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Tema 7.

El DNA y la replicacin
La transmisin de la informacin gentica
Nucletidos
Estructuras primaria, secundaria y terciaria del DNA
Desnaturalizacin e hibridacin
Superenrollamientos
Helicasas y topoisomerasas
Empaquetamiento y organizacin del DNA
Nucleosomas e histonas
Caractersticas de la replicacin del DNA
El replicn
Iniciacin de la replicacin
DNA polimerasas
Los replisomas de procariotas y eucariotas
Terminacin
Telmeros y telomerasa

Replicacin y expresin gnica en organismos procariotas y eucariotas


En Procariotas, al no haber un ncleo diferenciado, la replicacin, transcripcin
y traduccin tienen lugar en el mismo y nico compartimento intracelular. Las dos
ltimas suelen transcurrir simultneamente.
Eucariotas

La replicacin y

Ribosomas del
la transcripcin
Ncleo
r. e. rugoso
La traduccin ocurre en el
Nucleolo transcurren en el

Replicacin

citoplasma, en ribosomas
asociados o no al retculo
endoplsmico rugoso

ncleo

Transcripcin

Traduccin

Citoplasma

Membrana plasmtica

El material gentico: los cidos nucleicos


Replicacin
Transcripcin

U
U

Hebra
codificante

U
U

Traduccin

Hebra
molde

Los cidos nucleicos son cadenas de nucletidos o polinucletidos:


ADN DNA : Acido desoxirribonucleico (polmero de desoxirribonucletidos)
ARN RNA : Acido ribonucleico (polmero de ribonucletidos)
El DNA contiene la informacin transmisible en cdigo de 4 letras (4 bases),
pero no es el molde para la sntesis de protenas.
El RNA mensajero o mRNA contiene el mensaje codificado para la sntesis de
protenas: tripletes de 4 posibles bases para codificar 20 letras o aminocidos.

Estructura y nomenclatura de nuclesidos y nucletidos

bsica

(RNA)

cido

neutro
(DNA)

Adems de formar parte de los cidos nucleicos, los nucletidos pueden ser
transportadores de energa qumica (ATP, GTP), sealizadores intracelulares
(AMPc, GMPc), o componentes de coenzimas (NAD+, CoA, FAD, etc).

Niveles estructurales de los cidos nucleicos


Estructura primaria: polmero lineal formado por la unin de numerosos
nucletidos mediante enlaces fosfodister
DNA de cadena sencilla (ssDNA) y RNA
Estructura secundaria: disposicin espacial relativa de los nucletidos
que se encuentran prximos en la secuencia
DNA Doble cadena polinucleotdica (dsDNA)
RNA Zonas de apareamiento parcial y zonas sin aparear, con
protuberancias, bucles y horquillas en determinadas regiones
Estructura terciaria: todas aquellas de orden superior a los niveles
primario y secundario
DNA Estructuras resultantes del superenrollamiento, de la asociacin
con protenas en la cromatina y los cromosomas, y de secuencias
especiales (DNA H trplex, DNA G tetraplex, Holliday junctions)
RNA Plegamiento tridimensional definido (tRNAs y otras estructuras)

Estructura primaria del DNA : cadena polinucleotdica


Desoxirribonuclesidos 5 monofosfato de
las 4 bases nitrogenadas A, T, G, C.

Tiene extremos distintos: 5-fosfato y 3-OH.


Tiene sentido, direccionalidad o polaridad,
por los enlaces fosfodister 3-5.

T
G

Cada cadena de DNA tiene individualidad,


dada por su secuencia de nucletidos.
La secuencia siempre es 5 3:
5-ATGCG-3
ATGCG

C
A

Extremo

5

Extremo

3

Estructura secundaria del DNA: hebras o cadenas antiparalelas


y complementarias unidas por puentes de H
Complementariedad entre bases:
siempre A-T (2 p. de H) y G-C (3
p. de H)
Lado del surco mayor

Cadenas antiparalelas:
ambas son 5-3 en
sentidos opuestos

Lado del surco menor

Hay igual distancia en los pares A-T y G-C entre los C1


de los enlaces glicosdicos (1,08 nm). As, el dsDNA tiene
el mismo grosor a lo largo de toda su estructura (2,4 nm)

