Buscar la tcnica de la Nigrosina

Tincin simple negativa: Nigrosina se trata de un colorante aninico, que no penetra en el

interior celular. Proporciona una visin de la forma y el tamao ceulares al observarse los
microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro.
Colorantes:
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Solucin acuosa de Nigrosinna:

Nigrosina 10 g
Agua destilada 100 ml
Fuchsina bsica fenicada de Zielh

Procedimiento:
1. Colocar una gota de Nigrosina sobre uno de los extremos del portaobjetos.
2. Extender la muestra en la gota con el asa de siembra.
3. Realizar un frotis: con un segundo portaobjetos se extiende la muestra de modo
que cubra toda la superficie del primero.
4. Secar al aire.
5. Observar en 40 y 100x.
Procedimiento:
1. Preparar una extensin seca y fijada por calor.
2. Teir con Fuchsina diluida (cubrir el porta con agua y aadir 3-4 gotas del
colorante)
3. Lavar con agua y secar
4. Colocar una gota de Nigrosina en el extremo del porta y con la ayuda de un
portaobjetos con bordes biselados, extender una capa muy fina de Nigrosina sobre
la extensin.
5. Secar al aire (la Nigrosina se cuartea con el calor)
Buscar la coloracin de cido Perydico de Schiff: PAS
En la tcnica de Pas se utiliza cido perydico de Schiff, colorante con gran afinidad por
mucopolisacridos y en consecuencia elegible para membranas fngicas, que se
observan de color rojo en un fondo verde.
Preparacin de ractivos:
1. cido peryodico al 0.5%:
0,5 gr de cido peryodico
100 ml de agua destilada.
2. Reactivo de Schiff:
Llevar hasta ebullicin el agua destilada.
Tomar 200 ml de agua destilada.
Agregar 1 gr de Fucsina bsica.
Mezclar.
Dejar enfriar a 50C y filtrar.

Aadir 1 gr de metabisulfito de sodio.

Dejar en reposo 24 horas, en un frasco oscuro. En esta fase la solucin deber
tomar un color rosa plido.
Agregar 4 gr de carbn activado.
Envasar y guardar a 4C.
3. Bao de cido Sulfuroso:
5ml de cido clorhdrico 1 N.
6ml de Metabisulfito sdico 10%.
100 ml de agua destilada.
4. Colorante de contraste:
Hematoxilina de Harris.
Tcnica:
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9.

Desparafinar e hidratar.
Adicionar cido peryodico al 0,5% 5 minutos.
Lavar con agua destilada.
Agregar el reactivo de Schiff: 15-30 minutos.
Aclarar en 3 baos de agua sulfurosa 2 min. Cada uno.
Lavar en agua corriente 5 minutos.
Sumergir en hematoxilina de Harris de 30 a 60 segundos.
Lavar con agua corriente durante 5 minutos.
Deshidratar, aclarar y montar.

Resultados:
Compuestos PAS positivo: rojo oscuro a magenta.
Compuestos PAS negativos: los mucopolisacaridos cidos no pueden ser oxidados por el
cido peryodico y por eso son PAS negativos.
Buscar la coloracin de Metenamina de plata (Gomori-Grocott)
La impregnacin argntica con nitrato metenamina de plata colorea intensamente de
negro las paredes del hongo, no as las fibras reticulares.
Preparacin de la muestra: El tejido debe ser fijado en formol para mejores resultados, y
seccionado a 5 micras.
Reactivos:
1. Solucin de cido brico (solucin A):
1. 3,09 g de cido brico.
2. 250 cc de agua destilada.
2. Solucin de tetraborato sdico (solucin B):
1. 4,77 g de tetraborato sdico.

2. 250 cc de agua destilada.

3. Solucin buffer borato (comprobar que el pH sea 8.2)
1. 13 cc de solucin A.
2. 7 cc de solucin B.
4. Solucin de plata metanamina:
1. 42,5 cc de metanamina (hexametilentetranamina) 3%.
2. 2,5 cc de nitrato de plata 5%.
3. 12 cc de buffer borato (pH 8.2).
Procedimiento:
Debe evitarse, durante todo el proceso, el uso de instrumentos metlicos, ya que la plata
precipitara sobre ellos.
1. Desparafinar e hidratar.
2. Aadir cido perydico 0,5%, 12 minutos.
3. Lavar con agua destilada.
4. Sumergir los cortes en la solucin de plata metanamina, 1 hora mnimo a 60 C; a
partir de este tiempo comprobar regularmente al microscopio.
5. Lavar con agua destilada.
6. Aadir cloruro de oro, 1 minuto.
7. Lavar con agua destilada.
8. Aadir tiosulfato sdico 3%, 1-2 minutos.
9. Lavar con agua corriente.
10. Tincin de contraste (rojo nuclear, hematoxilina, verde luz...), 1 minuto.
11. Deshidratar, aclarar, montar.
Resultados:
Reticulina, membranas basales, hongos, mucinas, glucgeno: negro.
Fondo: segn tincin de contraste.
Ncleos: marrn oscuro a negro
Buscar la coloracin de Hematoxilina-Eosina

