvos
15
6. Materiales y Mtodos.
16
6.1 Colecta y transporte de organismos
16
6.2 Sitios de muestreo
16
6.3 Anlisis microbiolgico.
20
6.4 Aislamiento y purificacin de bacterias
21
6.5 Morfologa celular de las cepas
21
6.6 Tincin de Gram y prueba de la catalasa
22
iii
6.7 Ensayo de adhesin a moco de ostin.
22
6.7.1 Preparacin del cultivo.
22
6.7.2 Preparacin de la membrana.
22
6.7.3 Ensayo de adhesin.
23
6.8 Identificacin molecular de bacterias potencialmente patgenas
23
6.8.1 Extraccin del ADN genmico de cepas
23
6.8.2 Visualizacin del ADN genmico.
24
6.8.3 Amplificacin del gen 16S DNA para identificacin molecular

de bacterias
25
6.8.4 Visualizacin de los productos del PCR en geles de agarosa
26
6.8.5 Secuenciacin y anlisis bioinformtico.
26
7. Resultados.
27
7.1 Anlisis microbiolgico
28
7.2 Aislamiento y purificacin de bacterias
32
7.3 Caracterizacin de cepas aisladas de ostiones
33
7.4 Ensayo de adhesin
34
7.5 Identificacin molecular de bacterias potencialmente patgenas
37
8. Discusiones.
41
9. Conclusiones.
52
10. Bibliografa.
53
11. ANEXOS
71
iv
LISTA DE TABLAS
Tabla
Titulo
Pagina
12
Tabla 3
Ubicacin geogrfica de las granjas de moluscos en Baja California

Sur, Zona Pacifico Norte.
Ubicacin geogrfica de las granjas de moluscos en Baja California
Sur, Zona Pacifico Sur.
Produccin ostrcola por municipio en B.C.S. en el ao 2010.
Tabla 4
Medios de Cultivo utilizados
21
Tabla 5
Mezcla de reaccin usada para la amplificacin del gen 16S ARN.
25
Tabla 6
27
Tabla 10
Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacterias

con potencial patgeno para ostin
Anlisis microbiolgico de los ostiones de C. gigas tomados de
diferentes zonas de Guerrero Negro.
Regin de Baha Magdalena (San Buto y Paredones)
Santo Domingo (Las Botellas)
ANOVA del log UFC en Agar Marino de los tres muestreos
Tabla 11
ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos
31
Tabla 12
.Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1,
31
Tabla 1
Tabla 2
Tabla 7
Tabla 8
Tabla 9
13
14
28
29
30
30
2y3
Tabla 13
ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2
31
y3
Tabla 14
ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2
32
y3
Tabla 15
Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre
32
muestreos
Tabla 16
Tabla 17
Tabla 18
Tipo y nmero de microorganismos con potencial patgeno,

aisladas en diferentes medios de cultivo selectivos.
Caracterizacin de las cepas con potencial patgeno aisladas de
ostiones
Caractersticas de adhesin de las cepas aisladas de ostiones en
diferentes medios de cultivo
32
33
35
Tabla 19
Tabla 20
Cepas con potencial patgeno aisladas de diferentes especies de

ostin y seleccionadas por su perfil de adhesin para identificarse
molecularmente
Gnero y especie de las cepas con potencial patgeno aisladas de
ostin y seleccionadas por su capacidad de adherirse a moco de
ostin.
37
39
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8
Figura 9
Figura 10
Figura 11
Figura 12
Figura 13
Figura 14
Titulo
Crassostrea gigas
Crassostrea gigas
Crassostrea gigas
Crassostrea gigas
Crassostrea gigas
S. palmula.
C. gigas
C. gigas
S. palmula
S. palmula
C. palmula
C. gigas
C. gigas
Mapa de lugares de muestreo de ostiones en BCS.
Pagina
17
17
18
18
18
19
19
19
19
19
19
19
19
20
Figura 15
Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genmico de las cepas

de ostin: Carril 1. Lambda DNA, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4.
Cepa 06, 5. Cepa 011, 6. Cepa 012, 7. Cepa 024, 8. Cepa 062, 9.
Cepa 065, 10. Cepa 018, 11. Cepa 072.
38
Figura 16
Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA y

pH* y con ADN genmico de las cepas: Carril 1. Marcador de
peso molecular, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011,
6 . Cepa 024, 7. Cepa 062, 8. Cepa 065, 9. Cepa 018, 10. Cepa
072.
38
vii
RESUMEN
La produccin mundial de moluscos se ha visto adversamente afectada por numerosas
enfermedades y debido a su severo impacto en el desarrollo econmico y socioeconmico en
muchos pases, algunas de estas enfermedades se han convertido en una restriccin primaria para el
desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de moluscos. En esta investigacin se cuantific la
microbiota en diferentes medios de cultivo para bacterias con potencial patgeno y se aislaron las
bacterias predominantes en diferentes especies de ostiones que se cultivan o se encuentran en el
medio natural a lo largo de las costas del Ocano Pacfico en Baja California Sur. Se caracterizaron
de acuerdo a su patrn de adhesin a extractos crudos de moco de ostin, asumiendo que los
microorganismos que se adhieren a moco tienen la capacidad de colonizar el tracto digestivo y
dems rganos que secretan mucosas en los ostiones. Se identificaron molecularmente diez cepas
con potencial patgeno que se adhirieron a moco de ostin. Los resultados mostraron que de las 80
cepas que se aislaron el 30% de las cepas presentaron la capacidad de adherirse a moco de ostin.
De las cepas aisladas en ABP el 47% presentaron adhesin fuerte, de AM el 23%, de AXLD el
80% y de ATCBS, el 22%. Las cepas con potencial patgeno, predominantes en organismos de
Crassostrea gigas, C. cortiziensis y C. sikamea, y Saccostrea palmula identificadas fueron: La cepa
01 presento un 100% de identidad con Enterococcus sp. C213. La cepa 011 present un 99% de
identidad con Enterococcus faecalis partial strain ZG7-15 y la cepa 062 tambin un 99% de
identidad con Enterococcus faecium strain FMC59. La cepas 03, 06 y 018, presentaron un 99% de
identidad con Escherichia coli cepa FUA1242 y la cepa 072 present un 100% de identidad con E.
coli cepa PMV-1. La cepa 012 tuvo tambin un 99% de similitud con Staphylococcus pasteuri cepa
87. La cepa 065 present tambin un 99% de similitud con Enterobacter cloacae strain AB2. De
acuerdo a la bibliografa, estos microorganismos con potencial patgeno han estado implicados en
brotes de enfermedades transmitidas por alimentos causando diferentes tipos de infecciones por lo
que de acuerdo a los resultados obtenidos, la prevalencia de estas bacterias en los ostiones, refleja
un riesgo para la salud del consumidor. Sin embargo, para saber si estas bacterias son tambin
patgenas para los ostiones en sus diferentes estadios de crecimiento, se requiere desarrollar otros
ensayos.
viii
1. INTRODUCCION
Los productos marinos, incluyendo los moluscos ostreidos, representan una proporcin
muy importante de los alimentos a escala mundial, y forman parte importante y esencial de
la dieta del hombre en muchos pases. Los moluscos son, despus de los insectos, el grupo
de animales ms extendido sobre el planeta; se han clasificado aproximadamente 200 mil
especies. Se les encuentra lo mismo en la copa de los rboles que en las profundidades
marinas y su estudio ha ofrecido a los cientficos temas por dems interesantes, por lo que
constituyen uno de los grupos mejor entendidos en la actualidad. Los moluscos bivalvos
son las ostras, mejillones, almejas, vieiras siendo estos de gran importancia econmica para
la alimentacin. En cuanto a la contribucin de alimentos los moluscos ocupan el 3er lugar
junto a los peces didromos, las plantas y peces de agua dulce. En el panorama mundial las
ostras ocupan el segundo lugar ms importante despus de los Cyprinidos o carpas (Helm et
al., 2006).
Los moluscos bivalvos, son organismos filtro-alimentadores y se ubican en la base de la
cadena alimenticia; crecen rpido, especialmente en los trpicos, y son ampliamente
demandados como alimentos gourmet en los mercados globales. Por lo anterior son
candidatos ideales para la acuacultura, adems, en los proyectos comerciales no se
requieren inversiones grandes ni equipos sofisticados. A pesar de ser importante, la
acuacultura de moluscos no se ha consolidado como una actividad dominante en Mxico,
debido a que no se ha considerado una conjuncin de elementos tcnicos, econmicos y
sociales (Helm et al., 2006).
Entre los moluscos de la familia Ostreidae se incluye a un gran nmero de especies
comestibles; su distribucin est confinada a una franja de aguas costeras dentro de las
latitudes 64 N y 44 S. Su distribucin vertical se extiende desde un nivel
aproximadamente medio desde la zona intermareal, hasta profundidades de 32 m sin
embargo, las especies comerciales rara vez se encuentran en profundidades mayores de 12
m (Helmet al., 2006).
Los ostreidos en particular incluyen las ostras u ostiones, que son indudablemente los
moluscos preferidos del hombre, tanto por las cantidades que pueden extraerse como por su
calidad nutricional, generalmente aceptada y que con el tiempo se han incluido al comercio
y al cultivo. Los ostiones son un alimento altamente nutritivo; su contenido en protena es
totalmente digerible y representa el 50 % de la materia seca.. Adems, el ostin tiene un
contenido relativamente alto de carbohidratos (28 % de la materia seca) y relativamente
bajo de lpidos bajo (11 % de la materia seca). Contiene adems vitaminas (A, riboflavina,
tiamina, niacina) y minerales (hierro, yodo, magnesio, fsforo, cobre, calcio), por lo cual se
considera un alimento equilibrado para el consumo humano (Len, 1999).
Los ostiones son organismos bentnicos que se distribuyen en zonas fango-arenosas,
aunque pueden invadir sustratos slidos y duros como las rocas, e incluso se desarrollan
fijndose a las races areas del mangle, en los estuarios, desembocaduras de ros y lagunas
costeras, donde generalmente existen condiciones del medio favorables para su desarrollo y
prosperidad. En condiciones controladas de cultivo, pueden desarrollarse en otro tipo de
sustratos. Se alimentan principalmente de fitoplancton y son altamente gregarios, por lo que
se les encuentra formando agrupaciones compactas o islotes, denominados bancos. Se
distribuyen en las zonas tropicales y templadas, desde el nivel de las mareas hasta
profundidades de 40 m y sin embargo, prosperan principalmente en aguas poco profundas
(SEPESCA/INP, 1994).
Al gnero Crassostrea pertenecen numerosas especies que habitan en medio marino y/o
esturico. Las que presentan un mayor inters y han sido objeto de cultivo o explotacin
son C. gigas, llamada ostra japonesa o del Pacfico, que ha sido importada, entre otros
pases occidentales, por Francia, en donde ha reemplazado totalmente a la ostra portuguesa
C. angulata; C. virginica u ostra americana, que es objeto de importantes cultivos en las
provincias martimas del Canad y sobre la costa oriental de los Estados Unidos,
cultivndose en concurrencia con otras especies en la costa del Pacifico. C. angulata u ostra
portuguesa, se distribua por Portugal, Espaa, Marruecos y en las costas del Adritico.
Otras especies pertenecientes a este gnero son C. margaritacea, que es la especie ms
comn en frica del Sur, C. glomerata es la ostra de Nueva Zelanda, siendo objeto de
cultivo en las zonas intertidales; C. rhizophorae que vive fija sobre los manglares en el mar
del Caribe y se cultiva en Venezuela, Martinica y Guadalupe; C. guyanensis, que se
encuentra fijada sobre rocas en la costa Atlntica de Amrica del Sur, desde Trinidad hasta
Brasil. C. gasar puebla los mangles de las riveras del oeste africano desde Senegal a
Angola. C. commercialis es la especie de Australia, llamndose ostra de roca o de
mangrove y siendo objeto de un fuerte cultivo. Otras especies que se pueden citar son C.
nippona y C. rivularis en Japn y en Extremo Oriente, C. cuscullata en la regin
indopacfica y en las costas americanas desde Per a California, as como en frica desde
Cabo Verde al Cabo de Buena Esperanza y C. lacerata como especie cosmopolita. (Torres,
2001).
Las especies pertenecientes al gnero Ostrea que presentan un mayor inters son O. edulis
u ostra plana europea que junto a C. gigas son el objeto de este estudio; O. sinuata, que
puebla las costas de Nueva Zelanda; O. lurida, indgena de la costa pacfica de Amrica del
Norte desde la baja California hasta Alaska, aunque en la actualidad el cultivo de esta
especie ha sido suplantado por el de C. gigas, al igual que sucede con O. denselamellosa de
las costas de China, Corea y Japn, que fue objeto de un cultivo intensivo desde 1918 hasta
1939 pero que actualmente se sustituye por el de C. gigas; O. chilensis, es la especie de
Nueva Zelanda, si bien se han encontrado poblaciones de estas en Per y Chile, dicha
localizacin es un ejemplo claro de dispersin de especies a causa de las corrientes. O.
puelchana, habita las riberas de Brasil hasta el golfo de San Matas al sur del Mar del Plata
en Argentina; O. stentina se localiza en el Cantbrico y el Mediterrneo, siendo abundante
en Marruecos. O. atherstonei existe en pequeas cantidades en frica del Sur y O. stentina
que est distribuida por las costas atlnticas, las riberas del Mediterrneo y la regin
indopacfica, as como O. folium, O. sandwichensis y O. crista-galli que habitan en la
regin indopacfica, O. lima es tpica de isla Mauricio, Filipinas y Hawi; O. megodon del
golfo de California, las islas Galpagos, Per y Australia y O. frons que es cosmopolita
(Torres, 2001).
Mxico ocupa el sexto lugar en la produccin promedio mundial de ostin. El 96% de la