Reglas de
Chargaff:

A=T
G=C

A + G = T + C = 50 %
pur = pir = 50%

A/T = T/A =1
G/C=C/G =1
A+G/T+C=1
pur / pir = 1

Disposicin
autorreplicativa:

Tipos de dobles hlices de DNA: A, B, Z

surco
menor
surco
mayor

Los esqueletos de DNA


y RNA son flexibles y, en
base a sus ngulos de
giro, puede adoptar
distintas conformaciones

A: dsRNA, RNA/DNA
La estructura ms
normal in vivo, y la
descrita por Watson y
Crick, es la forma B

B: dsDNA in vivo

Z: pur-pir, in vitro

DNA-A

DNA-B

DNA-Z

Dimetro de la hlice

2,55 nm

2,37 nm

1,84 nm

pb por giro de hlice

11

10,4

12

33,6

34,6

-30

Rotacin por pb
Rotacin de la hlice

dextrgira dextrgira

levgira

Mantenimiento de la estructura secundaria del DNA

Estabilidad de la doble hlice


- Puentes de H entre las bases complementarias apareadas
- Interacciones hidrofbicas entre las caras de las bases
- Fuerzas de van der Waals entre las bases apiladas, que
aumentan con la longitud del DNA
- Solvatacin de los fosfatos, que disminuye su repulsin
electrosttica
- Interacciones electrostticas con Mg2+, histonas y otras
protenas de carcter bsico, que interaccionan con las
cargas negativas de los grupos fosfato y reducen la repulsin
El apareamiento entre las bases es esencial para las
funciones de los cidos nucleicos: permite la separacin
de las dobles hlices (desnaturalizacin o fusin) y su
asociacin (renaturalizacin e hibridacin)

Desnaturalizacin o fusin (melting) del DNA


El DNA se puede desnaturalizar por calor, por
agentes qumicos o por enzimas (helicasas).
El proceso opuesto es la renaturalizacin.

parcial

Al producirse un desapilamiento de las bases,


hay un aumento en la A260: efecto hipercrmico al
pasar de dsDNA a ssDNA (o efecto hipocrmico
desde ssDNA a dsDNA).

ssDNA
parcial

50% dsDNA y
50% ssDNA

total

dsDNA

Tm: temperatura para llegar al 50% de hipercromicidad


Por cada 1% de aumento en G-C, la Tm aumenta ~ 0,4C

Clculo de los valores de Tm de un


DNA a partir de su secuencia

Al aumentar la fuerza inica sube la Tm, porque se favorecen


Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)
los apareamientos parciales

Tm = 70 + 41 (G+C) / n - 675 / n

Hibridacin de cidos nucleicos


La hibridacin es la asociacin entre cidos nucleicos de cadena sencilla
de distinto origen (es decir, no la reasociacin de un dsDNA), con secuencias
parcial o totalmente complementarias: se pueden formar dobles hlices
imperfectas sin complementariedad total
Adems de ser clave en algunos aspectos de la funcionalidad celular de
los cidos nucleicos (p.e. interferencia de RNA), la hibridacin es la base de
mltiples tcnicas de Biologa Molecular (PCR, Northern, Southern, FISH).
En ellas se usan fragmentos de DNA o RNA que se unen a sus secuencias
complementarias y sirven para iniciar la sntesis de DNA (cebadores) o para
identificar esas secuencias (sondas, con marcaje).

Identificacin o marcado de
cidos nucleicos mediante
una sonda de hibridacin

Hidrlisis enzimtica de cidos nucleicos: las nucleasas


Las nucleasas son enzimas capaces de hidrolizar
enlaces fosfodister entre nucletidos de los cidos
nucleicos.
El corte puede ser a uno u otro lado del grupo fosfato.
Pueden ser desoxirribonucleasas (DNasas) o ribonucleasas (RNasas), y
endonucleasas o exonucleasas.
Las endonucleasas cortan en el medio de la cadena polinucleotdica. Algunas
cortan de forma inespecfica, mientras que las llamadas endonucleasas de
restriccin o enzimas de restriccin reconocen secuencias especficas de
dsDNA y cortan en ambas cadenas.
Las exonucleasas hidrolizan enlaces comenzando por un extremo (3 5) de
la cadena polinucleotdica, provocando la escisin de nucletidos de uno en uno
desde ese extremo.
Endonucleasa de restriccin (DNA)

