CRIOPRESERVACION DE SEMEN OVINO EN EL PERU

Mellisho S.E.(1) y Flores M.E.

Departamento de Produccin Animal - Facultad de Zootecnia
Universidad Nacional Agraria La Molina Lima. Per

Resumen

La investigacin tuvo como objetivo validar una metodologa de congelamiento rpido,

utilizando hielo seco (CO2) y nitrgeno lquido. Con esta finalidad se realizaron trabajos en la costa
con semen de carneros de las razas Black Belly, Asblack y Assaf y en la sierra (4200 m.s.n.m.) con
semen de carneros Merino y Corriedale.
El dilutor de congelamiento fue elaborado a base de 3,634 g de tris, 0,5 g de glucosa, 1,99 g
de ac. Citrico, 15 ml de yema de huevo, 5 ml de glicerina, 100,000 UI de penicilina y 100 mg de
estreptomicina, agregando a estos insumos agua destilada c.s.p. 100 ml. El dilutor fue agregado al
semen en dos partes, el primero sin glicerol a temperatura de ambiente y el segundo con glicerol a
4-5 C, en 3 fracciones iguales cada 10 minutos. El semen completamente diluido se mantuvo a 4-5
C por 45 a 60 minutos (tiempo de equilibrio a la glicerina), luego de la cual se realizo el proceso de
congelamiento.
En la superficie del bloque de hielo seco (-79 C) se prepararon agujeros de capacidad
aproximada 0,2 ml (aprox.), en estos se dosifica 0,2 ml semen equilibrado y se deja por 2 minutos y
se va observando el cambio de estado (liquido a slido), luego se vierte el contenido de los agujeros
(pellets o pastillas) directamente a recipientes conteniendo nitrgeno liquido. El almacenamiento se
realiz en goblets debidamente identificados en un tanque criognico.
El protocolo de dilucin y congelamiento fue validado ya que se obtuvo tasas de motilidad
espermtica individual y progresiva post descongelamiento mayores e iguales a 55% y siendo para 6
carneros de la regin costa de 58,3% y para 3 carneros de la regin sierra 56,7%
Palabras Clave: Criopreservacin, dilutor, semen, ovino
(1) emellisho@lamolina.edu.pe

I. Introduccin

La inseminacin artificial tiene como objetivo principal contribuir a la multiplicacin de las

caractersticas de los reproductores de mayor valor gentico. Su potencial reside en maximizar el
poder fecundante del semen, de tal forma que con la inseminacin artificial aumenta el nmero de
cras logradas por reproductor en comparacin a la monta natural.
Las tcnicas de congelamiento de semen posibilitan an ms la multiplicacin y difusin de
genes, al mismo tiempo que su conservacin por perodos prolongados de tiempo. El uso de semen
congelado ovino produjo un gran impacto en el mejoramiento gentico mundial, al permitir acelerar
considerablemente el flujo de material gentico superior hacia sectores de inferiores caractersticas
productivas, as como por facilitar el transporte de semen a nivel internacional evitndose el costoso
traslado de los reproductores y disminuyendo los riesgos sanitarios.
Sin embargo, la inseminacin cervical con semen congelado en ovinos presenta varias
dificultades, debido a la reduccin de la viabilidad espermtica producida por el proceso de
congelamiento y descongelamiento (Solomon y Lightfoot, 1970). A esto se suma la dificultad de
transponer la crvix de la oveja con la pipeta de inseminacin. Por estas razones, en el ovino, la
inseminacin artificial con semen congelado utiliza la tcnica no quirrgica de laparoscopa con la
que se han obtenido mejores tasas de preez.
Los objetivos que se persigue en este trabajo es validar una metodologa de congelamiento
rpido para el semen de ovino y obteniendo una motilidad individual y progresiva del esperma
descongelado mayor a 50%, para garantizar buenas tasas de preez a la inseminacin
Laparascpica.
II. Materiales y Mtodos
El trabajo se realizo con semen obtenido de 6 carneros de las razas Black Belly (4), Asblack (1)
y Assaf (1) pertenecientes a la Universidad Nacional Agraria La Molina (UNALM) y Instituto Nacional
de investigacin Agraria (INIA), localizadas en Lima (Costa) criados en condiciones estabuladas y 3
carneros de las razas Corriedale (2) y Merino (1) pertenecientes al Centro de Investigacin y
Capacitacin Campesina de Ayaracra - Pasco (Sierra 4200 m.s.n.m.) criados en condiciones
extensivas (pastoreo).