produccin es principalmente de origen pesquero y proviene del Golfo de Mxico. El 4%
restante proviene del Pacfico, e incluye la produccin acucola de ostin Japnes
Crassostrea gigas en sistemas tecnificados e intensivos, a partir de semillas producidas en
laboratorio. En trminos de volumen de produccin, la pesquera de este molusco est
considerada en la quinta posicin, aunque no ocupa igual posicin en trminos de valor
econmico (Cruz, 1996). En el Golfo de Mxico el ostin es una de las especies de mayor
importancia comercial. Su explotacin se centra en los estados de Campeche, Tabasco,
Veracruz y Tamaulipas. La mayor produccin se registra en Veracruz, ocupando el primer
lugar con un 60%. Tabasco se encuentra en segundo lugar con un 28%, seguido por
Tamaulipas en tercer lugar con un 8% y Campeche en cuarto lugar con un 4% (Avils y
Eusebio, 1991).
El impacto de los patgenos es variable y depende de la edad de los animales. La salinidad,
temperatura, cantidad de nutrientes, radiacin solar son algunos de los factores que pueden
influir en la supervivencia y la proliferacin de agentes patgenos que afectan el
crecimiento de los ostreidos y en muchos casos los llevan hasta la muerte. Las altas
densidades en cultivos de moluscos generan estrs y favorecen la aparicin de patgenos
oportunistas siendo las bacterias las que causan mayor ndice de mortalidad en ostreidos.
Adems de que afectan tanto a larvas como juveniles y adultos (Granier et al., 2007;
Lafferty et al., 2004).
En organismos marinos y particularmente en aquellos que son objeto de cultivo intensivo,
la distincin entre la biota residente y transitoria es crucial porque debido a su forma de
alimentacin mediante filtrado, constantemente estn acumulando microorganismos que no
necesariamente se asientan en los tejidos y conductos de su tracto digestivo gastrointestinal
(TGI), sino que son digeridos y asimilados, mientras que otros ms, pueden convertirse en
parte de su microbiota residente Moriarty 1990 en Jorquera et al., 2002). Durante los
estadios larvarios de bivalvos, una parte de la biota transitoria se vuelve rpidamente
microbiota residente (Jorquera et al., 2002). Por lo tanto, conocer la composicin de esta en
el ostin permitir entender mejor el mecanismo de accin de los microorganismos, tanto

patgenos como benficos. Algunas enfermedades infecciosas solo afectan a los moluscos
en un estadio especfico de su desarrollo, de manera que parece razonable suponer que la
mayor susceptibilidad podra estar relacionada en parte
con la falta de una barrera
inmunolgica otorgada por la microbiota residente, que cumple una funcin

fundamentalmente protectora contra la colonizacin por potenciales patgenos (Jorquera et
al., 2002; Kue y Chang, 1985).
La microbiota normal del TGI es muy diversa y juega un papel muy importante en la salud
y nutricin de los animales (Dumoneceaux et al., 2006, Navarrete et al., 2009; Romero y
Navarrete, 2006). El TGI de los animales y en particular de las ostras, es el hbitat natural
de una gran diversidad de microorganismos y un amplio rango de ellos
pueden ser
bacterias patgenas para el organismo, y/o para el consumidor (Schulze et al., 2006, Spite
et al., 2000). Este puede ser el caso de algunos microorganismos comnmente asociados
con el sedimento marino que son patgenos entricos (Grimes et al., 1986), Vibrio,
Aeromonas (Dumontet et al., 2000), Listeria (Colburn et al., 1990) y Clostridium (Huss,
1980) y se han encontrado albergados en estos animales.
Por otro lado entre los moluscos, las ostras ocupan el 1er lugar en transmisin de
enfermedades o agentes infecciosos. Adems de que causan muerte, generan cuantiosas
prdidas econmicas en la ostricultura (Thompson et al, 2005 en Witman y Flick 1995). La
acumulacin de microorganismos en el sistema digestivo de los moluscos bivalvos incluido
el ostin es muy difcil de eliminar, si no se aplican procesos cuidadosos y estrictos de
limpieza y depuracin. Existen diferentes agentes etiolgicos que han provocado brotes
epidmicos de gastroenteritis, clera y hepatitis A, dentro de los que podemos mencionar
los siguientes: Vibrio cholerae (Thompson et al, 2004), Vibrio vulnificus (ChatzidakiLivanis et al, 2006), Vibrio parahemolyticus (Zimmerman et al., 2007), Shewanella
(Richards et al., 2008)
E. coli enteropatognica (Ruchaud-Sparagno et al., 2007),
Norovirus (Le Guyader et al., 2008. Tambin se han reportado casos de enfermedades
causadas por organismos no patgenos en personas inmunocomprometidas o desnutridas,

ancianos y nios (Avendao-Capitan, 1986).
Los moluscos son los organismos ms impactados por la contaminacin ambiental debido a
su condicin de organismos filtradores que acumulan gran cantidad de bacterias patgenas,
toxinas marinas y trazas de metales. Su microbiota guarda relacin con la calidad del medio
ambiente en donde se encuentran. En trminos generales son vehculos de transmisin de
toxiinfecciones alimentaras. La incidencia de brotes sigue constituyendo uno de los
problemas de salud pblica ms extendidos y permanecen como una de las causas
principales de morbilidad. Se ha estimado que una de cada dos mil comidas de moluscos
crudos origina enfermedades. Hoy da el riesgo de contraer una enfermedad de origen
entrico es mayor si se toma en consideracin la contaminacin de las aguas costeras por
desechos urbanos de alto contenido fecal. Dichos alimentos pueden poner a la gente en
riesgo de enfermedades peligrosas o la muerte por lo que no se recomienda comer ostiones
crudos. Diferentes especies de Vibrio, en particular Vibrio vulnificus es una bacteria que se
encuentra en aguas marinas, no es una amenaza para la gente sana, pero V. vulnificus puede
causar un frio repentino, fiebre, nausea, vomito, envenenamiento de la sangre y muerte en
pocos das en personas con ciertas condiciones mdicas. La presencia de esta bacteria no es
el resultado de contaminacin o de una inadecuada manipulacin del producto. Comer
ostiones de aguas limpias o en restaurantes de alta calidad no provee proteccin. Comer
ostiones crudos con salsa picante o mientras se toma alcohol no mata la bacteria. Solamente
cocinando completamente los ostiones se mata la bacteria. Especies consideradas como
procedentes de heces fecales son reconocidas como contaminantes de estos animales
marinos filtro-alimentadores y como una causa importante de los brotes de enfermedades
asociadas al consumo de dichos organismos procedentes de la extraccin o el cultivo. Sin
embargo algunas especies como Salmonella (Asakura et al, 2002) y Campylobacter (Endtz
et al., 1997; Cappelier et al., 1999) han sido detectadas en ambientes donde no existe
actividad ni contaminacin humana, por lo que se sugiere considerarlos como parte de la
microbiota normal de molusco
2. JUSTIFICACION
El ostin por su carcter filtrador es propenso a la acumulacin de patgenos causantes de
enfermedades (Sanidad) y su transmisin al humano (Inocuidad), principalmente
infecciones bacterianas y parasitarias. El cultivo de ostin es una industria en crecimiento
en el Estado y requiere de estrategias para incrementar la supervivencia en la produccin de
semilla y el crecimiento en la engorda. Uno de los principales problemas que enfrenta el
cultivo de ostin en el Estado, es la falta de semilla en mayor cantidad y de buena calidad
que garantice cultivos exitosos. Para lograr este reto es importante conocer cul es la
problemtica actual en los diferentes laboratorios y granjas de ostin del estado, resolverla
y evitar cuantiosas prdidas econmicas en las granjas que se dedican a su explotacin.
Otro problema serio es la contaminacin por aguas residuales y desechos industriales. El
ostin es un alimento altamente nutritivo, con buena digestibilidad pero al consumirlo
crudo o ligeramente tratado, existe el riesgo de transmisin de una serie de enfermedades.
En este proyecto se propone investigar la microbiota predominante y con potencial
patgeno en ostiones de las granjas ostrcolas del estado con el objetivo de aislar e
identificar los microorganismos con potencial patgenos y analizar su capacidad de
adherirse a mucosas de ostin.
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Aislamiento y caracterizacin de bacterias predominantes y con potencial patgeno, que
puedan afectar la sanidad del ostin como especie objeto de cultivo y la inocuidad del
producto cultivado.
3.2 OBJETIVOS PARTICULARES.
Aislar en medios selectivos para microorganismos patgenos, las bacterias

predominantes en ostiones nativos y ostiones cultivados procedentes de diferentes
granjas ostrcolas de Baja California Sur.
Determinar experimentalmente, en condiciones de laboratorio, la capacidad de

adhesin de las bacterias aisladas, a mucosas del ostin.
Identificar molecularmente, a nivel de gnero y especie, las bacterias

potencialmente patgenas aisladas de ostiones, que pudieran representar un riesgo
desde el punto de la sanidad del organismo cultivado y de la inocuidad del producto
para el consumidor.
4. HIPOTESIS DE TRABAJO
Tomando en cuenta que las tcnicas y metodologas de trabajo propuestas para la

investigacin son eficientes para el aislamiento y caracterizacin de bacterias del
ostin, al menos una de esas bacterias presentar la capacidad de colonizar a
mucosas de ostin y habr sido previamente reportada como potencialmente
patgena para moluscos ostreidos.
5. ANTECEDENTES
5.1 MOLUSCOS BIVALVOS EN EL CONTEXTO MUNDIAL
De acuerdo con la Organizacin Mundial de Epizootias (OIE), durante las ltimas dcadas,
la produccin mundial de moluscos se ha visto adversamente afectada debido al severo
impacto de enfermedades infecciosas. La deteccin, seguimiento y medidas de mitigacin y
control de patgenos certificables y/o notificables se ha convertido en un requerimiento
primario para el desarrollo y la sustentabilidad del cultivo de moluscos. La transferencia de
agentes infecciosos va el transporte de moluscos vivos, ha sido la principal causa de
difusin de enfermedades y epizootias. La dinmica actual de libre comercio y el legtimo
derecho de los pases acuicultores de buscar nuevas alternativas para la produccin de
alimentos y su distribucin en los mercados mundiales, con generacin de desarrollo
econmico y social, a menudo han propiciado se minimicen o se pasen por alto algunos
factores sanitarios esenciales que, de no considerarse en su justo contexto, pueden hacer
fracasar los cultivos de moluscos y demeritar la calidad de sus productos.
Entre los requerimientos bsicos de manejo para una mejor distribucin de dichos
organismos, se incluye el conocimiento de la condicin sanitaria de los moluscos bivalvos
a transferir, cules problemas sanitarios les afectan, qu riesgo hay de que esos problemas
se transfieran a otras poblaciones naturales o cultivadas de moluscos bivalvos en la zona
receptora, y qu problemas sanitarios propios de los moluscos bivalvos de la zona receptora
pueden afectar al molusco bivalvo transferido. El conocimiento de sta informacin
proporciona una mayor garanta de xito para las empresas acucolas, ayuda a proteger la
biodiversidad de moluscos y otras especies en el ambiente y protege al consumidor.
La experiencia, que en materia sanitaria, han desarrollado algunos de los pases lderes en la
produccin de moluscos y otros organismos acuticos a niel mundial, ha permitido contar
con lineamientos relativamente precisos para evitar la transferencia de enfermedades,
mismos que se han agrupado en el Cdigo Sanitario para los Animales Acuticos y en el
Manual de Pruebas de Diagnstico para los Animales Acuticos de la OIE.
Adicionalmente, muchos pases han desarrollado lineamientos sanitarios propios que