Endonucleasa inespecfica (RNA o DNA)

Exonucleasa (RNA o DNA)

Estructuras plegadas de ssDNA y RNA


Tanto en ssDNA como en RNA, se forman zonas de
doble hlice local entre regiones con secuencias
palindrmicas o con complementariedad parcial,
que resultan interrumpidas por protuberancias, bucles
y horquillas en las zonas sin complementariedad.

ssDNA o RNA

Secuencias palindrmicas
o repeticiones inversas

Horquilla

Estas estructuras forman giros y dobleces en la doble


hlice, que a su vez generan estructuras
tridimensionales ms o menos flexibles y definidas,
cuyo ejemplo ms conocido son los tRNAs.
Cuando hay varios apareamientos y estructuras
posibles, la ms probable es la que tenga una G de
formacin ms negativa, es decir, la que ms
interacciones dbiles desarrolle.

Estructura terciaria del DNA. Superhlices


La estructura del dsDNA ms estable (con la mayor G de
formacin) es la que desarrolla el mximo apareamiento
entre bases, que precisa del nmero adecuado de pares de
bases por vuelta (10,4 para el DNA B), segn el ngulo de
giro y la rotacin entre nucletidos.
En estructuras de DNA cerradas o inmovilizadas, la doble
hlice no puede rotar libremente sobre su eje, y se suelen
generar defectos o excesos de vueltas en ellas. Ello altera
el nmero de pares de bases por vuelta y no permite al DNA
adquirir la estructura ms estable.
Para compensar los defectos o excesos de vueltas, el
DNA desarrolla vueltas en el mismo sentido o el opuesto
generando vueltas de superhlice, lo que le permite ajustar
el nmero de pares de bases por vuelta y mantener el
mximo apareamiento.

Hlice

Superhlice

Esta propiedad es de
carcter topolgico, y
tiene lugar sin ruptura de
enlaces covalentes.
Cuando se rompe una
cadena, las superhlices
se deshacen.

Estructura terciaria. Superhlices

Superhlice
negativa

DNA relajado

Superhlice
positiva

Superhlice negativa: giro en el mismo sentido al de la hlice B (dextrgiro).


Producida por una falta de enrollamiento de la doble hlice, para generar
nuevas vueltas.
Superhlice positiva: giro en sentido opuesto al de la hlice B (levgiro).
Producida por un exceso de enrollamiento de la doble hlice, para compensar
las vueltas de ms.
En las clulas, el DNA suele estar superenrollado negativamente porque es
ms conveniente y favorable energticamente: permite generar zonas de
apertura local de la doble hlice.
Sin embargo, en zonas concretas puede estar superenrollado positivamente.

Estructura terciaria del DNA. Topoismeros


Topoismeros: ismeros topolgicos de la misma molcula de DNA, que se
diferencian entre s por el grado de superenrollamiento.
Se pueden interconvertir entre s gracias a la accin de las topoisomerasas,
que son enzimas capaces de aadir o eliminar superenrollamientos.
Al ir aumentando el superenrollamiento,
el DNA presenta:

DNA ms relajado

ctodo (-)

- Mayor grado de compactacin:


necesario para el empaquetamiento en
las clulas y ncleos
- Menor superficie y mayor densidad
- Mayor velocidad de sedimentacin
- Mayor velocidad de migracin en un
campo elctrico. As, los topoismeros
se pueden separar electroforticamente.
DNA ms superenrollado

nodo (+)

Importancia de las helicasas y topoisomerasas


Para la copia, expresin y funcionalidad del DNA es necesario abrir la doble
hlice, lo que hacen las enzimas helicasas.
Al desenrollarla se introduce un exceso de vueltas de hlice en la zona
adyacente, que no puede rotar libremente, por lo que se crean superhlices
positivas en esas zonas.
Estas tienen que ser eliminadas por las topoisomerasas, para que la tensin
no sea excesiva y el DNA se pueda seguir abriendo.
Las topoisomerasas tambin pueden introducir nuevos superenrollamientos
para compactar el DNA.
topoisomerasas

