3º Métodos de Esterilização

Microbiologia Terceiro
Encontro
Mtodos de
Esterilizao
Prof. Ms. Edson Luiz de Oliveira
Microbiologia Mtodos de Esterilizao- Desinfeco

Antissepsia-Assepsia
Problematizao Avaliao
a) Por que o calor um agente eficaz de esterilizao?
b) Quais as etapas necessrias para esterilizar materiais que podem conter
endsporos bacterianos?
c) Por que a Pasteurizao no sinmino de esterilizao?

Entende-se por asspsia todas as condies, gestos e atitutes que so
determinantes do estado de ausncia de microrganismos contaminantes no
meio em que atua

Esterilizao
A esterilizao a destruio completa de todos os micro-organismos,
incluindo-se as formas mais resistentes como os esporos, micobactrias,
vrus sem envoltrios (lipdicos) e fungos
Utilizao de esterilizantes fsicos, gasosos ou qumicos
Esterilizantes fsicos como umidade e o calor seco so mtodos comumente
utilizados. (autoclave, estufa e bico de Bunsen- flambar)

Esterilizao
Filtrao til para remover bactrias ou fungos do ar ou de solues
inadequados para vrus e algumas bactrias menores HEPA (alta eficincia
para partculas areas)
Radiao ultravioleta e ionizante A radiao ultravioleta necessita de
exposio direta
Oxdo de etileno gs esterilizante mais utilizado (inflamvel)

Formaldedo carcinognico
Perxido de Hidrognio natureza oxidante
cido paractico e o glutaraldedo

Esterilizao
Mtodos de Esterilizao
Mtodo
Concentrao ou nvel
Esterilizantes Fsicos
Vapor sob presso
121C ou 132C por diferentes intervalos de

tempos
Filtrao
Filtros com poros de 0,22-0,45 mm; filtro HEPA
Radiao ultravioleta
Exposio varivel a comprimento de onda de

254 nm
Radiao ionizante
Exposio varivel a radiaes de micro-onda

ou gama

Esterilizao
Mtodo
Concentrao ou nvel
Vapores de gases esterilizantes

xido de Etileno
450-1200mg/L a 29C at 65C por 2-5h
Vapor de Formaldedo
2%-5% a 60C-80C
Vapor de Perxido de Hidrognio
30% a 55C at 60C
Gs plasma
Gs de perxido de hidrognio
altamente ionizado

Esterilizao
Mtodo
Concentrao ou nvel
Esterilizantes qumicos
cido paractico
0,2%
Glutaraldedo
2%

Esterilizao pelo calor
Para todos os organismos existe uma temperatura mxima para o
crescimento, acima da qual ocorrem efeitos letais
Desnaturao das macromolculas
A taxa de mortalidade pelo calor proporcional concentrao de
organismos naquele momento, isto , o tempo necessrio para que
uma frao definida (por exemplo 90%) de clulas seja morta
independente da concentrao inicial
Se desejamos esterilizar uma populao microbiana leva-se mais
tempo em temperaturas baixas que em temperaturas altas

O calor mido tem maior poder de penetrao que o calor seco,
produzindo uma reduo maior no nmero de organismos vivos, a
uma determinada temperatura
Tempo de reduo decimal ou D :

Tempo necessrio para uma reduo
da densidade populacional em
10 vezes, a uma determinada
temperatura

A inclinao da reta nos fornece uma medida da sensibilidade do
organismo ao calor, nas condies empregadas
A determinao dos tempos de reduo decimal um procedimento
relativamente longo, que exige vrias contagens do nmero de viveis
O grfico pode ser utilizado para calcular o tempo necessrio de
processamento para que se promova uma esterilizao, por exemplo,
em operaes de envasamento


Esterilizao pelo calor - esporos
A resistncia das clulas vegetativas e dos endsporos de um mesmo
organismo variam consideravelmente.
Tempo para reduo decimal (D) em autoclave (121C)
Endsporos
Clulas vegetativas
4-5 minutos
0,1-0,5 minuto
O endsporos so as estruturas mais termorresistentes conhecidas

O principal fator na resistncia ao calor corresponde quantidade de
gua e ao estado da gua no seu interior

Durante sua formao, o protoplasma reduzido a um volume
mnimo como resultado do acmulo de Ca2+, de pequenas protenas
cidas solveis de Esporo (PPASs) e da sntese de cido dipicolnico,
levando a formao de uma estrutura de consistncia similar a um gel.