vienen a fortalecer las medidas generales para evitar la transferencia de enfermedades. La
mayor informacin cientfica sobre los agentes patgenos de moluscos bivalvos que
conocemos, se refiere fundamentalmente, a las especies mayormente cultivadas y
dispersadas alrededor del mundo o nativas de pases desarrollados, tales como C. gigas, C.
virginica, Ostrea edulis, Mytilus edulis, M. galloprovincialis, Ruditapes philippinarum,
Saccostrea glomerata, entre otras (http://www.oie.int/).
5.2 LA OSTRICULTURA EN MEXICO
Mxico ocupa el cuarto lugar en cultivo de moluscos bivalvos en Amrica Latina y se
realiza en mayor parte en las costas del Pacfico de Baja California y Golfo de California.
La ostricultura comercial de Mxico se basa prcticamente en el cultivo intensivo de la
ostra del Pacfico C. gigas con semilla producida en el laboratorio. El 95.6 % de las
empresas dedicadas a la produccin intensiva de moluscos bivalvos, se dedican al cultivo
de la especie C. gigas en la Pennsula de Baja California y Mar de Cortez en el estado de
Sonora y en menor proporcin al cultivo del ostin americano C. virginica en los estados
del Golfo de Mxicos. En Nayarit se realiza la acuicultura del ostin de Placer C.
corteziensis por medio de colecta de semilla del medio natural. En Sinaloa el futuro de esa
especie nativa es incierto, ya que existen problemas en la produccin de juveniles en el
laboratorio y al parecer hay un agente patgeno que limita la maduracin de los
reproductores (PMSMB, 2008).
5.3 OSTRICULTURA EN BAJA CALIFORNIA SUR
El Estado de Baja California Sur tiene caractersticas inigualables para el desarrollo de una
acuacultura sostenible y sustentada en elementos de sanidad e inocuidad, que podran
impactar considerablemente en la economa local si se respetan estas bases. La
caracterstica de aislamiento geogrfico peninsular a pesar que puede verse como una
desventaja, es considerada como la principal caracterstica favorable para la industria
ostrcola local,
ya que la adecuada aplicacin de restricciones a la libre movilizacin de
10
semillas podra ser favorable para el adecuado control de enfermedades y parsitos que
afectan los cultivos en los estados vecinos del Noroeste de Mxico. Para tal efecto, el
Comit de Sanidad Acucola de B.C.S. tiene como funciones detectar, prevenir y
reducir/controlar la aparicin y dispersin de enfermedades en los cultivos acucolas del
Estado, con el fin de reducir riesgos a la inversin, impulsando normas que coadyuven en
el crecimiento ordenado y sustentable de sta actividad respetando los ecosistemas, base
fundamental de la sanidad e inocuidad del producto destinado al consumidor.
Al respecto, durante el 2008, se supervisaron 12 localidades del Estado donde se tienen
establecidos grupos de cultivo principalmente de ostin y mano de len, as como, 2
laboratorios de produccin de abuln y uno de bivalvos en la Zona Pacifico Norte y 2
laboratorios de produccin de bivalvos en La Paz, B.C.S. Paralelamente se realizan anlisis
a los organismos en cultivo para detectar y prevenir posibles infecciones por enfermedades
certificables de la OIE, (Organizacin Mundial de Epizootias), as como, parsitos y para la
deteccin de herpes virus.
Estos parsitos, en general, causan daos en los tejidos, desarrollndose principalmente en
el tejido epitelial del estmago y de la glndula digestiva y estn asociados con bajas
condiciones de vida, enflaquecimiento de la ostra y agotamiento de sus reservas de energa
(glicgeno), decoloracin de la glndula digestiva, interrupcin del crecimiento,
reabsorcin de las gnadas y desorganizacin total del epitelio de la glndula digestiva,
causando inanicin (Caceres et al., 2008).
La mortalidad por estos parsitos parece estar relacionada con la esporulacin de los
mismos ya que sta se produce en el epitelio de los palpos, del estmago, del conducto
digestivo y probablemente de las branquias (Caceres et al., 2008). Es de destacar que la
variacin en la produccin de ostiones en 2005 cuando se produjeron 250,081 docenas, su
reduccin para 2006 a 129,520 docenas, y el incremento para el ao 2007 a 346,466
docenas y finalmente una nueva reduccin en el 2008 a 245,915 docenas, se puede explicar
principalmente
en funcin de la inconstancia en la produccin de semillas y la
consecuente limitacin en la siembra de los productores. El cultivo de moluscos en Baja
11
California Sur es una actividad dinmica en constante desarrollo, tanto en sus aspectos
tcnicos como en el impacto social y econmico que genera. El cultivo de esta especie, se
lleva a cabo exclusivamente en cuerpos de agua del pacifico sudcaliforniano, desde el
estero Rancho Bueno al sur del complejo lagunar Baha Magdalena, hasta la Laguna de
Guerrero Negro al norte del estado. El alto contenido de alimento natural, temperatura
adecuada casi todo el ao y su excelente nivel de limpieza hacen de estos cuerpos de agua
sitios
de
privilegiados
para
la
actividad
ostrcola
(http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf). En el Pacfico norte de Baja

California Sur se encuentran ubicadas la mayora de las granjas ostrcolas del Estado (Tabla
1).
Tabla 1.- Ubicacin geogrfica de granjas ostrcolas en la zona Pacfico Norte de Baja
California Sur (Fuente:http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf )
NOMBRE DE
UBICACIN
LOCALIDAD
MUNICIPIO
COORDENADAS
LA EMPRESA
SCPP Y A La
Campo Chupa-
Perla de Guerrero Lodo. Laguna

Negro SC de RL
Guerrero Negro
Muleg
BCS
27 59 40.50 N
114 417.65 O
Guerrero Negro
BCS
Comit Pesquero Laguna Ojo de
Guerrero negro
Social y Privado
Liebre
BCS
SCPP Baha
El Rincn Baha
Baha Tortugas
Tortugas SC de
Tortugas
BCS
Sol Azul SA de
Estero el Cardn
El Cardn BCS
CV
BCS
Muleg
27 5510.09 N
1110 53.50 O
Muleg
27 39 46.52 N
114 51 56.08 O
RL
Muleg
26 47 25.81 N
113 8 58.20 O
12
SCPP Punta
Estero El Coyote
Punta Abreojos
Abreojos SC DE
BCS
BCS
Muleg
113 26 4.57 O
RL
SC El Progreso de Estero La Bocana La Bocana BCS

Produccin
26 47 25.81 N
Muleg
BCS
26 47 14.75 N
113 41 24.67 O
Pesquera SCde RL
Sin embargo tambin podemos encontrar algunas granjas ostrcolas en el centro sur de Baja
California Sur, cuya ubicacin geogrfica se resumen en la Tabla 2.
Tabla 2.- Ubicacin geogrfica de granjas de moluscos en la zona Pacfico Sur de Baja
California Sur (Fuente: http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)
NOMBRE DE LA UBICACIN
LOCALIDAD
MUNICIPIO
COORDENADAS
Comond
23 32 44.94 N
EMPRESA
SCPP Santo
Campo El
Santo Domingo
Domingo SCL
Pailebote
Moluscos Baha
Campo Las
Puerto Adolfo
Magdalena SPR de
Botellas
Lpez Mateos
Sistema de
Campo Los
Estero San Buto
Maricultura y Pesca
Islotes
112 4 5.98 O
Comond
112 4 59.76 O
RL
Comond
SA de CV
Campo 13
24 46 28.40 N
112 2 51.59 O
S de RL de CV
Argos Acuicultores
2518 9.05 N
Estero San Buto
Comond
24 46 14.65 N
112 2 11.69 O
13
La produccin ostrcola en Baja California Sur, en el 2010 fue de 504,432, con una mayor
produccin en el Municipio de Muleg, Tabla 3.
Tabla 3. Produccin ostrcola por municipio en B.C.S. en el ao 2010.
(Fuente: http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf)
Productor
Municipio
Localidad
Cantidad (Dz)
La Perla
Muleg
Guerrero Negro
200
Sol Azul
Muleg
El Cardn
294,177
Verde Mar Acucola
Muleg
El Cardn
41,666
Baha Tortugas
Muleg
Baha Tortugas
819
Punta Abreojos
Muleg
Punta Abreojos
67,000
El Progreso
Muleg
La Bocana
47,000
Total municipal:
Molusco Baha
Muleg
Comond
Magdalena
450,862
Pto. Adolfo Lpez
NR
Mateos
Santo Domingo
Comond
Santo Domingo
48,879
Acuacultura El Paraso
Comond
Santo Domingo
4,691
Sistemar
Comond
Estero San Buto
NR
Argos Acuacultores
Comond
Estero San Buto
Total municipal:
Cultemar
Total estatal
Comond
La Paz
53,570
Rancho Bueno
0
504, 432
14
5.4 RIESGO SANITARIO ASOCIADO AL CULTIVO Y CONSUMO DE

MOLUSCOS BIVALVOS.
En aos recientes se ha incrementado la preocupacin del sector pblico por asegurar la
inocuidad de diversos alimentos de origen marino, pesquero y acucola, para el consumo
humano directo. Esto se debe en parte, a que se han detectado casos de envenenamiento y
de enfermedades infecciosas (Martnez y Montoya, 2003; Thompson et al., 2005). Los
aspectos de salud pblica relacionados con el consumo de productos provenientes de la
ostricultura, se enfocan principalmente a evitar la presencia de peligros biolgicos (ej.
parsitos, bacterias y virus) y qumicos (ej. plaguicidas, metales pesados y biotoxinas)
(Martnez y Montoya, 2003).
Los moluscos bivalvos son sedentarios y filtradores; sus branquias cubiertas de mucus y
cilios vibrtiles, adems de cumplir con la funcin respiratoria, retienen fitoplancton,
materia orgnica particulada y diversos microorganismos como bacterias, virus y protistas
planctnicos. (Di Girolamo et al., 1977). El riesgo en el consumo de ostiones es debido a
que son propensos a acumular y en consecuencia, a transmitir microorganismos patgenos
al consumidor. Por otro lado, tambin pueden acumular biotoxinas y productos qumicos
como fertilizantes, metales pesados, compuestos organoclorados y medicamentos
veterinarios como antibiticos que pueden ser nocivos para la salud humana. Una buena
parte de los brotes epidmicos causados por la intoxicacin o infeccin alimentaria
provienen de moluscos bivalvos provenientes de la pesca o de la acuacultura, cuando han
sido contaminados con virus y/o bacterias debido a que las aguas en las que crecen, pueden
en algunos casos contaminarse con materia fecal de aguas residuales, e incluso por
infecciones que tiene la persona que manipula dichos alimentos (Metcalf et al., 1979,
Rippey, 1994).
15
6. MATERIALES Y METODOS.
6.1 COLECTA Y TRANSPORTE DE ORGANISMOS
Se viaj a cada lugar de muestreo, en las costas del Ocano Pacfico a lo largo de Baja
California Sur, Figura 14. En el caso de granjas se hizo previa cita con los responsables.
De cada lugar se tomaron al azar al menos tres organismos. Cada organismo colectado, se
escurri, se coloc en una bolsa de papel estril y se cubri con otra bolsa de plstico
debidamente higienizada y se guardaron en un ambiente fresco en una hielera para
transportarse hasta el laboratorio y analizarse inmediatamente.
Los organismos colectados en el municipio de Muleg se analizaron microbiolgicamente
el mismo da en la Unidad del CIBNOR que se encuentra en Guerrero Negro. Los
organismos que se colectaron en los municipios de Comond y la Paz se analizaron en el
Laboratorio de Ciencia y Tecnologa de Alimentos.
6.2 SITIOS DE MUESTREO.
1ER MUESTREO.
FECHA: 19 ENERO 2012
En el primer muestreo llevado a cabo en las Zonas 1, 2 y 3 del municipio de Muleg, solo
se colectaron organismos de C. gigas, como se observa en las figuras 1, 2, 3, 4 y 5.
Zona 1
Municipio: Muleg. Localidad: Gro. Negro. Ubicacin: La Salinera. Coordenadas:

Latitud 27 53 19.34 N
Longitud 114 08 34.76 O. No. Mestras: 3. Analizadas: 2
16
Fig 1. Crassostrea gigas
Zona 2
Municipio: Muleg. Localidad: Gro. Negro. Ubicacin: Granja Ostin del Pacifico.
Laguna de Gro. Negro. Coordenadas: Latitud 27 5940.50 N
Longitud 114 417.65
O. No. Muestras: 3. Analizadas: 3
Fig. 2. Crassostrea gigas
17
Zona 3
Municipio:
Muleg.
Localidad:
Gro.
Coordenadas: Latitud 28 02 26.34 N
Negro.
Ubicacin:
Granja
Intermareal
Longitud 114 06 36.32 O. No. Muestras:
6. Analizadas: 6
2DO. MUESTREO FECHA: 26 ABRIL 2012

Municipio:
Comond.
Localidad:
San
Buto.
Ubicacin:
Baha
Magdalena.
Coordenadas: Latitud 24480N y Longitud 11230 O. No. Muestras: 8.
18
Fig. 6. S. palmula
Fig 7. C. gigas
Fig 8. C. gigas
3ER.
MUESTREO
Fig 10.
S. palmula FECHA:
Fig 11.4S.MAYO
palmula2012
Fig 12. C. gigas
Fig 9. S. palmula
Fig 13. . C. gigas
3er. MUESTREO FECHA: 4 MAYO 2012
Municipio:
Comond.
Localidad:
Santo
Domingo.
Ubicacin:
Las
Botellas.
Coordenadas: Latitud 251732 N y Longitud 115608 O. No. Muestras: 13

En este muestreo se colectaron 3 organismos de las especies C. corteziensis, 3 de C.
rhizophorae, 3 de S. palmula y 4 de C. gigas.
19
Fig 14. Mapa de lugares de muestreo de ostiones en BCS.

