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AFPP 9me CONFRENCE INTERNATIONALE SUR LES MALADIES DES PLANTES

TOURS 8 ET 9 DCEMBRE 2009

LA PCR QUANTITATIVE : UN POTENTIEL A CREUSER POUR LA PREVISION DU


DEVELOPPEMENT DES SYMPTOMES DE SEPTORIOSE
D. GOUACHE (1), S. SELIM (2), C. ROISIN(2), J. SANSSENE (2)
(1)

ARVALIS INSTITUT DU VEGETAL


Chemin de la Petite Minire, 78280 Guyancourt, France
(2)
Institut Polytechnique LaSalle Beauvais
19 rue Pierre Waguet BP 30313 F-60026 BEAUVAIS Cedex, France
Contact : d.gouache@arvalisinstitutduvegetal.fr
RSUM
La PCR quantitative permet de quantifier le dveloppement du myclium avant apparition
des symptmes. Pour la septoriose du bl, maladie incubation longue, un tel outil semble
particulirement intressant. Il faut cependant tre capable den interprter les rsultats en
termes oprationnels. En 2007 et 2008, des cintiques de biomasse fongique ont t
obtenues sur des essais faisant lobjet dobservations de symptmes pas de temps
rgulier. Les suivis de symptmes ont permis de dterminer la date dexplosion des
symptmes. On montre quil existe une relation linaire entre le rsultat issu de la PCR
quantitative et lintervalle de temps entre la date du prlvement et la date dexplosion des
symptmes. Moyennant une amlioration de cette relation, la PCR quantitative pourrait donc
sinscrire dans des schmas davertissement ou de conseil.
Mots-cls : bl (Triticum aestivum), septoriose (Mycosphaerella graminicola), PCR
quantitative, prvision

SUMMARY
QUANTITATIVE PCR: A POTENTIALLY INTERESTING TOOL FOR PREDICTING
SYMPTOM DEVELOPMENT OF SEPTORIA TRITICI BLOTCH
Quantitative PCR allows mycelial development of a pathogen to be followed before symptom
expression. For the wheat disease septoria, which has long incubation times, this is of
particular interest. The PCR results do however need to be interpreted into a operationnal
recommendations. In 2007 and 2008, fungal biomass dynamics were followed in trials that
were also the object of regular visual disease assessments. The onset of symptom
development was thus calculated. We show that there is a linear relationship between the
PCR results and duration of the interval separating tissue sampling and disease onset. Given
an improvement of this relation, it could be used in advisory schemes.
Key words: wheat (Triticum aestivum), septoria tritici blotch (Mycosphaerella graminicola),
quantitative PCR, prediction

