Guia TP 2013

QUMICA BIOLGICA
GUA DE TRABAJOS PRCTICOS
Facultad de Ciencias Exactas Qumicas y Naturales

Universidad Nacional de Misiones
GUIA DE TRABAJOS
PRACTICOS
Licenciatura en Gentica
Profesorado en Biologa
Equipo Docente:
Ing. Eusebia Valdez
Ing. Nora Sosa
Ing. Daro Ferreyra
Lic. Pablo Martina
Auxiliares
Armella Sierra, Alicia B.
Galeano Mariana Beln
Villan Claudio Sebastian
AO 2013
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 1
OBTENCIN EXPERIMENTAL DEL PK
AMINOCIDOS
OBJETIVOS:
Obtencin experimental de los pK de dos aminocidos: cido asprtico y glicina, a partir
de sus correspondientes curvas de titulacin.
FUNDAMENTOS TERICOS:
El conocimiento de las propiedades cido-base de los aminocidos es sumamente
importante para la comprensin y el anlisis de las protenas.
Los aminocidos cristalizados poseen puntos de fusin relativamente elevados,
generalmente por encima de los 200C. Son mucho ms solubles en agua que en disolventes
no polares. Tales propiedades son precisamente las que deben esperarse si el retculo de las
molculas en estado cristalino est estabilizado por fuerzas electrostticas de atraccin entre
grupos con cargas opuestas, como ocurre con el elevado punto de fusin de la red cristalina de
las sales, como el cloruro de sodio.
Estos y otros datos han conducido a la conclusin de que los aminocidos se
encuentran y cristalizan a partir de las disoluciones acuosas neutras en forma de iones
dipolares:
H
R
COOH
COO-
NH3+
NH2
Forma no disociada
Forma dipolar o de ion hbrido
Cuando se disuelve en agua un in hbrido cristalizado como la alanina, puede actuar como
cido (dador de protones) o como base (aceptor de protones):
H
Como cido: CH3
H
COO-
H+
+ CH3
NH3+
H+
COO-
NH2
H
Como base:
CH3 C
NH3+
H
COO-
CH3
COOH
NH3+
QUMICA BIOLGICA
Un (-aminocido sencillo, monoamnico y monocarboxlico, por ejemplo la alanina, es

considerado como un cido dibsico cuando se halla en su forma totalmente protagonizada;
puede ceder dos protones durante su valoracin completa como una base. El curso de tal
valoracin en dos etapas con NaOH puede representarse mediante las siguientes ecuaciones,
que indican la naturaleza de las especies inicas que intervienen:
Cada etapa de la disociacin tiene un valor de pK.
El pK1 indica el valor de pH al cual se encuentran presentes concentraciones
equimoleculares del dador de protones (H3N+CHROCOOH) y del aceptor de protones
(H3N+CHROO-); el pK2 es el correspondiente valor de pH cuando se encuentran presentes
concentraciones equimoleculares de H3N+CHROO- y H2NCHROO-.
El pH al cual la molcula no posee carga elctrica neta y no se desplaza en un campo elctrico,
es el pH isoelctrico, que es la media aritmtica entre los valores de pK1 y pK2.
MATERIALES:
Equipos:
pHmetro
Reactivos:
Aspartato al 5%
Glicina al 5%
HCl 2N
NaOH 1N
DESARROLLO DEL PRCTICO:

Titulacin con cido Asprtico:
En un vaso de precipitado se colocan 50 ml de aspartato al 5% acidulado con HCl 2N.
Esta solucin se titula con NaOH 1N.
Se confecciona una tabla consignando los valores de pH obtenidos por cada volumen
de lcali agregado (volumen = 0,5 ml por vez). Con estos datos se confecciona la curva de
titulacin correspondiente, en papel milimetrado.
Titulacin con Glicina:
En un vaso de precipitado se colocan 50 ml de glicina al 5% alcalinizada con NaOH 1N.
Esta solucin se titula con HCl 2N.
Se confecciona una tabla consignando los valores de pH obtenidos por cada volumen de cido
agregado (volumen = 0,5 ml por vez). Con estos datos se confecciona la curva de titulacin
correspondiente, en papel milimetrado.
COMPLEMENTO PRCTICO N1
Consideraciones tericas
Amortiguadores: Se llaman disoluciones amortiguadoras, tampones o buffers aquellas
disoluciones cuyo pH vara muy poco cuando se le aaden cantidades moderadas de cidos o
bases fuertes. Desde el punto de vista biolgico los amortiguadores controlan el pH de las
clulas y de los diversos lquidos corporales: sangre, lquido intersticial, etc. y desde el punto
de vista del laboratorio, los amortiguadores son indispensables para controlar el pH de casi
todas las reacciones bioqumicas: cinticas, enzimticas, cultivos de rganos y tejidos.
Propiedades de los amortiguadores: Deduciendo de la ecuacin de Henderson-Hasselbalch
pH= pK+ log (sal/ cido)
QUMICA BIOLGICA
1) El pH del amortiguador depende de la naturaleza del cido dbil que lo integra. Cuando la
concentracin del cido y la sal son iguales, el pH coincide con el pK.
2) El pH depende de la proporcin sal/cido, pero no de las concentraciones absolutas; as al
aadir agua el pH no vara.
3) Prcticamente hasta que uno de los dos est prximo a agotarse la fluctuacin del pH es
mnima.
4) La capacidad amortiguadora, definida como la cantidad de cido o base que admite un
amortiguador sufriendo un cambio de pH en una unidad, es mxima en su pK
PROBLEMAS DE pK Y DE pH.
1. Calcular el pKa del cido lctico, dado que cuando la concentracin de cido lctico libre es
0,010 M y la concentracin de lactato es 0,087 M, el pH es 4,80.
2. Calcular el pH de una mezcla de cido actico 0,1 M y de acetato sdico 0,2 M. El pKa del
cido actico es 4,76.
3. Calcular la relacin de la concentracin de acetato y de cido actico requerida en un
sistema tampn a pH 5,3.
4. Propiedades de un tampn. El aminocido glicina se utiliza a menudo como principal
ingrediente de un tampn en experimentos bioqumicos. El grupo amino de la glicina que
tiene un pKa de 9,6, puede existir bien en la forma protonada (-NH3+) o bien como base libre
(-NH2) debido al equilibrio reversible:
R-NH3+
5.
6.
7.
8.
R-NH2 + H+
En qu intervalo de pH puede utilizarse la glicina como tampn eficiente debido a su grupo

amino?
En una solucin 0,1 M de glicina a pH 9,0. qu fraccin del grupo amino tiene la glicina en
la forma NH3+?
Qu cantidad de KOH 5 M debe aadirse a 1,0 L de glicina 0,1 M a pH 9,0 para elevar su
pH exactamente a 10,0?
Para que el 99% de la glicina est en su forma NH3+, cul debe ser la relacin numrica
entre el pH de la solucin y el pKa del grupo amino de la glicina?
Efecto del pH sobre la solubilidad. La naturaleza fuerte polar y formadora de puentes de
hidrgeno del agua hace que sea un disolvente excelente para las especies inicas
(cargadas). En cambio, las molculas orgnicas apolares no ionizadas, tales como el
benceno son relativamente insolubles en agua. En principio, la solubilidad en agua de todos
los cidos o bases orgnicos se puede incrementar por desprotonacin o protonacin,
respectivamente, de las molculas, para que formen una especie cargada. Por ejemplo, la
solubilidad del cido
benzoico en agua es baja. La adicin de bicarbonato sdico sube el pH de la solucin y

desprotona el cido benzoico formando el ion benzoato que es bastante soluble en agua.
9. Las molculas (a) a (c) (segunda columna) son ms solubles en solucin de NaOH 0,1 M
o en HCl 0,1 M?
QUMICA BIOLGICA
10. Tratamiento de la urticaria por veneno de hiedra. Catecoles sustituidos con grupos alquilo
de cadena larga son los componentes del veneno de hiedra y de roble que producen
urticaria caracterstica. Si estuviera sometido a la accin del veneno de hiedra, cul de los
tratamientos siguientes aplicara al rea afectada? Justifique su eleccin.
Lavar el rea con agua fra.
Lavar el rea con vinagre diluido o jugo de limn.
Lavar el rea con jabn y agua
Lavar el rea con jabn, agua y bicarbonato sdico.
11. pH y absorcin de frmacos. La aspirina es un cido dbil con un pKa de 3,5.
12. Se absorbe a la sangre a travs de las clulas que forran el estmago y el intestino
delgado. La absorcin requiere el paso a travs de la membrana celular, que viene
determinado por la polaridad de la molcula. Las molculas cargadas y muy polares pasan
lentamente mientras que las que son hidrofbicas y neutras pasan rpidamente. El pH del
jugo gstrico en el estmago es alrededor de 1,5 y el pH del contenido en el intestino
delgado es alrededor de 6 se absorbe en sangre ms aspirina del estmago o del intestino
delgado? Justifique claramente su eleccin.
13. En qu punto se presenta la glicina predominantemente en la forma H3N-CH2-CO.OH?
14. En qu punto la carga neta media de la glicina es de +1/2?
15. En qu punto esta ionizado el grupo amino en la mitad de las molculas?
16. En qu punto es el pH igual al pK del grupo carboxilo?
17. En qu punto es el pH igual al pK del grupo amino protonado?
18. En qu punto tiene la glicina su mxima capacidad tamponante?
19. En qu punto es la carga neta media igual a cero?
20. En qu punto ha sido ya completamente titulado el grupo carboxilo?
21. En qu puntos estn la mitad de los carboxilos ionizados?
22. En qu punto esta totalmente titulada la glicina?
23. En qu punto la estructura de la especie predominante es H3N+-CH2-CO.O-?
24. En qu punto las estructuras de las especies predominantes corresponden a una mezcla
50:50 de H3N+-CH2-CO.O- y H2N-CH2-CO.O-?
25. En qu punto la carga neta media de la glicina es 1?
26. En qu punto las estructuras de las especies predominantes consisten en una mezcla
50:50 de H3N+-CH2-CO.OH y H3N+-CH2-CO.O-?
27. Qu punto corresponde al punto isoelctrico?
28. En qu punto la carga neta media de la glicina es 1/2?
29. Qu punto representa el final de la titulacin?
30. Si uno quisiese utilizar la glicina como un tampn eficiente, qu puntos representaran las
peores regiones de pH para su poder tamponante?.
31. En qu punto de la titulacin la especie predominante es H2N-CH2-CO.O-?
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 2
AMINOCIDOS
CROMATOGRAFA MONO Y BIDIMENSIONAL EN PAPEL.
EFECTOS DE LAS SALES.
OBJETIVO DEL PRCTICO:
1. Separacin e identificacin de aminocidos individuales por Cromatografa
Bidimensional en papel, utilizando diferentes solventes.
2. Demostrar el efecto adverso del aumento de la concentracin de sal inorgnica
contenida en la muestra original.
FUNDAMENTO TERICO:
La separacin de una mezcla de sustancias se puede efectuar satisfactoriamente en
una direccin nica, pero en algunos casos, cuando la complejidad de la mezcla da lugar a una
incompleta separacin de los componentes en un solo disolvente, se emplea la cromatografa
bidimensional, con dos disolventes para producir una mejor resolucin de las manchas.
Los dos disolventes actan sucesivamente, en dos direcciones que forman un ngulo
recto, y el papel se seca entre las dos actuaciones.
En la Cromatografa Bidimensional, se aprovecha el comportamiento diferente de las
sustancias ante dos solventes distintos, para separar mezclas que eran inseparables en cada
uno de los solventes aislados.
Se aplica la mancha o siembra en una esquina del papel de filtro y se eluye con un
disolvente S1 en direccin ascendente, que corresponde al eje Y.
Se seca, y se lo hace girar 90 en sentido de las agujas del reloj, de modo tal que el eje
X quede en posicin vertical. Se eluye nuevamente pero esta vez con el disolvente S2, que
ascender verticalmente.
El efecto final es una mayor resolucin en virtud de:
a) El aumento de trayectoria cromatogrfica disponible.
b) Las sustancias que circulan juntas en un solvente, circulan separadas en un
segundo solvente.
El anlisis de aminocidos tiene un valor incalculable para el estudio del metabolismo.
El examen de las reacciones de las enzimas y para la determinacin de los patrones normales
caractersticos que se encuentran en sangre y orina en algunas enfermedades.
Los aminocidos o sus mezclas pueden ser analizados por cromatografa,
descendentes sobre papel.
En el caso de mezclas complejas es preferible la cromatografa bidimensional. Los RF
de los aminocidos son los mismos, acten solos o en mezcla con otros.
Las cantidades crecientes de sales inorgnicas afectan de manera adversa a la
cromatografa de aminocidos (y de otros compuestos orgnicos). Las sales producen
distorsin, as mismo, en el patrn de aminocidos de la orina. Con frecuencia, el RF de las
sustancias individuales cambia considerablemente en presencia de la sal. No es seguro que en
presencia de la sal se produzca la reaccin con la ninhidrina. La eliminacin de la sal de las
soluciones biolgicas puede llevarse a cabo fcil y completamente con resinas de intercambio
inico.
Los aminocidos Leucina, Fenilalanina, Metionina, Tirosina y Triptfano se separan
mediante los sistemas: Butanol terciario : Metiletilcetona : Agua : Dietilamina, o, Agua :
Butanol : Metanol.
Los restantes aminocidos no migran y pueden separarse con el sistema Fenol : Agua
o n-Butano : Agua.
El secado del papel debe hacerse a la menor temperatura posible ya que el exceso de
calor provoca prdidas de los aminocidos, especialmente cuando se utiliza fenol como
disolvente.
QUMICA BIOLGICA
El reactivo ms utilizado para localizar las manchas es la ninhidrina, pudiendo

pulverizarse sobre el papel o sumergirse el papel en una cubeta con solucin de ninhidrina
como si fuera un eluyente.
Los cromatogramas revelados con nihidrina pueden conservarse sumergiendo el papel
en algn barniz adecuado.
MARCHA PRCTICA:
Aminocidos utilizados: Tirosina, Asparagina, Cistena y Glutamina.