Fuente:http://cesabcs.org/pdf/UbicacionTermografosMoluscos2010%282%29.pdf
6.3 ANLISIS MICROBIOLGICO

Se analizaron todos los organismos colectados de cada especie y de cada punto de
muestreo. Los ostiones recin llegados al laboratorio se lavaron con agua corriente, la
superficie se cepill hasta observarla limpia, se enjuagaron con agua estril y
posteriormente se realiz la diseccin en una charola con un punzn, pinzas y tijeras
estriles. Se colocaron en tubos falcn de 40 ml previamente estriles; se homogenizaron
con un homogenizador de tejidos y se realizaron diluciones decimales para llevar a cabo
cuentas viables por la tcnica de extensin en superficie de mesfilos aerobios y en medios
20
selectivos para los gneros Vibrio, Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Staphylococcus,
hongos y levaduras.
6.4 AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS (Marvin, 1976)
Del crecimiento obtenido en las diluciones ms altas sembradas en los medios de cultivo de
la Tabla 4, se seleccionaron colonias predominantes aisladas y se resembraron
individualmente por estra cruzada en cajas de petri con los mismos medios de cultivo.
Tabla 4: Medios de Cultivo utilizados
Agar marino
Agar Baird Parker
Agar Papa Dextrosa
Agar TCBS
Agar XLD
Agar y Caldo EC
Caldo Selenito Cistina
Caldo Vassiliadis-Rappaport
Caldo lactosado
De las siembras por estra cruzada se seleccionaron colonias aisladas y se resembraron en

Caldo TSB. Se incubaron de 12 a 18 horas a 30C para su crecimiento. Posteriormente
alcuotas de 250 l se adicionaron con igual cantidad de glicerol al 80% en tubos eppendorf
de 1.5 ml, se etiquetaron y se guardaron en ultracongelacin, hasta su anlisis.
6.5 MORFOLOGA CELULAR DE LAS CEPAS
Del crecimiento obtenido en el punto anterior, se hicieron preparaciones en fresco para
observar las caractersticas morfolgicas de cada bacteria en el microscopio de contraste de
fases.
21
6.6 TINCIN DE GRAM Y PRUEBA DE LA CATALASA (Marvin 1976).

Todas las cepas seleccionadas de los diferentes medios fueron resembradas en caldo TSB
por 12 horas. Se llevaran a cabo frotis en portaobjetos de cada cepa y se les realiz la
tincin de Gram, posteriormente se observaron en un microscopio de contraste de fases. La
prueba de la catalasa se llev a cabo poniendo una gota de cultivo fresco sobre el
portaobjetos y se le agreg una gota de perxido de hidrgeno, se observo la formacin de
burbujas para determinar si la prueba fue positiva.
6.7 ENSAYO DE ADHESIN A MOCO DE OSTION
Para el ensayo de adhesin de las cepas con potencial patgeno a moco de ostin se utilizo
el mtodo reportado por Rojas and Conway 2001, el cual se describe a continuacin.
6.7.1 Preparacin del cultivo.
Cada cepa de bacteria con potencial patgeno se reactiv en agar TSA, se inocul al 1% en
3-5 ml del medio TSB y se incub a 37C hasta que el cultivo alcanzo la fase de
crecimiento logartmica mxima. Se centrifug a 3500 rpm durante 5 min, se lav el pellet
con 3 ml
de buffer H-H, se centrifug otra vez a 3500 rpm durante 5 minutos.
Posteriormente se suspendi en 1 ml del mismo buffer, ajustando la densidad ptica a 0.9 a

una longitud de onda de 600 nm en un espectrofotmetro Bio-Rad SmartSpectm 3000.
6.7.2 Preparacin de la membrana.
Se cort un trozo suficiente de membrana Immobilon-P (PVDF: Polyvinilidene difluoride
microporous membrane marca Millipore), de acuerdo al nmero de cepas y por triplicado.
Se dividi la membrana en cuadros de 1 cm2. Se coloc la membrana en metanol por 2
segundos y se enjuag con agua destilada por 5 min. Se equilibr en Buffer H-H y se
coloc sobre el papel filtro previamente humedecido con el Buffer H-H, con el fin de
mantenerla hmeda todo el tiempo. Se utiliz como control positivo la cepa L. fermentum
86 (Macas Rodrguez M. E., 2008) a la cual se le di el mismo tratamiento que al cultivo.
El ensayo se realiz por triplicado, usando como control negativo H-H.
22
6.7.3 Ensayo de adhesin.

Sobre cada cm2 de la membrana colocada sobre la cama de papel filtro hmedo con H-H se
depositaron 20 L de cada suspensin celular hasta que se absorbi el lquido. Se incub la
membrana en una solucin al 3% de albumina de suero bovino (BSA) preparada con Buffer
H-H y se mantuvo por 20 min a temperatura ambiente para bloquear sitios no especficos.
Se desech la albumina y se lav la membrana 2 veces con H-H. Posteriormente se incub
la membrana en una solucin que contena 300 L de extracto crudo de moco de ostin
marcado enzimticamente (HRP-Moco en 10 ml de Buffer H-H y se dej incubando por 2
horas a temperatura ambiente. Se desech el moco marcado y se lav la membrana 2 veces
con buffer H-H 10 min cada vez, se desech el Buffer y se enjuag con una solucin de
acetato de sodio 0.1 M pH=5.0 para enseguida desarrollar color con el sustrato de la enzima
y un cromgeno (3.5 mg de diamino bencidina, 2.5 L de perxido de hidrogeno y 10 ml
de acetato de sodio 0.1 M) Cuando se desarroll el color, la membrana se enjuago con
metabisulfito de sodio 0.1 M por 3 min para detener la reaccin.
Por ltimo la membrana se sec a temperatura ambiente y fue llevada a un documentador
de geles (Bio Rad) para posteriormente analizar los resultados en forma cualitativa.
6.8 IDENTIFICACIN MOLECULAR DE BACTERIAS POTENCIALMENTE
PATGENAS
6.8.1 Extraccin del ADN genmico de cepas
Las cepas guardadas con glicerol a -85C se reactivaron por estra cruzada en agar TSA,
incubndose por 18-24h a 30C. Se tom una colonia aislada de cada cepa y se inocularon
al 1% en caldo TSB y se incubaron por 12 h a 30C, una vez pasando este tiempo los
cultivos se pusieron (1.5 ml) en tubos eppendorf de 1.5 ml. Se centrifug por 5 minutos a
6000 rpm a 4C, y se desech el sobrante. A partir de este punto se utiliz el Kit Wizard
Genomic DNA Purification Kit Part # TM050, protocolo 3.G. para el aislamiento de ADN
genmico de bacterias Gram negativas. Brevemente. Se suspendieron las clulas agitando
vigorosamente en 480l de 50mM EDTA y se agregaron 600 l de la Solucin de Lysis
23
Nuclei. Se resuspendi con la micropipeta subiendo y bajando la suspensin y se incub a

80C por 5 minutos para terminar de lisar las clulas y entonces enfriar a temperatura
ambiente. Se agregaron 3 l de la solucin RNasa al lisado de clulas, se Invirti el tubo de
2 a 5 veces para mezclar y se incub a 37C por 15-60 minutos. La muestra se enfri a
temperatura ambiente y se agregaron 200l de la solucin para precipitar protenas al lisado
de clulas tratado RNasa. Se agit vigorosamente por 20 seg para mezclar y se incub la
muestra en hielo por 5 minutos, se centrifug a 13,000-16,000 x g por 3 minutos y se
transfiri el sobrenadante que contiene el DNA a un tubo para centrfuga limpio de 1.5 ml
conteniendo 600l de isopropanol a temperatura ambiente. Se mezcl vigorosamente por
inversin del tubo hasta que La red de hebras de DNA form una masa visible. Se
centrifug a 13,000-16,000 x g por 2 minutos y se decant cuidadosamente el sobrenadante.
Se dren el tubo con un papel absorbente y se agregaron 600l de etanol al 70% a
temperatura ambiente, se invirti el tubo varias veces para lavar el pellet de ADN, se
centrifug a 13,000-16,000 x g por 2 minutos. Se aspir cuidadosamente el etanol y se
dren el tubo sobre un papel absorbente limpio para permitir que el pellet se seque al aire
por 10-15 min. Se agregaron 100 l de solucin de rehidratacin de ADN al tubo y se dej
rehidratar el DNA incubando a 65C por una hora. Peridicamente se mezcl la solucin
invirtiendo el tubo. Alternativamente, para rehidratar el DNA se incub la solucin toda la
noche a temperatura ambiente o a 4C. El DNA se almacen a 2-8C.
6.8.2 Visualizacin del ADN genmico.
La medicin de la concentracin de ADN se llev a cabo comparndolo con diferentes
concentraciones de lambda () DNA Para visualizar el ADN se prepararon geles de agarosa
al 1% en buffer TAE (tris 40 mM, pH 7.6, cido actico 20mM y EDTA 1mM) y en
presencia de bromuro de etidio 1 l. (10mg/ml EtBr). Se prepararon 5 l de muestra
mezclados con 5l (una gota) del buffer de la muestra (10X stlc, 50% glicerol, 0.25%
bromophenol blue, 0.25% xylene cyanol FF en 1X buffer TAE). Se colocaron las muestras
en los carriles del gel de agarosa acomodado en la cmara. El gel se corri en una cmara
de electroforesis horizontal (Bio-Rad) conectada a una fuente de poder (Bio Rad) a 50
24
Volts. Despus de correr el gel por 45 minutos se procedi a analizarlo en una cmara de
luz UV.
6.8.3 Amplificacin del gen 16S DNA para identificacin molecular de bacterias (Broda et
al,. 1999).
Una vez purificado el ADN genmico de cada cepa, se llev a cabo la reaccin de
amplificacin de los genes ribosomales 16sRNA por PCR en la que se utilizaron los
oligonucletidos pA y PH*, Broda et al., 1999.
pA: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
pH*: 5'- AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3'.
La composicin de la mezcla de reaccin se muestra en la tabla 5.
Tabla 5. Mezcla de reaccin usada para la amplificacin del gen 16S ARN.
Componente
stock)
(Concentracin Concentracin final
Volumen por 50 l
de reaccin (en
l)***
Buffer de enzima Taq(10X)
1.5X
MgCl2 (50mM)
0.15mM
dNTPS
0.20mM
Oligo pA(100 mM)
0.5 M
0.25
Oligo PH*(100 M)
0.5 M
0.25
Taq polimerasa (5U/ l)
0.01 u/ l
0.25
ADN genmico (0.5 g/ l)
5ng/ l
H2O
bi-destilada
libre
de
38.3
DNAsas
Volumen final
50
25
***Cantidades estandarizadas para el kit de PCR de Invitrogen, deben considerarse las

concentraciones stock indicadas para kits de otras marcas.
Una vez mezclados los componentes, se llev a cabo la siguiente reaccin colocando los
tubos que contienen la mezcla en un termociclador (Perkin Elmer).
El programa consisti de 35 ciclos, 95C por 4 minutos, 94C por 45 seg y 72C por 1
minutos. El programa termin con 5 minutos de incubacin a 72C. Finalmente se baj la
temperatura a 4C.
Una vez concluida la reaccin se observ el producto de la amplificacin en un gel de
agarosa al 1.5%.
6.8.4 Visualizacin de los productos del PCR en geles de agarosa
Para observar los productos de PCR se prepar un gel de agarosa al 1.5%. Cada producto 5
l se mezcl con 1 l de buffer para la muestra (Tris-HCl 0.5 M, Glicerol, SDS 10%,2Mercapto-etanol, Bromofenol azul 1%) y se corri una electroforesis a 70 Volts durante 40
minutos, se utiliz un marcador de peso molecular (PCR Markers, Promega), un control
positivo (Lactobacillus fermentum) y un blanco (agua libre de nucleasas). Los productos de
PCR se enviaron a la empresa Macrogen (Korea) para su purificacin y secuenciacin.
6.8.5 Secuenciacin y anlisis bioinformtico.
Las secuencias obtenidas y sus cromatogramas fueron editados en Chromas, se quitaron los
extremos que no tenan buena resolucin y se alinearon (forward and reverse) con el
software Align de Blast. Las secuencias resultantes fueron comparadas en la base de
secuencias de NCBI con la herramienta Blast.
26
7. RESULTADOS
Se hicieron tres muestreos de campo a lo largo del Estado de Baja California Sur,
colectando ostiones cultivados y organismos silvestres (Tabla 6). Se colectaron ms
muestras de ostin Japons C. gigas que de las otras especies, debido a que es la especie
ms cultivada en el estado. En una granja ostrcola de la regin de Santo Domingo (Las
Botellas), se colectaron ejemplares de ostin de placer C. corteziensis y ostin Kumamoto
C. sikamea
El ostin de mangle Saccostrea palmula, una especie nativa que generalmente crece en
forma silvestre, pegada a los mangles y otros objetos presentes en la zona intermareal, fue
incluido en los muestreos 2 y 3, como fuente potencial de bacterias patgenas y punto de
referencia para los resultados con las especies de cultivo no-nativas.
Tabla 6. Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacterias con
potencial patgeno para ostin.
No.
Ubicacin
Muestreo
1
Organismos
Cepas
analizados
aisladas
Observaciones
G. Negro
Zona 1
Zona 2
Zona 3
Regin de
Baha
25
Aisladas de C. gigas
Aisladas de C. gigas y S.
25
palmula
Magdalena
8 Aisladas de C. gigas, 13 de C.
3
Las Botellas
13
30
corteziensis, 5 de C. sikamea, 4
S. palmula (ostin de mangle)
27
7.1.- ANLISIS MICROBIOLGICO.