INTRODUCTION
En France, la septoriose, maladie fongique foliaire cause par Mycosphaerella graminicola
(anamorph Septoria tritici), est la plus dommageable sur bl tendre (Triticum aestivum),
pouvant engendrer des pertes de rendement de lordre de 50 q/ha dans les situations les
plus exposes (Jorgensen et al. 2008). Le contrle de la maladie est essentiellement bas
sur la lutte chimique. Cependant, cette lutte chimique est doublement remise en cause. Le
dveloppement de rsistances aux matires actives par le pathogne a induit des baisses
defficacit importantes (Maufras et al., 2006 ; An., 2009). De plus, la pression socitale sest
concrtise par lengagement pris lors du Grenelle de lEnvironnement de rduire lutilisation
des produits phytopharmaceutiques de 50% (An., 2007). Les modles pidmiologiques et
les outils daide la dcision permettant de caler au mieux le positionnement des traitements
afin daugmenter leur efficacit et/ou de diminuer leur nombre reprsentent des solutions
permettant de rpondre ce double enjeu (Gouache et Couleaud, 2009). Les modles
peuvent cependant tre complments par des observations afin den augmenter la fiabilit.
Cest le cas du modle de dveloppement des maladies foliaires propos par Audsley et al.
(2005), qui utilise des observations visuelles de maladie.
La septoriose est pourtant une maladie incubation longue (Lovell et al., 2004 ; ViljanenRollinson et al., 2005) avec des valeurs rapportes allant de 11 37 jours. Lobservation des
symptmes une date donne ne fournit donc pas dinformations sur le dveloppement de
lpidmie dans les 11 37 jours prcdant lobservation. Pourtant, la quantification par
Polymerase Chain Reaction (PCR) existe sur septoriose (Fraaije et al., 2001 ; Guo et al.,
2006) et permet de quantifier de manire prsymptomatique le champignon, fournissant de
bonnes relations entre avec dautres variables quantifiant le niveau de maladie (nombre de
lsions, nombre de pycnides, surface symptomatiques). Cet outil a t utilis pour caractriser
tudier lefficacit des fongicides (Guo et al., 2007), les rsistances varitales (Fraaije et al.,
2001), les progressions pidmiques (Fraaije et al., 2002) et la rsistance aux fongicides
(Fraaije et al., 2005). Cependant, la valeur prvisionnelle dun tel outil a jusqu maintenant t
peu explore. On a donc cherch relier le dveloppement de symptmes celui de la
biomasse myclienne caractrise par PCR quantitative dans le cas de linteraction bl tendre
Septoria tritici.
MATERIEL ET MTHODE
METHODOLOGIE DE QUANTIFICATION
Le traitement des chantillons et lextraction dADN a t ralise selon le protocole dcrit
dans Selim (2009). Lamplification du gne de tubuline (GenBank accession no.
AY547264) ciblant un fragment de 63 paires de bases, selon une mthodologie drive de
Bearchell et al. (2005), utilisant 0.3 M de chaque amorce, 0.2 M de sonde TaqMan et 200
ng dADN. Chaque raction (volume total 25 l) contenait 1 volume de PCR master mix
(Applied Biosystems, USA). Les conditions damplification taient les suivantes : 10 min
95C, suivies de 40 cycles de 15 s 95C et dune min 60C. ralises avec un appareil de
type ABI PRISM 7300 sequence detection system (Applied Biosystems, USA).
CONDUITE DES EXPERIMENTATIONS
Des prlvements ont t raliss sur deux types dessais implants en 2007 et 2008 sur le
site de Villiers-le-Bacle (91). Ces essais sont dcrits dans le tableau I. Deux dentre eux
(2007-D et 2008-D) ont t dcrits dans Gouache et Robert (2009) et tudiaient diffrentes
varits. Le dernier concernait la varit Soissons, cultive deux niveaux dazote, dose X
et dose X-50 kg N/ha, X tant la dose prvisionnelle calcule par la mthode des bilans. Les
essais taient conduits en trait et non-trait fongicides, et pour le reste de la conduite selon
les standards locaux. On ne traitera ici que des parcelles non-traites.

Tableau I : Caractristiques des essais


Essai

Anne de
rcolte

2007-D

2007

2008-D

2008

2008-F

2008

Modalits prleves
Charger, Paledor, Royssac,
Toisondor
Dinosor, Toisondor
Soissons dose X, Soissons
dose X-50

Date de
semis

Dates de
prlvement

Organes
prlevs

Nombre de
notations maladie

09/10/2006

04/05, 04/06

F1, F2, F3

19/10/2007

08/04, 15/04,
21/04, 29/04,
05/05, 13/05,
21/05, 02/06,
09/06, 17/06,
23/06, 30/06

12/11/2007

6
F1, F4

PROTOCOLE DE PRELEVEMENT
Pour chaque parcelle et chaque tage foliaire, un prlvement est constitu de 20 feuilles
chantillonnes le long dun transect de la parcelle en vitant les rangs de bordure.
Lhumidit rsiduelle a t enleve par tamponnage avec papier absorbant. Les chantillons
ont ensuite t expdis au laboratoire de Lasalle-Beauvais en service 24 heures.
ANALYSE ET TRAITEMENT DES DONNEES
Toutes les analyses ont t ralises laide du logiciel statistique R (R Development Core
Team, 2007). Les analyses ROC (Receiver-Operator Characteristic) ont t ralises avec la
bibliothque de fonctions ROCR (Sing et al., 2007). Lanalyse des cintiques de progression
de symptmes a t ralise par ajustement de courbes de Gompertz selon la mthodologie
dcrite dans Gouache et Robert (2009).