Esterilizao (autoclave)
Faz-se atravs do autoclave cujo funcionamento idntico ao da panela
de presso sendo a temperatura necessria para esterilizao de 121C, e
o tempo de esterilizao de cerca de 15 minutos. 3,0-3,5 bars (3 X 760
mmHg) Este tempo de esterilizao dever ser aumentado quando se
enche bastante o autoclave com meios para esterilizar



Esterilizao (autoclave)
Objetivo: morte de todos os possveis organismos vivos. As
solues ao sair do autoclave esto estreis. Utiliza-se este tipo de
esterilizao pelo calor hmido para meios de cultura e diversas
solues. Existem vrios tipos de autoclaves verticais ou
horizontais. Controle: Bacillus stearothermophilus (incubao a
37C)

Esterilizao (Tindalizao)
Este mtodo consiste numa esterilizao fracionada em que o meio sofre 3
aquecimentos em 3 dias consecutivos, para destruio de formas vegetativas
bacterianas que evoluem de esporos. Utiliza temperaturas inferiores a 100C,
e faz-se em banho-maria, onde se mergulham os frascos de meio a esterilizar
hermeticamente fechados, durante cerca de 1h, repetindo-se o tratamento
em 3 dias consecutivos.
Objetivo:
eliminao
de
formas
esporuladas, as quais germinam quando
submetidas a temperaturas de 100C,
resultando desta germinao as formas
vegetativas no resistentes a essa
temperatura.

A Pasteurizao
A Pasteurizao um processo que reduz a populao microbiana do leite
e de outros alimentos sensveis ao calor
No sinnimo de esterilizao
Originalmente, era empregada para matar bactrias patognicas
(tuberculose, brucelose, febre Q e febre tifoide)
Impede a disseminao de patgenos : Salmonella e Escherichia coli
O157:H7.
Impede o crescimento de organismos deteriorantes

A Pasteurizao
Passagem atravs de um trocador de calor

Controle do fluxo de leite, da temperatura e do tamanho da fonte de
calor
Pasteurizao rpida 71C por 15 s
Pasteurizao lenta 63-66C por 30 minutos
Pasteurizao rpida menores alteraes organolpticas e morte com
maior eficincia dos micro-organismos termorresistentes

Esterilizao (por radiao)
a) Defina a dose de reduo decimal para a radiao

b) Por que a radiao ionizante mais eficiente que a radiao ultravioleta,
na esterilizao de produtos alimentcios?

Radiao ionizante corresponde a um tipo de radiao eletromagntica,
com energia suficiente para produzir ons e outras espcies moleculares a
partir de molculas com as quais as partculas de radiao colidem. Produz
eltrons (e-), radicais hidroxil (OH.) e radicais hidrido (H.) Afeta protenas
e cidos nuclicos.
Radiao UV: Fluxos laminares laboratoriais so equipados com lmpadas
UV germicidas para promover a descontaminao de superfcies


A unidade de radiao, denominada Roentgen, corresponde a uma medida
de energia de radiao liberada por uma fonte.
O padro para aplicaes biolgicas, tais como a esterilizao, corresponde
dose de radiao absorvida.
A dose absorvida expressa em rad (100 erg/g) ou gray (1 Gy = 100 rad)

Os micro-organismos so mais resistentes radiao ionizante que os
organismos multicelulares

A quantidade de energia necessria para reduzir uma carga bacteriana em
10 vezes de, no mnimo, 200 Gy
A dose letal de radiao para humanos de 10 Gy ou menos
Vrias fontes de radiao ionizante esto disponveis, incluindo aparelhos
de raios X, tubos de raios catdicos e nucldeos radioativos
Produo de raios X e raios g.
60Co e 137Cs (subprodutos da fisso nuclear)

Esterilizao e descontaminao nas indstrias de suprimentos mdicos e
produtos alimentcios.