Revelador: Ninhidrina (disolver 200 mg de ninhidrina en 100 ml de acetona)
Solventes: S1
Butanol : Metanol : Agua
(4 : 5 : 1)
S2
Fenol : Agua
(4 : 1)
Nota: es preciso lavarse bien las manos antes de tocar el papel porque los aminocidos se
hallan en el sudor. De todos modos, el papel debe sujetarse nicamente por los bordes, ya que
las huellas digitales aparecen como manchas confusas de color, luego del tratamiento con
revelador.
DESARROLLO DEL PRCTICO:
Se formarn dos comisiones:
COMISIN 1:
1) Preparar S1 (aproximadamente 25 ml), colocarlo en la cubeta y taparlo.
2) Sembrar la mezcla de aminocidos sobre el borde derecho anterior del papel de
filtro. Hacer una marca en el borde superior derecho. Dejar secar.
3) Dar al papel la forma de un cilindro, sujetar con un clip, colocar el cilindro en la
cubeta con la zona sembrada hacia abajo, cuidando que el papel no toque las
paredes del vidrio. Cerrar rpidamente la cubeta.
4) Retirar el cromatograma cuando el solvente ha llegado hasta aproximadamente 2
cm del borde superior. Dejar secar.
5) Girar 90 el papel en el sentido de las agujas del reloj.
6) Formar nuevamente un cilindro e introducir en la cubeta con S2 (previamente
saturada).
7) Dejar actuar el eluyente, retirar, dejar secar y revelar con ninhidrina.
COMISIN 2:
1) Preparar S1 (aproximadamente 25 ml), colocarlo en la cubeta y taparlo.
2) Marcar suavemente la lnea de base como para realizar cuatro siembras. Sembrar,
partiendo del borde inferior izquierdo un aminocido (Tirosina), realizar en total tres
siembras (tres veces en cada uno). Sobre la segunda siembra, una vez seco el
cromatograma, sembrar dos veces ClNa, dejando secar entre cada siembra. Sobre
la tercer marca, sembrar cuatro veces ClNa. Sobre la cuarta marca solo sembrar
ClNa, dejando secar entre cada siembra.
3) Enrollar el papel de filtro, sujetar con un clip, colocar en la cubeta y tapar.
4) Retirar el cromatograma cuando el disolvente ha llegado hasta unos 2 cm del borde
superior. Dejar secar.
5) Revelar con ninhidrina y observar el efecto que producen las cantidades crecientes
de sales inorgnicas sobre la Cromatografa de los aminocidos.
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 3
LPIDOS
CROMATOGRAFA EN CAPA DELGADA: SEPARACIN DE FOSFOLPIDOS.
OBJETIVO:
Este trabajo prctico tiene por objetivo separar los fosfolpidos presente en la yema del
huevo, utilizando la tcnica de Cromatografa en capa delgada.
FUNDAMENTO TERICO:
Los lpidos cumplen en el cuerpo humano varias funciones: son componentes
estructurales de las membranas celulares, constituyen una importante fuente de energa
mediante la oxidacin de los cidos grasos, siendo esta fuente energtica acumulada como
reserva en forma de triacilglicridos en el tejido adiposo. Adems existen cuatro vitaminas (A,
D, E y K) de naturaleza lipdica, y de las prostaglandina, sustancias que intervienen en
procesos diversos : como la contraccin del msculo liso y la regulacin intercelular, son
derivados lipdicos.
Desde el punto de vista de la salud, el transporte de lpidos en la sangre es un tema
extremadamente importante, ya que anormalidades en este proceso puede ser un factor
importante en el desarrollo de la arteriosclerosis. La obesidad resulta del deposito excesivo de
lpidos en el organismo.
La Diabetes Mellitus, la Icteria obstructiva, la Pancreatitis, estn asociados con
anormalidades en los lpidos sanguneos. Por ultimo, no pueden dejar de mencionarse
enfermedades genticas no muy difundidas, denominadas Lipidosis causadas por la
acumulacin de esfingolpidos en diversos rganos. Por esta razn es necesario familiarizarse
con los fundamentos de la bioqumica de los lpidos y su metabolismo, para comprender los
efectos metablicas asociados a los trastornos patolgicos a los que se hizo mencin.
Los lpidos se han clasificados de diversas manera, una de las formas ms satisfactoria
es la que se basa en la estructura de sus esqueletos. Los lpidos complejos que se caracterizan
por tener cidos grasos como componente, tambin son llamados lpidos saponificables por
que producen jabones por hidrlisis alcalina. Los lpidos sencillos no tienen cidos grasos, y
por lo tanto no son saponificables.
Tabla 1: Clasificacin de lpidos.
Tipo de lpido
Complejos
(saponificables)
Acilglicridos
Fosfoglicridos
Esfingolpidos
Ceras
Esqueleto
Glicerina
3-fosfato glicerol
Esfingosina
Alcoholes no polares de PM
elevado
Simples
(insaponificables)
Terpenos
Esteroides
Prostaglandina
QUMICA BIOLGICA
MARCHA PRCTICA
1. Preparacin de las placas: Tomar con pinzas dos portaobjetos limpios y
desengrasados; sumergirlo en una solucin de slicagel. Dejar secar en posicin
horizontal. Llevar las placas a una estufa a 120 durante 1 hora, para activarlas.
Guardarla en un desecador si no se las utilizan de inmediato.
2. Extraccin de fosfolpidos de la yema de huevo: A 1 ml de solucin de yema
de huevo agregar 4 ml de una mezcla de cloroformo:etanol (2:1); agitar. Separar las
fases con una pipeta Pasteur. Descartar la superior.
3. Siembra del material: Sembrar una pequea gota en la fase clorofrmica en un
punto medio a 0.5 cm del borde inferior de la placa. El borde inferior es aquel hasta
el cual llega la capa de slicagel, siendo el borde superior aquel con una franja
libre que permita manipular la placa.
4. Preparar el Solvente: Cloroformo : metanol : agua (65 : 35 : 4)
5. Desarrollo del cromatograma: Colocar la placa con el borde sembrado hacia
debajo de modo que la capa de slicagel quede sumergida 1 o 2 ml en el solvente
(el nivel de este no debe llegar al lugar de siembra). Tapar la cuba. Dejar correr
hasta que el frente de solvente llegue casi al borde superior. Sacar la placa de la
cuba y dejar secar en posicin horizontal. Tapar la cuba para evitar la evaporacin
del solvente.
6. Revelado de las placas: Colocar las placas en un frasco conteniendo yodo slido.
Se produce la tincin de los lpidos por accin de los vapores de yodo.
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 4
CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA HPLC
1. Qu es HPLC?
2. Tipos de cromatografa lquida
3. Diagrama de un sistema HPLC
4. Solventes utilizados
5. Bombas
6. Sistema de inyeccin de muestras
7. Columnas y fases estacionarias
8. Deteccin
9. Anlisis cuantitativo
1. Qu es HPLC?
La cromatografa lquida es una versin de la cromatografa, es un mtodo fsico de
separacin en el cual los componentes a separar se distribuyen entre dos fases:
Una fase estacionaria: slida o lquida
Y la otra fase es mvil: lquida, movindose por percolacin a travs de este lecho.
2. Tipos de cromatografa lquida
Basndonos en la naturaleza de la fase estacionaria se clasifican en:
Cromatografa de adsorcin
Cromatografa de particin
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin
Cromatografa de adsorcin: la separacin se basa en repetidas etapas de

adsorcin - desorcin, es un fenmeno superficial de interaccin entre la fase
estacionaria (adsorbente) y el soluto.
Cromatografa de particin: la separacin se realiza por etapas de particin
(distribucin de los componentes entre dos fases) entre la fase mvil y la fase
estacionaria.
Cromatografa de intercambio fnico: La fase estacionaria tiene la superficie
cargada de iones con una carga contraria a los componentes que queremos
separar. As cuanto mayor sea la carga de la muestra mas fuertemente ser
atrada por la fase estacionaria y ms tiempo tardar en salir de la columna (eluir).
La fase mvil es un tampn acuoso en el que el pH y la polaridad son las variables
que se utilizan para controlar el tiempo de elusin, esto es, la separacin.
Cromatografa de exclusin: Aqu la fase estacionaria posee poros de dimensiones
comprendidas entre ciertos lmites y la muestra es entonces retenida o filtrada
segn su tamao molecular. Los componentes de mayor tamao eluyen primero y
los de menor tamao por ltimo ya que estas ltimas tienen que recorrer un mayor
camino en los poros de la fase estacionaria.
10
QUMICA BIOLGICA
CLASIFICACIN SEGN LA POLARIDAD RELATIVA DE LAS DOS FASES.

En cuanto a la cromatografa de adsorcin y de reparto no siempre se puede asegurar cual de
los dos procesos implicados desempea el papel ms importante, por esta razn, en la
prctica se define la cromatografa segn sea la polaridad relativa de las dos fases:
Cromatografa en fase normal
Cromatografa en fase inversa
Cromatografa en fase normal: la fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar y la
fase mvil es apolar. As las muestras polares son retenidas en la columna durante tiempos
mayores que las muestra menos polares o apolares.
Cromatografa en fase inversa: la fase estacionaria es de naturaleza apolar mientras que la
fase mvil es un lquido polar. En este caso cuanto ms apolar sea la muestra, mayor ser su
retencin.
cromatografa en fase normal
cromatografa en fase inversa
11
QUMICA BIOLGICA
4. Fase Mvil
La fase mvil desempea una parte activa en el proceso de separacin en HPLC
mientras que en la cromatografa gaseosa no tiene accin alguna.
La mayora de los solventes se pueden utilizar siempre que renan ciertas caractersticas
como:
Disolver la muestra
Miscible con otros solventes para formar mezclas tiles
No degradar o disolver la fase estacionaria
Tener baja viscosidad para reducir la cada de presin
Disponibilidad, precio
Ser compatible con el detector utilizado.
Tener transparencia ptica cuando se usa un detector UV.
Los solventes ms utilizados son: hexano, isooctano, cloruro de butilo,
cloroformo, diclorometano, tetrahidrofurano, acetonitrilo, iso y n-propanol,
metanol y agua.
Estos solventes deben filtrarse y desgasificarse. Se filtran porque pueden acumular

partculas en suspensin y daar los componentes del HPLC. Se desgasifican porque al
exponer el solvente a la atmsfera este comienza a acumular los gases disueltos que se
encuentran en la atmsfera y si no se eliminan pueden producir interferencia en los
detectores, producir picos falsos y desviaciones de la lnea de base.
Los mtodos de filtracin usados son:
Filtro a la entrada del solvente
Filtracin en lnea
Los mtodos de desgasificacin mas usados son:
Ultrasonido
Burbujear Helio
Degasificacin al vaco en lnea
5. Bombas
La bomba es el dispositivo que se utiliza para impulsar el solvente o diluyente.
Se clasifican en dos tipos:
Bombas de presin constante: son sencillas, econmicas y fciles de operar, sin
embargo el caudal puede cambiar debidos a cambios en la viscosidad del solvente.
Bombas de caudal constante: son las mas usadas, son normalmente de dos tipos.
1. Bombas alternantes: la mas importante tiene un pistn nico conectado a una leva que
12
QUMICA BIOLGICA
fuerza el lquido a travs de una vlvula de direccin nica.

2. De desplazamiento continuo (bombas jeringa): consta de un cilindro de gran volumen
que contiene la fase mvil que es expelida por un pistn.
6. Programacin del solvente

Existen dos mtodos de programacin de solvente en HPLC.
Isocrtico: cuando la composicin de la fase mvil se mantiene constante durante un

anlisis.
Gradiente de elusin: cuando se vara la composicin de la fase mvil, con lo cual

se vara la polaridad.
La elusin por gradiente se utiliza con muestras cuyos componentes poseen polaridades muy
diferentes por que en estos casos es preferible variar la polaridad de la fase mvil durante el
anlisis con el fin de mejorar la separacin de los componentes que eluyen en ltimo lugar.
7. Sistema de inyeccin de muestras

Las muestras se introducen a la columna usando vlvulas inyectoras, que pueden ser:
Manuales
Automticas
13
QUMICA BIOLGICA
8. Columnas y fases estacionarias

La separacin en cromatografa lquida se lleva a cabo mediante interacciones
entre la muestra y la fase estacionaria, estas pueden ser:
Fases porosas: son partculas porosas que difieren en su composicin

qumica, estructura y tamao. Pueden ser cuerpos porosos, peliculares o
micropartculas.
Fases enlazadas: formada por partculas (soporte) que tienen la fase

estacionaria qumicamente enlazada a las mismas. Se enlazan hidrocarburos de
diferente longitud al soporte con lo cual se obtiene una fase apolar (Ej.: octadecilo)
que se utilizan en fase inversa y si al final de la cadena hidrocarbonada se enlazan
grupos polares (amino o ciano) se obtienen las fases polares que se usan en fase
normal.
14
QUMICA BIOLGICA
9. Deteccin
Un detector ideal es sensible a bajas concentraciones de cualquier compuesto, tiene una
respuesta lineal y no produce el ensanchamiento de los picos.
Los tipos de detectores en HPLC se clasifican en:
Detectores basados en una propiedad de la fase mvil. Ej. Detector de ndice de refraccin.
Detectores basados en una propiedad de la sustancia a separar. Ej. Detector de
Fluorescencia, Detector Ultravioleta.
Los detectores ms usados en HPLC son:
Detector UV: mide la absorbancia de un compuesto en la fase mvil y determina su
concentracin utilizando la ley de Beer.
Hay bsicamente tres tipos:
Detector de onda fija
Detector de longitud de onda variable
Detector de arreglo de diodos
Detector de ndice de refraccin: mide la diferencia de ndice de refraccin entre el

solvente puro y el solvente que contiene la muestra.
15
QUMICA BIOLGICA
Detector de fluorescencia: solamente detectan compuestos que tengan

fluorescencia nativo o inducida por derivatizacin
Detectores electroqumicos: detecta compuestos que pueden se oxidados o
reducidos. Se clasifican en tres tipos:
Detector amperomtrico
Detector conductimtrico
Detector potenciomtrico