Los anlisis microbiolgicos se realizaron a todas las especies de ostiones trados al
laboratorio. Estos anlisis se hicieron por cuenta viable usando la tcnica de diluciones en
diferentes medios de cultivo selectivos para diferentes microorganismos patgenos. Para
cuantificar la microbiota predominante se us agar marino, un medio de cultivo rico en
nutrientes donde pueden crecer todos los microorganismos cultivables del ambiente marino.
En general las cuentas ms altas de bacterias en agar marino se encontraron en los ostiones
colectados en Guerrero Negro (Tabla 7), sin embargo, en esta misma regin se presentaron
cuentas bajas de microorganismos con potencial patgeno.
Tabla 7. Anlisis microbiolgico de los ostiones (C. gigas) procedentes de diferentes
zonas de Guerrero Negro, B.C.S.
Medio
de
Muestreo 1. Log UFC/g de OSTIONES, C gigas

ZONA 1
ZONA 2
ZONA 3
Ostin
O1
02
O3
O4
O5
O6
O7
O8
09
010
011
AM
6.2
7.0
6.3
<3
<3
7.0
7.9
7.3
5.2
6.1
5.7
TCBS
<2
<2
<2
<2
<2
4.0
3.3
5.0
5.3
<2
4.1
APD
<1
<1
3.3
3.8
<1
<1
3.3
<1
<1
<1
<1
ABP
<1
1.0
<1
<1
<1
1.0
3.0
3.8
1.0
<1
2.0
MRS
<1
<1
3.6
3.6
<1
<1
4.9
4.8
2.3
4.4
2.0
cultivo
Los ostiones de Baha Magdalena fueron los que presentaron en lo general las cuentas ms
bajas de los tres muestreos, Tabla 8: En los medios AM (Agar Marino), en TCBS selectivo
28
para microorganismos del Gnero Vibrio, en APD (Agar Papa Dextrosa) donde crecen
hongos y levaduras y en ABP (Agar Baird Parker), donde crece Staphylococcus sp.
Con respecto a los tipos de microorganismos, la cuenta viable total en agar marino (AM)
estuvo en un rango de 3.0 a 7.9 Log UFC, Tabla 8.
Tabla 8.- Anlisis microbiolgico de los ostiones (C. gigas) colectados en
Baha
Magdalena B.C.S. (San Buto y Paredones).

Medio de cultivo
Muestreo 2. Log UFC/g de OSTIONES
Ostin
O12 013 O14 O15 O16 O17 O18 O19
AM
3.6
3.0
5.8
3.5
3.3
3.9
4.8
5.2
TCBS
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
APD
<1
<1
1.3
<1
<1
<1
<1
<1
1.6
<1
<1
<1
<1
1.0
1.5
1.3
ABP
Las bacterias del gnero Staphylococcus y otras relacionadas que crecen en medio ABP,
tambin se observaron en bajas concentraciones, en un rango de <1 a 4.2 Log UFC/g. Sin
embargo, la mayora de las muestras presentaron ms de 1 Log UFC/g, lo cual significa que
esta bacteria es comn en los ostiones, aunque no se encuentre en altas concentraciones.
En la regin de Santo Domingo se encontraron las cuentas ms altas de bacterias con
potencial patgeno, especficamente en los ostiones de una granja ubicada en la localidad
de Las Botellas (Tabla 9).
29
Tabla 9. Anlisis microbiolgico de los ostiones (C. gigas) colectados en
Santo
Domingo B.C.S. (Las Botellas).

Medio de
Muestreo 3. Log UFC/g de OSTIONES
cultivo
Ostin
O21
022
O23
O24
O25
O26
O27
O28
O29
030
O31
O32
O33
3.3
6.6
6.0
4.6
6.9
5.5
4.2
5.1
5.5
5.2
5.5
5.2
4.9
4.6
3.5
3.8
3.1
3.55
2.8
2.9
1.9
3.9
3.3
3.4
4.0
3.0
ND
ND
1.0
1.7
ND
3.6
1.0
ND
1.3
ND
ND
ND
ND
1.3
2.6
2.0
1.3
1.8
3.5
4.2
ND
1.7
1.3
ND
3.0
ND
AM
TCBS
APD
ABP
ND. No Determinado
De acuerdo con los resultados del anlisis microbiolgico, en general los ostiones
analizados tienen bajas concentraciones de hongos y levaduras (detectables en medio
APD); se observaron en un rango de <1 a 3.8 Log UFC/g, sin embargo la mayora presento
<1 Log UFC/g (Tabla 7, 8 y 9). Estos resultados confirman que estos microorganismos
eucariontes no son predominantes en los ostiones.
A pesar de las diferencias que se observaron en el log de UFC en los diferentes muestreos,
al hacer el anlisis estadstico del log UFC en Agar marino de los tres muestreos, se
observ que no hubo diferencia significativa, ya que p es mayor que = 0.05.
Tabla 10. ANOVA del log UFC en Agar Marino de los tres muestreos de ostiones
SS
Intercept
Numero de Muestreo
Degr. of
MS
779.3314
779.3314
396.3181
0.000000
11.7057
5.8529
2.9764
0.066724
30
Error
57.0264
29
1.9664
Sin embargo, en el anlisis estadstico del log UFC de bacterias crecidas en Agar TCBS, se
observ que hubo diferencias significativas entre los tres muestresos y la prueba de Tukkey
confirm que en el muestreo 2 present diferente log de UFC que los muestreos 1 y 3.
Tabla 11. ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos de ostiones
SS
Intercept
Degr. of
MS
161.8111
161.8111
122.2543
0.000000
Numero de Muestreo
27.7298
13.8649
10.4754
0.000377
Error
38.3833
29
1.3236
Tabla 12. Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1, 2 y 3
Numero de Muestreo
Unidades Logaritmicas 1
2
1.000000
2.518182
****
3.365385
****
2
****
Con respecto al anlisis estadstico realizado para el log UFC en Agar Papa Dextrosa, se
observ que tampoco hubo diferencias significativas, Tabla 13.
Tabla 13. ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2 y 3
SS
Intercept
Numero de Muestreo
Error
Degr. of
MS
19.22855
19.22855
12.38116
0.002040
7.66556
3.83278
2.46791
0.108982
32.61402
21
1.55305
En el anlisis estadstico del log de UFC en Agar Baird Parker si hubo diferencias
significativas entre los diferentes muestreos de ostiones, como se muestra en la Tabla 14.
La Prueba de Tukkey confirm que el muestreo 3 fue diferente a los muestreos 1 y 2. En la
31
grfica de medias en Anexo 3, se observ que el log de UFC de Staphyilococcus fue mayor
que en el 1 y 2.
Tabla 14. ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2 y 3
SS
Degr. of
MS
Intercept
51.09740
51.09740
42.91428
0.000001
Numero de Muestreo
12.93529
6.46764
5.43187
0.010687
Error
30.95782
26
1.19069
Tabla 15. Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos
Numero de Muestreo
Unidades Logaritmicas
0.675000
****
1.072727
****
2.270000
****
7.2. AISLAMIENTO Y PURIFICACIN DE BACTERIAS.

El aislamiento de bacterias con potencial patgeno se hizo resembrando colonias de las
cajas de petri sembradas con las diluciones ms altas durante las cuentas viables. El mayor
nmero de cepas aisladas se obtuvieron de cajas Petri con Agar Marino debido a que en
este medio se observ en lo general, mayor crecimiento bacteriano. A partir de cajas Petri
con agar TCBS, un medio de cultivo selectivo para vibrios, se aislaron un mayor nmero de
cepas, lo cual es congruente tomando en cuenta que el Gnero Vibrio tiene varias especies
reportadas en la bibliografa como patgenas para moluscos. procedentes de cajas Petri con
Agar Baird Parker se aislaron 15 cepas de colonias con caractersticas morfolgicas tpicas.
El material biolgico resultante del primer muestreo se sembr tambin en Caldo Selenito
Cistina y en Agar XLD, de donde se aislaron 5 cepas de enterobacterias, Tabla 16.
Tabla 16. Tipo y nmero de microorganismos con potencial patgeno, aislados en
diferentes medios de cultivo selectivos.
32
MEDIO DE CULTIVO
No. DE CEPAS AISLADAS
TIPO DE MICROORGANISMOS
AGAR MARINO
35
Mesfilos aerobios
AGAR BAIRD PARKER
15
Staphylococcus
AGAR PAPA DEXTROSA
Hongos y levaduras
AGAR TCBS
23
Vibrio
CALDO SELENITO
Enter.obacterias, ej Salmonella
CISTINA/AXLD
7.3 CARACTERIZACIN DE CEPAS AISLADAS DE OSTIONES.

Las cepas aisladas fueron sometidas a diferentes pruebas bioqumicas y microscpicas, con
el propsito de caracterizarlas. Como se puede observar en la Tabla 17, de 34 cepas 17
fueron Gram+ y 17 Gram-, 18 fueron bacilos y 16 cocos.
Tabla 17. Caracterizacin de cepas con potencial patgeno aisladas de ostiones.
CEPA
Medio
Tincin
Prueba
Morfologa
de
Gram
Catalasa
cellular
Origen
Cultivo
O1
ABP
Coco
C. gigas
O2
ABP
Coco
C. gigas
O3
ABP
Bacilo
C. gigas
O4
ABP
Coco
C. gigas
O5
ABP
Coco
C. gigas
O6
ABP
Bacilo
C. gigas
O7
XLD
Coco
C. gigas
O8
XLD
Bacilo
C. gigas
O9
XLD
Bacilo
C. gigas
O10
XLD
Coco
C. gigas
33
O11
XLD
Coco
C. gigas
O12
AM
Coco
C. gigas
O13
AM
Bacilo
C. gigas
O14
AM
Coco
C. gigas
O15
AM
Coco
C. gigas
O16
AM
Coco
C. gigas
O17
AM
Bacilo
C. gigas
O18
AM
Bacilo
C. gigas
O19
AM
Bacilo
C. gigas
O20
AM
Bacilo
C. gigas
O21
TCBS
Bacilo
C. gigas
O22
TCBS
Bacilo
C. gigas
O23
TCBS
Bacilo
C. gigas
O24
TCBS
Bacilo
C. gigas
O25
TCBS
Bacilo
C. gigas
O62
TCBS
Cocos
C. sikamea
O65
TCBS
Bacilo
C. sikamea
O26
AM
Coco
C. gigas
O27
AM
Coco
C. palmula.
O28
AM
Bacilo
C. gigas
O29
AM
Bacilo
C. palmula
O30
AM
Coco
C. gigas
O31
AM
Coco
C.gigas
O72
AM
Bacilo
C. corteziensis.
7.4 ENSAYO DE ADHESIN
34
El factor ms significativo que afecta los cultivos de importancia acucola es la incidencia

de patologas microbianas, principalmente de origen bacteriano. La adhesin bacteriana a
superficies y a tejidos es el paso inicial esencial en la colonizacin del tejido del hospedero
y subsecuente ocurrencia de infeccin en sistemas patognicos (Montgomery et al., 1994),
involucrando diferentes estructuras llamadas adhesinas (Hacker 1992 y Hoepelman et al.,
1992). Se ha reportado que la capa de moco est involucrada en la prevencin de la
colonizacin microbiana de patgenos por un mecanismo de competicin con la microbiota
presente en el moco (Westerdahl et al., 1991). Sin embargo el papel que juega el moco en
moluscos como la primera capa involucrada en la adhesin microbiana o como un
mecanismo de defensa en contra de la invasin por patgenos no ha sido completamente
elucidado. Los resultados del ensayo de adhesin realizado usando el mtodo de dot blot de
las bacterias con potencial patgeno a estracto crudo de moco de ostin marcado
enzimticamente, se muestra en la Tabla 18, donde se observan las caractersticas de
adhesin cualitativa a extracto crudo de moco de ostin de cepas con potencial patgeno
aisladas de ostiones. Las figuras del ensayo de adhesin se encuentran en el anexo 1.
Tabla 18.- Caractersticas de adhesin de las cepas aisladas de ostiones en diferentes

