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PCR

La sntesis siempre va del sentido 5--3


Los cidos nucleicos son capaces de sufrir un proceso de desnaturalizacin. Si
sometemos el DNA a una Ta elevada se van a separar las dos hebras al romperse los
puentes de H. La Ta a la cual el 50% de las molculas estn separadas es lo que se
denomina Ta de fusin (melting point), suele estar alrededor de los 85 grados. Esa Ta va a
depender del porcentaje de CG que contenga la molcula, cuanto ms GCs hayan, ms Ta
necesitaremos para romper los 3 puentes H.
Si bajamos la Ta se produce el proceso de renaturalizacin y esas cadenas van a tender a
aparearse de nuevo atendiendo a las reglas de complementariedad.
PCR: tcnica que se utiliza para el diagnstico molecular
Consiste en sintetizar DNA en un tubo de ensayo

Primer forward 5---3 (rojo)

Ambos como mnimo de 18 nucleotidos.

Primer reverse 5--3(verde)


DNA pol: enzima que sintetiza el DNA
Se utilizo la DNA pol de un m o hipertermfilo.
Las DNA polimerasas no pueden sintetizar el DNA a partir de los nucletidos, necesitan
una secuencia corta de nucletidos que le suministre el extremo 3-OH libre y eso es lo que
se llama un primer (cebador) y es sintetizado por una RNA polimerasa. Van a utilizar
una hebra como molde y sintetizar la complementaria.
Para sintetizar el DNA, tendremos que poner en el tubo de ensayo:
-

DNA polimerasa de un m.o hipertermfilo porque se adapta a cualquier situacin, se


llama Taq polimerasa
dNTP (G,C, T, A)
muestra que contenga el DNA que queremos amplificar
Tampn de Mg para las Taq polimerasas
Primers (18 nucleotidos)

Diseo de primers forward y reverse:


Aparato para PCR: Termociclador:
Es un aparato que va a subir y bajar la Ta rpidamente. Un ciclo de PCR contiene 5 fases:
Etapa inicial: consiste en programar el termociclador a una Ta de 95 grados durante 10
minutos. Se hace eso para desnaturalizar y degradar las posibles impurezas que puedan
haber (ej: enzimas intiles). A esa Ta la Taq polimerasa no le va a pasar nadar porque es
resistente a elevadas Tas.
3 etapas: ciclos de la PCR:
-

Desnaturalizacin: consiste en someter el tubo a una de 95 grados durante 30


segundos para que se separen las hebras de DNA.
Hibridacin: se baja la Ta a 50-65 grados durante 30-60 segundos, aqu entramos en
proceso de renaturalizacin, es decir que las hebras tendrn a juntarse de nuevo. El
Primer forward va a hibridar (complementar) en la hebra que queremos amplificar 35 (la de abajo). El primer reverse va a hibridar la hebra de arriba.
Elongacin (sntesis): se programa el aparato a 72 grados durante 2 minutos. Esta
Ta es la Ta ptima de sntesis para la DNA polimerasa a partir del extremo 3del
cebador.

Etapa final: se programa el aparato a 72 grados durante 10 minutos para que la Taq
polimerasa repase todo (por si queda algn hueco por rellenar)
Estos ciclos se repiten del orden de 30 veces
Las DNA polimerasas no pueden el DNA de la nada, necesitan un extremo 3 (aportado por
el cebador) y por ah va a ser donde se van a incorporar los nucletidos.
Otra de las caractersticas es que al ser la molcula de DNA bicaternaria, la manera que
tienen las DNA pol de sintetizar el DNA es que van a utilizar una hebra como molde y vana
sintetitar la complementaria aadiendo siempre el nucletido creciente a ese extremo 3.
Una vez termiado la reaccin de PCR, lo que hay que hacer es coger del tubo una muestra
y ver si ha sido amplicada o no. Las protenas se separan mediante electroforesis en geles
de agarosa, que permite separar fragmentos de DNA que van de 200 pares de bases hasta
3000. Para visualizar el DNA se utiliza el