La concentracin de un analito (componente) en la muestra se puede calcular por diferentes
mtodos:
Normalizacin interna
Estndar externo
Estndar interno
Normalizacin interna: Consiste en referir el contenido de analito al total de reas en el
cromatograma. Para ello se suman las reas de todos los picos presentes y el contenido de
analito se calcula segn:
P = 100 *(Ai/Ai)
Pi es el porcentaje del componente i en la mezcla
Ai es el rea del componente i
Ai es la sumatoria de todas las reas del cromatograma
Ventajas:
No requiere estndar de referencia
Es muy preciso porque los errores de inyeccin y preparacin de muestra se
compensan.
Desventajas:
Es necesario que todos los componentes de la mezcla se separen, lo cual no siempre
ocurre.
Se requiere que todos lo s componentes tengan el mismo factor de respuesta (f i); esto
significa que si se trabaja con un detector UV todos los compuestos deben tener el
mismo valor de absortividad a la longitud de onda elegida.
16
QUMICA BIOLGICA
Si se tienen patrones puros de todos los compuestos se calculan los factores de respuesta
segn:
f-i- = Pi/Ai
Fi es el factor de respuesta del patrn i
Pi es el porcentaje del patrn i
Ai es el rea del patrn
Y el porcentaje de los compuestos se calcula de la siguiente manera:
P = 100 *(fi.Ai/fi. Ai)
Estndar externo: Es el mtodo mas utilizado en HPLC. Consiste en preparar estndares de
concentracin semejante al analito en la muestra y determinar sus respectivas reas
en las mismas condiciones de operacin que las muestras. Luego se determina el
rea del analito y se calcula su concentracin:
Utilizando la siguiente ecuacin donde se compara el rea del analito en cuestin con el rea
correspondiente al estndar de referencia:
P = 100 * D *(AmCs / AS)
P es el porcentaje de analito en la muestra
Am y As son las reas de la muestra y estndar respectivamente.
Cs es la concentracin del estndar
D es un factor de dilucin
En este mtodo la precisin de los datos depende de:
La calidad del estndar utilizado
De la preparacin de la muestra y el estndar
Y de los errores de inyeccin de ambos
Estndar interno: Consiste en agregar cantidades exactamente medidas de una sustancia
tanto en la muestra como a un estndar que contiene el analito.
Para determinar la concentracin de analito en la muestra se calcula la relacin de rea de
analito a estndar interno tanto en la muestra como en el estndar y se calcula:
P = 100 * D *(RmC, / RS)
Pi es el porcentaje de analito en la muestra
Rm y R, son las relaciones de reas de analito a estndar interno en la muestra y
estndar respectivamente.
CS es la concentracin del estndar
D es un factor de dilucin
La exactitud del mtodo depender de la pureza del
estndar.
Ventajas:
El estndar interno no tiene que ser de pureza controlada
No depende de los errores de inyeccin
Compensa los errores generados en la preparacin de la muestra como ser: dilucin,
extraccin y derivatizacin.
3. Teoras del proceso cromatogrfico

Las teoras tratan de explicar el comportamiento de los solutos en las columnas. Las ms
estudiadas son:
La teora de los platos tericos

17
QUMICA BIOLGICA
La teora cintica (Van Deemter)

La teora desarrollada para columnas capilares (Golay)
Segn la teora de los platos, una columna esta constituida por una serie de platos que
contiene una fase estacionaria y supone que:
El volumen de la fase estacionaria es constante en cada plato
El volumen de la fase mvil es constante en cada plato
Las dos fases en cada plato estn en equilibrio
El valor del coeficiente de distribucin es constante e independiente de la

concentracin de soluto
La desventaja de la teora es la falta de conexin entre el tamao de partcula de la fase
estacionaria, la difusin, la velocidad de flujo y la temperatura. La ecuacin que rige esta
teora es
N = 16 (tr/W)2
Donde N es el nmero de platos tericos, tres el tiempo de retencin del soluto y en el
ancho de la base del pico del soluto.
La teora cintica considera el proceso cromatogrfico en funcin de los siguientes
factores:
Las trayectorias mltiples que toma un soluto durante su movimiento a travs del
empaque de la columna (A)
Difusin axial o longitudinal del soluto en la fase mvil (B)
La resistencia a la transferencia de masa entre la fase mvil y la estacionaria ( C ) La

ecuacin de la teora es la de Van Deemter
HETP o H=A+B/u+C*u
Donde HETP es la altura equivalente de un plato terico, esto es L/H ( L es la longitud de la
columna) y u es la velocidad lineal de la fase mvil (cm/seg). En el grfico tenemos las curvas
para diferentes gases ( nitrgeno, helio, hidrgeno) donde se observa la variacin de la altura
del plato terico (HEPT) con la velocidad.
18
QUMICA BIOLGICA
CROMATOGRAFA DE GASES
(GC)
1.
2.
3.
4.
Definicin de cromatografa
Esquema de un cromatgrafo
Teoras del proceso cromatogrfico
Cromatgrafo de gases
Inyectores
Columnas
Gas portado
Detectores
5. Cromatograma y su interpretacin
6. Anlisis cualitativo
7. Anlisis cuantitativa
1. Definicin de cromatografa
Cromatografia: se define como un mtodo de separacin en el cual los :componentes a
separar se distribuyen entre dos fases
Fase estacionaria: de gran rea superficial (slida o lquida)
Fase mvil: que es un fluido que pasa a travs de la fase estacionaria (gas, lquido o
fluido supercrtico).
2. Esquema de una separacion cromatografica (capilar)
4. Cromatgrafo de gases:
5
adquisicion y
tratamiento de
datos
Sistema de
deteccion
de
Sistema
3
Columna
cromatrografica
Gas de arrastre y
sus controles de
flujo
Sistema de
inyeccion
19
QUMICA BIOLGICA
Inyector : el inyector es el dispositivo con el cual se introduce la muestra en la columna.
Las muestras (lquidas) son

introducidas a travs de un sello
de goma (septum) a un tubo de
vidrio (liner) que se encuentra en
un block de metal caliente el cual
vaporiza la muestra que es
introducida por la fase mvil a la
columna.
Columnas:
Es el lugar donde ocurre la separacin.
Los materiales con los cuales se fabrican columnas son: cobre, aluminio, acero inoxidable,
vidrio o tefln. El relleno puede ser un slido o un lquido recubriendo un slido. Se
clasifican en:
Empacadas
Analtica
Preparativa
Microempacadas
Capilares
WCOT (pared recubierta)
SCOT ( soporte recubierto)
PLOT (capa porosa)
Cromatografa con temperatura programada.

Sea una muestra con un amplio espectro de ebullicin (Ej.: aceites esenciales)
A temperaturas altas se tendr un anlisis rpido sin resolucin y a temperaturas bajas los
anlisis sern lentos pero con alta resolucin.
En consecuencia la cromatografia se efecta con aumento progresivo de la temperatura
para resolver este tipo de muestras y realizar el anlisis en un corto tiempo. El aumento
progresivo de la temperatura esta controlada electrnicamente y se habla entonces de
cromatografia con temperatura programada.
Gas portador
El gas portador cumple dos propsitos:
1. Transportar los componentes de la muestra
2. Crear una matriz adecuada para el detector (compatibilidad)
Los gases ms usados son: nitrgeno, hidrgeno, oxgeno, helio, argn, nen, dixido de
carbono y monxido de carbono.
20
QUMICA BIOLGICA
Ventajas de la cromatografia capilar
Separaciones con alta resolucin

Anlisis cualitativos y cuantitativos de mayor exactitud
Reduccin del tiempo para el desarrollo de un mtodo
Reduccin del tiempo de anlisis
Mayor sensibilidad
Detectores
El detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluidas a la salida
de la columna cromatogrfica.
Los ms usados en cromatografa gaseosa son:
Detector de conductividad trmica: mide la conductividad trmica del gas portador
producida por la presencia de sustancias eluidas
Detector de fotometra de llama: mide la intensidad de emisin molecular de la

fluorescencia de los heterotomos en molculas orgnicas.
Detector de ionizacin de llama: mide las variaciones de la corriente de ionizacin de

una llama de oxgeno-nitrgeno debido a la presencia de sustancias eluidas.
Detector de ionizacin de llama alcalina: produce partculas cargadas en una llama

alcalina donde los compuestos con P Y N incrementan la corriente de partculas.
Detector de captura electrnica: se basa en la electronegatividad de las sustancias

eluidas y en su capacidad para formar iones negativos por captura de electrones.
Detector de espectrometra de masas: produce fragmentos de molculas por

bombardeo electrnico v luego analiza las masas.
Detector selectivo de masas
Las molculas efluentes de la columna cromatogrfica son sujetas a un impacto de
electrones de 70 eve. En vaco, lo cual causa su fragmentacin tpica. El anlisis de esa
fragmentacin por el detector permite su identificacin y medicin.
Caractersticas: universal, responde a todos los compuestos con peso molecular mayor
que 10.
Sensibilidad: 10 -13 g (monitoreando iones selectivamente) 10-9 g (en el modo barrido)
En la figura podemos ver como trabaja un GC/MS
21
QUMICA BIOLGICA
Como se produce la ionizacin de las molculas
El detector ms sensible es el de captura de electrones (ECD), un detector

especfico para compuestos electronegativos.
5. Cromatograma y su interpretacin
En un cromatograma cada pico es la seal del detector que representa un compuesto.

Cada compuesto se identifica por su tiempo de retencin (tR) que es un parmetro
cualitativo.
La concentracin de un compuesto se obtiene empleando el rea del pico (o la altura)
en algn mtodo cuantitativo; este es un parmetro cuantitativo.
Tiempo de Retencin Corregido
tR' = tR - tM
Factor de Capacidad o relacin de capacidad

K = tR / tM = (tR tR)/tM
El factor de capacidad nos indica cuantas veces es retenida una sustancia en relacin una
sustancia no retenida.
22
QUMICA BIOLGICA
6. Anlisis cualitativo
El anlisis cualitativo es un procedimiento para la identificacin de los picos
cromatogrficos, este anlisis puede hacerse por:
Por datos de retencin
Por series homlogas (ndices de retencin de Kovat)

Existen varios mtodos para cuantificar un pico cromatogrfico
Normalizacin de rea
Normalizacin de rea con factores de respuesta
Patrn externo
Patrn interno
(Ver estos mtodos en el apunte de HPLC)
Sobre sus aplicaciones
Sus aplicaciones son muy numerosas, particularmente en el campo de la qumica
orgnica y la biologa.
Anlisis orgnico de aguas
Todos los compuestos voltiles y estables a una temperatura elevada:
Qumica orgnica general.
Los hidrocarburos constituyen el mejor terreno de aplicacin de la
cromatografa en fase gaseosa. Algunos de los casos ms frecuentes son el
metano, aromticos, terpenos.
La separacin de terpenos y de sus derivados oxigenados. En particular, la
industria alimentaria. Ej.: la separacin de los componentes de un zumo de
naranja.
Perfumes
Alcoholes. Por ejemplo la deteccin clnica del etanol en la sangre.
Otros compuestos oxigenados tales como aldehdos, cetonas, acetatos y
los heterociclos.
Compuestos orgnicos halogenados, no polares
Insecticidas. La industria alimentaria se interesa en la deteccin de residuos
de insecticidas.
Materiales plsticos. polmeros
Anlisis de las sustancias no orgnicas: gases permanentes, agua
En qumica biolgica y farmacutica.
23
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 5
ESPECTROFOTOMETRIA UV VISIBLE
Laboratorio Central FCEQyN UnaM
OBJETIVOS:
Conocer los fundamentos de la espectrofotometria para su utilizacin como recurso de
investigacin.
Lograr que el alumno aprenda a manejar este instrumento como una herramienta de
analisis, conociendo sus ventajas, cuidados y limitaciones.
FUNDAMENTOS TERICOS:
Introduccin
Propiedades de la luz
Absorcin de la luz
El espectrofotmetro
Errores en espectrofotometra
Curvas de calibracin
Trabajo prctico
Introduccin
Espectrofotometra: es cualquier procedimiento que usa la luz para medir la
concentracin de compuestos qumicos.
Instrumental:
Esquema de un espectrofotmetro
convencional
fuente
monocromador
o ranura de entrada
o elemento de dispersin
o ranura de salida
muestra
detector
Aplicaciones: Dos propsitos diferentes

1. Anlisis Cualitativo: Determinar el espectro de absorcin de una sustancia pura.
2. Anlisis Cuantitativo: Determinar la concentracin de una solucin.
Propiedades de la luz
La radiacin ultravioleta (UV) y visible comprende una pequea parte del espectro
electromagntico, entre 190 y 1000 nm.), que incluye otras formas de radiacin como las de
radio, infrarrojo (IR), csmica y rayos X.
24
QUMICA BIOLGICA
Esta radiacin o energa radiante se puede describir por sus propiedades ondulatorias, esto es:
Longitud de onda (): es la distancia entre dos mximos sucesivos de una onda; se mide
en nanmetros (nm) que equivale a 10-9 m.
Frecuencia (): es el nmero de mximos de una onda que pasa en un punto del espacio
en un segundo, se mide en Hertz que corresponde a un ciclo por segundo (1/s).
que estn relacionados por la velocidad de la luz c (2.998 * 108 m/s).
. c
Adems la energa radiante se comporta como si esta formado por paquetes de energa
llamados fotones.
La energa de los fotones depende de la frecuencia de la radiacin y esta dada por la siguiente
relacin.
E(fotn) = h (fotn)
(h = 6.626 * 10-34 J.s es la constante de Planck )
Que podemos poner en funcin de la longitud de onda, esto es:
E = h c /
Absorcin de la luz
Cuando una intensidad (I) de luz (esto es, energa por unidad de rea y de tiempo) atraviesa un
espesor dx de disolucin de concentracin c sufre una absorcin dI que es proporcional al
espesor, a la intensidad incidente y a la concentracin de la disolucin.
- dI I c dx
expresin que podemos igualar agregando un parmetro k que ser funcin de la naturaleza de
la sustancia y de la longitud de onda.
- dI = k I c dx
operando e integrando entre el espesor cero (intensidad incidente Io) y el espesor l (intensidad
transmitida I) se obtiene:
I = Io e-kcl
Esto es, la intensidad de luz transmitida.
A partir de esta expresin se define la: transmitancia T = I/ Io = e-kcl
Como la fraccin de luz incidente que pasa a travs de la muestra.
Como la transmitancia no es proporcional a la concentracin de soluto se convierte la misma
en Absorbancia A (aplicando logaritmo) la cual si es proporcional a la concentracin:
A = log10 (I/ Io = e-kcl )
A = -log10 T = c l
Relacin que se conoce como la ley de Beer
A=cl
Donde c es la concentracin molar (moles/litro) es
la absorcin molar (lt/mol*cm). l longitud del camino
ptico (cm).
La ley de Beer es aplicable a soluciones diluidas de
concentraciones iguales o menores a 0.01 M (0.01
mol/lt) .
El espectrofotmetro
Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la transmitancia o la absorbancia de una
muestra como una funcin de la longitud de onda de la
radiacin electromagntica.
Las partes de un espectrofotmetro son:
o Una fuente que genera una radiacin
electromagntica en un amplio rango de
longitudes de onda.
o Un equipo de dispersin que selecciona
una longitud de onda en particular ( en
realidad selecciona ancho de banda).
o Un compartimiento para la muestra.
o Uno o ms detectores para medir la
intensidad de la radiacin.
25
QUMICA BIOLGICA
Fuente
Una fuente ideal debera tener una intensidad constante para todas las longitudes de onda,
bajo ruido y una gran estabilidad trmica; desafortunadamente tal fuente no existe.
Dos fuentes son las mas comnmente usadas en espectrofotometra UV-Visible.
La lmpara de deuterio:
Que tiene una buena intensidad continua en la regin UV pero disminuye a medida
que nos acercamos a la regin visible. Se la usa en el rango de 190 a 360 nm.
Con el tiempo de uso la intensidad de la luz de la lmpara disminuye rpidamente,
teniendo una vida media (tiempo en el cual su intensidad disminuye a la mitad de su
valor inicial) de 1000 hs.
La lmpara halgena de tungsteno:
Tiene buena intensidad en parte del espectro
UV y en todo el rango visible. Se la usa en el
rango de 360 a 1000 nm y tiene una vida
media de 10000 hs.
La mayora de los espectrofotmetros usan
ambos tipos de lmparas para medir en el
rango UV Visible, cambiando
automticamente de fuente de acuerdo a la
longitud de onda buscada.
Elementos de dispersin
Un elemento de dispersin desva las diferentes longitudes de onda de la radiacin en
diferentes ngulos. Cuando se combina con una ranura de salida apropiada estos
elementos pueden ser usados para seleccionar una
longitud de onda en particular.
Dos son los ms usados: a) prismas y b) redes de
difraccin
o
Prismas
Estos generan un arco iris a partir de la luz solar. Este
mismo principio es usado en los espectrofotmetros.
Son simples, econmicos pero producen una
dispersin angular no lineal y adems estos ngulos de
dispersin son sensibles a la temperatura.
Por esta razn los espectrofotmetros ms modernos
contienen redes de difraccin.
Redes de difraccin
Estos consisten en un gran nmero de lneas
igualmente espaciadas y paralelas entre s, sobre una
superficie de vidrio a la que se aplica un recubrimiento de aluminio para crear una
superficie reflejante.
La luz que incide sobre la red es reflejada en diferentes ngulos, dependiendo de la
longitud de onda. Adems la dispersin angular es lineal y no depende de la temperatura.
Sin embargo, estos elementos reflejan la luz en diferentes
ordenes, los cuales se superponen; en consecuencia, se usan
filtros o redes cncavas para dispersar y enfocar la radiacin
simultneamente.
Un monocromador: consiste de una ranura de entrada, un
elemento de dispersin y una ranura de salida. Idealmente la
salida de un monocromador es una luz monocromtica.
26
QUMICA BIOLGICA
En la prctica, la salida es siempre una banda aguda simtricamente distribuida. El

ancho de banda a la media altura el ancho de banda instrumental (SBB).
Compartimiento para la muestra