RESULTATS
RELATION DIRECTE NOMBRE DE COPIES DADN ET SYMPTOMES
A la lecture de la figure 1a, qui reprsente la relation
entre le nombre de copies dADN et les surfaces
ncroses, il apparat que la prsence de symptmes
est lie au dpassement dun seuil de nombre de
copies dADN compris entre 101 et 102. Une analyse en
courbe ROC (Hughes et al., 1999) des donnes met
effectivement en avant le fait que le nombre de copies
est un trs bon indicateur de prsence/absence de
symptmes : en effet, la courbe sloigne fortement de
la bissectrice, et laire sous la courbe (Area Under the
Curve, AUC) sapproche trs fortement de 1 (figure
1b).

Figure 1 : Analyse de la relation entre rsultats de PCR


quantitative et surfaces ncroses. Analysis of the
relationship between quantitative PCR and necrtoic
area (a) Surfaces ncroses en fonction du nombre de
copies dADN (chelle logarithmique). Necrotic area
explained by number of DNA copies (log scale).
(b) Courbe ROC analysant lefficacit du nombre de
copies dADN comme indicateur de prsence/absence
de symptmes. ROC curve analysis of number of DNA
copies as an indicator of presence/absence of
symptoms.

(a)

RELATION ENTRE CINETIQUES DE NOMBRE DE COPIES


(b)
DADN ET DE SYMPTOMES
Pour approfondir le lien entre niveau de symptmes et rsultat de la PCR quantitative, on a
ajust une courbe de Gompertz chaque courbe dvolution de symptmes sur chaque
tage foliaire prlev au cours des essais. Cela a permis de caractriser chaque fois le
paramtre de position de la cintique de dveloppement des symptmes : il sagit du t90 qui
reprsente la date laquelle 10% de symptmes ncrotiques sont apparus sur ltage
foliaire (Gouache et Robert, 2009). On considre que ce paramtre indique le moment du
dcollage de la maladie sur ltage foliaire tudi. On a ensuite reprsent lvolution des
quantits dADN en fonction des sommes de tempratures partir de diffrentes origines : le
semis, la date dmergence de ltage foliaire tudi, et la date correspondant au dcollage
de la maladie sur ltage foliaire tudi (Figure 2a). On observe que le calage des sommes
de temprature en fonction de la date de dcollage de la maladie permet de regrouper les
points en une cintique. Ainsi, on peut considrer, en inversant les axes, que le nombre de
copies dADN est une variable explicative et que le temps entre la date du prlvement et la
date dexplosion de la maladie est la variable prdire (Figure 2b). Il apparat donc possible
de prvoir par le biais dune quantification dADN fongique le dveloppement ultrieur du
champignon. La rgression correspondante est hautement significative (p<10-16) et affiche un
R2 de 0.90. Cependant, un bruit persiste, lerreur quadratique moyenne tant de 78.54 C.

Figure 2 : (a) Cintique de nombre de copies dADN (chelle logarithmique) en fonction de


sommes de tempratures exprimes en fonction de diffrentes origines pour les essais de
lanne 2008. Evoluation of the number of DNA copies (log scale) over thermal time from
various origins (from bottom to top: from sowing, from leaf emergence, from symptom
explosion) for 2008 trials. (b) Utilisation du nombre de copies dADN comme variable
prdictive du temps entre la date du prlvement et lexplosion de la maladie. Use of the
number of DNA copies as a predictor of the time from sampling to symptom explosion, as
caracterized by t90.
Nous avons ralis essai par essai des sries danalyses de covariance pour apprhender
lorigine de la variabilit autour de cette relation (Tableau I). On remarque qu lexception de
lessai 2008-D, il ny a pas deffets dinteraction significatifs avec le nombre de copies.
Cependant, sur cet essai, cet effet est peut tre relier une lgre attaque de rouille jaune
mal matrise qui a pu perturber la quantification visuelle des symptmes. On note quil ny a
pas non plus deffet de la conduite azot sur cette relation. Leffet varit apparat par contre
dans tous les cas sauf un significatif au seuil de 5%. Il semble galement y avoir un effet
tage foliaire, mais celui-ci semble moins net. La pente de la relation tudie apparat donc
comme plutt stable, et le bruit observ autour de celle-ci comme tant du des effets de la
varit ou de ltage foliaire.