helicasas

Helicasas
Son enzimas que catalizan la rotura de los puentes de hidrgeno de la
doble hlice del DNA con gasto de ATP, produciendo una desnaturalizacin
natural, local y procesiva, y generando DNA de cadena sencilla.
Otras trabajan con hbridos DNA-RNA o con RNA de doble cadena.
Requieren ATP para su unin al DNA y lo hidrolizan durante su accin.
Son hexamricas y circulares, lo que les da alta procesividad: se cierran
sobre una hebra, se deslizan y deshacen el dsDNA.
Algunas van en sentido 53 y otras en 35.
Funcionan en replicacin, transcripcin y reparacin del DNA, y en general
en todas las funciones del DNA y el RNA.
En los procesos de replicacin estn fsicamente asociadas a las primasas.

Helicasas replicativas:
DnaB en E. coli
Mcm2-7 en eucariotas

Topoisomerasas
En su actividad interconvierten topoismeros para solventar problemas topolgicos.
As, desenrollan, desanudan o desencadenan DNA eliminando superenrollamientos,
pero tambin pueden compactar el DNA aadiendo vueltas de superhlice.
Para su accin tienen actividades enzimticas nucleasa y trans-esterificadora,
que realizan acciones de corte y reempalme en una o las dos hebras del DNA.
Pueden relajar superhlices (-) y (+) e introducir superhlices (-) y (+): cada tipo de
topoisomerasa hace una o ms de esas opciones.
Las Topo I cortan el DNA en una
de las cadenas, relajando el DNA al
quitar una vuelta de superhlice.
Las Topo II gastan ATP para cortar
el DNA en las dos cadenas,
aadiendo o quitando dos vueltas de
superhlice o separando molculas
de DNA entrelazadas.
Cada una tiene sustratos y
acciones caractersticas en la
replicacin, transcripcin, reparacin,
organizacin de la cromatina, mitosis
o recombinacin.

Empaquetamiento del DNA con protenas


Dentro de la clula, el DNA est condensado y empaquetado con protenas,
formando un nucleoide en Procariotas y cromatina en Eucariotas.
La condensacin y empaquetamiento del DNA sirve para:
Compactarlo, para que quepa en la clula.
Protegerlo de lesiones, sobre todo en mitosis.
Transmitir eficazmente el DNA a las clulas hijas.
Organizar la molcula de DNA para facilitar los procesos en los que interviene.
La condensacin se realiza gracias a la asociacin con protenas especficas, que
lo pliegan, enrollan y forman bucles, dando niveles de organizacin superiores y
evitando que el DNA se convierta en un ovillo enmaraado inaccesible.

En Procariotas, el nico
cromosoma o nucleoide,
casi siempre circular, est
empaquetado y organizado
gracias a las nucleoid
associated proteins o NAPs.

Empaquetamiento del DNA en eucariotas: cromatina


Cromatina: ~ 1 DNA / 1 histonas / 1 protenas no histonas
Cromatina interfsica
- el DNA est menos empaquetado o condensado
- resulta accesible para las protenas
Eucromatina: poco condensada, replicacin temprana
Heterocromatina: muy condensada, replicacin tarda
- h. constitutiva: centrmeros, telmeros y otras regiones
- h. facultativa: caracterstica de cada tipo celular
- El estado de la cromatina est controlado por los sistemas epigenticos y
por unin de protenas, que deciden el grado de compactacin
- Para la actividad transcripcional hace falta que la cromatina est en forma
de eucromatina
Cromosomas mitticos
- DNA con mximo empaquetamiento
- formacin controlada por el ciclo celular

Niveles de condensacin del DNA eucaritico


DNA de doble hlice
Cromatina en cuentas de
collar formadas por
nucleosomas sin H1

empaquetado 6 veces
Fibra de cromatina de 30 nm
con nucleosomas y H1, en
solenoide o zig-zag

empaquetado 40 veces
solenoide

Lazos de eucromatina en
interfase
empaquetado 103-104 veces

Seccin condensada
de un cromosoma

Cromosoma
metafsico entero

centrmero

zig-zag

Nucleosoma: el elemento bsico de la cromatina


Un nucleosoma est formado por 146 pb de DNA core que rodea al ncleo
o core histnico, de carcter proteico, al que se une mediante mltiples
interacciones electrostticas y puentes de H.
Es una especie de cilindro plano de 11 nm de dimetro y 6 nm de altura.
La relacin entre la masa del DNA y de las protenas es 1:1.
Ncleo o core histnico: est formado por un octmero de histonas (2x)
H2A, H2B, H3 y H4. No tiene histona H1.
El DNA forma 1,65 vueltas superenrolladas negativamente, lo que
disminuye los problemas topolgicos al desenrollarlo.
Entre cada dos nucleosomas hay DNA espaciador.
DNA del
nucleosoma