Dilucin de semen.
El dilutor de congelamiento y la metodologa de congelamiento a seguir son los revisados
por a seguir Evans y Maxwell, (1987) y Cueto et al., (1993). La composicin del dilutor es Tris (3,634
g), Glucosa (0,50 g), acido citrico (1,99 g), yema de huevo (15 ml), Glicerina (5 ml) y antibiticos
penicilina (100 00 UI) y estreptomicina (100 mg) y completando la solucin con agua destilada a 100 ml.
En esta solucin isotnica el tris (Hidroximetil Aminometano) o citrato cumple el papel de
buffers y glucosa como fuente de energa. Adems, contienen agentes protectores para las
membranas celulares durante el enfriamiento a 4 a 5 C (yema de huevo) y el congelamiento
(glicerol).
Para preparar, se pesan el tris, glucosa y el cido ctrico en una probeta de 100 cc y se
completa a 80 cc de agua destilada apirgena, al disolucin se realiza entibiando la mezcla
ligeramente. A esto se agrega 15 ml de yema de huevo (sin clara) y se homogeniza invirtiendo la
probeta tapada con papel de aluminio, varias veces. A continuacin la solucin se divide en dos
partes:
Solucin A: 50 cc de la solucin obtenida.
Solucin B: 45 cc de solucin obtenida. Agregar a esta 5 cc de glicerol y homogeneizar
previamente entibiado
La solucin B se coloca, tapada en la heladera a 5 C (4 a 5 C). La solucin A se coloca en
Bao Mara a 32 a 33 C.
La coleccin de semen se realizo usando una oveja inmovilizada en un brete lo cual
facilitaba la monta del macho. Para obtener un eyaculado de buena cantidad y calidad se dos
mosntas falsas. La vagina artificial que se utiliz fue la uruguaya de marca Walmur, a una
temperatura de 38 a 40 C y a una presin adecuada, que fue verificada con el ingreso con cierta
dificultad del dedo ndice del operario.
El semen colectado es recepcionado en unas copas graduadas y trasladadas a bao mara
a 32 C, para realizar la evaluacin de calidad seminal, esta consisti en valorar las caractersticas
volumen, color, aspecto, impurezas, pH, motilidad masal y concentracin espermtica. Todos los
carneros pasaron por una rutina de coleccin y evaluacin previas a la dilucin y congelacin de
semen.

Conocida la calidad seminal de los reproductores se iniciaron los trabajos de procesamiento

de semen y el chequeo de la calidad constaba en examinar el volumen, color y aspecto,
concentracin y la motilidad individual progresiva de los espermatozoides.
El semen colectado inmediatamente colocado en bao mara a 32 se procede a realizar una
pre-dilucin de 1:1 con la solucin A, de tal manera que los espermatozoides tienen mas medio
Buffer y energtico, mientras se realiza la evaluacin seminal. Una vez conocida la calidad y
cantidad seminal se determina el nmero de dosis de inseminacin de acuerdo a la siguiente
formula:
N de dosis I.A. = Vol. Eyaculado (cc) X Conc. Esperm. (x 106 /cc)X Motilidad (%)
N espermatozoides por dosis de I.A.
Donde:
N espermatozoides por dosis de I.A. = 25 x 106 espermatozoides mtiles
Volumen de dosis de I.A.

= 0.2 cc cada pellets.

Al resultado obtenido del numero de dosis multiplicado por el volumen de cada pellets o
pastilla se le reduce el volumen del eyaculado y este valor representa el volumen de dilutor agregar,
pero debido a que el dilutor esta fraccionado en dos soluciones A y B, se agrega la mitad de cada
uno.
Se aade la solucin A restante, ya que se agrego al eyaculado como pre-dilucin en igual
volumen previamente, siempre cuidando que la solucin y el semen estn a la misma temperatura
en bao mara (32 C). Inmediatamente se inicia el descenso de temperatura gradual y controlada a
2 C por cada 3 minutos, hasta llegar a 5 C, el cual requiere de 35 a 40 minutos. Luego se le
agrega solucin B fraccionada en tres partes a intervalos de 10 minutos, y se contina la fase de
equilibramiento o estabilizacin por un espacio de 45 a 60 minutos siguientes manteniendo al semen
en heladera a 5 C.
Congelamiento de semen
Para el congelamiento de semen en pastillas es necesario contar con un bloque de hielo
seco (- 79 C) de superficie lisa. Se prepararon agujeros de capacidad aproximada 0,2 ml (aprox.),
en estos se dosifica 0,2 ml semen equilibrado (5 C) y se deja por 2 a 3 minutos y se va observando

el cambio de estado (liquido a slido), luego se vierte el contenido de los agujeros (pellets o pastillas)
directamente a recipientes conteniendo nitrgeno liquido (-196 C). El almacenamiento se realiz en
goblets debidamente identificados en un tanque criognico.
La evaluacin de motilidad espermtica, durante el procesamiento de semen: 1) despus de
agregar la solucin A, 2) despus de agregar la solucin B, 3) alcanzado el equilibrio; y, 4)
descongelando un pellets de semen congelado en nitrgeno liquido, es muy importante para ver la
viabilidad y sobrevivencia de los espermatozoides al cambio de medio y temperatura.
Descongelamiento de pellets o pastillas
La pastillas se descongela en un tubo de ensayo de vidrio seco, agitando en un bao de agua
a 38 C, hasta que cambie de estado solid a liquido (30 a 60 segundos), luego de la cual debemos
pasarlos a bao maria a 32 a 33 C.
III. Resultados y Discusin
A.