Tabelau I : Rsultats des analyses de covariance : niveau des significativit des effets des
modalits testes (varit ou azote) et de ltage foliaire sur la relation entre nombre de
copies dADN et dlai jusqu lexplosion des symptmes. Leffet du nombre de copies, nonreprsent, est systmatiquement hautement significatif. Results of covariance analyses :
level of significancy of the experimental factors (cultivar or nitrogen) and leaf layer on the
relation between the number of DNA copies and time to symptom explosion.
Essais 2007 D et 2008 - D
Interaction
Interaction
tage
varit
foliaire nombre de
varit
copies

Effet
test

Varit

Etage
foliaire

2007D
2007D sans
F3
2008D
2008D sans
F4

5.2*10-4

non test

0.18

non test

0.0035

non
test
0.054

Interaction
tage
foliaire
varit
nombre
de copies
non test

0.49

0.24

0.38

0.38

1.4*10-6

0.19

0.0029

0.57

0.17

0.031

0.062

non
test

non test

0.10

non test

non test

Effet
test

Azote

Etage
foliaire

2008 - 0.81
F

8.5*10-5

Essai 2008 - F
Interaction
Interaction
tage
azote
foliaire nombre de
varit
copies

0.69

0.56

Interaction
tage
foliaire
nombre de
copies

Interaction
tage
foliaire
nombre de
copies
0.38

Interaction
tage
foliaire
varit
nombre
de copies
0.75

DISCUSSION
La PCR quantitative applique aux pathognes permet den quantifier le niveau in planta
avant mme lexpression de symptmes visibles. Sur septoriose, cet outil a t dploy dans
de nombreuses tudes, dmontrant son intrt pour ltude des rsistances varitales
(Fraaije et al., 2001), de lefficacit des fongicides (Guo et al., 2007) et des rsistances des
pathognes (Fraaije et al., 2001) ceux-ci, et des progressions pidmiques dans des
couverts aux architectures diffrencies (Fraaije et al., 2002). La quantification
prsymptomatique dun pathogne offre aussi un potentiel pour amliorer le dploiement de
mthodes de lutte, mais comme lont soulign Lockley et al. (1996), cela implique de pouvoir
relier de manire robuste la mesure ralise au dveloppement ultrieur du pathogne, puis
de relier ce dveloppement une action par le biais de rgles de dcision. Des expriences
existent avec dautres outils de quantification prsymptomatique, comme limmunodiagnostic,
pour dclencher des interventions fongicides. Kendall et al. (1998) ont par exemple tabli un
seuil de dclenchement du 2me traitement anti-septoriose avec ce type doutil. Cependant, ces
schmas sont limits car ce type de diagnostic ne permet pas de projection dans lavenir.
On a montr que la quantit dADN mesure par PCR quantitative pouvait effectivement tre
relie aux niveaux de symptmes, premirement en tant quindicateur de prsence/absence,
mais surtout en tant quoutil de prdiction du dveloppement ultrieur des symptmes. Cela
correspond bien aux observations ralises par Kema et al. (1996) dcrivant le
dveloppement du myclium dans la feuille comme trs lent pendant une longue phase puis