La espectroscopia se usa para medir lquidos o
soluciones.
Las muestras se colocan en recipientes denominados
cubetas o celdas para realizar las mediciones.
Material:
Idealmente
las
celdas
deben
ser
completamente transparentes a todas las longitudes de
onda ya que cualquier absorbancia de la cubeta reduce
el rango lineal efectivo para la muestra.
Las celdas de mas bajo costo son las de plstico, estas
celdas no resisten a todos los solventes y absorben
fuertemente por debajo de 300 nm no pudiendo
utilizarse para medir en esta regin.
Las celdas de vidrio son un poco ms costosas que las de plstico pero
son ms durables y resisten la mayora de los solventes, sin embargo,
absorben fuertemente a partir de los 320 nm. Las celdas de cuarzo
fundido son razonablemente transparentes por debajo de 210 nm.
Las mejores celdas son hechas de slice sinttica fundida de alta
pureza y son transparentes por debajo de 190 nm.
Tipos de celdas
Hay una gran variedad de celdas disponibles pero las mas usadas son:
a)
La celda rectangular con extremo superior abierto con dimensiones internas
(camino ptico) que van desde 1 a 100 mm, la ms popular es la de 10 mm.
b)
La celda ranurada que es idntica a la anterior pero se usa cuando los volmenes
de las muestras son pequeo.
Detectores
Un detector convierte una seal luminosa en una seal elctrica, este puede ser un tubo
fotomultiplicador o un detector de fotodiodo.
Fotomultiplicador:
Es un tubo electrnico capaz de amplificar
significativamente una corriente. El ctodo esta
construido con un metal sensible a la luz capaz de
absorber energa radiante y emitir electrones en forma
proporcional a la energa radiante que hace impacto en
la superficie del metal sensible a la luz. Los electrones
producidos en el primer nivel de energa pasan a chocar
con una superficie secundaria donde cada electrn
producen entre 4 a 6 electrones secundarios que va a
otro nivel, repitiendo la multiplicacin de electrones hasta
el nivel final donde llega una corriente electrnica
amplificada.
Fotodiodo:
En un fotodiodo la luz incide sobre un material
semiconductor y hace que los electrones fluyan a travs
del mismo, de ese modo agota la carga de un capacitor
conectado a travs del material. La cantidad de carga
necesaria para recargar el capacitor en intervalos
regulares es proporcional a la intensidad de la luz.
Algunos espectrofotmetros ms modernos contienen
arreglo de diodos en lugar de un solo detector: este consiste de una serie de diodos
ubicados lado a lado sobre un cristal de silicona. Cada diodo tiene un capacitor individual
27
QUMICA BIOLGICA
que esta conectado por un conmutador de estado slido a una lnea de salida comn. La
cantidad de carga necesaria para recargar los capacitores es proporcional al nmero de
fotones detectado por cada diodo, el cual es proporcional a la intensidad de la luz. De esta
manera se obtiene el espectro de absorcin midiendo la variacin de la intensidad en todo
el rango de
longitud de onda.
Un arreglo tpico comprende entre 200 y 1000 elementos.
Tipos de espectrofotmetros
o
Espectrofotmetro de simple haz:
Primero se mide Io para una cubeta de referencia que contiene el solvente puro. Entonces
se reemplaza la cubeta de referencia por la cubeta que contiene la muestra a medir y se
obtiene I.
o
Espectrofotmetro de doble haz:
La luz pasa alternativamente a travs de la cubeta de referencia y de la muestra. Un
espejo giratorio (choper) hace pasar la luz alternativamente entre las cubetas de muestra y
de referencia. En los procedimientos de rutina primero se registra un espectro de lnea de
base con dos cubetas de referencia. As la absorbancia de referencia es restada de la
absorbancia de la muestra para obtener la absorbancia verdadera de la muestra a cada
longitud de onda.
Precauciones:
La mayora de los espectrofotmetros operan mejor a A (absorbancia) entre 0.4 0.9.
Si la absorbancia es muy elevada la intensidad es difcil de medir.
Si la absorbancia es muy baja es muy difcil distinguir entre la referencia y la muestra.
Errores en espectrofotometra
La medicin de las concentraciones se basa en la linealidad de la absorbancia con la
concentracin, esto es, en la ley de Beer. Por lo tanto desviaciones a la ley son fuentes de
errores, esto sucede cuando:
o Se miden concentraciones muy elevadas.
28
QUMICA BIOLGICA
o La energa de la radiacin incidente no es monocromtica.

o La absorcin del solvente es significativa comparada con la absorcin del soluto.
o La energa radiante es transmitida por otros mecanismos (luz errtica).
o Los lados de las celdas no son paralelos
Curvas de calibracin
En una curva de calibracin la absorbancia es graficada como una funcin de una cantidad
conocida de un analito derivado de una muestra patrn.
Procedimiento para la construccin de una curva de calibracin.
Paso 1: Preparar muestras de concentraciones conocidas de un analito cubriendo un
rango de concentracin conveniente y medir la absorbancia (A) de estos patrones.
Paso 2: Restar la absorbancia de la muestra de referencia si se uso un equipo de
simple haz.
Paso 3: Hacer un grfico de la absorbancia corregida versus la concentracin de analito
analizado.
Ejemplo:
Se desea construir una curva de calibracin para determinar la concentracin de plomo en
agua potable. Se obtiene la siguiente informacin durante la medicin de absorbancias a
427 nm.
Paso 1: Preparar patrones y medir sus absorbancias.
Se realizaron 3 repeticiones de cada patrn.
Patrn
Concentracin
1
2
3
4
0.100
0.060
0.030
0.004
Absorbancia
(A)
0.923
0.681
0.453
0.258
A (promedio)
0.929
0.682
0.454
0.257
0.926
0.677
0.453
0.265
0.926
0.680
0.453
0.260
Paso 2: Medicin de la absorbancia del blanco y resta de la absorbancia de los patrones.

Si el espectrofotmetro es de doble haz no es necesario hacer este paso.
Blanco
Concentracin
0.000
Patrn
1
2
3
4
A
0.081
A
0.083
Concentracin
0.100
0.060
0.030
0.004
A
0.079
A (promedio)
0.081
A (corregida)
0.845
0.599
0.372
0.179
Paso 3: Grafico de datos y curva de calibracin

a) Si se cumple la ley de Beer podemos obtener los parmetros de la ecuacin que es una
lnea recta.
Por regresin lineal obtenemos para A = m * C + b
Donde m = 6.96 y b = 0.16
29
QUMICA BIOLGICA
b) Grfico de absorbancia vs. Concentracin:
Absorbancia
Curva de Calibracin
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0,000
0,050
0,100
Concentracin
Anlisis cuantitativo de un compuesto

A. Experiencia
Datos
o Solucin patrn (std) cafena, [ ]g/l
o Peso molecular (PM): 194,22 g/mol
o Peso de la muestra: W 1= 0,9 g
o Concentracin de la muestra a preparar: Cm= 0.5 (g/lt)
Medir el espectro de Absorbancia del patrn en el rango de 200 400 nm

Medir el espectro de Absorbancia de la muestra problema en el rango 200 400 nm
B. Evaluacin
1.
2.
3.
4.
5.
Determinar max de la solucin patrn

medir Amaxstd
medir la absorbancia de la muestra a esa longitud de onda
Calcular la concentracin de la muestra usando la ley de Lambert-Beer A = c d
Determinar el % p/p de cafena en la muestra
Problemas
1- Calcular la absorbancia de una solucin con un 80% de tramitancia.
2- Calcular la absorbancia de una disolucin cuya tramitancia es de 1%.
3- Calcular la tramitancia de una disolucin cuya absorbancia es de 1.
4- Calcular la absorbancia a 340nm de una disolucin 100 M de NADH, si su coeficiente de
absorcin molar es de 6,22 x 103 M-1cm-1.
5- Una disolucin de creatinina a 540nm manifiesta una absorbancia de 0,42 y en las mismas
condiciones experimentales un patrn de 1mg de creatinina en 100 ml presenta una
absorbancia de 0,57. Averiguar la concentracin de la creatinina problema.
6- Una disolucin de NADH tiene una concentracin de 1mg/ml. la masa molecular del NADH
es 709. Calcular la absorbancia de esta disolucin a 340 nm. (NADH) = 6,22 x 103 M-1cm-1.
7- Se prepara una disolucin de ATP-Mg puro (masa molecular = 529) de concentracin 100
g/ml. La absorbancia medida a 259 nm resulta ser igual a 2,91. Calcular en estas condiciones
el coeficiente de absorcin molar del ATP.
8- Para determinar la concentracin de glucgeno en una muestra se produce la reaccin
glucgeno-ioduro y a 450 nm en cubeta de 1 cm se mide una absorbancia de 0,25. En las
30
QUMICA BIOLGICA
mismas condiciones una disolucin de glucgeno patrn de concentracin 10 mg/ml producira

una absorbancia de 0,2. Cul es la concentracin de la muestra?
9- Calcular el coeficiente de absorcin (a 1cm 1%) a 328 nm de la vitamina A si una muestra de
esa sustancia de concentracin 2 g/ml en cloroformo produce una absorbancia de 0,31.
10- Para determinar la concentracin de creatinina en orina de tres pacientes A, B y C se
realiza la reaccin de Haffe con una serie de patrones y con las orinas de estos pacientes
obteniendo los resultados de la siguiente tabla. Determinar grficamente las concentraciones
de A, B y C.
Patrn
(mg/ml)
1
2
3
4
5
A a 520
nm
0,18
0,35
0,52
0,67
0,80
Problem
as
A
A a 520 nm
0,08
0,41
0,24
31
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 6
APLICACIN DE ESPECTROFOTOMETRA COMO MTODO
DE CUANTIFICACIN DE BIOMOLCULAS
OBJETIVOS:
Aprender a utilizar como herramienta de determinacin cuantitativa, de
molculas orgnicas, el mtodo espectrofotomtrico.
Determinar empricamente los valores de concentracin de protenas, glucosa y
colesterol, como as tambin conocer los parmetros normales y anormales, en seres
humanos.
INTRODUCCIN:
La espectrofotometra es el mtodo de anlisis ptico ms usado en las
investigaciones biolgicas. El espectrofotmetro es un instrumento que permite comparar la
radiacin absorbida o transmitida por una solucin que contiene una cantidad desconocida de
soluto (muestra a analizar), y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.
En otras palabras la determinacin cuantitativa de una especie, con base en observaciones
que dependan de la cantidad de radiacin absorbida, dependen de la comparacin entre el
valor de la absorcin de un patrn de referencia y la absorcin de la muestra. Los
espectrofotmetros deben permitir efectuar la comparacin entre la seal obtenida por una
mezcla que no contiene el analito (blanco) y otra que si lo tiene, para obtener de esta manera
solo la absorbancia del analito [Abs. patrn (Sn + analito) Abs. blanco (Sn)].
DETERMINACIN DE GLUCOSA
La determinacin de glucosa sangunea, es el dato mas importante y de mas larga data
para el estudio de pacientes con alteraciones en el metabolismo de los carbohidratos.
La concentracin de glucosa, se mantiene constante dentro de ciertos lmites. Los
mecanismos de regulacin de los niveles de glucosa sangunea se producen a expensa de un
equilibrio entre la produccin y el consumo, procesos regulados por hormonas (insulina,
glucagn, adrenalina, somatostatina ) y glucocorticoides intervinientes en el proceso.
La variaciones de los niveles de concentracin de glucosa fuera de los limites normales,
tanto para sangre, liquido cefaloraquideo y otros, pueden derivarse en una gran cantidad de
estados patolgicos.
Se produce hiperglucemia en enfermedades como: Diabetes Mellitus, Pancreatitis
crnica y aguda, insuficiencia heptica y renal, etc.
Se produce hipoglucemia en enfermedades como: Enfermedad de Adisson-mixedema,
tumores extrapancreticos, productores de sustancia insulinoides, etc (consultar apunte teorico
para el parcial).
FUNDAMENTO DEL MTODO
La glucosa de la muestra se determina calorimtrica mente segn la siguiente ecuacin:
Glucosa + Oxigeno GOD
2 H2O2 + Fenol + 4-AF
POD
Ac. Glucnico + H2O2

Quinoneimina + 4 H2O
La Quinoneimina es cromgeno rojo con pico de absorcin a 505 nm.
32
QUMICA BIOLGICA
MARCHA PRCTICA
Materiales:
Reactivo 1: 4-aminofenazona.
Reactivo 2: Fenol.
Reactivo 3: Enzimas GOD y POD.
Patrn: Solucin de Glucosa.
Muestra: Suero o Plasma Heparinizado.
Timer
Espectrofotmetro o colormetro.
Micropipetas y pipetas
Probeta
Bao Mara a 37
Preparacin del reactivo de trabajo
En una probeta agregar respetando el orden:

1. Agua destilada partes del volumen.
2. Los reactivos 1 y 2.
3. Levar a volumen con agua destilada y mezclar.
4. Homogeneizar suavemente las enzimas. Agregar y mezclar.
Reactivo 1
Reactivo 2
12 cm3
12 cm3
Agua
C.S.P.
300 cm3
Reactivo 3
1.2 cm3
Procedimiento:
En tres tubos marcados como B (blanco), P (patrn o standard), M (muestra),

colocar:
B
Muestra
Testigo
Reactivo de
trabajo
20 l
2 cm3
20 l
2 cm3
2 cm3
Mezclar, incubar a 37, 10 minutos. Leer en el espectrofotmetro a 505 nm o en el

foto colormetro con filtro verde (490 530 nm) llevando a cero en aparato con el
blanco de reactivo.
Clculos:
= 1 / (Abs. P abs B) = g/l

Glucosa en g/l : . Abs M
33
QUMICA BIOLGICA
Valores de Referencia de Glucosa, entre: 0.70 1.10 g/l

* Si se utiliza un espectrofotmetro con doble haz de luz debe omitirse en el clculo del factor la
absorbancia del blanco.
DETERMINACIN DE COLESTEROL
El nivel srico de colesterol ha sido objeto en los ltimos aos de numerosas

investigaciones, tanto en individuos sanos como en enfermo.
El colesterol srico, es influenciado por un gran nmero de condiciones patolgicas.
Teniendo en cuenta la notable prevalenca de problemas asterosclerticos
y
enfermedades coronarias en la poblacin actual y la relacin estadstica significativa entre dicha
patologa y la hipercolesterolemia, la determinacin del colesterol srico es un aporte importante
en el control de los llamados factores de riesgos, para el desarrollo de las enfermedades
coronarias.
FUNDAMENTO DEL MTODO
El colesterol es oxidado enzimticamente por la colesterol oxidasa (CHOD), previa
hidrlisis enzimtica de los steres mediante una lipasa de origen fngico. El agua oxigenada
genera la oxidacin , produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF)
mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa. El producto es una quinona con
absorbancia mxima a 505 nm.
La secuencia es la siguiente:
Esteres de colesterol + Oxgeno
Colesterol + Oxgeno
H2O2 + 4-AF + Fenol
POD
Lipasa
CHOD
Colesterol + cidos Grasos
Colesterol-3-ona + H2O2
4(P-benzoquinona monoimino) fenazona + H2O
MARCHA PRCTICA
Materiales:
Patrn: solucin de colesterol.

Enzimas: suspensin conteniendo lipasa, colesterol oxidasa y peroxidasa.
Reactivo: 4-AF.
Reactivo : fenol.
Timer
Espectrofotmetro o colormetro.
Micropipetas y pipetas
Probeta
Bao Mara a 37
34
QUMICA BIOLGICA
Con los reactivos anteriores, se prepara la solucin de trabajo en un frasco color

caramelo, en las proporciones mostradas en la Tabla.
Agua c.s.p.
80 cm3
250 cm3
Reactivo : 4-AF
4 cm3
12.5 cm3
Reactivo fenol
4 cm3
12.5 cm3
Enzimas
1.6 cm3
5 cm3
Muestra : suero o plasma heparinizado
Procedimiento
En tres tubos o cubetas espectrofotomtricas marcadas como: B (blanco), P (patrn o

standard), M ( muestra), colocar :
B
Muestra
Standard
Reactivo de trabajo
P
2 cm3
M
20 l
2 cm3
20 l
2 cm3
Incubar 15 minutos a bao Mara 37 o 30 minutos a temperatura ambiente ( 25 ).

Leer en el foto colormetro, con filtro verde (490 a 530 nm), o en espectrofotmetro a
505nm , llevando el aparato a cero con el blanco.
El color es estable 2 horas, por lo que la absorbancia puede ser leda dentro de ese
lapso.
Clculos:
Factor
= 2/ (Abs. P abs B) = g/l
Colesterol en g/l = . (Abs. M)

Valores de referencia (pacientes mayores de 20 aos)
Valor deseable: hasta 2 g/l
Valor limite: hasta 2.4 g/l
Valor elevado: mayor a 2.4 g/l
35
QUMICA BIOLGICA
DETERMINACIN DE PROTENAS TOTALES Y ALBMINAS

Las protenas son compuestos orgnicos macromoleculares, ampliamente distribuidos
en el organismo.
Actan como elementos estructurales y de transporte, y aparecen bajo la forma de
enzimas, hormonas, anticuerpos, factores de coagulacin, etc.
Esta multiplicidad de funciones hace que las protenas resulten esenciales para la vida.
En el plasma las protenas contribuyen a mantener el volumen de fluido circulante, transportan
sustancias relativamente insolubles y actan en la inactivacin de compuestos txicos y en la
defensa contra agentes invasores.
Normalmente las protenas ms abundante en el plasma es la albmina, cuya funcin
ms importante es la de permitir el transporte de cidos grasos, hormonas esteroides,
bilirrubina y catecolaminas, que en forma libre son insolubles en medio acuoso.
La concentracin de albminas en el plasma influye notablemente en el mantenimiento de la
presin coloidosmtica, lo que estara relacionado con su relativamente bajo peso molecular y
su gran carga neta.
En condiciones patolgicas, como perdidas renales, desnutricin, infecciones
prolongadas, suele presentarse hipoproteinemia, mientras que en otras situaciones como
mieloma mltiple, endocarditis bacteriana y hemoconcentraciones de diverso origen se
presenta hiperproteinemia.
En general, ambas situaciones se ven acompaadas tambin por hipoalbuminemias.
Los aumentos anormales de albminas son ocasionales y se relacionan casi siempre
con deshidratacin, que produce el consecuente aumento del contenido proteico del plasma.
FUNDAMENTO DEL MTODO:
Los enlaces peptdicos de las protenas reaccionan con el in cprico en medio alcalino,
para dar un complejo de color violeta con mximo de absorcin a 540 nm cuya intensidad es
proporcional a la concentracin de protenas totales en la muestra.
MARCHA PRCTICA:
Materiales:
Reactivo EDTA/Cu: Complejo EDTA/Cu 13mmol/lt y alquil aril polieter (AAP).

Suero Patrn: Solucin de albminas y globulinas en estado nativo con titulo
conocido de protenas y albminas.
Muestra: Suero libre de hemlisis.
Espectrofotmetro o Colormetro.
Micropipetas y pipetas.
Tubos de ensayo.
Bao Mara a 37 C.
36
QUMICA BIOLGICA
Procedimiento:
En tres tubos, marcados cada uno como: B (blanco), P (patrn o standard) y M

(muestra); colocar:
B
P
M
Agua Destilada
50 l
Suero Patrn
50 l
Muestra
50 l
Reactivo
3
3
3,5 cm
3,5 cm
3,5 cm3
EDTA/Cu
Mezclar, incubar 15 min. a 37 C, y leer en espectrofotmetro a 540 nm llevando a

cero con el Blanco de Reactivo.
Clculos:
f = factor = (Protenas Totales g/dl) / (Abs. P abs B)
Protenas Totales en g/dl = Abs. M . f
Valor de Referencia: Protenas Totales = 6,1 a 7,9 g/dl
DETERMINACIN DE ALBMINAS
FUNDAMENTO DEL MTODO:
La albmina reacciona especficamente con la forma aninica de la
Bromocresolsulfonftalena (BCF) en presencia de un exceso de colorante, en medio tamponado
a pH 3,8. El aumento de absorbancia a 625 nm respecto del blanco de reactivo es proporcional
a la concentracin de albmina.
MARCHA PRCTICA:
Materiales:
Reactivo (BCF): Solucin de Bromocresolsulfonftalena.
Suero Patrn.
Procedimiento:
En tres tubos, marcados cada uno como: B (blanco), P (patrn o standard) y M

(muestra); colocar:
B
P
M
Suero
10 l
Patrn
Muestra
10 l
Reactivo
3,5 cm3
3,5 cm3
3,5 cm3
BCF
Clculos:
f = factor = (Albminas g/dl) / (Abs. P abs B)
Alb. en g/dl = (Abs. M) . f
37
QUMICA BIOLGICA
Valor de Referencia: Albmina = 3,5 a 4,8 g/dl
Cuestionario:
Por que se debe incubar a 37 C y no a 25 C que es la temperatura estndar de laboratorio?
Por que la concentracin del patrn de glucosa es 1 g/l?
Por qu se debe restar el blanco?
Qu cuidados debe tener al manejar muestras biolgicas?
Qu cuidados debe tener con el almacenamiento de los reactivos, en especial los que
presentan actividad biolgica?
38
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 7
ELECTROFORESIS DE ZONA
OBJETIVO:
Conocer los fundamentos de la electroforesis para su utilizacin como recurso de
investigacin.
Lograr que el alumno aprenda a manejar esta tecnica como una herramienta de
analisis, conociendo sus ventajas, cuidados y limitaciones.
Permitir que el alumno se afiance en la utilizacin de material de laboratorio.
INTRODUCCIN:
La electroforesis es un mtodo electroanaltico-semipreparativo basado en la
migracin de las partculas cargadas o potencialmente cargadas al ser sometidas a la accin
de un campo elctrico. Nos permite separar cidos nucleicos, protenas y otras
macromolculas.
Analtico: nos permite determinar el nmero mnimo de componentes de una
mezcla, sus propiedades.
Preparativo: nos permite purificar la mayor cantidad posible de una determinada molcula
(Skoog 2000).
La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto
de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcional
al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia que
le ofrece el medio (soporte).
V=qE/f
La electroforesis se puede clasificar en dos tipos principales:
Electroforesis libre: el campo elctrico es aplicado a disoluciones.
Electroforesis de zona: el campo elctrico es aplicado a un soporte.
El equipo para realizar una electroforesis de zona es el siguiente:
Fuente
Cuba
Buffer
Soporte
Se han empleado varios tipos de soporte para la electroforesis de zona:

1) PAPEL. Aunque no es exactamente un gel, se puede considerar similar a ellos para lo que
aqu nos interesa ya que realmente es una malla de fibras de celulosa. Es poco restrictivo, pero
es difcil de obtener tamaos de poro y espesores totalmente homogneos. Adems, muchas
macromolculas se adsorben a las fibras que lo forman, lo que da lugar a artefactos y
separaciones defectuosas. Se empleaba fundamentalmente para molculas pequeas, como
pptidos y aminocidos.
2) ACETATO DE CELULOSA. Este derivado de la celulosa forma un gel de poro grande, muy
poco restrictivo para las protenas de tamao corriente. A diferencia del papel, es inerte frente a la
mayor parte de las protenas y se puede conseguir en lminas de caractersticas estructurales
constantes y definidas. Esto, junto con su facilidad de manejo, costo relativamente bajo y la
rapidez y reproducibilidad con que se pueden efectuar separaciones hace que este tipo de gel
tenga utilidad en los laboratorios de anlisis clnicos (para el anlisis de protenas sricas, p.ej.).
39
QUMICA BIOLGICA
3) ALMIDON. Se emplean geles formados con almidn parcialmente hidrolizado procedente

de diversas fuentes naturales. El poro es menor que para el caso del acetato de celulosa, y se
suelen obtener mejores separaciones que con ste ltimo, ya que la difusin es menor. Sin
embargo, y a pesar de haber sido muy utilizados hasta hace algn tiempo, han sido sustituidos por
geles de poliacrilamida debido a la dificultad que supone el obtener resultados reproducibles
empleando un producto de origen natural.
4) AGAROSA. Uno de los dos componentes del agar. Es un polisacrido lineal que forma
geles de tamao de poro muy grande; se usa fundamentalmente para la separacin de cidos
nucleicos (de 70 pb a 9 Mpb de ADN; hasta 12 Mpb en la electroforesis de campo pulsante) y para
inmunoelectroforesis, donde se precisa una difusin elevada
5) POLIACRILAMIDA. A diferencia de los anteriores, el gel se forma "in situ" por la
polimerizacin de una disolucin del monmero. Es posible controlar el tamao del poro de una
forma muy reproducible. Es el tipo de gel ms empleado para la electroforesis de protenas de
tamao comprendido entre 10.000 a 250.000 dalton, y de otras molculas de tamaos similares,
incluyendo cidos nucleicos. Son geles completamente inertes, mecnicamente estables y
transparentes, lo que facilita tanto su manejo como la deteccin de las molculas separadas en
ellos. La tcnica se conoce como PAGE (acrnimo de PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).
Un gel para electroforesis debe poseer las siguientes caractersticas:
1) No debe interaccionar ni con la muestra ni con los componentes del medio.
2) Debe ser qumica y mecnicamente estable bajo las condiciones de operacin.
3) Debe permitir la deteccin de las molculas separadas.
4) Es deseable que se pueda controlar su reticulacin, o, lo que es lo mismo, el dimetro medio
del poro.
Al utilizar esta tecnica se debe tener ciertas precausiones:
El campo electrico utilizado para la migracin de las biomoleculas produce un aumento de
temperatura. Es importante tener esto en cuenta ya que el calor puede desnaturalizar las
muestras, estropear el soporte y el equipo.
La eleccion del soporte es fundamental para evitar la adsorcion inespecifica de las molculas
por este.
Equipo para electroforesis de geles de agarosa
40
QUMICA BIOLGICA
ELECTROFORESIS DE PROTEINAS PLASMATICAS
INTRODUCCIN:
El suero humano contiene mas de 125 protenas identificadas que cumplen varias
funciones (Transporte, defensa, inhibidores enzimticos, etc.).
Las mismas pueden agruparse deacuerdo a su caractersticas de solubilidad y
desplazamiento electrofortico, en distintas fracciones, las que varan deacuerdo a la muestra y
soporte utilizados.
Empleando un suero standard normal y un soporte de acetato de celulosa, tendramos
la siguiente distribucin relativa de las fracciones de protenas separadas mediante
electroforsis, como se observa en la Fig. 1. Y un trazado densitomtrico como el de la Fig. 2.
Los rangos y valores promedios de cada fraccin se detallan en la Tabla 1.
Tabla 1
FRACCION
RANGO
PROMEDIO
Albmina
1 globulina
2 globulina
globulina
Gama
globulina
47 a 70 %
3a7%
5 a 12 %
5 a 16 %
10 a 20 %
59 %
4,5 %
9%
12 %
15,5 %
Si la muestra es plasma en vez de suero, se observa una fraccin mas que se ubica
entre Beta y Gama, la cual corresponde al Fibringeno. La Tabla 2, muestra los principales
componentes de cada fraccin.
Tabla 2
FRACCION
Albmina
1 globulina
2 globulina
globulina
Gama globulina
COMPONENTES
Albmina.
Glucoprotenas, Lipoprotenas, Antitripsina, Protrombina.
Macroglobulinas, Haptoglobina, Lipoprotena, Eritropoyetina.
Transferrina, Microprotenas, Complemento (C3 y C4), Hemopoyetina.
Inmunoglobulinas IgA IgD IgE IgG IgM.
En el estudio de las protenas plasmticas, las primeras pruebas a realizar deben ser:
Cuantificacin de Protenas Totales.
Electroforesis de Protenas.
Si ambas pruebas son normales, finaliza el estudio, pero si se detectan bandas
sospechosas en la electroforesis se debe completar el estudio con pruebas de confirmacin,
como por ejemplo: Inmunoelectroforesis.
41
QUMICA BIOLGICA
MARCHA PRCTICA:
Reactivos y Materiales:

Solucin Buffer pH 8,6*.
Colorante: Negro Amido 10 B 5 g/l.
Metanol al 45 %.
Acido Actico al 15 %.
Decolorante: Metanol al 50 %.
Acido Actico: 0,05 ml/l.
Tiras de Acetato de celulosa conservadas en solucin de alcohol metlico al 40 %
(evitar el secado de las mismas, de lo contrario se inutilizan).
Fuente de poder para electroforesis (100 a 500 Volt 1 a 30 mA).
Sembrador.
* El buffer debe tener un pH de 8,6. Debe cumplir la funcin de mantener constante ese
pH durante todo el proceso de fraccionamiento, no precipita ni desnaturaliza las
protenas, un pH estable es fundamental para obtener patrones reproducibles.
Nota: Sembrar un suero control para interpretar los resultados.
Procedimiento:
1. Sumergir las tiras en un exceso de buffer (150 cm3 para tres tiras), durante un
mnimo de 15 min.
2. Absorber el exceso de buffer de las tiras entre dos hojas de papel filtro.
3. Montar las tiras sobre el puente correspondiente, asegurndose que la cara
absorbente este hacia arriba. (Situar la esquina cortada hacia abajo y a la derecha)
4. Llenar con buffer ambos lados de la cuba hasta un nivel idntico y suficiente para
asegurar que entre en contacto con las tiras.
5. Aplicar las muestras en las tiras a 1 cm del borde catdico.
6. Cubrir la cuba con su tapa y conectarla a la fuente de poder ajustando el voltaje a
200 volt. Mantener la electroforesis durante 50 min.
7. Desconectar la fuente y sacar las tiras del puente, sumergirlas con la cara
absorbente en una cantidad suficiente de colorante (200 cm3 para tres tiras).
Dejarlas en agitacin durante un mnimo de 5 minutos (Situar la esquina cortada
hacia la abajo y a la derecha).
8. Decolorar las tiras efectuando tres o cuatro baos con decolorante en agitacin,
hasta obtener un fondo completamente blanco.
9. Deshidratar las tiras en un bao de metanol absoluto durante 1 min. en agitacin.
10. Pasar las tiras a un bao de solucin transparentadora, recientemente preparada y
mantenerlas en agitacin durante 1 o 2 min.. extenderlas sobre una placa de vidrio
(cara absorbente en contacto con el cristal) eliminando las burbujas de aire con un
rodillo.
11. Calentar la placa en una estufa o lampara de infrarrojos a una T de 60-70 C, hasta
que la trasparencia sea completa (3 a 4 min.). Dejar enfriar a temperatura ambiente.
12. Leer las tiras en un densitmetro a 600 nm. Se obtiene la expresin grfica de una
curva con los valores de cada fraccin.
Nota: Si no se cuenta con los elementos para realizar la cuantificacin por
densitometria, se realiza una cuantificacin por elucin.
42
QUMICA BIOLGICA
CUANTIFICACIN POR ELUCIN

Procedimiento:
1. Proceder a la separacin de las distintas fracciones (Cortando las tiras de
acetato de celulosa y colocando cada una en un tubo).
2. Agregar 10 cm3 de eluyente al tubo de Albmina, y 5 cm3 para cada una de
las restantes fracciones (disolver).
3. El blanco de reactivo se prepara con un pedazo de tira bien decolorado de
tamao similar a una de las fracciones y agregando 5 cm3 de eluyente.
4. Leer a 540 nm las Densidades Opticas, de cada fraccin, llevando a cero con
el blanco correspondiente. Tomar nota de todas las fracciones.
Clculos
FRACCION
Densidades Opticas
Albmina
1 globulina
2 globulina
globulina
Gama globulina
A1 x 2
B1
B2
C1
D1
SUMATORIA TOTAL = A1 x 2 + B1 + B2 + C1 + D1 = F
Albmina en %:
F
(A1 x 2)
100%
X = 58 %
Idemtico para las demas fracciones.

Albmina en g/dl:
100 %
58 %
6,9 g/dl
X=
Idemdentico para las demas fracciones.

Valores de referencia: Protenas Totales: 6,1 a 7,9 g/dl
FRACCION
Albmina
1 globulina
2 globulina
globulina
Gama globulina
% Relativo
50 a 58
4a8
7 a 11
11 a 15
14 a 22
Absol. g/cl
3,4 a 4,5
0,35 a 0,45
0,60 a 0,77
0,75 a 1,00
0,90 a 1,30
43
QUMICA BIOLGICA
Cuestionario:
1- Cuales considera Ud. son las correctas maneras de proceder en la manipulacin de los
soportes para electroforesis ?
2- Nombre cuales son las bandas que aparecen en un densitogrma, si la muestra es suero?
y si la muestra fuese plasma?
3- Normalmente en una electroforesis de zona para protenas sricas el voltaje es de 80-110V,
pero en una electroforesis PAGE los voltajes fluctan entre 800 1400 V, por que?
4- El colorante utilizado durante el practico, A que debe su especificidad de tincin? Cual
otro podra utilizarse?
44
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 8
ANTICUERPOS
Objetivos:
Utilizar los anticuerpos como herramienta para evidenciar la presencia de antgenos

Conocer los alcances de esta herramienta
Fundamentos Tericos:
Los anticuerpos son molculas con forma de Y formados por dos cadenas pesadas
idnticas y dos cadenas livianas idnticas. Cada brazo de una molcula de anticuerpo contiene
una cadena liviana unida a una cadena pesada por un puente disulfuro. Cerca del final de cada
brazo hay giros altamente variables, llamadas regiones determinante de la complementariedad
(CDRs), las cuales forman el sitio de unin de los antgenos (cualquier molcula capaz de
generar una respuesta inmune). La secuencia de los seis giros es altamente variable entre los
anticuerpos, hacindolos especficos para cada antgeno. La interaccin entre un anticuerpo y
un eptope en un antgeno es complementaria en todos los casos; esto es, la superficie del sitio
de unin de un antgeno en un anticuerpo coincide fsicamente con el correspondiente eptope.
El intimo contacto entre las dos superficies, estabilizado por numerosas uniones no covalentes,
es responsable de la alta especificidad exhibida por los anticuerpo.
La especificidad de los anticuerpos es tan alta que incluso en algunos casos pueden
distinguir entre proteinas que difieren en un solo aminocido. Por esta razn y la forma en que
pueden ser producidos estos son altamente utilizados en diferentes experimentos.
a) Anticuerpo b)interaccin antgeno-anticuerpo

Las propiedades los anticuerpos los vuelve una herramienta interesante para el trabajo
en el laboratorio. Sin embargo una vez que los Ac. Se unen a los Ag. Se vuelve fundamental
evidenciarla, por esta razn se han desarrollado varias formas para hacerlo. Entre las variantes
se encuentra la posibilidad de unir al los Ac. Grupos cromgenos, grupos fluorescentes, o
enzimas, de esta manera el complejo Ac-Ag es evidenciado por la presencia de color o el
producto de una reaccin qumica.
En algunos casos no es necesario modificar los Ac para mostrar la presencia de Ag. Ya
que cuando los primeros encuentran en la muestra un ag con mas de dos epitopes se puede
producir una red, debida a la interaccin de varios epitopes con varios paratopos, que es visible
a simple vista como una aglutinacin
45
QUMICA BIOLGICA
DETERMINACIN DE GRUPOS SANGUNEOS Y FACTOR RH.

GRUPOS SANGUNEOS
Introduccin:
En la superficie celular de los glbulos rojos de las diferentes personas hay dos tipos de
antgenos relacionados entre s, los tipos A y B. Dada la forma en que estos antgenos se
heredan, una persona puede no tener ninguno, tener uno de ellos o tener los dos
simultneamente. De esta manera los glbulos rojos humanos pueden ser clasificados en 0
(cero), A, B y AB.
En el plasma de las personas que no poseen uno de estos antgenos en sus eritrocitos
existen habitualmente potentes anticuerpos que reaccionan especficamente contra esos
antgenos provocando aglutinacin.
En otras palabras existen anticuerpos (aglutininas) para los antgenos (aglutingenos) A
y B. Se demostr que el suero de un individuo no contiene anticuerpos para el antgeno
presente en sus propios glbulos rojos, pero si contra los que no posee.
Se aclara mejor en el siguiente cuadro:
GRUPO
HEMATES
AGLUTINGENOS (Ag)
SUERO
AGLUTININAS (Ac)
0
A
B
AB
0
A
B
AB
,
(anti-B)
(anti-A)
NINGUNO
Cuando los glbulos no contienen ni aglutingeno A ni aglutingeno B, la sangre es

de tipo 0.
Cuando solo existen aglutingenos del grupo, B la sangre es del grupo B.
Cuando existen ambos aglutingenos A y B, la sangre es del grupo AB.
Las aglutininas son gamma globulinas igual que otros anticuerpos, producidas por
las mismas clulas que elaboran anticuerpos para cualquier otro antgeno. Casi
todas son molculas de inmunoglobulinas de tipo IgM e IgG.
Grupos Sanguneos y Transfusin:

La transfusin ideal consiste en infundir sangre de la misma composicin antignica que el
receptor, esto solo es posible en contadas ocasiones (gemelos idnticos o sangre guardada
del mismo receptor).
En la gran mayora de los casos se trata de que sean compatibles en los sistemas
antignicos ms importantes: AB0 y Rh.
En el sistema AB0 se debe usar sangre del mismo grupo, siempre que sea posible. Si no es
as los glbulos infundidos deben ser compatibles con el suero del receptor de acuerdo al
siguiente esquema, en que las posibilidades de donar sangre se indican en la direccin de
las flechas.
A
AB
B
El individuo 0 puede ser transfundido con sangre 0, el individuo A puede ser
transfundido con sangre A o B.
46
QUMICA BIOLGICA
El individuo B puede ser transfundido con sangre B o 0.

El individuo AB puede ser transfundido con sangre AB, B, A o 0.
En todos los casos de no coincidencia del grupo, se debe verificar que el titulo de
aglutininas del dador no sea alto, siendo as es un dador peligroso.
FUNDAMENTOS DEL MTODO:
Los glbulos rojos del paciente se ponen en contacto con reactivo anti-A, o anti-B. Si
existen en la misma superficie de los eritrocitos los antgenos correspondientes, se
producir una aglutinacin visible macroscpicamente. La ausencia de aglutinacin en
todos los casos, implica grupo 0.
MARCHA PRCTICA
Reactivos
Anti-A monoclonal*
Anti-B monoclonal*
Muestra: Glbulos rojos o sangre entera.
*Reactivos preparados a partir de anticuerpos monoclonales secretados por lneas
celulares de hibridomas de ratn (consultar: Biologa Celular y Molecular de la Clula,
3er o 4ta ed., Alberts et al.)
Recoleccin:
La sangre debe ser obtenida aspticamente, con o sin anticoagulante.
Aditivos:
Pueden emplearse como anticoagulantes: EDTA, Heparina, ACD, etc.
Material Requerido:
Placas de vidrio
Palillos mezcladores descartables
Limitaciones del Mtodo:
Reacciones dbiles pueden observarse en los siguientes casos:
Neonatos; los antgenos A y B no se encuentran totalmente expresados en el recin
nacido. Por esta razn deben extremarse los cuidados, sobre todo en los
prematuros.
Leucemias u otros desrdenes malignos.
Pacientes recientemente transfundidos con cantidades sustanciales de sangre de
grupo no idntico.
Procedimiento:
Tcnica en Placa:
Preparar una suspensin de glbulos rojos al 10%, o sangre entera.
En una placa limpia colocar:
1. Una gota de sangra entera. Una gota de reactivo anti-A o anti-B.
2. Mezclar el reactivo y los glbulos con un palillo descartable cubriendo un rea
circular de 2 cm de dimetro y balancear la placa continuamente durante 2 minutos.
3. Observar la aglutinacin visible macroscpicamente hasta los 2 minutos.
Consignas a responder
- Cual es la diferencia entre suero y plasma? Para esta experiencia vale tener
encuenta tal connotacin?
- En personas con eritroblastosi fetal se puede determinar el grupo y facto
47
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 9
HIDRATOS DE CARBONO
OBJETIVO DEL PRCTICO:

Familiarizar al alumno con las propiedades qumicas generales de los hidratos de
carbono.
INTRODUCCIN:
Los hidratos de carbono abundan en prcticamente todos los seres vivos. En los tejidos
vegetales constituyen los elementos fibrosos de su estructura o los productos de la reserva
nutricia de tubrculos, semillas y frutos. En los tejidos animales constituyen la reserva
energtica de las clulas o integran complejas molculas que participan en diversas funciones.
En la alimentacin humana, los hidratos de carbono constituyen el principal aporte
desde el punto de vista energtico.
Qumicamente, estn compuestos por carbono, hidrogeno y oxigeno, y pueden definirse
como polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas. Esto es, son compuestos que poseen una
funcin aldehdo o cetona y varias funciones alcohlicas, o compuestos que por hidrlisis
originan polihidroxialdehdos o polihidroxicetonas.
Segn la complejidad de la molcula se clasifican en monosacridos, oligosacridos y
polisacridos.
ACCIN DE LOS CIDOS
HIDRLISIS:
El tratamiento de los oligo y polisacaridos compuestos por azucares neutros con todos
los anillos en forma piransica, con HCl 1N o H2SO4 1N a 100C, produce hidrlisis (enlaces
glucosdicos) en 15 min.
Los enlaces furansicos son mas cido lbiles. Los piransicos de los derivados cidos
o bsicos de los azucares (cidos urnicos, aminoazcares) se hidrolizan con mayor lentitud.
48
QUMICA BIOLGICA
DESHIDRATACIN:
Los cidos concentrados (4-6N a 100C) y a temperaturas mas bajas deshidratan
intramolecularmente los monosacridos. Las pentosas dan furfural; las hexosas dan primero
hidroxi-metil-furfural, que se degrada luego con tratamiento cido mas largo a cido levulinico.
Los monosacridos son estables a cidos diluidos y en caliente.
La velocidad relativa de esta reaccin varia con los distintos azucares y depende de la
naturaleza y la concentracin del cido usado.
Esta reaccin puede servir de base para una serie de pruebas coloreadas, especificas,
ya que el hidroxi-metil-furfural y el furfural se condensan con numerosos fenoles y aminas
aromticas para dar productos coloreados (reaccin de Molish).
Eligiendo la concentracin del cido, el tiempo de calentamiento, la temperatura y el
fenol o amina aromtica, se limita la formacin de color a un azcar especifico o a una clase
determinada de ellos.
ACCIN DE LOS LCALIS