medios de cultivo.
Medio
CEPA
ADH
13
AM
O13
ABP
O1
14
AM
O14
ABP
O2
15
AM
O15
ABP
O3
16
AM
O16
ABP
O4
17
AM
O17
ABP
O5
18
AM
O18
ABP
O6
19
AM
O19
AXLD
O7
20
AM
020
AXLD
O8
21
TCBS
O21
AXLD
O9
22
TCBS
O22
10
AXLD
O10
23
TCBS
O23
11
AXLD
O11
24
TCBS
O24
12
AM
O12
25
TCBS
O25
35
26
TCBS
O25-A
55
ABP
O55
27
APD
O26
56
AM
O56
28
TCBS
O27
57
TCBS
O57
29
ABP
O28
58
ABP
O58
30
AM
O29
59
AM
O59
31
AM
O30
60
TCBS
O60
32
AM
O31
61
ABP
061
33
AM
032
62
TCBS
O62
34
ABP
O33
63
TCBS
O63
35
APD
O34
64
AM
O64
36
ABP
O35
65
TCBS
O65
37
AM
O36
66
AM
O66
38
AM
O37
67
TCBS
O67
39
AM
O38
68
AM
068
40
ABP
O39
69
TCBS
O69
41
ABP
O40
70
AM
O70
42
TCBS
O41
71
AM
O71
43
ABP
O42
72
AM
O72
44
AM
O43
73
TCBS
O73
45
AM
O44
74
TCBS
O74
46
AM
O45
75
AM
O75
47
AM
O46
76
AM
O76
48
AM
O48
77
TCBS
O77
49
TCBS
O49
78
TCBS
O78
50
AM
O50
79
TCBS
O79
51
AM
O51
80
AM
080
52
AM
O52
53
AM
O53
54
TCBS
O54
Como puede observarse en esta Tabla 19, el 30% de las cepas aisladas en los diferentes
medios de cultivo presentaron la capacidad de adherirse ms fuertemente a moco de ostin
que las dems, De las 15 cepas que se aislaron en ABP, el 47% tuvieron una adhesin
fuerte. De las 35 cepas aisladas en AM, el 23% se adhirieron ms. De las 5 cepas aisladas
36
de AXLD el 80% se adhirieron fuerte y de las 23 cepas aisladas en ATCBS, solo el 22%
presentaron adhesin fuerte. Tomando en cuenta que la adhesin a moco intestinal es un
prerequisito para la colonizacin, las cepas con adhesin fuerte tienen la capacidad de
colonizar los ostiones y si son patgenas tendrn la capacidad de infectar.
7.5 IDENTIFICACIN MOLECULAR DE BACTERIAS POTENCIALMENTE
PATGENAS.
Adems de las pruebas anteriores realizadas a las cepas que ms se adhirieron, se llev a
cabo su identificacin molecular. Las cepas seleccionadas para la identificacin molecular se
observan en la Tabla 13, donde se observa la morfologa y el medio de cultivo donde fue
aislada.
Tabla 19. Cepas con potencial patgeno aisladas de diferentes especies de ostin y
seleccionadas por su perfil de adhesin para identificarse molecularmente
No.
Cepa
Morfologia /Medio de cultivo
012
Cocos, diplococos, Agar Marino
018
Bacilos cortos mviles , Agar Marino
072
Bacilos cortos mviles, Agar Marino
01
Coco, diplococos Agar Baird Parker
03
Coco, diplococos Agar Baird Parker
06
Bacilos cortos mviles, Agar Baird Parker
024
Cocos y diplococos, Agar TCBS
062
Cocos y diplococos, Agar TCBS
065
Bacilos cortos y medianos, Agar TCBS
10
011
Coco, Agar XLD
37
La calidad del ADN genmico purificado se observ en un gel de agarosa al 1%, Figura 15.
En algunos carriles se observa mayor cantidad de ADN y en otro el ADN se observa un
poco degradado, sin embargo fue suficiente para llevar a cabo las reacciones de PCR.
Figura 15. Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genmico de las cepas de ostin: Carril 1. Lambda
DNA, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011, 6. Cepa 012, 7. Cepa 024, 8. Cepa 062, 9. Cepa
065, 10. Cepa 018, 11. Cepa 072.
Los productos de PCR tambin se corrieron en un gel de agarosa y se observan en la Figura

16, donde se observa una banda de alrededor de 1,500 pares de bases.
1000
pb
Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA y pH* y con ADN genmico de las
cepas: Carril 1. Marcador de peso molecular, 2. Cepa 01, 3. Cepa 03, 4. Cepa 06, 5. Cepa 011, 6 . Cepa
024, 7. Cepa 062, 8. Cepa 065, 9. Cepa 018, 10. Cepa 072.
Los productos de PCR se enviaron a la empresa Macrogen para su limpieza y

secuenciacin.
38
Las secuencias recibidas se editaron, se alinearon y las secuencias consenso resultantes se

compararon con las bases de secuencias de NCBI usando la herramienta BLASTn, donde se
encontr la mayora de los gneros y especies de las bacterias en estudio Tabla 20. La
mayora de estos gneros y especies de bacterias son consideradas como patgenos
oportunistas.
Tabla 20. Gnero y especie de las cepas con potencial patgeno aisladas de ostin y
seleccionadas por su capacidad de adherirse a moco de ostin.
Description
Max Total Query
score score cover value
Numero de CEPA Morfologa/Medio

Ident
cultivo/especie
acceso a
NCBI
Enterococcus sp. C213 16S

ribosomal RNA gene, partial
Coco
1126 1126
100%
0.0
100% FJ513910.1
sequence
ABP
O1
Escherichia coli strain FUA1242

16S ribosomal RNA gene, partial
Coco-bacilo
2583 2583
100%
0.0
99% HQ169124.1
sequence
ABP
O3

rRNA gene, strain ZG7-15
2583 2583
100%
0.0
99% HQ169124.1
O6
ABP
C.gigas
Coco
1202 1623
98%
0.0
99% HE646431.1
O11
XLD
C.gigas
Staphylococcus pasteuri strain 87

C.gigas
Coco-bacilo
sequence
Enterococcus faecalis partial 16S
C.gigas
Coco
2578 2578
99%
0.0
99% KF735653.1
012
AM
sequence
C.gigas
Bacilo
2634 2634
100%
0.0
99% HQ169124.1
018
sequence
Bacterium PJ-38 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
AM
C.gigas
Bacilo
1146 1403
Enterococcus faecium strain FMC59 2547 2547
99%
0.0
98% KF146333.1
024
TCBS
C.gigas
100%
0.0
99% KF358453.1
O62
Coco
39
Description
Max Total Query
score score cover value
Numero de CEPA Morfologa/Medio

Ident
cultivo/especie
acceso a
NCBI
TCBS
sequence
C. sikamea
Enterobacter cloacae strain AB2
Bacilo
2502 2942
99%
0.0
99% JX188069.1
O65
sequence
Escherichia coli PMV-1 main
chromosome, complete genome
TCBS
C. sikamea
Bacilo
1768 12349 100%
0.0
100% HG428755.1 O72
AM
C.corteziensis
Como se observa en la Tabla 20, se identificaron molecularmente 10 cepas bacterianas

predominantes en ostiones adultos de las costas de Baja California Sur,
aisladas en
diferentes medios de cultivos de diferentes especies de ostiones, con una adhesin fuerte a
extracto crudo de moco de ostin y con una interaccin antagnica determinada contra
cepas con potencial probitico para ostiones. De acuerdo a la comparacin en las bases de
datos de NCBI (National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov), las
cepas 01, 011 y 062 se identificaron como Enterococcus. la cepa 011 tuvo un porcentaje de
similitud de 99% con E. faecalis y la 062 con E. faecium. Las cepas 03, 06, 018 y 072, son
Escherichia coli. Las cepa 024 present un 98% de identidad con una bacteria identificada
en las bases de datos como Bacterium PJ-38. La cepa 012 tuvo un porcentaje de similitud
de 99% con Staphylococcus pasteuri, mientras que la cepa 065 tuvo un porcentaje de
similitud de 99% con Enterbacter cloacae.
40
8. DISCUSION
Todos los organismos estn rodeados por microorganismos no peligrosos y peligrosos
(Virgin, 2007) y durante su co-evolucin se han establecido interacciones recprocas que
han dado lugar a la homestasis entre el hospedero y su microbiota comensal o patognica.
Sin embargo otros microorganismos son oportunistas y pueden modificar
su estatus
dependiendo de la capacidad inmune del hospedero, por lo que la homeostasis es dinmica.

En C. gigas han sido encontradas algunas especies de bacterias comensales, no solo en el
sistema digestivo, sino en la hemolinfa y en otros tejidos suaves, probablemente debido a
que se alimentan por filtracin y a que su sistema circulatorio es abierto (Olafsen et al.,
1993; Colwell. 1960).
La respuesta inmune en ostreidos, es mediada por va celular, en virtud de las propiedades
fagocticas de los hemocitos y por medio de factores humorales, los cuales varan de
acuerdo a las diferentes especies bacterianas y cepas probadas, incluyendo algunas especies
relacionadas con la salud humana (Pruzzo et al., 2005). Se ha demostrado que bacterias de
origen fecal como Escherichia coli y Vibrio cholerae, fueron destruidos por fagocitosis en
hemolinfa de ostreidos, mientras que algunos patgenos de alimentos que producen una
cpsula externa de polisacridos, como ciertas cepas de V. vulnificus, persistieron ms
tiempo en la hemolinfa y fueron resistentes a la digestin en fagolisosomas (Pruzzo et
al.,2005).
E ostin Japons o del Pacfico C. gigas, est expuesto a comunidades microbianas
abundantes y variables en su entorno lagunar y estuarino. Los ostreidos son habitados por
comunidades microbianas abundantes que varan con las condiciones ambientales y
coexisten con clulas inmunocompetentes de su sistema circulatorio. En algunas regiones
del mundo, la microbiota asociada a ostiones incluye cepas patgenas para los humanos, y
ha sido estudiada esencialmente para propsitos de bioseguridad e inocuidad en alimentos.
Aunque las comunidades microbianas asociadas a ostiones sanos ha sido poco estudiada, se
sabe que es abundante y variable de acuerdo a las condiciones ambientales..
41
Parece ser que la respuesta antimicrobiana en C. gigas, controla a comensales y patgenos,

y se relaciona con las reacciones dependientes de oxgeno potente y de pptidos
antimicrobianos producidos a baja concentracin por clulas epiteliales o por hemocitos
circulantes. Por ejemplo, en ostiones no enfermos, los hemocitos expresan niveles basales
de defensinas y pptidos ricos en prolina. Sin embargo, cuando la carga microbiana se
incrementa dramticamente en los tejidos del ostin enfermo, son llevadas por los
hemocitos a los sitios de infeccin, junto con protenas que incrementan la permeabilidad
bactericida y grandes defensinas con formas especficas, cuya expresin en hemocitos es
inducida por la infeccin (Schmitt et al., 2012).
Durante el desarrollo de la presente investigacin, se aisl, se caracteriz y se identific
molecularmente la microbiota con potencial patgeno cultivable y predominante en adultos
de C. gigas, C. corteziensis, C. sikamea y S. palmula, colectados en diferentes localidades
de la costa Pacfico de Baja California Sur. Los resultados mostraron una comunidad
microbiana abundante cuando se cuantific en agar marino y su abundancia estuvo
relacionada con el lugar de colecta, ya que el log UFC/g encontrado en los ostiones de un
mismo sitio de muestreo fue similar. Sin embargo no se observ diferencia en abundancia
con respecto a la especie de ostin analizada tal como previamente se mostr en las tablas
6, 7 y 8.
Con respecto al anlisis en medios de cultivos selectivos, se observ que en Agar TCBS,
que es selectivo para especies del Genero Vibrio, las cuentas fueron bajas, excepto en el
muestreo 3 donde se observaron cuentas arriba de 4 ordenes logartmicos de UFC/g de
organismo. Estos resultados coinciden con lo reportado por Pruzzo, et al., (2005), quien
menciona que las especies de Vibrio son muy abundantes en las aguas costeras, que son
comnmente aisladas del tejido de bivalvos para consumo, que pueden persistirah despus
del proceso de depuracin en aguas controladas. Este mismo autor comenta que Vibrio es
un componente regular de la microbiota de bivalvos y que los moluscos pueden representar
un nicho ecolgico importante para esta bacteria.
42
Para cuantificar la presencia del gnero Staphylococcus en la microbiota de los ostiones, se

hicieron cuentas viables en agar Baird Parker (ABP), encontrando cuentas bajas, excepto en
el muestreo 3, donde se contaron hasta 4 rdenes logartmicos de UFC. Otros
investigadores encontraron que este gnero de bacterias est presente en aguas marinas a la
misma frecuencia que coliformes y enterococos fecales (Gunnt et al., 1983).
Tambin se cuantific la presencia de hongos y levaduras en Agar Papa Dextrosa,
encontrado muy pocas colonias, lo cual sugiere que no son predominantes en la microbiota
cultivable de estos ostiones. Un reporte reciente ha mostrado la composicin taxonmica de
los hongos asociados con C. gigas, incluyendo 22 especies de hongos filamentosos, de los
cuales 17 especies fueron identificadas como pertenecientes a 6 gneros: Alternaria,
Aspergillus, Botrytis, Fusarium, Penicillium, and Trichoderma (Borzykh y Zvereva, 2012).
Las cepas predominantes en cada medio de cultivo se aislaron y se purificaron (Tabla 9),
que en total fueron 80 y fueron sometidas a un ensayo de adhesin a extracto crudo de
moco de ostin previamente marcado enzimticamente con la enzima HRP.
Se ha reportado que la colonizacin del sistema digestivo de ostreidos por bacterias, tiene
una dependencia particular del ambiente externo debido al flujo de agua que pasa a travs
del tracto digestivo (Harris 1993, Prieur 1990) y se ha considerado que las condiciones
ambientales y la variacin estacional alteran la comunidad bacteriana del sistema digestivo
en algunos invertebrados acuticos y que es probable que el hbitat pueda influir las
condiciones en el tracto digestivo y pueda por lo tanto ser un factor importante en la
composicin de la microbiota del mismo.
En el presente estudio, se encontr que el 30% de las cepas probadas se adhiere al moco de
ostin y tiene la capacidad de colonizar al ostin, por lo que se asume que pueden
permanecer en el organismo independientemente de las condiciones ambientales (Tablas
17, 18 y 19).
Hay pocos estudios sobre los cambios de la microbiota bajo diferentes condiciones
ambientales. LaValley et al., (2009) report diferencias significativas en los perfiles de la
43
comunidad microbiana asociada a ostreidos y a agua de mar, indicando un grupo diverso de