acclrant trs fortement peu avant lapparition des symptmes : lapparition des symptmes
et le dveloppement de la biomasse du myclium semblent trs lis. Ltude de la relation
entre quantit de myclium (value par PCR quantitative) et temps (en degr-jours base 0
C) restant entre la date du prlvement et la date dexplosion des symptmes a cependant
montr quil existe des effets non encore pris en compte. La pente de la relation est apparue
comme plutt stable, mais cela demanderait dtre vrifi sur un plus grand nombre de
situations, et en particulier de varits connues pour leur rsistance quantitative. On a pu
constater un effet de la varit et un effet de ltage foliaire sur cette relation. Le peu deffet
constat sur la pente de la relation semble exclure lhypothse dune diffrence de vitesse de
croissance myclienne pour expliquer cet effet. Ces effets demandent donc tre creuss.
Rohel et al. (2002) dans un travail sur lefficacit des matires actives ont signal la difficult
de relier dveloppement de la biomasse myclienne estime par PCR quantitative au
dveloppement ultrieur des symptmes. Une analyse prliminaire des donnes prsentes
dans cet article avec la mthode prsente ici laisse penser quun effet des traitements
fongicides existe sur cette relation, en interaction avec ltage foliaire. Cependant, la
sensibilit de la mthodologie de quantification ntant pas la mme, il est difficile de tirer
une conclusion.
On montre dans cette tude que la PCR quantitative semble pouvoir tre un prdicteur
robuste des futurs symptmes de septoriose. Ceci est particulirement intressant dans le
cas de la septoriose, pathogne temps de latence lev, pouvant dpass 4 semaines,
(Lovell et al., 2004 ; Viljanen-Rollinson et al., 2005). En effet, une observation visuelle ne
permet pas dapprhender lensemble des contaminations ayant eu lieu moins dune latence
auparavant, contrairement cet outil, qui, selon sa sensibilit, permet dobtenir une
quantification 2 3 semaines avant apparition des symptmes. La capacit prdictive de la
PCR quantitative ouvre ainsi une porte son utilisation dans des schmas de conseil ou daide
la dcision. Lutilisation dobservations visuelles de symptmes peut permettre dajuster au
mieux aux conditions parcellaires un modle pidmiologique (Audsley et al., 2005). Ces
modles peuvent leur tour tre utiliss pour fournir un conseil technique, de dcision de
traitement par exemple (Gouache et Couleaud, 2009). On peut par le biais de la relation tudie
ici envisager de remplacer lobservation visuelle par une mesure de PCR quantitative, qui
apporterait ainsi 2 3 semaines dinformations supplmentaires. Lassimilation de donnes
dans les modles de fonctionnement (Naud et al., 2009) pourrait tre une piste pour mettre cela
en oeuvre.
CONCLUSION
On montre lintrt de la PCR quantitative comme outil permettant une prdiction robuste du
dveloppement ultrieur des symptmes de septoriose. Une meilleure comprhension des
effets des varits et des fongicides, sur cette relation apparat cependant ncessaire. Dans le
cadre de la prvision, toute amlioration de la sensibilit des mthodes de quantification par
PCR pour des faibles quantits de pathogne serait trs intressante. Lintgration de cet outil
dans des schmas de conseil par le biais de modles pidmiologiques semble donc possible.
REMERCIEMENTS
Ce travail a t ralis dans le cadre de lUMT (Unit Mixte Technologique) Pivert. Il a t
soutenu par le projet Casdar (Compte dAffectation Spciale pour le Dveloppement Agricole et
Rural) n 6128 Gestion des fongicides et insectic ides sur bl et colza : suivi des phnomnes
de rsistances, et dveloppement doutils daide au raisonnement des traitements fongicides
en grandes cultures, afin de limiter le recours la lutte chimique et de prserver l'efficacit des
substances actives. La poursuite du travail est en cours avec lappui du FSOV (Fonds de
Soutien lObtention Vgtale dans le cadre du projet intitul Evaluation de la rsistance
du bl la septoriose provoque par Mycosphaerella graminicola .
Les auteurs tiennent remercier lensemble des quipes techniques de La Minire qui ont
permis dobtenir les donnes. Anne-Sophie Rabetsarazaka est remercie pour son appui

technique et lanalyse prliminaire des donnes de 2008. Florent Duyme est remerci pour son
appui statistique.
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