TPICOS DE CIENCIAS SOCIALES, ARTES Y HUMANIDADES

RESULTADOS:

GENERACION
DE
UN
BANCO
DE
CLULAS
COMPETENTES Y PRODUCTRAS DE PLSMIDOS.

BACTERIANAS

Fotografa 1. La absorbancia obtenida fue la

adecuada para iniciar el protocolo de clulas
competentes, las condiciones para la
conservacin a ultra congelacin de las
clulas bacterianas fueron: equipo 1 CaCl2/
glicerol siendo las condiciones ptimas,
equipo 2 CaCl2/NaCl, equipo 3 NaCl/Glicerol
y equipo 4 NaCl2/NaCl
Fotografa 2. Se
presentan
8
cajas de medio
LB, solo en una
se
registr
crecimiento
(caja con medio
LB
con
Kanamicina
perteneciente al
equipo 1)

1|
Equipo 4

6A

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TRANSFORMACION DE CLULAS COMPETENTES Y SELECCIN

DE CLONES POSITIVOS

NOTA: Para realizar esta prctica se tomaron clulas competentes del 6 B

Fotografa 3. Colonias de clulas

competentes
transformadas
pVAX1/EGFP en medio LB con
kanamicina

NOTA: se obtuvieron 2 cajas con

medio LB con Kanamicina y 24
clonas en total. Las clonas de la
13 a la 24 se donaron al grupo
6B

Fotografa 4. Caja de medio LB

con kanamicina, presenta el
aislado las clonas positivas con
el plsmido en su interior

Se present crecimiento en medio LB

con kanamicina, el cual se identifican 11
clonas positivas (1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11 y 12) conteniendo el plsmido
pVAX1/EGFP, el cual les otorgo la
capacidad de resistencia a la kanamicina
permitindoles crecer adecuadamente;
estas clonas crecieron en toda la zona
donde se aislaron, siendo blancas y
cremosas.
2|
Equipo 4

6A

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CONSTRUCCIN MOLECULAR, PURIFICACIN Y EVALUACIN DE

PLASMIDOS
Purificacin del plsmido

Fotografa 5. En dos microtubos se

tomaron 1ml de cultivo de la clona
8 y 9, centrifugndose 1min a
12000rpm

Fotografa 8. Se agreg 150L de

solucin lll a los microtubos, a los
5min de incubacin se pudo
observar la precipitacin de las
protenas y el DNA cromosmico,
siendo ms evidente en la clona 8
(tubo izquierdo) que en la 9 (tubo
derecho)
3|

Fotografa 6. Se descart el
sobrenadante y se resuspendi el
botn celular final de cada
microtubo con 150L de solucin l

Fotografa 7. Se agreg 150L de

solucin ll recin preparada e
incubo 5min los microtubos con las
clonas 8 y 9 con solucin la
solucin 1
Equipo 4

6A

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Fotografa 9. Se centrifugaron los

microtubos 5min a 11000rpm y se
recuper el sobrenadante sin llevar
residuos slidos a microtubos
estriles y limpios

Fotografa 10. Se agreg al

sobrenadante recuperado 1mL de
etanol abs, se incubo 6 min y
centrifugo a 11000rpm por 10min
eliminando el sobrenadante por
aspiracin con micropipeta

Fotografa 11. Se lav por repetido el botn con etanol al

70% y se centrifugo a 11000rpm 5 min, se decant el
sobrenadante y se dej secar en papel secante por 15min
hasta evaporar el etanol. Se resuspendi en DNA plasmdico
en 30L de agua MiliQ estril y almaceno a -20C para su
posterior utilizacin

4|
Equipo 4

6A

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Cuantificacin de DNA plasmdico

NOTA: se us un NanoDrop para obtener los resultados, ya que un
espectrofotmetro no era capaz de leer cantidades tan pequeas
Tabla 1 cuantificacin del ADN plasmdico

Clona

D.O. 260 nm

D.O. 280 nm

D.O. 230 nm

Pureza
260/280

Pureza
260/230

77.85

37.34

3892.8

2.09

2.39

128.158

62.382

6407.9

2.025

2.33

30.598

18.982

1529.9

1.61

2.43

17.352

9.333

867.6

1.86

1.40

221.571

104.738

11078.6

2.12

2.34

138.083

68.754

6804.1

2.01

2.25

95.821

46.229

4781

2.07

2.35

95.973

46.039

4798.6

2.08

2.31

Relacin ADN/protenas: 260nm/280nm, los valores ptimos son de ~1.8 2.0

Relacin ADN/sales: 260nm/230nm, los valores ptimos son de 0.3 0.6
Tabla 2 interpretacin de la informacin del ndice de pureza en las clonas

Clon
a
1

Pureza 260/280proteinas

Pureza 260/230sales

Encontramos valor de 0.09 por

encima de los valores ptimos

Encontramos valor de 0.025 por

encima de los valores ptimos

Encontramos valor ptimo dentro

del rango aproximado, teniendo un
valor de pureza adecuado en la
clona

Muestra valor de 2.33 por encima

del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona
Muestra valor de 2.27 por encima
del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona
Muestra valor de 2.40 por encima
del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona

5|
Equipo 4

6A

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5
Muestra valor de 1.34 por encima
del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona, sin embargo fue
el que tubo menor cantidad de
todas las clonas
6
Encontramos valor de 0.12 por
Muestra valor de 2.28 por encima
encima de los valores ptimos
del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona
7
Encontramos valor de 0.01 por
Muestra valor de 2.19 por encima
encima de los valores ptimos,
del valor mximo optimo, se
aun as se encuentra cerca de los encuentra grandes cantidades de
valores ptimos
sales en la clona
8
Encontramos valor de 0.07 por
Muestra valor de 2.29 por encima
encima de los valores ptimos
del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona
9
Encontramos valor de 0.08 por
Muestra valor de 2.25 por encima
encima de los valores ptimos
del valor mximo optimo, se
encuentra grandes cantidades de
sales en la clona
Los datos obtenidos no son del todo confiables al presentar
contaminacin por sales y protenas, sus niveles de pureza son muy bajos
segn lo calculado
Encontramos valor ptimo dentro
del rango aproximado, teniendo un
valor de pureza adecuado en la
clona

Ensayo de restriccin
NOTA: se llev a cabo con el protocolo para la enzima de restriccin Kpn1

6|

Imagen 1. Se llev acabo el protocolo de la

enzima de restriccin Kpn1, se hicieron los
clculos para 4.5 reacciones Agua MiliQ:
(12l)(4.5l)=54l. 10x Buffer Kpn1: (2l)
(4.5l)=9l Plsmido original 6B: (5l)
Fotografa 12. Se descongelo el ADN
(4.5l)=22.5l Kpn1: (1l)(4.5l)= 4.5l
plasmdico purificado, conservndose en
hielo frapp
NOTA: Para ms de una reaccin con la
misma enzima, preparar un cocktail,
adicionando 0.5l de cada reactivo
Equipo 4 6A

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Fotografa 13. Se agrega

9l 10x Buffer Kpn1

Fotografa 12. Se agrega

54L Agua MiliQ

Fotografa
Fotografa 14.
15. Se
Se agrega
agrega
22.5l
Plsmido
original
6B
4.5L Kpn1

7|
Equipo
Fotografa
16.4Se6A
dejaron
incubar a 37C por 1hr

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Fotografa 17. Se llevaron

los microtubos a bao mara
a 65C para la inactivacin
de la enzima y de esta
manera evitar una digestin
en exceso.

Posteriormente
se
mantuvieron en hielo frapp
para
su
posterior
almacenado a -20C hasta
usarlas de nuevo

ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA AL 0.8% DE LOS PLSMIDOS

DIGERIDOS

Digestin de Pvax1 EGFP con Xho I Laboratorio 10

8|
Equipo 4

6A

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Sper
enrollamiento

plsmido

Mapeo de electroforesis
1. Mw

6. Clona 7 xho1

2. plasmido original

7. Clona 8 xho1

3. clona 4 xho1

8. Clona 9 xho1

4. clona 5 xho1
5. clona 6 xho 1

Observacin: slo encontramos el plsmido linealizado en el fondo y sper

enrollamientos en la parte de arriba

9|
Equipo 4

6A

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3761 pb

Banda ms cercana a
3761 pb dando

Numero de pozo
1.-1Kb

2.- E4 3.-E8 4.-E7

5.-E6

6.- E5 7.-E9

Se puede identificar en el pozo 4 que la clona 7 es la ms cercana a 3761 pb

por lo que podemos decir que es nuestra posible clona positiva que contiene
nuestro Pvax1/EGFP

10 |
Equipo 4

6A

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Gel

de
agarosa al 0.8% de los plsmidos laboratorio 10

3761 pb
Plsmido sin digerir, sper
enrollamientos

3000 pb

761 pb

Plsmido Pvax1

Nuestro gen EGFP

Mapa de carga
1. Mw
2. Pvax1-EGFP / EcoR1
3. Clona 7 / EcoR1
4. vaco
5. Pvax1 Equipo 1 / doble dig acetatos
6. Pvax1 Equipo 2 / doble dig acetatos
7. Pvax1 Equipo 3 / doble dig butanol
8. Pvax1 Equipo 4 / doble dig butanol

Observaciones: protocolo con acetatos no se lleg a reconocer el botn,

mientras que con utilizando el protocolo con butanol se encontr el botn o sea
el fragmento recuperado, lo cual lo hace el ms rentable en este procedimiento.
No se logr distinguir los fragmentos pertenecientes al plsmido EGFP
mientras que se reconoce a 3000 pb lo que es nuestro plsmido Pvax1 y en la
parte de arriba dos bandas sin digerir o sper enrolladas, hasta el fondo se
encuentra a 761pb nuestro gen pudindolo identificar detectando su presencia.
11 |
Equipo 4

6A

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LIGACIN DE FRAGMENTOS DE ADN

Ligacin

NOTA: slo el segundo y tercer pozo pertenecen a nuestros plsmidos,

los dems son externos
Mapa de carga
1. Mw
2. plsmido sin digerir temp ambiente
3. plsmido digerido 37C

12 |
Equipo 4

6A