bacterias especializadas que habitan y son capaces de proliferar dentro de los ostreidos. Sin
embargo no se encontraron reportes donde se haya estudiado la adhesin de la bacteria a las
superficies mucosas del ostin, como un mecanismo de colonizacin de la microbiota
comensal y la infeccin de patgenos. En diferentes modelos animales se ha comprobado
que las mucosas de los organismos actan como una barrera en contra de invasores
microbianos, donde las bacterias invasoras forneas y las comensales interactan
ntimamente con el epitelio y ejercen cierta influencia sobre los sistemas inmune y celular
del hospedador. As mismo, la barrera epitelial sirve como una posicin segura que provee
una base para un avance adicional de muchas bacterias patgenas y como una puerta de
entrada para que los patgenos se diseminen hacia los tejidos ms profundos. Por ejemplo,
los patgenos bacterianos entricos pueden eficientemente infectar la mucosa
gastrointestinal del hospedero, usando mecanismos de virulencia altamente sofisticados que
les permiten sobrepasar las barreras de defensa del tracto gastrointestinal (Ashida, 2011).
Por otro lado, en muchos procesos fisiolgicos de invertebrados, el moco tiene varias
funciones y tambin tiene influencia en la estructura de la comunidad y del ecosistema. El
moco de moluscos contiene principalmente agua y otros componentes como protenas,
carbohidratos y lpidos. El moco funcional esta probablemente formado por una mezcla de
mucinas producidas por diferentes tipos de glndulas secretoras (Davies y Hawkins, 1998).
El moco hidratado es un slido visco-elstico, capaz de funcionar como una cubierta
eficiente, pero se va haciendo lquido conforme el estrs se incrementa y retorna al estado
slido una vez que el estado de estrs se elimina o es reducido de manera importante. El
moco juega un papel importante en la alimentacin de los bivalvos que se alimentan por
filtracin, ya que ayuda al atrapamiento y transporte de las partculas alimenticiasde las
branquias a la boca y es tambin utilizado para limpiar la cavidad del manto del exceso de
partculas que son rechazadas por los palpos labiales. La secrecin abundante de moco
epitelial es usada para aislar moluscos de su ambiente, pudiendo servir adems como un
ionoregulador. El moco de moluscos marinos puede contener aglutininas, lisozyma y otros
44
productos especficos de defensa tales como venenos producidos por el animal, y sustancias
que resultan desagradables o irritantes para sus enemigos o depredadores (Davies y
Hawkins, 1998).
Durante el ensayo de adhesin a extractos crudos de moco de ostin realizado en la
presente investigacin, se observ que solo el 30% de las cepas ensayadas se adhieren, lo
cual sugiere que tienen la capacidad de colonizar in-vivo el tracto digestivo y dems tejidos
mucosales del ostin.
De las cepas ms abundantes, que presentaron mayor adhesin, que fueron aisladas en los
diferentes medios de cultivos selectivos y que en estudios previos haban sido sometidas a
ensayos de interaccin antagnica con cepas probiticas (Savin-Amador, 2013), se
seleccionaron 10 con el propsito de identificarlas molecularmente. Como se mostr
previamente en la tabla 20, 3 de estas cepas se aislaron en Agar Baird Parker, 1 en XLD, 3
en Agar marino y 3 en TCBS. Estos medios son selectivos para Staphylococcus,
Enterobacterias, Bacterias hetertrofas del ambiente marino y Vibrio spp respectivamente.
Sin embargo al analizar las secuencias de los genes 16S amplificados, encontramos que el
gnero y especie de estas bacterias no corresponden a los gneros que debieran crecer en
estos medios. Esto pudo deberse a que estas especies estaban presentes en mayor
abundancia y a que no fueron afectadas por los agentes selectivos que contiene cada medio
de cultivo.
La cepa 01 present un 100% de identidad con Enterococcus sp. C213. La cepa 011
present un 99% de identidad con Enterococcus faecalis (partial strain ZG7-15) y la cepa
062 tambin un 99% de identidad con Enterococcus faecium (strain FMC59). El gnero
Enterococcus es caracterizado por cocos solos, en pares o en cadenas, Gram positivos y
catalasa negativos. Las especies pertenecientes a este gnero han sido primeramente
asociadas con la microbiota indgena del tracto gastrointestinal de animales y humanos y
estn ampliamente distribuidas en el aire, agua, suelo, vegetacin (Lukasova y Sustackova,
2003). A pesar de que ciertos enterococos ha sido asociados a infecciones nosocomiales
(Murray, 1998), una gran variedad de estas cepas estn siendo usadas como probiticos
45
para humanos, e incluso han sido incluidas en alimentos animales argumentando su

contribucin a la salud de animales de granja y como agentes de control biolgico en
acuacultura (Calo-Mata et al., 2007).
Se sabe que los enterococos son naturalmente resistentes a la mayora de los antibiticos
usados en la prctica clnica, que adquieren fcilmente dicha resistencia y que tienen la
habilidad de dispersar genes de resistencia a otras especies (Kuhn et al., 2000). Algunas
cepas resistentes a multidrogas y vancomicina son aislados comnmente de fuentes
animales, humanas, hbitats acuticos y productos de la agricultura, lo cual indica su
habilidad para entrar en la cadena alimenticia humana (Rice et al., 1995). Estas bacterias
son resistentes en forma natural a cefalosporinas, aminoglicosidos y clindamicina, pueden
tambin ser resistentes a tetraciclinas y eritromicina y poco sensibles a penicilina,
ampicilina y glicopptidos. Las cepas que producen -lactamasa son raras y las cepas
resistentes a Vancomicina (VRE) estn emergiendo como un problema global de salud
pblica. La resistencia a antibiticos extremadamente alta observada en este gnero de
bacterias ha hecho que se les tema como agentes infecciosos en salas de cuidado intensivo,
ya que se han descrito probables factores de patogenicidad como hemolisinas (Rice et al.,
1995).
Las especies de enterococos ms importantes son E. faecalis y E. faecium; La primera es
ms comn en enfermedades humanas, la segunda puede poseer mecanismos de resistencia
superiores (Huycke et al., 1998). E. faecalis ha sido reportada como responsable de la
transferencia de plsmidos que llevan caractersticas de resistencia a antibiticos a otros
enterococos y a Listeria monocytogenes en plantas de tratamiento de agua (Marcinek et al.,
1998). E. faecalis tiene transposones conjugativos que pueden ser transferidos de bacterias
animales a humanas. Tales transposones pueden tambin transferir resistencia a
vancomicina a Staphylococcus aureus, estreptococos y lactobacilos. En ambas especies, el
desarrollo evolutivo de resistencia ha sido atribuido a que tiene un rango amplio de
hospederos y elementos genticos extremadamente mviles como son los transposones y
los plasmidos. Por lo tanto la resistencia a antibiticos, principalmente a vancomicina, y la
46
presencia de hemolisinas, deben ser evaluadas antes de utilizar estas especies como
probiticos o aditivos ((Marcinek et al., 1998).
El espectro antimicrobiano observado para las especies de enterococos, incluye varios
gneros de bacterias contaminantes y patgenas Gram positivas y Gram negativas. Algunas
cepas de origen marino producen sustancias inhibitorias contra patgenos en los sistemas
acucolas (Chahad et al., 2007) Y su uso para inhibir patgenos ha ganado importancia en
granjas de peces como una manera ms efectiva que administrar antibiticos para mantener
la salud de los organismos (Vijayan et al., 2006). Recientemente fueron secuenciados los
genomas de 51 cepas de Enterococcus aisladas de varios ambientes ecolgicos, para
entender cmo es que E. faecium emergi como un patgeno de hospitales, y debido a la
diversidad de las cepas estudiadas, se propuso que se midieran las distancias evolutivas
entre grupos, del linaje responsable de infecciones humanas, resistente a multidrogas y de
epidemias(Lebreton et al., 2013).
Por lo anteriormente expuesto, se consideran indispensables estudios adicionales de las
cepas del gnero Enterococcus aisladas de ostin, para conocer con mas detalle y precisin
el grado de patogenicidad o de beneficio para el cultivo de estos organismos.
La cepas 03, 06 y 018, presentaron un 99% de identidad con Escherichia coli (cepa
FUA1242) y la cepa 072 present un 100% de identidad con E. coli (cepa PMV-1).E. coli
es una bacteria comensal cuyo nicho es la cubierta de mucosa del colon de mamferos y es
el bacilo anaerobio o facultativo ms abundante en la microbiota intestinal humana (Kipper,
et al., 2004), As mismo, E. coli est ampliamente distribuida en el tracto intestinal de
animales de sangre caliente (Ishii y Sadowsky, 2008); es a menudo no patognica, aunque
diferentes cepas pueden causar enfermedades en los sistemas digestivo, urinario o nervioso
central (Nataro, 1998). Se conocen comnmente seis categoras de E. coli que producen
diarreaenterotoxigenica (ETEC) (Dalton et al., 1999), enteropatognica (EPEC) (RuchaudSparagano, 2007), enteroinvasiva (EIEC) (Levine, 1987), enterohemorrgica (EHEC),
productora de la toxina shiga (STEC) (Takeda, 2011), enteroagregativa (EAEC EAggEc)
(Beauchamp y Sofos, 2010) y difusivamente adherente (DAEC) (Scaletsky et al., 2002).
47
Existe gran diversidad filogentica dentro de cada patotipo y los miembros de cada uno son
derivados de los grupos filogenticos A, B1 o D o de otros linajes miscelneos.
Tambin son comunes las infecciones extraintestinales debido a E. coli y pueden involucrar
casi cualquier rgano o sitio anatmico. Las tpicas infecciones extraintestinales incluyen
las del tracto urinario, meningitis, intraabdominal, pneumonia, en dispositivos
intravasculares, osteomielitis e infeccin en tejido suave, lo cual ocurre comnmente
cuando el tejido es comprometido (Russo y Johnson, 2000).
La alta similitud de las cepas 03, 06 y 018 con la cepa de E. coli FUA1242, la cual ha sido
reportada como EHEC (yoo et al., 2012), sugiere que los aislados obtenidos del ostin
podran pertenecer a esta categora (EHEC). Sin embargo, se requiere analizar los
diferentes factores de virulencia tpicos de este grupo para confirmarlo. La cepa cepa
O157:H7 enterohemorrgica de E. coli fue reportada en camarones en la India (Surendraraj
et al., 2010) y a pesar de no ser muy comn el aislamiento de E. coli que produce diarrea de
mariscos, E. coli STEC ha sido reportada en pescado y almejas en el mercado Ind y fue
ms comn que el serotipo O157 (Kumar et al., 2001). En Brasil, se aisl una cepa de
STEC de moluscos y se evidenci que las medidas preventivas, especialmente durante la
cosecha y postcosecha, son muy importantes para evitar contaminacin de cualquier
naturaleza (Ayulo et al., 1994). La ocurrencia de E. coli en mariscos ha sido estudiada en
diferentes partes del mundo (Baer et al., 1976; Hood et al., 1983; Watkinson et al., 2007;
Teophilo et al., 2002). Se ha sugerido que los moluscos colectados en ambientes costeros
pueden ser vehculos de transmisin de E. coli productora de toxina Shiga ya que se
aislaron cepas ETEC stx1d en muestras de moluscos incluyendo C. gigas en Francia
(Gourmelon et al., 2006). En un anlisis de los moluscos bivalvos de nueve estados de
Estados Unidos, se report que los ms altos niveles promedio de E. coli, fueron
encontrados en ostiones de la regin del Golfo de Mxico durante el verano (De Paola et
al., 2010).
La cepa 072 present un 100% de identidad con E. coli cepa PMV-1, que pertenece al
serotipo O18:K1 y e al grupo de E. coli patgena extraintestinal (ExPEC). Un amplio rango
48
de infecciones extraintestinales en humanos y animales vertebrados son causadas por cepas