Espcie ou funo
D10a (Gy)
Tipo de micro-organismo
Clostridium botulinum
Bactrias gram-positivas,
anaerbias, esporulantes
3.300
Clostridium tetani
anaerbias, esporulantes
2.400
Bacillus subtilis
aerbias, esporulantes
600
Salmonell typhimurium
Bactrias gram-negativas
200
Lactobacillus brevis
Bactrias gram-positivas
1.200
Deinococcus radiodurans
Bactrias gram-negativas,
resistentes radiao
2.200

Espcie ou funo
D10a (Gy)
Tipo de micro-organismo
Aspergillus niger
Bolor
500
Saccharomyces cerevisiae
Levedura
500
Febre aftosa
vrus
13.000
Coxsackie
vrus
4.500
Inativao enzimtica
20.000-50.000
Desinfestao de insetos
1.000-5.000
D10 corresponde quantidade de radiao necessria para reduzir a populao inicial, ou o nvel de atividade, em 10
vezes (uma unidade logartmica). Gy = grays. 1 gray = 100 rads

Esterilizao (Filtrao)
a)Por que os filtros de profundidade no so amplamente utilizados em

processos de esterilizao?
b)Qual a vantagem da membrana filtrante em relao ao filtro de
nucleao, na esterilizao?

Esterilizao (Filtrao)
Utilizada na esterilizao de gases ou lquidos sensveis ao calor
Os filtros so dispositivos contendo poros de dimenses muito pequenas,

que impedem a passagem de micro-organismos, mas suficientemente
grandes para permitir a passagem de lquidos ou gases
Algumas das maiores clulas microbianas possuem dimetro superior a
10 mm, enquanto no menor extremo da escala encontram-se algumas
bactrias com dimetro inferior a 0,3 mm.




Esterilizao (Filtrao) 3 tipos de filtros
Filtro de profundidade
Lmina ou camada fibrosa
Confeccionada por um conjunto aleatrio de papis, asbesto ou fibras de vidro sobrepostos (fibra de vidro,
celulose e polipropileno)
As partculas so retidas medida que atravessam o trajeto tortuoso criado ao longo da espessura da
estrutura
Pelo fato de serem relativamente porosos so frequentemente utilizados como pr-filtros
Empregados na remoo das partculas grandes de uma soluo, a fim de que no ocorram obstrues
durante o processo final de esterilizao por filtrao
Empregados na filtrao do ar, em processos industriais

Membrana filtrante
Mais comum empregado em microbiologia

Compostas por polmeros que suportam altas tenses, tais como acetato de
celulose, nitrocelulose ou polissulfona
Produzidos de modo a apresentarem inmeros orifcios pequenos
Tamanho dos orifcios so controlados durante a manufatura
Atua como um crivo retendo partculas na superfcie do filtro
80-85% da rea superficial consistem em poros abertos (permite um fluxo
relativamente alto)


Filtros de trilhas de nucleao (Nucleopore)
Oriundos do tratamento de filmes muito finos de policarbonato (espessura de 10
mm) com radiao nuclear
Em seguida h tratamento qumico que cauteriza os danos no filme provocados
pela radiao. O tratamento qumico amplia os pontos danificados originando os
orifcios
O tamanho dos orifcios so precisamente controlados por meio da intensidade da
soluo cauterizante
Usado em microbiologia para reter clulas e permitir a passagem de fluidos e
outras partculas. Tambm empregado em MEV

Esterilizao vapores de Gases esterilizantes
Vapores de gases esterilizantes
xido de etileno
450-1200mg/l a 29C at 65C por 2-5h
Vapor de formaldedo
2%-5% a 60C at 80C
Vapor de perxido de hidrognio
30% a 55C at 60C
Gs plasma
Gs de perxido de hidrognio altamente

ionizado

Esterilizao vapores de Gases esterilizantes (xido de Etileno)
Utilizado na esterilizao de artigos sensveis ao calor
Instrumentos cirrgicos, fios de agulhas para suturas e plsticos