En presencia de un lcali diluido, los monosacridos se isomerizan a temperatura
ambiente, probablemente con formacin de un intermediario enlico (Trans. Lobry de Bruyn
Van Eckenstein).
Interconversin de glucosa, manosa y fructosa:
49
QUMICA BIOLGICA
Aumentando la concentracin del lcali y/o la temperatura, la velocidad y el grado de

isomerizacin se incrementa, movindose el doble enlace del enodiol a lo largo de la cadena
de carbono, dando lugar a diversos ismeros y finalmente a la ruptura de los enlaces C-C. Esta
isomerizacin en presencia de oxigeno va acompaada de una extensa oxidacin con
formacin de productos tales como los aldehidos frmicos, gliclico y glicrico y reductona
(CHOC=COH-COH).
En circunstancias similares, los oligo y polisacaridos se isomerizan bajo la accin de los
lcali en su extremo reductor y, a menos que se tomen precauciones para evitar la
isomerizacin de estos polmeros, tiene lugar una reaccin de eliminacin, catalizada por los
lcali que produce una degradacin por etapas de los enlaces glicosidicos, que avanza a lo
largo de la cadena de los polisacaridos a partir de su extremo reductor.
CARCTER REDUCTOR
Los azucares que poseen un grupo reductor (carbono hemicetal o hemiacetal) son
oxidados por numerosos agentes.
Los que carecen de estos grupo reductores (por ejemplo los que contienen solo enlaces
glucosdicos, como la sacarosa) son muy resistentes a la oxidacin.
El ataque inicial de los agentes oxidantes generales (Cu++, Ni++, Ag+, Fe(CN)6) y
compuestos aromticos nitrados tiene lugar en el grupo reductor del azcar. Tras el ataque
inicial, la oxidacin e isomerizacin pueden continuar a lo largo de la cadena de carbono de
una manera no estequiomtrica, dando numerosos productos de bajo peso molecular.
El producto mas comn para detectar grupos reductores libres en un hidrato de
carbono, consiste en medir la capacidad de la muestra para reducir Cu++ en medio alcalino (por
ejemplo, la reaccin de Fehling). Controlando las condiciones de reduccin de Cu++, su
cantidad es proporcional a la cantidad del azcar reductor. Cantidades equimoleculares de los
distintos azucares reductores reducen el Cu++ a velocidades distintas.
El Cu++ formado precipita Cu2O de coloracin rojiza. La cantidad de Cu2O formado
puede determinarse gravimtricamente por titulacin o colorimtricamente.
MARCHA PRCTICA:
1. REACCIN DE MOLISH (EN MEDIO CIDO)
La presencia de un hidrato de carbono en una muestra se pone de manifiesto por la
reaccin de Molish.
TCNICA: A 1 ml de solucin de glucosa en tubo de ensayo agregar 3 gotas de
solucin alcohlica de alfa-naftol e inclinando el tubo, aadir por las paredes H2SO4
concentrado, de manera de formar dos capas; en la superficie de contacto se formara un
color violeta caracterstico.
Materiales:
Solucin alcohlica de alfa-naftol al 5%: disolver 0,5 gr. de alfa-naftol en 20
ml de etanol al 25%. Poner en frasco cuentagotas.
Glucosa al 1% (10 mg/ml)
H2SO4 concentrado.
50
QUMICA BIOLGICA
2. TRATAMIENTO ALCALINO
A temperatura elevada o concentracin elevada de un lcali, los monosacridos libres
experimentan oxidacin, reordenacin, fragmentacin y polimerizacin, dando coloraciones.
TCNICA: A 1 ml de solucin de glucosa, aadir 1 ml de solucin de Na(OH) al 10% y
calentar hasta ebullicin. Se produce una coloracin amarillenta que vira al castao.
MATERIALES:
Glucosa 1%
Na(OH) 10%
3. CARCTER REDUCTOR (MEDIO ALCALINO)

A) REACCIN DE FEHLING:
El reactivo de Fehling es una solucin A de SO 4Cu a la cual se mezcla con otra B de
Na(OH) y tartrato de Na y K.
La ltima sal cumple la funcin de mantener en solucin el Hidrxido cprico, que
precipitara al adicionar Na(OH).
El reactivo fuertemente alcalino, en presencia de hidratos de carbono con grupos
aldehdos o cetnicos libres, reducen el Cu++ que precipita como xido cuproso de color
amarillo.
SO4Cu
2Cu(OH)2
2 Na(OH)
R-C=O
I
H
Cu(OH)2 +
R-C=O
I
OH
SO4Na2
Cu2O
+2 H2O
TCNICA: calentar 2 ml de reactivo de Fehling (1 ml de A + 1 ml de B) a ebullicin y

observar que no se reduce espontneamente. Si est en buenas condiciones, dejar enfriar y
aadir 1 ml de solucin de glucosa 1% y calentar nuevamente en bao Mara. Se produce un
precipitado amarillo rojizo de xido cuproso.
Materiales:
Glucosa 1%
Reactivo de Fehling:
A) solucin de SO4Cu: 34,6 gr de SO4Cu.5H2O en 500 ml de H2O.
B) tartrato de Na y K: 173 gr de Na(OH) : 70 gr de K en 500 ml de H2O.
B) REACCIN DE BROWN: (EN MEDIO ALCALINO)
(+) para monosacridos y disacridos.
(-) para polisacridos y sacarosa.
Tambin basado en el poder reductor, en este caso sobre un compuesto aromtico
nitrado.
51
QUMICA BIOLGICA
cido pcrico
cido picrmico
TCNICA: agregar a una solucin de glucosa 1% unas gotas de solucin de Na(OH)

1,5 molar, y luego agregar solucin saturada de cido pcrico. Al calentar se observar una
coloracin roja debido a la formacin de cido picrmico.
Materiales:
Solucin de glucosa 1%.

Solucin saturada de cido pcrico: disolver cido pcrico en agua hasta aparicin de
pequeo precipitado.
4. CARACTERIZACIN DE LAS PENTOSAS (EN MEDIO CIDO).

Por deshidratacin y condensacin con una amina aromtica da un producto coloreado
especfico.
REACCIN DE LA ANILINA.
TCNICA: a 1 ml de solucin de pentosa 1% agregar 1 ml de solucin de acetato de
anilina en tubo de ensayo, calentar en bao Mara suavemente hasta ebullicin y dejar enfriar
durante 2 minutos. Aparece una coloracin rojo brillante caracterstica de la presencia de
pentosas. Comprobar trabajando con una hexosa.
Materiales:
Solucin de pentosa (xilosa) 1%.

Solucin de hexosa (glucosa) 1%.
Acetato de anilina: 2 ml de cido actico glacial + 5 gotas de anilina.
5. CARACTERIZACIN DE LAS CETOHEXOSAS: (EN MEDIO CIDO)

REACCIN DE SELIWANOFF: (corrientemente se usa para investigar fructosa).
Es una reaccin coloreada, a tiempo fijo, especfica para las cetosas que sufren
deshidratacin en HCl concentrado y dan derivados de furfural ms rpidos que las aldosas.
Estos derivados forman complejos coloreados con el resorcinol (metaldihidrobenceno).
La velocidad en que se desarrolla el color indica sise trata de una aldosa o una cetosa.
TCNICA: a 2 ml de reactivo de Seliwanoff aadir 3-4 gotas de solucin de fructosa y
calentar a ebullicin en bao Mara hasta aparicin de color rojo cereza caracterstica de la
fructosa. La coloracin debe aparecer dentro de los 30 segundos de ebullicin.
Por ebullicin prolongada otros azcares no cetnicos pueden dar una reaccin positiva
pero de menor intensidad.
Repetir utilizando solucin de glucosa.
52
QUMICA BIOLGICA
Materiales:
1) Solucin de fructosa 1%
2) Solucin de glucosa 1%
3) Reactivo de Seliwanoff: disolver 0,25 gr de resorcinol en 500 ml de HCl 6 N (HCl
conc./H2O 1:1).
DISACRIDOS
INTRODUCCIN:
Los disacridos se forman por unin de dos monosacridos mediante un enlace
glucdico. Se conocen muchos disacridos que difieren en los monosacridos que los forman y
en su forma de unin. Dos disacridos pueden producir los mismos monosacridos por
hidrlisis, en estos casos la diferencia entre los disacridos se encuentra en la forma de unin
del enlace glucdico o en la posicin del mismo sobre la segunda molcula.
Los ms importantes desde el punto de vista de la qumica biolgica son: sacarosa,
maltosa y lactosa.
Al efectuar el reconocimiento de disacridos, es necesario tener en cuenta que
contienen muchas veces glcidos reductores provenientes de impurezas o de la hidrlisis del
mismo disacrido.
MARCHA PRCTICA.
A) REACCIN DE MOLISH:
Efectuar la reaccin empleando 1 ml de cada una de las soluciones de disacridos.
Ser positivo.
TCNICA: proceder de acuerdo a lo indicado para monosacridos.
Materiales:
Disacridos 1%.
Solucin alcohlica de alfa naftol al 5%.
H2SO4 conc.
B) TRATAMIENTO ALCALINO:
Se observa que mientras la sacarosa, que carece de grupo aldehdico o cetnico libre
es estable y su solucin toma un tinte amarillo solo despus de un calentamiento prolongado
(hay hidrlisis por calor), las soluciones de los dems disacridos con grupos aldehdicos libres
dan coloracin amarilla que pasa al castao oscuro rpidamente.
TCNICA: a 1 ml de solucin de disacrido, aadir 0,5 ml de Na(OH) al 10% y calentar
hasta ebullicin.
MATERIALES NECESARIOS:
Disacridos 1%.
Na(OH) 10%.
C) REACCIN DE FEHLING:
Se comprobar que es reducido solamente por la lactosa y maltosa, mientras
permanece inalterado por la sacarosa.
53
QUMICA BIOLGICA
TCNICA: calentar 2 ml de reactivo de Fehling con 1 ml de solucin de sacarosa,

lactosa y glucosa.
Sacarosa 1%.
Lactosa 1%
Glucosa 1%
Reactivo de Fehling.
D) REACTIVO DE SELIWANOFF:
La sacarosa dar una reaccin positiva por contar en su molcula con una unidad de
fructosa.
La lactosa servir como testigo negativo de la reaccin.
TCNICA: a 2 ml de reactivo de Seliwanoff aadir gotas de solucin de sacarosa y
calentar a ebullicin en bao Mara hasta aparicin de color rojo cereza. Trabajar con solucin
de lactosa.
Solucin de sacarosa 1%.
Solucin de lactosa 1%.+
Reactivo de Seliwanoff.
E) REACTIVO DE BARFOED
Se emplea para diferenciar entre monosacridos y disacridos.
El reactivo es una solucin de Acetato de cobre en agua acidulada con cido actico.
En este medio cido no se produce la descomposicin del hidrato de carbono dando
sustancias de gran poder reductor y la accin reductora se debe exclusivamente al grupo
aldehdo libre y a esto se debe la diferencia de reaccin.
En los disacridos esto representa un porcentaje menor de la molcula con grupo
aldehdo libre que los monosacridos , de manera que su accin es menos visible.
D-glucosa + Acetato Cprico + 2 Agua
Ac. Glucnico + Oxido Cuproso + Ac. Actico
La velocidad de reaccin se determina por la velocidad de formacin de Cu2O. El