DNA ncleo o core: 146 pb


DNA espaciador: 13-110 pb
DNA total: 160-260 pb

histonas

nucleosoma
ncleo o core
histnico

DNA ncleo
o core

DNA
espaciador

DNA

En humanos hay unos 3 x 107


nucleosomas por clula

Propiedades generales de las histonas


Tipo de histona

Histona

P mol

Lys + Arg

Histonas core

H2A

14000

20 %

H2B

13900

22 %

H3

15400

23 %

H4

11400

24 %

H1

20800

32 %

Histona ligadora

Son muy ricas en


aminocidos bsicos
Estn muy conservadas
evolutivamente entre ellas y
entre distintas especies
Hay variantes histnicas
de H1, H2A y H3

Las histonas core forman sus dmeros y tetrmeros, e interaccionan con el DNA,
a travs de un dominio conservado llamado pliegue histnico
H2B

Pliegue histnico:
H2B

Tetrmero H3-H4

Octmero de histonas

Elementos que controlan el empaquetamiento de la cromatina


La compactacin y organizacin funcional de la
cromatina est facilitada por el superenrollamiento
y alta concentracin del DNA, y por la accin de
protenas arquitectnicas.
La unin de la histona H1 permite formar a la
cromatina una estructura ms empaquetada: de la
fibra de 10 nm a la de 30 nm.
Las colas histnicas sobresalen del nucleosoma
e intervienen en la compactacin y funcionalidad de
la cromatina.

Las colas sufren modificaciones qumicas reversibles


(acetilacin, metilacin, fosforilacin) en residuos
especficos, que controlan el estado estructural y
funcional de la cromatina a travs de interacciones entre
ellas y con otras protenas (cdigo de las histonas)

La cromatina interfsica se une y organiza sobre un soporte


estructural formado por protenas y RNA llamado matriz nuclear
Membrana nuclear
Fibra de
cromatina

Protenas
histnicas y
no histnicas

Fibra de
croma5n
a de 30
nm
Fibra de
30 nm
Nucleosoma
(11 nm)

Poro nuclear

Matriz
nuclear
Lazos de bra
de croma5na
de 30 nm

DNA (2 nm)

Metafase
Fibras de la matriz nuclear

Interfase

En interfase, los cromosomas


se posicionan en territorios
cromosmicos especficos

Empaquetamiento cromosmico y armazn o scaffold

Armazn
o scaffold

Las SAR/MAR o S/MAR


son regiones especiales
del DNA mediante las
cuales la cromatina se une
a las estructuras de la
matriz y del scaffold o
armazn cromosmico

Matriz o
scaold

S/MAR

Principios de la replicacin del DNA


1.- El genoma completo se replica una sola vez en cada ciclo celular.
Si hay ms de un origen, como en eucariotas, lo hacen de forma
sincronizada, pero no necesariamente simultnea.
2.- La divisin celular no tiene lugar mientras no se haya completado
la replicacin: ha de haber alternancia. Los reguladores del ciclo celular
disparan los mecanismos que inician la replicacin y la divisin celular.
3.- La replicacin es semiconservativa, requiere un cebador para
empezar la sntesis de DNA, y sta slo procede en direccin 53.

Fases de la replicacin
- Iniciacin: reconocimiento del origen por el iniciador proteico y apertura
del DNA por las helicasas.
- Elongacin: sntesis del DNA por los replisomas o complejos de
replicacin en las horquillas de replicacin.
- Terminacin: procesos especiales en los finales de los replicones
circulares procariotas o de los lineales eucariotas.

La replicacin del DNA es semiconservativa


En la replicacin, cada cadena sirve de molde para la sntesis de otra
cadena complementaria, que queda apareada con ella. As, cada nueva
doble hlice tiene una cadena parental y otra de nueva sntesis, por lo
que la replicacin es semiconservativa.