Caractersticas del semen fresco

Esta evaluacin se realizo inmediatamente a la coleccin de semen.
Tabla 1: Caractersticas del semen de carneros de diferentes razas, procesados para
criopreservacin

B)

Raza de ovino

Regin de Per

(n)

Volumen de
eyaculado (cc)

Concent. Esperm.
(millones)

Motilidad masal
(0 a 5)

Black Belly
Assaf
Asblack
Corriedale
Merino

Costa
Costa
Costa
Sierra
Sierra

1,1

2970

4,3

1
1
2
1

1,4
1,2
1,1
0,8

3000
3000
2950
2800

5,0
4,0
4,5
4,0

Viabilidad del semen congelado

La metodologa de procesamiento de semen congelado empleada fue utilizada por Evans y

Maxwell (1987) y Cueto et al,. (1993), los resultados se muestran en la siguientes tablas.

Tabla 2: Motilidad individual y progresiva (%) del semen congelado de carneros de diferentes razas
65,0
% de Motilidad

60,0

60,0

57,8

57,0

55,0

55,0

55,0
50,0
45,0
40,0
35,0
M
er
in
o

C
or
rie
da
le

A
sb
la
ck

A
ss
af

B
la
ck

B
el
ly

30,0

Tabla 3: Motilidad individual y progresiva (%) del semen congelado de carneros en costa o sierra.
60,0

58,3
56,7

%deMotilidad

55,0
50,0
45,0
40,0
35,0
30,0
Costa

Sierra

La motilidad individual y progresiva obtenida al descongelar el semen de los carneros de las

diferentes razas fue mayor a 55%. Adems, la respuesta fue similar (entre razas) utilizando el dilutor
tris-glucosa-glicerina y como tcnica de congelamiento el mtodo rpido utilizando hielo seco. El
porcentaje de motilidad fue superior a la obtenida por Quispe et al. (1998) y Quinn et al. (1968)
quienes reportan 36,9% de motilidad 37,0% de motilidad individual y progresiva, para el semen
congelado utilizando tris-yema-glicerina, respectivamente. Y alcanzo la motilidad similar a resultados
obtenidos por Garca et al., (1992) y Cueto et al., (1993).
El uso de 20 millones de espermatozoides por inseminacin artificial va Laparascpica,
permite el uso mas intensivo del macho 400% superior al uso bajo una inseminacin vaginal o
cervical con semen fresco diluido.

IV Recomendaciones

Realizar la siguiente fase de la investigacin, la cual consiste en realizar una prueba de

fertilidad en campo inseminando ovejas por la tcnica de laparascpica.

Concienciar a los ganaderos que poseen excelentes reproductores, para aplicar la metodologa
de congelamiento de semen, con el fin de preservar el material gentico por ms tiempo y para
difundirlos a zonas ms distantes.

Los criadores de ovinos debern organizarse con el fin de almacenar, mantener (Banco
Gentico) y comercializar las dosis de los excelentes reproductores.

Adems se debe iniciar la prueba de progenie de los carneros, usados en inseminacin artificial.

VI. Revisin bibliogrfica

1. Cueto, M.; Garca Vinent, J.; Gibbons, A.; Wolff, M. y Arrigo, J. (1993) Obtencin,
procesamiento y conservacin del semen ovino. Manual de divulgacin. Comunicacin Tcnica de
Produccin Animal del INTA Bariloche N 200.
2. Evans, G. y Maxwell, W. (1987) Salomons artificial insemination of sheep and goats. Ed. Sidney,
Butterworths. pp. 185.
3. Garca Vinent, J.; Gonzlez, R.; Cueto, M. y Gibbons, A. (1992) Efecto de la inseminacin
artificial intrauterina con dos concentraciones de semen congelado, celo natural y sincronizado,
sobre la fertilidad en ovejas merino australiano. Manual de divulgacin. Comunicacin Tcnica de
Produccin Animal del INTA Bariloche N 187.
4. Maxwell, W.; Curnock, R.; Logue, D. and Reed, H. (1980). Fertility of ewes following artificial
insemination with semen frozen in pellets or straws, a preliminary report.. Theriogenology. 14:83-89
5. Quinn P., Salamon S. and White G. (1968) The effect cold shock and deep-freezing on ram
spermatozoa collected by electrical eyaculation and by an artificial vagina. Aus. H. science. 19;119
6. Salamon S and Lightfoot RJ (1970) Fertility of ram spermatozoa frozen by the pellet method. II.
The effects of method of insemination on fertilization and embryonic mortality. J Reprod Fertil,
Aug 1970; 22: 399 - 408.
7. Vivanco M., H. (1988) Reproductive development to adulthood and effects of breed and
environment on the reproductive characteristics of rams in the central highlands of Peru. Utah State
University, Logan, Utah.