Processo relativamente lento e influenciado pela concentrao do gs, pela
umidade relativa e contedo de umidade do artigo a ser esterilizado
Atividade timo com umidade relativa de 30%, com um decrscimo na

atividade em umidades mais altas ou mais baixas

Exerce sua atividade esporicida atravs da alquilao de grupos terminais
hidroxila, carboxila, amina e sulfidrila inativando certas enzimas
A efetividade da esterilizao monitorada pelo teste do B. subtilis


Esterilizao vapores de Gases esterilizantes (Formaldedo - HCHO)
Dissolvido em gua produzindo formalina em um soluo final de 37%
Combinao com etanol (2:7) intensifica a atividade microbicida
Alquilao direta dos grupos funcionais tais como amina, carboxilas e

hidroxilas, formando hidroximetilderivados

Esterilizao vapores de Gases esterilizantes (Vapor de perxido de
hidrognio)
Mata eficientemente a maioria das bactrias em concentraes de 3% a 6%
Mata todos os organismos , incluindo os esporos, em concentraes
maiores (10% a 25%)
A forma oxidante ativa no o perxido de hidrognio, mas sim os radicais

livres hidroxila formados pela decomposio do perxido de hidrognio
Implantes de plstico, lentes de contato e prteses cirrgicas.

Esterilizao Esterilizantes qumicos
O cido peractico, um agente oxidante tem excelente atividade e seus
subprodutos (cido actico e oxignio)
O glutaraldedo menos txico para tecidos viveis, mas pode, tambm,
causar queimaduras na pele e ou membranas mucosas
O glutaraldedo mais ativo em nveis alcalinos de pH (ativado por hidrxido
de sdio), mas menos estvel

Esterilizao , Desinfeco e Antissepsia
A esterilizao a destruio completa de todos os micro-organismos,
incluindo-se as formas mais resistentes como os esporos, micobactrias, vrus
sem envoltrios (lipdicos) e fungos
A desinfeco a eliminao da maior parte dos micro-organismos. As

formas mais resistentes sobrevivem
A antissepsia resulta na reduo do nmero de micro-organismos na
superfcie da pele. Os antisspticos so agentes qumicos que matam ou
inibem o crescimento de micro-organismos, sendo suficientemente atxicos
para serem aplicados em tecidos vivos

Desinfeco
Mtodo
Concentrao (Nvel de Atividade)
Calor mido
75C at 100C por 30 min (alto)
Mtodo
Glutaraldedo
2%-3,5% (alto)
Perxido de Hidrognio
35%-25% (alto)
Formaldedo
3%-8% (alto/intermedirio)
Hipoclorito
Varivel (alto)

Desinfeco
Mtodo
Glutaraldedo
2%-3,5% (alto)
Perxido de Hidrognio
35%-25% (alto)
Formaldedo
3%-8% (alto/intermedirio)
Hipoclorito
Varivel (alto)
cido peractico
Varivel (alto)
Compostos de Cloro
100-1000 ppm de cloro (alto)

Desinfeco
Mtodo
lcool (etil, isopropril)
70%-95% (intermedirio)
Compostos fenlicos
0,4%-95% (intermedirio)
Compostos iodforos
30-50 ppm de iodeto livre/l (intermedirio)
Compostos de amnio quaternrio
0,4% - 16% (baixo)

Desinfeco (classificao)
Os desinfetantes de alto nvel so utilizados para artigos envolvidos com
procedimentos invasivos que no podem suportar os procedimentos de
esterilizao (p. ex. certos tipos de endoscpios, instrumentos cirrgicos
contendo plstico ou outros componentes que no podem ser
autoclavados)
Os desinfetantes de nvel intermedirio so utilizados para limpeza de

superfcie ou de instrumentos nos quais improvvel a contaminao com
esporos bacterianos ou por organismos altamente resistentes (endoscpio
de fibra ptica, laringoscpios, espculos vaginais, circuitos de respirao
anestsica)

Desinfeco (classificao)
Os desinfetantes de baixo nvel so utilizados para tratar instrumentos e
dispositivos no crticos, como braadeiras de aparelhos de presso,
eletrodos de eletrocardiograma e estetoscpios
Desintetantes
Exemplos
Halognios
Compostos de iodo
Compostos de Cloro
Compostos fenlicos
Hexaclorofenol
Compostos de Amnio Quaternrio
Cloreto de Benzalcnio
Cloreto de cetilperidnico
lcoois
Etanol
Isopropanol