5 -A-T-C-G-T-A-C- 3
3 -T-A-G-C-A-T-G- 5

Replicacin
5 -A-T-C-G-T-A-C- 3
3 -T-A-G-C-A-T-G- 5
5 -A-T-C-G-T-A-C- 3
3 -T-A-G-C-A-T-G- 5

Experimento de Meselson y Stahl (1958):


la replicacin es SEMICONSERVATIVA

Hay un solo replicn en Procariotas pero muchos en Eucariotas,


para disminuir el tiempo de replicacin de los genomas grandes
Un replicn es un fragmento de DNA que se replica de forma autnoma a
partir de un origen de replicacin. Es decir, es una unidad de replicacin.
Contiene un inicio (origen) y a veces un final (terminador).
Procariotas: un replicn: un solo origen de replicacin
Escherichia coli: 4,6 Mpb = 1 origen x 2 horquillas x 60 kb/min x 30 min
Eucariotas: muchos replicones: muchos orgenes coordinados
Homo sapiens: 2900 Mpb = 50.000 orgenes x 2 horquillas x 2-3 kb/min x 10 min
unidireccional

La replicacin es bidireccional a partir del origen

origen

eucariotas
bidireccional
horquillas de
replicacin

origen

procariotas

Inicio de la replicacin en E. coli: origen oriC e iniciador DnaA


Para la iniciacin de cualquier evento de replicacin, es necesaria la interaccin
entre una secuencia llamada origen de replicacin o replicador (que es lo
primero que se replica), y un factor proteico llamado iniciador.
DnaB: helicasa
DnaC: cargador de la helicasa

oriC

DnaG:
primasa
SSB

girasa
(topoisomerasa)

replisoma

primosoma
SSB: protena de unin a ssDNA

En los cromosomas de eucariotas hay muchos orgenes potenciales


sobre los que se forman complejos prerreplicativos preRC, que luego
pueden ser o no usados como orgenes de replicacin
En Eucariotas los orgenes no estn definidos
por secuencias determinadas, sino por varios
posibles elementos de secuencia, estructura
y modificaciones de la cromatina, as como
por la unin de protenas a ellos

Los dominios replicativos tienen mltiples


orgenes, y no se replican a la vez

No todos los posibles orgenes son activados y


usados como orgenes en cada ciclo replicativo

Los orgenes son activados por la unin


de determinadas protenas y finalmente
la fosforilacin de la helicasa Mcm 2-7,
que abre el DNA

Las primasas inician la sntesis de cadenas polinucleotdicas


Son RNA polimerasas dependientes de DNA, y sintetizan cebadores de
5-12 nt para que sea posible la iniciacin de la replicacin del DNA molde.
Pueden usar rNTPs o dNTPs, pero usan ms los
primeros por su abundancia, por lo que los
cebadores suelen ser de RNA.
Pueden comenzar la sntesis copiando cualquier
secuencia, pero tienen ciertas preferencias. P.e., la
primasa DnaG de E. coli tiene preferencia por 3GTC.
En eucariotas la actividad Pol-primasa produce
cebadores hbridos, con una parte inicial de RNA
(8-12 nt) y otra final de DNA (10-20 nt).

cebador
de RNA

primasa

Caractersticas de las DNA polimerasas (DNA pol)


Son enzimas capaces de replicar DNA, es decir, de sintetizar una hebra de
DNA copia usando como molde otra hebra de DNA.
Las que sintetizan el DNA en la replicacin se llaman REPLICASAS.
+ requerimientos
- molde: cadena complementaria
- cebador: RNA o DNA con un extremo 3-OH
- los 4 desoxirribonuclesidos 5 trifosfato: dATP, dGTP, dCTP, dTTP
- Mg2+ (o Zn2+): para la catlisis
+ reaccin:

(DNA)n + dNTP (DNA)n+1 + PPi

G0 = - 6 kJ/mol

+ direccin o polaridad de sntesis 5'3


+ tienen un solo sitio activo para los 4 posibles sustratos
+ tienen alta fidelidad y alta procesividad
Actividades que pueden estar presentes en las DNA polimerasas
- polimerasa 5'3: adicin de 1 nucletido a un extremo 3-OH libre,
elegido por su apareamiento con el molde.
- exonucleasa 3'5 correctora o editora: verifica el apareamiento y corta
el ltimo nucletido si no es correcto.
- exonucleasa 5'3: elimina DNA (o RNA) de forma procesiva desde una
mella. Junto con la polimerasa hace corrimiento de mella.