de E. coli que pertenecen a este gran grupo ExPEC y son categorizadas frecuentemente en
patotipos de acuerdo a los sntomas clnicos de los hospederos. Los patotipos incluyen E.
coli uropatognica (UPEC), aislada de humanos y animales con infecciones del tracto
urinario, E. coli de meningitis neonatal (NMEC), aislada de neonatos humanos, E. coli
septicmica, aislada de humanos y animales con casos de septicemia de varios orgenes y E.
coli patgena para aves (APEC), responsable de colibacilosis en aves. Las cepas APEC de
serotipos O1:K1, O2:K1 y O18:KI pertenecen al mismo grupo clonal altamente patognico,
como las cepas de E. coli humanas de los mismos serotipos aisladas de casos de meningitis
neonatal, infecciones del tracto urinario y septicemia. Estas cepas APEC constituyen un
riesgo zoontico potencial (Moulin-Schouleur et al., 2007). La cepa de E. coli PMV-1 ha
sido propuesta como un modelo para estudiar las interacciones patgeno hospedero, debido
a que ha sido probado que es altamente virulenta despus de ser administrada
peritonealmente en ratones modelo (van Westerloo et al., 2005). El genoma completo de
esta cepa fue secuenciado con una cobertura de 40 de profundidad usando
pirosecuenciacin (Peris-Bondia et al., 2013). Esta cepa ha sido identificada como causante
de peritonitis y permanece como uno de los patgenos ms comunes (arriba de 60%) en
infecciones intraperitoneales.La peritonitis contina siendo una de las emergencias
abdominales que causa mayores tasas de mortalidad y morbilidad, por arriba del 38%
(Sewnath et al., 2001). No se encontraron reportes previos de este patotipo ExPEC de E.
coli en moluscos.
La cepa 012 tuvo tambin un 99% de similitud con la cepa Staphylococcus pasteuri (strain
87), que es una bacteria Gram positiva, coagulasa negativa, que est emergiendo como
agente de infecciones nosocomiales y un contaminante derivativo de sangre, aunque su
papel como causante de enfermedades humanas sigue siendo controversial. A pesar de la
pequea cantidad de aislamientos recuperados, esta bacteria, recientemente, parece expresar
resistencia a algunas clases de compuestos antibiticos, tales como methicillin/osacillin,
macrolides, lincosamides, streptogramins, tetraciclinas y cloranfenicol, streptomicina,
fosfomicina, asi como compuestos de amonio cuaternario (Savini et al., 2009). Se ha
49
reportado que los estafilococos estn presentes en aguas marinas a una mayor frecuencia
que los coliformes y los estreptococos (Gunnt y Colwell, 1983). En particular, S. pasteuri
ha sido aislado e identificado a partir de micro capas superficiales del mar (Agogu et al.,
2005), del intestino de salmn del Atlntico alimentado con una dieta suplementada con 5%
de quitina, y recientemente fue encontrado asociado a anemonas (Zongjun et al., 2010). Sin
embargo no se encontraron reportes previos asociados a moluscos bivalvos.
La cepa 065 present tambin un 99% de similitud con Enterobacter cloacae (strain AB2).
Las especies del complejo Enterobacter cloacae estn ampliamente dispersas en la
naturaleza, a pesar de que pueden actuar como patgenos. Los estudios bioqumicos y
moleculares en este complejo han mostrado heterogeneidad genmica y comprenden 6
especies: Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Enterobacter hormaechei,
Enterobacter kobei, Enterobacter ludwigii y Enterobacter nimipressuralis. E. cloacae y E.
hormaechei, que son los ms frecuentemente aislados de especmenes clnicos de humanos.
La identificacin fenotpica de todas las especies pertenecientes a este taxn es usualmente
difcil y no siempre confiable, por lo tanto, los mtodos molculares son usados ms
frecuentemente. Aunque el complejo de cepas de E. cloacae est entre los Enterobacter spp
ms comunes que causan infecciones nosocomiales del torrente sanguneo en las ltimas
dcadas, se sabe poco de sus propiedades asociadas a virulencia. En contraste, existen
muchos reportes publicados sobre las caractersticas de resistencia a antibiticos de estas
bacterias, que son capaces de sobreproducir AmpC -lactamasas por represin de un gen
cromosomal, o por la adquisicin de un gen ampC transferible en plsmidos que le confiere
resistencia a diversos antibiticos. Muchas otras determinantes de resistencia que son
capaces de hacer inefectivas casi todas las familias de antibiticos han sido recientemente
adquiridas. La mayora de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana estn enfocados en
E. cloacae, E. hormaechei y E. asburiae. Estos estudios reportaron pequeas variaciones
entre las especies y la nica diferencia significativa no tuvo caractersticas discriminantes
(Mezzatesta et al., 2012). En un estudio de la microbiota y metales pesados en ostiones
cultivados (Crassostrea iredalei) en Setiu Wetland, Terengganu, en la Costa Este de
Malaysia, se observ que los ostiones contienen predominantemente la especie Shewanella
50
putrifaciens seguida por Vibrio parahaemolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, Enterobacter

cloacae, Escherichia coli y Chromobacterium violaceum (Najiah, 2008). En un estudio
realizado en ostin de mangle Crassostrea rhizophorae (Guilding, 1828), se evalu la
calidad microbiolgica de organismos procedentes de tres estaciones del banco natural
Laguna Grande del Obispo, estado Sucre, Venezuela, Las enterobacterias ms abundantes y
frecuentes en C. rhizophorae fueron Escherichia coli (34%), Proteus mirabilis (12%) y
Enterobacter cloacae (12%) (Gonzalez et al., 2011).
51
9. CONCLUSIN
Los microorganismos predominantes y con potencial patgeno y aislados y caracterizados
molecularmente, de adultos de Crassostrea gigas, C. corteziensis, C. sikamea y Saccostrea
palmula, colectados en diferentes localidades de la costa Pacfico de Baja California Sur,
tienen gran similitud con especies y cepas que han estado implicados en brotes de
enfermedades transmitidas por alimentos, que causan diferentes tipos de infecciones, lo
cual compromete la inocuidad de estos organismos cultivados. De acuerdo con los
resultados obtenidos, la prevalencia de estas bacterias en los ostiones, refleja un potencial
riesgo para la salud del consumidor. Sin embargo, para determinar si estas bacterias son
tambin patgenas para los ostiones en sus diferentes estadios de crecimiento, se requiere
desarrollar nuevas investigaciones y otros ensayos..
52
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http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf
61
ANEXO 1.
Figura A.- Perfil de adhesin de cepas con potencial patgeno a extracto crudo de
moco de ostin.
62
Figura B.- Perfil de adhesin de cepas con potencial patgeno a extracto crudo de
moco de ostin.
63
ANEXO 2.
Anlisis estadstico
AGAR MARINO
Num. De Muestreo Medio de Cultivo Unidades Log.
1
1
1
1
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
6.2
7
6.3
<3
6.2
7
6.3
2
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
Agar Marino
<3
7
7.9
7.3
5.2
6.1
5.7
3.6
3
5.8
3.5
3.3
3.9
4.8
5.2
3.3
6.6
6
4.6
6.9
5.5
4.2
5.1
5.5
5.2
5.5
5.2
4.9
2
7
7.9
7.3
5.2
6.1
5.7
3.6
3
5.8
3.5
3.3
3.9
4.8
5.2
3.3
6.6
6
4.6
6.9
5.5
4.2
5.1
5.5
5.2
5.5
5.2
4.9
64
AGAR Papa Dextrosa

1
1
Agar Papa Dextrosa

Agar Papa Dextrosa
<1
<1
0
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Agar Papa Dextrosa

Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
Agar Papa Dextrosa
3.3
3.8
<1
<1
3.3
<1
<1
<1
<1
<1
<1
1.3
<1
<1
<1
<1
<1
ND
ND
1
1.7
ND
3.6
1
ND
1.3
ND
ND
ND
ND
3.3
3.8
0
0
3.3
0
0
0
0
0
0
1.3
0
0
0
0
0
1
1.7
3.6
1
1.3
65
AGAR TCBS
1
1
Agar TCBS
Agar TCBS
<2
<2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
Agar TCBS
<2
<2
<2
4
3.3
5
5.3
<2
4.1
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
<2
4.6
3.5
3.8
3.1
3.55
2.8
2.9
1.9
3.9
3.3
3.4
4
3
1
1
1
1
1
4
3.3
5
5.3
1
4.1
1
1
1
1
1
1
1
1
4.6
3.5
3.8
3.1
3.55
2.8
2.9
1.9
3.9
3.3
3.4
4
3
66
AGAR Bair Parker

1
1
Agar Bair Parker

Agar Bair Parker
<1
1
0
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
Agar Bair Parker

Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
Agar Bair Parker
<1
<1
<1
1
3
3.8
1
<1
2
1.6
<1
<1
<1
<1
1
1.5
1.3
1.3
2.6
2
1.3
1.8
3.5
4.2
ND
1.7
1.3
ND
3
ND
0
0
0
1
3
3.8
1
0
2
1.6
0
0
0
0
1
1.5
1.3
1.3
2.6
2
1.3
1.8
3.5
4.2
1.7
1.3
3
67
ANEXO 3
Grafica de medias y Prueba de Tukkey para el Log UFC en AGAR MARINO EN LOS TRES MUESTREOS
Numero de Muestreo
2
4.137500
****
5.269231
****
5.700000
****
Prueba de tukkey
68
Grafica de medias para el Log UFC en AGAR TCBS EN LOS TRES MUESTREOS
Grafica de medias y Prueba de Tukkey para el Log UFC en agar papa dextrosa entre los tres
muestreos.
69
Numero de Muestreo
2
0.162500
****
0.945455
****
1.720000
****
Grafica de medias para el Log UFC en agar Baird Parker entre los tres muestreos.
70

Te 3182 Dsfdsafadssdfdsafcxvzresdfda

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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

REA DE CONOCIMIENTO CIENCIAS AGROPECUARIAS

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TITULO DE

CD. UNIVERSITARIA, LA PAZ, B.C.S SEPTIEMBRE DEL 2014

A esta frase de mi padre que es una herencia ms para m vida diaria.

Si callamos la verdad siempre seremos sordos y ciegos

3.1. Objetivo general

3.2. Objetivos particulares

5.1 Moluscos bivalvos en el contexto mundial

5.2 Ostricultura en Mxico

5.3 Ostricultura en Baja California Sur.

5.4 Riesgo sanitario asociado al cultivo y consumo de moluscos bivalvos

6.1 Colecta y transporte de organismos

6.2 Sitios de muestreo

6.3 Anlisis microbiolgico.

6.4 Aislamiento y purificacin de bacterias

6.5 Morfologa celular de las cepas

6.6 Tincin de Gram y prueba de la catalasa

6.7 Ensayo de adhesin a moco de ostin.

6.7.1 Preparacin del cultivo.

6.7.2 Preparacin de la membrana.

6.7.3 Ensayo de adhesin.

6.8 Identificacin molecular de bacterias potencialmente patgenas

6.8.1 Extraccin del ADN genmico de cepas

6.8.2 Visualizacin del ADN genmico.

6.8.3 Amplificacin del gen 16S DNA para identificacin molecular

6.8.4 Visualizacin de los productos del PCR en geles de agarosa

6.8.5 Secuenciacin y anlisis bioinformtico.

7.1 Anlisis microbiolgico

7.2 Aislamiento y purificacin de bacterias

7.3 Caracterizacin de cepas aisladas de ostiones

7.4 Ensayo de adhesin

7.5 Identificacin molecular de bacterias potencialmente patgenas

Ubicacin geogrfica de las granjas de moluscos en Baja California

Medios de Cultivo utilizados

Mezcla de reaccin usada para la amplificacin del gen 16S ARN.

Resumen de muestreos realizados para el aislamiento de bacterias

ANOVA del log UFC en Agar TCBS de los tres muestreos

.Prueba de Tukkey para log UFC en Agar TCBS entre muestreos 1,

ANOVA para log UFC en Agar Papa Dextrosa entre muestreos 1, 2

ANOVA para log UFC en Agar Baird Parker entre muestreos 1, 2

Prueba de Tukkey para log UFC en Agar Baird Parker entre

Tipo y nmero de microorganismos con potencial patgeno,

Cepas con potencial patgeno aisladas de diferentes especies de

Gel de agarosa al 1% con bandas de ADN genmico de las cepas

Figura 16. Productos de PCR amplificados con los primers pA y

Mxico ocupa el sexto lugar en la produccin promedio mundial de ostin. El 96% de la

el ostin permitir entender mejor el mecanismo de accin de los microorganismos, tanto

con la falta de una barrera

inmunolgica otorgada por la microbiota residente, que cumple una funcin

E. coli enteropatognica (Ruchaud-Sparagno et al., 2007),

causadas por organismos no patgenos en personas inmunocomprometidas o desnutridas,

Aislar en medios selectivos para microorganismos patgenos, las bacterias

Determinar experimentalmente, en condiciones de laboratorio, la capacidad de

Identificar molecularmente, a nivel de gnero y especie, las bacterias

Tomando en cuenta que las tcnicas y metodologas de trabajo propuestas para la

Adicionalmente, muchos pases han desarrollado lineamientos sanitarios propios que

ya que la adecuada aplicacin de restricciones a la libre movilizacin de

en funcin de la inconstancia en la produccin de semillas y la

consecuente limitacin en la siembra de los productores. El cultivo de moluscos en Baja

(http://cesabcs.org/pdf/Noticias/Moluscos/Articulo_MB.pdf). En el Pacfico norte de Baja

Perla de Guerrero Lodo. Laguna

Comit Pesquero Laguna Ojo de