La tincin sistemtica es hematoxilina-eosina, importante para valorar el tipo de reaccion

en los tejidos, que puede ser: congestiva con vasodilatacin, edema, exudados y
depsitos de fibrina; purulenta, con cmulos de polimorfonucleares, o ms a menudo
granulomatosa con histiocitos, clulas gigantes de tipo cuerpo extrao o de Langhans,
rodeados por linfocitos y plasmocitos.
Tcnica:
1. Sumergir los preparados histolgicos en xilol para eliminar los excesos

de parafina. El xilol es un alcohol txico pero existen reactivos (como el Hemo-D)

que ejercen la misma funcin aclarante de parafina sin la toxicidad del xilol.
2. Luego pasan por una serie de alcoholes en concentracin decreciente para

rehidratar la muestra (100, 95 y 70).

3. Se lava en agua para eliminar exceso de alcohol
4. Se sumerge en hematoxilina por 10 minutos, luego se lava en agua para eliminar

excesos y se pasa rpidamente por alcohol cido.

5. Se lava nuevamente
6. Se sumerge 30 segundos en eosina.
7. Se pasa por otra serie de alcoholes, esta vez en orden creciente (70, 95 y 100)

para deshidratar la muestra y que se pueda realizar el montaje con un pegamento

no soluble en agua.
8. Finalmente se deja remojar 10 minutos en xilol, antes de realizar el montaje final.

Resultados:
Ncleo celular: Violeta
Citoplasma: Rosa
Musculatura: Rojo , rosa o fucsia
Glbulos rojos: Rojo, anaranjado
Fibrina: Rosa
Buscar la coloracin de Gridley
Objetivo: Demostrar la presencia de hongos.
Fijador: Formol al 10%.
Corte: 4-6 micras.
Reactivos:
cido Crmico al 4%
Reactivo de Schiff de Coleman

 Solucin de Fucsina Aldehca

Amarillo de Metileno al 0.25%
Alcohol de 70*
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Oxidar con cido crmico al 4% durante 1 hora.
3. Lavar en agua.
4. Agregar reactivo de Coleman-Schiff durante 15 min.
5. Lavar en agua.
6. Lavar en alcohol 70*.
7. Aadir Fucsina Aldehca durante 30 minutos.
8. Lava en alcohol 96*.
9. Lavar en agua.
10. Agregar solucin de Amarillo de Metileno 1 minuto.
11. Lavar en agua.
12. Deshidratar, aclarar y montar.
Tcnica de la tincin de Gram
La tincin de Gram se usa para teir filamentos actinomicticos.
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Preparar un frotis.
Dejar secar y fijar al calor.
Teir con cristal violeta por un minuto.
Enjuagar con agua corriente suavemente y escurrir.
Cubrir el frotis con Yodo de Gram y dejar reposar por un minuto.
Enjuagar con agua corriente y escurrir
Decolorar con etanol al 95%. Para esto, incline el portaobjetos sobre la charola
de tincin y aada goteando el etanol, dejando que corra por todo el frotis.
Para un frotis delgado es suficiente con 10 a 20 segundos.
8 Detener la accin decolorante lavando con agua.
9 Contrastar con safranina por 20 a 30 segundos, enjuagar y dejar secar el frotis.
10 Examinar con el objetivo de inmersin.

Tincin de Ziehl-Neelsen

La tincin de Ziehl-Neelsen es til en actinomicetos; Nocardia muestra resistencia parcial

a cido y Actinomyces no es resistente.

Tcnica Hidrxido de potasio (KOH)

Disuelve rpidamente las clulas permitiendo digerir material proteico, observando con
mayor nitidez los elementos fngicos, su efecto de clarificar puede incrementarse al
calentar a la llama ligeramente la preparacin.
Adicionalmente, se pueden emplear colorantes para pigmentar la pared de los hongos
y mejorar la visualizacin.
La observacin de hifas, permite sugerir la presencia de invasin micotica.