Desinfeco (Halognios)
Compostos contendo iodo ou cloro

Iodo um elemento altamente reativo que precipita protenas e oxida
enzimas essenciais
As solues aquosa de cloro so bactericidas: cloro elementar (Cl2), cido
hipocloro (HOCl) e on hipoclorito (OCl2).
O cloro pode exercer seu efeito pela oxidao irreversvel de grupos
sulfidrila (SH) de enzimas essenciais.

Desinfeco (Compostos fenlicos)
Apresentam interesse histrico
Coeficiente fenlico (padres comparativos igual a 1, maior que 1 e menor

que 1).
No esporicida temperatura ambiente (mas esporicida a temperaturas
prximas a 100C)
Pouca atividade contra vrus desprovidos de envoltrios lipdicos
Fenol atua rompendo membranas contendo lipdios (extravazemento do
contedo celular)
Ativos contra micobactrias (parede celular que apresenta concentrao de

lipdios muito alta)

Desinfeco (Compostos de amnio quaternrio)
Quatro grupos orgnicos covalentemente ligados ao nitrognio
Maior atividade microbicida com grupos com cadeias de 8 a 18 tomos de
carbono
Cloreto de benzalcnio e cloreto de cetilperidneo
Cloreto de benzalcnio
Cloreto de cetilpiridnio

Desinfeco (Compostos de amnio quaternrio)
Bacteriostticos (baixa concentrao)
Bactericidas (alta concentraes)

Pseudomonas, Mycobaterium e fungos Tricophyton (resistentes)
Vrus resistentes
Esporos bacterianos (resistentes)

Desinfeco (lcoois)
Atividade microbicida intensificada com aumento da cadeia carbnica (5 a 8)
Etanol e Isopropanol
Bactrias vegetativas, micobactrias, alguns fungos e vrus contendo lipdios

No so efetivos contra alguns fungos e vrus desprovidos de envoltrio lipdico
A atividade maior na presena de gua (70% > 95%)
Pele e termmetros

Antispticos
Agente antissptico
Concentrao
lcool (etil e isopropil)
70%-90%
Iodforos
1-2mg de iodeto livre/l; 1%-2% de iodeto

disponvel
Clorexidina
0,5%-4,0%
Paraclorometaxilenol
0,50%-3,75%
Troclosan
0,3%-2,0%

Antisspticos
Reduzem o nmero de micro-organismos na superfcie da pele
lcoois excelente atividade contra todos os grupos de organismos
(atxicos e removem lipdeos)
Iodforos espectro semelhante aos lcoois

Clorhexidina menor velocidade que o lcool
Paraclorometaxilenol limitada principalmente s bactrias Gram positivas
(txico e residual)
Triclosan ativo contra bactrias

Antisspticos
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Oxdo de etileno gs esterilizante mais utilizado (inflamvel)

cido paractico e o glutaraldedo

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121C ou 132C por diferentes intervalos de

Filtros com poros de 0,22-0,45 mm; filtro HEPA

Exposio varivel a comprimento de onda de

Exposio varivel a radiaes de micro-onda

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Vapores de gases esterilizantes

450-1200mg/L a 29C at 65C por 2-5h

Vapor de Perxido de Hidrognio

30% a 55C at 60C

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Tempo de reduo decimal ou D :

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O endsporos so as estruturas mais termorresistentes conhecidas

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Passagem atravs de um trocador de calor

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a) Defina a dose de reduo decimal para a radiao

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A dose absorvida expressa em rad (100 erg/g) ou gray (1 Gy = 100 rad)

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60Co e 137Cs (subprodutos da fisso nuclear)

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a)Por que os filtros de profundidade no so amplamente utilizados em

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Os filtros so dispositivos contendo poros de dimenses muito pequenas,

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Mais comum empregado em microbiologia

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450-1200mg/l a 29C at 65C por 2-5h

2%-5% a 60C at 80C

Vapor de perxido de hidrognio

30% a 55C at 60C