Sntesis de DNA: elongacin de una cadena de DNA


por la actividad DNA polimerasa
Sntesis de una cadena de DNA complementaria a la molde mediante la formacin de
un enlace fosfoster entre una cadena creciente con un extremo 3-OH libre (cebador) y
un dNTP entrante. Las DNA pol tienen un solo centro activo, y seleccionan el nucletido
correcto slo en base a la geometra del par formado con la base del molde.

Cebador

Si el apareamiento es correcto, el
grupo 3-OH hace un ataque
nuclefilo sobre el fosfato del
dNTP entrante y se forma el enlace

Molde
La energa para la reaccin
proviene del enlace fosfato del
dNTP. Tambin est favorecida
por la liberacin e hidrlisis del
PPi (G0 = - 31 kJ/mol)

Fidelidad de la replicacin
El proceso replicativo de E. coli comete un error por cada 108-1010 nt aadidos
(tasa de error 10-8-10-10). Como el genoma es de 4,6 x 106 pb, ello implica 1 error
por cada ~ 20 a 2000 replicaciones.
Esto mejora notablemente las tasas de error para las sntesis de RNA y
protenas, que son del orden de 10-4.
Es una tasa de error muy baja para deberse slo al apareamiento y geometra
de los pares de bases en el centro activo de la replicasa.
Tasas de error:
- polimerasa: 10-4-10-5
- exonucleasas editoras: 10-2-10-3
- sistemas de reparacin posreplicativos: 10-2-10-3
Actividad editora o correctora

Polaridad 53 en la replicacin
El DNA slo se sintetiza
en sentido 5-3

origen

Horquilla de
replicacin

Direccin de movimiento
de las horquillas

hebra
adelantada
53 global
hebra adelantada
fragmento de Okazaki
en crecimiento
cebador
de RNA

hebra
retrasada
35 global

f. de Okazaki previo
( 1000 nucletidos)

La hebra de DNA con el extremo 3


cerca de la horquilla se llama hebra
adelantada y se sintetiza en direccin
5-3 de forma continua.
La hebra retrasada se sintetiza en
direccin 5-3 de forma discontinua
mediante los fragmentos de Okazaki,
cada uno con su propio cebador.
Los fragmentos son luego unidos
para dar un crecimiento global 3-5.
Ambas hebras se pueden sintetizar
simultneamente gracias a la
disposicin del replisoma.

Las estructuras cristalinas de numerosas DNA polimerasas


unidas a DNA han mostrado la misma disposicin general.
Primera estructura de una DNA pol
(fragmento Klenow de E.coli pol I, 1985)
Lmina con
sitio cataltico

Dominios

Thumb (pulgar)
Palm (palma)
Fingers (dedos)
3 5 exonucleasa

Mecanismo de adicin de un nucletido al cebador


- entrada del dNTP
- apareamiento con el molde
hebra
molde

hebra
cebadora

- cierre de los dedos


- formacin del enlace fosfodister
- reapertura de los dedos con
desplazamiento de un par de bases
del cebador-molde
Cada uno de estos pasos est muy estimulado
por el apareamiento correcto entre la base del
dNTP entrante y la correspondiente en el molde
La actividad exonucleasa 3-5
correctora se activa cuando se
incorpora un nucletido mal
apareado y se altera la geometra
de las interacciones
El proceso de correccin se
realiza sin liberar el DNA

DNA polimerasas de E. coli.

La DNA pol III es la REPLICASA


La DNA pol I sustituye los cebadores de RNA de los fr. de Okazaki por DNA
La DNA pol II, IV y V estn implicadas en distintos procesos de reparacin del DNA

Holoenzima DNA polimerasa III (DNA pol III*)


- es la replicasa: sintetiza a la vez las dos hebras
- tiene alta procesividad: hasta 500.000 nt
- potencia cataltica: 250-1000 nt/seg
- tiene alta fidelidad
- hay unas 10-20 por clula de E. coli
- tiene 791,5 kDa, con 10 s.u. distintas
- es un dmero asimtrico (2)2 2'

Polimerasa ncleo o core


Complejo de carga de la
abrazadera o pinza , que
carga sta en la hebra
retrasada en cada
fragmento de Okazaki.

Sntesis de las dos hebras en la misma direccin: el replisoma


DNA polimerasa
Hebra
adelantada

Hebra
adelantada

DNA
parental

DNA polimerasa

La flexibilidad del DNA permite que la hebra retrasada forme un lazo para que
la sntesis sea simultnea en ambas hebras, lo que restringe la exposicin de
DNA de cadena sencilla, ms vulnerable.
Los elementos que componen el replisoma (DNA pol, helicasa, primasa, etc)
estn funcionalmente conservados en todos los organismos.
Las funciones propias de cada uno estn coordinadas por numerosas
interacciones mutuas.

Modelo del lazo o del trombn (de varas)

1000 nucletidos / seg

ciclos de 1-2 seg

fr. Okazaki: 1-2 kb

Hay 300-400 pinzas por clula, unas 20 veces ms que DNA pol III*

La DNA polimerasa I tiene un papel esencial en la replicacin:


elimina los cebadores de los fr. de Okazaki por corrimiento de mella
gracias a las actividades 53 exonucleasa y 53 polimerasa

Cierre por DNA ligasa

Protenas del replisoma de la bacteria Escherichia coli

DNA polimerasas de eucariotas

En total hay unas 13-15.


La Pol sintetiza la h. adelantada y la Pol
la h. retrasada.
La Pol sintetiza parte de los cebadores.
La Pol est implicada en el ajuste temporal
de la replicacin.
El resto estn implicadas en su mayora en
procesos de reparacin del DNA.
Protenas de la horquilla
de replicacin de
ncleos eucariticos

Pinza

PCNA

El DNA (2,4 nm) pasa a travs del agujero de las pinzas replicativas, que tiene
unos 3,5 nm y est cargado positivamente: hay unin topolgica, que implica
un anclaje mvil de la pinza al DNA.

Protenas con funciones anlogas en las horquillas


de replicacin de procariotas y eucariotas

Sistemas de terminacin en replicones circulares procariotas:


trampas direccionales para horquillas replicativas
La protena terminadora Tus se une
a las secuencias Ter, donde bloquea
direccionalmente a la helicasa DnaB y
al replisoma, que se desarma
horquilla
A

horquilla
B

Ubicacin de los
terminadores Ter

Secuencias
atrapadoras
para la
horquilla B

Secuencias
atrapadoras
para la
horquilla A
Punto de
encuentro

permisiva
no permisiva

5

3

hebra
retrasada 5

El problema de la duplicacin de los extremos y


el mantenimiento de la longitud de los telmeros
en replicones lineales como los de eucariotas
movimiento de la horquilla

Fr. de Okazaki
cebador

hebra
adelantada

3

5

hebra adelantada

telmeros
5

3

5

3

5

3

h. retrasada

Soluciones:
- circularizar el DNA
- usar una protena cebadora
- aadir repeticiones al extremo 3

eliminacin cebador RNA


ligacin fr. Okazaki
5

3

5

3

copia incompleta del extremo 5


y acortamientos en
replicaciones sucesivas:
prdida de material gentico

telomerasa

Replicacin de los telmeros


La telomerasa extiende el extremo 3
usando su secuencia de RNA para
aparear con la zona de ssDNA, y su
funcin transcriptasa reversa para
aadir nucletidos al mismo.
Usa como molde la parte no apareada
de su secuencia de RNA, y como
cebador el extremo 3-OH.

pol -primasa

DNA pol

Se realizan varias repeticiones del


proceso, aadiendo copias de la misma
secuencia para prolongar la hebra con el
extremo 3.
La hebra con el extremo 5 se rellena
por replicacin convencional de la
hebra retrasada: la pol -primasa
sintetiza un cebador que es extendido
por la DNA pol .
Luego el cebador de RNA se elimina,
dejando de nuevo un saliente de 12-16
nt de ssDNA en el extremo 3.

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