tamao de la molcula tambin puede ser un factor limitante.
TCNICA
Calentar durante tiempos iguales a Bao Mara 2 ml. reactivo con 1 ml. de solucin de
glucosa y lactosa . se observara la formacin de un precipitado de oxido cuproso bien
acentuado en la glucosa y en lactosa mas pequeo.
54
QUMICA BIOLGICA
MATERIALES
Sol. Glucosa 1 %
Sol. Lactosa 1 %
Rvo. De Barfoed : Acetato de Cu 6.65 g.
Sol. De Ac. Actico 1 % c.s.p. 100 ml.
POLISACRIDOS
INTRODUCCIN:
El almidn es una mezcla de dos polisacridos: amilosa, un polmero de la glucosa de
cadena recta formado por unidades de glucosa unida por enlaces alfa-1,4 y amilopectina, un
polmero de la glucosa de cadena ramificada con enlaces alfa-1,6 glucosdicos.
El glucgeno y polisacridos similares presentan una disposicin ramificada, en
abanico, de los restos de glucopiranosa alfa-1,4 a lo largo de la cadena alfa-1,6 en los puntos
de ramificacin.
El glucgeno no hidrolizado carece prcticamente de poder reductor, ya que posee
pocos grupos reductores por molcula, o sea que posee numerosos grupos azcares
terminales no reductores.
La hidrlisis de estos polisacridos progresa rpidamente en cido mineral diluido e
hirviente.
Las enzimas Amilasa Salival y Pancretica, y la Diastasa de la mala hidrolizan el
almidn en soluciones neutras o casi neutras.
Algunos polisacridos (amilosa, amilopectina, glucgeno y dextrano) forman complejos
coloreados caractersticos con el yodo molecular. Se tratara de un complejo de adsorcin
entre el yodo y las cadenas del polisacrido, enrolladas helicoidalmente. Para la formacin de
hlices y de complejos intensos con el yodo se requieren cadenas con no menos de ocho
restos lineales de azcar.
Los polisacridos lineales o helicoidalmente enrollados (amilosa o almidones ricos en
amilosa), dan por eso con el yodo un color azul negro intenso.
Los polisacridos ramificados con hlices interrumpidas (amilopectina) dan complejos
menos coloreados con el yodo.
Los polisacridos muy ramificados con segmentos cortos y formacin de hlice
dificultosa (glucgeno), solo dan complejos de dbil coloracin parda.
El color azul formado con el almidn se disociar a un estado incoloro en presencia de
alcohol, de solucin alcalina o a temperaturas superiores a 60 C.
MARCHA PRCTICA:
1.
RECONOCIMIENTO DE ALMIDN:
TCNICA: a una solucin diluida de almidn preparada por ebullicin, agregar una gota
de solucin dbil de yodo (lugol diluido), y se obtendr una coloracin azul intensa. Al
calentar se observar la desaparicin del color, apareciendo nuevamente por enfriamiento.
Solucin de almidn.
Lugol: I2 0,1N: 12 gr IK en 10 ml de agua y aadir 6,54 gr de I2; disolver el I2 y
diluir a 500 ml.
55
QUMICA BIOLGICA
2.
RECONOCIMIENTO DE GLUCGENO:
TCNICA: a una solucin de glucgeno aadir unas gotas de lugol diluido; se
observar una coloracin rojiza caracterstica.
3.
Solucin de glucgeno.
Lugol
REACCIN DE MOLISH:
TCNICA: efectuar la reaccin con dos tubos conteniendo cada uno de ellos 1 ml de
solucin de almidn y glucgeno respectivamente. La prueba ser positiva en ambos casos.
4.
Solucin de almidn.
Solucin alcohlica de alfa-naftol al 5%.
H2SO4 conc.
ACCIN DE LOS LCALIS:
TCNICA: empleando 1 ml de ambas soluciones de polisacridos, estudiar la accin de
los lcalis en caliente, los mismos permanecen inalterados por un tratamiento no muy
prolongado, por falta de grupos aldehdicos o cetnicos libres en cantidades suficientes, de
modo que los haga sensibles a esa accin.
5.
Solucin de almidn.
Na(OH) 10%.
REACCIN DE FEHLING:
TCNICA: empleando 1 ml de ambas soluciones, realizar la reaccin de Fehling. Por la
misma razn del caso anterior esta prueba ser negativa. No obstante, despus de una
hidrlisis por ebullicin con una gota de cido clorhdrico y una posterior neutralizacin de la
solucin, se observar ante un nuevo ataque con el Fehling, que la reaccin ser positiva y
esto indica la presencia de glucosa liberada.
Solucin de almidn.
Reactivo de Fehling
56
QUMICA BIOLGICA
TRABAJO PRCTICO N 10
ACTIVIDAD ENZIMTICA
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA AMILASA EN CONDICIONES PTIMAS
DE TRABAJO Y CON VARIACIN DE pH Y TEMPERATURA
OBJETIVO:
Enunciar las propiedades generales de las enzimas y destacar la importancia de las
mismas.
FUNDAMENTO TERICO:
Las enzimas son esenciales de la vida.
Promueven infinidad de reacciones qumicas, tanto anablicas como catablicas, con gran
rapidez, y en consecuencia, sin su presencia las reacciones qumicas serian tan lentas que no
podran mantenerse los procesos vitales (digestin, respiracin u oxidacin, secrecin,
excrecin, contraccin muscular, conduccin nerviosa).
Qumicamente las enzimas pueden ser simples o conjugadas. Las molculas de las
primeras son de naturaleza proteica (estn constituidas solamente por aminocidos) y las
segundas estn compuestas por una protena (parte aminoacdica) mas un complejo no
proteico denominado grupo prosttico o coenzima. Son ejemplos de coenzimas el difosfatopiridin-nucletido y la coenzima A.
La mayora de las enzimas se designan agregando el sufijo asa al nombre de la
sustancia o sustrato sobre el que acta. Ya indicamos que el almidn es digerido por la
amilasa. La maltosa resultante ser transformada en glucosa por accin de la maltasa.
Las enzimas presentan diferentes grados de especificidad:
Especificidad
Baja
Especificidad
grupo
Absoluta
Estereoqumica
No discrimina sustratos,
sino enlaces.
de Especifica de un enlace
qumico, adyacente a un
grupo determinado.
Cataliza una sola reaccin.
Distingue ismeros pticos
centros proquiral.
Corrige sus propios errores
Subtilisina
Proteasas sernicas
Trombina (Arg-Gly).
NADH-oxidasas
DNA polimerasa
En general las enzimas son especficas: es decir, actan solamente sobre un determinado
sustrato (un compuesto, una composicin estereoqumica o una reaccin qumica). Los
productos resultantes del proceso enzimtico pueden ser utilizados para resintetizar el primitivo
sustrato, por accin de la misma enzima. Se considera que la enzima se adapta
estereoqumicamente a la forma del sustrato.
57
QUMICA BIOLGICA
ENZIMAS
SIMPLES
CONJUGADAS
NATURALEZA PROTEICA
PROTEINAS + GRUPO PROSTETICO

ACCION DE LA TEMPERATURA
50C o mas
Prdida del poder enzimtico
20-40C
Menos de 20C
Accin enzimtica
Intervencin en el anabolismo
Accin inhibida
Intervencin en el catabolismo
MARCHA PRCTICA
Experiencia 1-1: Actividad Enzimtica de la Amilasa

La amilasa hidroliza los hidratos de carbono liberando molculas de disacridos. Su pH
optimo de accin es 5,5 y su temperatura optima de 37C. Al variar las condiciones de trabajo
la actividad enzimtica se modifica.
Materiales
Solucin de almidn 3 gr %
Solucin de amilasa 3 gr/l
Acido clorhdrico 1N
Hidrxido de sodio 1N
Buffer barbital sdico
Acido pcrico (solucin saturada).
Material de Vidrio
Procedimiento:
1) Colocar en un vaso de precipitado 8 ml de la solucin de almidn y 1 ml de la solucin
de amilasa.
2) Tomar muestras de 1 ml a tiempos 0-10-20-30 minutos.
3) Llevar 5 minutos a ebullicin cada muestra inmediatamente luego de su extraccin.
4) Luego de obtenidas todas las muestras agregar a cada una 2 ml de cido pcrico y 6,5
ml de Na(OH) 1N. Llevar a ebullicin 10 minutos e interpretar los resultados.
5) Construir un grfico de actividad enzimtica en funcin del tiempo.
Experiencia 1-2: Actividad enzimtica en funcin del pH.
Disponer de una serie de 3 tubos y colocar en ellos las cantidades indicadas en la siguiente
tabla:
TUBO N
Sn. de almidn
ClH 1N
NaOH 1N
Sn. de amilasa
Acido pcrico
NaOH 1N
1
2
10 ml
10 ml
0,2 ml
1 ml
1 ml
Incubar 15 minutos a 37C
2 ml
2 ml
1,2 ml
1 ml
3
10 ml
0,2 ml
1 ml
2 ml
0,8 ml
Llevar a ebullicin ( Bao Mara)10 minutos.

58
QUMICA BIOLGICA
Observar, anotar e interpretar los resultados.

Experiencia 2-1: Accin de la Ptialina sobre el almidn
El almidn comienza su digestin en la cavidad bucal, por accin de una enzima
contenida en la saliva, la amilasa o Ptialina, que lo desdobla en maltosa. Es producida
principalmente en el pncreas y glndulas salivales.
Nota: La siguiente experiencia prctica es para evidenciar la actividad enzimtica, por un
protocolo de observacin indirecta. La interpretacin es colorimtrica, por lo cual se debe
respetar, a la precisin, las concentraciones y volmenes empleados en todas las fases del
proceso.
Prestar atencin, tambin que es una tcnica doble que controla tanto productos como
reactivos, por lo cual los tiempos tambin son crticos.
Procedimiento:
1)
2)
3)
4)
5)
Prepare en un tubo de ensayo una dilucin con una pizca de almidn, 5 cm3 de agua
caliente, y agregue 1 ml de saliva. Mezclar.
Mantenga el tubo a 36-37C encerrado en la mano.
Al minuto de realizar la mezcla, tome una muestra con gotero o pipeta y coloque 1
agrupacin de 3 gotas cada una, sobre una placa de toque o superficie blanca.
Agregue una gota de lugol con un gotero a la agrupacin.
Mezcle bien con una varilla, y extienda las gotas hasta ocupar una superficie circular de
2 cm (Respetar este dimetro en todas las mediciones). A partir de este paso, deber
hacer observaciones (tantas cruces como intensidad de color se evidencie) que sern
consignadas en los casilleros correspondientes del cuadro que le presentamos al final de
la experiencia.
Teniendo en cuenta el procedimiento anterior reflexione y trate de responder el siguiente

interrogante:
Qu sucede con el almidn en contacto con la saliva, a 36-37C en funcin del tiempo
transcurrido?
Experiencia 2-2: Actividad enzimtica en funcin de la temperatura

Primera parte: Accin del fro
Prepare la misma mezcla anterior de almidn-agua.
Ponga esta solucin y el tubo con saliva en tubos separados y colquelos en un recipiente con
hielo.
Una vez enfriados ambos tubos, agregue 1 ml del tubo conteniendo la saliva en el tubo con la
Sn de almidn.
Mezcle y vuelva a poner en hielo
Tome muestras a los 0-10-20-30 minutos y realice la misma tincin con lugol (como) que en la
experiencia 2.1.
Observe y anote sus conclusiones en la tabla final.
Segunda parte: Accin del calor
Someta un tubo de ensayo con 1 ml de saliva a llama directa, antes de mezclarla con la Sn de
almidn, a una temperatura cercana a la ebullicin. Tenga la precaucin de alejar la cara de la
boca del tubo.
59
QUMICA BIOLGICA
Mezcle la saliva sometida a calentamiento con la solucin de almidn, incube en la mano

cerrada (37C). Realice la coloracin con lugol a los 0-10-20-30 minutos.
Observe y anote sus resultados en la tabla.
Realice una prueba control reemplazando, en otro tubo, la saliva por 1 ml de agua destilada, y
somtala a los mismos procesos.
Prueba N
1
2
3
4
Temperatura
ambiente
Tiempo (min) Lugol
0
10
20
30
Baja
temperatura
Lugol
Alta temperatura
Control (-) Lugol
Luego de realizar las experiencias 2.1 y 2.2 responda:

Cmo influye la temperatura sobre la accin enzimtica?
Cul es la importancia de los controles (+) y (-)?
Experiencia 3: Reconocimiento de la enzima Catalasa sobre el agua oxigenada.
Fundamento de la experiencia
La Catalasa es una enzima presente en tejidos tanto animales como vegetales. Cataliza la
reaccin de descomposicin del agua oxigenada:
2H2O2
O2 + 2H2O
La liberacin de O2 puede visualizarse por el abundante burbujeo en el sistema de reaccin.

Materiales
Agua oxigenada (20-30 volmenes).
Tubos de ensayo
Material de origen animal (Sangre).
Procedimiento
1)
2)
3)
4)
Prepare 2 tubos de ensayo (A y B). En ambos coloque unas gotas de sangre.

Someta el tubo B a ebullicin (durante 5 minutos) y deje enfriar.
Agregue en ambos tubos 5 ml de H2O2.
Observe y anote los resultados.
Experiencia 4: Actividad enzimtica de la Bromelina

La Bromelina es una enzima que se obtiene de la pia o anans. Aunque clasificada
como hierba, la bromelina es una enzima digestiva proteoltica que contiene azufre y que es
extrada del tallo y de la fruta de la planta de pia (Ananas comosus, familia de las
Bromeliceas). Se cree que cuando se ingiere con los alimentos la bromelina ayuda a digerir
las protenas y que cuando es ingerida con el estmago vaco, sus propiedades medicinales
como agente antiinflamatorio entran en accin.
60
QUMICA BIOLGICA
Materiales
Anan
Gelatina sin sabor
Licuadora
Procedimiento
1)
2)
3)
4)
5)
6)
Preparar gelatina: 4 gr de gelatina en polvo disuelta en 20 cc de agua caliente.

Una vez endurecida, dividir la gelatina en dos porciones iguales.
A una de las porciones agregar 2 cc de jugo de anans.
A la otra, agregarle 2 cc del mismo jugo, pero hervido.
Optativo: calentar el jugo en tubos de ensayo rangos de temperaturas (por ejemplo 35 a
40, 45 a 50 , etc) y comprobar la accin.
Dejar actuar por una hora. Anotar las diferencias.
Experiencia 4-2: Cromatografa Monodimensional

Realizar una Cromatografa Monodimensional sembrando el jugo de anans puro (1), la
gelatina mezclada con jugo de anans (2) y la gelatina mezclada con jugo de anans hervido
(3). Comparar cada una con aminocidos patrn elegidos (4).
Materiales:
Reactivos utilizados:
Solucin de aminocidos.
Revelador: Ninhidrina (200 gr. de Ninhidrina en 100 ml de acetona)
Solvente para Leu, Phe, Met, Tyr, Trp: Butanol: Metano: Agua (4:5:1)
Solvente para otros aa: Fenol : Agua (4:1)
Gelatina preparada.
4 cc de jugo de anans.
Papel secante.
Frascos de vidrio con tapa.
Procedimiento:
1) Cortar el papel (soporte) del tamao necesario, dependiendo de las cubas ( frascos)
2) Trazar la linea de siembra y sembrar concentrando en un punto las muestras que se
sealan arriba (1) (2) (3) (4).
3) Colocar el papel sembrado dentro del frasco, previamente el mismo con atmsfera
saturada del solvente (fase mvil).
4) Luego de una espera prudencial, sacar y revelar.
5) Interpretar.
61

Guia TP 2013

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Guia TP 2013

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

QUMICA BIOLGICA

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Facultad de Ciencias Exactas Qumicas y Naturales

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Forma dipolar o de ion hbrido

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Un (-aminocido sencillo, monoamnico y monocarboxlico, por ejemplo la alanina, es

DESARROLLO DEL PRCTICO:

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

En qu intervalo de pH puede utilizarse la glicina como tampn eficiente debido a su grupo

benzoico en agua es baja. La adicin de bicarbonato sdico sube el pH de la solucin y

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

El reactivo ms utilizado para localizar las manchas es la ninhidrina, pudiendo

Aminocidos utilizados: Tirosina, Asparagina, Cistena y Glutamina.

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Cromatografa de adsorcin: la separacin se basa en repetidas etapas de

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

CLASIFICACIN SEGN LA POLARIDAD RELATIVA DE LAS DOS FASES.

cromatografa en fase normal

cromatografa en fase inversa

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Estos solventes deben filtrarse y desgasificarse. Se filtran porque pueden acumular

Filtro a la entrada del solvente

Degasificacin al vaco en lnea

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

fuerza el lquido a travs de una vlvula de direccin nica.

6. Programacin del solvente

Isocrtico: cuando la composicin de la fase mvil se mantiene constante durante un

Gradiente de elusin: cuando se vara la composicin de la fase mvil, con lo cual

7. Sistema de inyeccin de muestras

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

8. Columnas y fases estacionarias

Fases porosas: son partculas porosas que difieren en su composicin

Fases enlazadas: formada por partculas (soporte) que tienen la fase

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Detector de ndice de refraccin: mide la diferencia de ndice de refraccin entre el

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Detector de fluorescencia: solamente detectan compuestos que tengan

10. Anlisis cuantitativo

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

3. Teoras del proceso cromatogrfico

La teora de los platos tericos

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

La teora cintica (Van Deemter)

El volumen de la fase estacionaria es constante en cada plato

El volumen de la fase mvil es constante en cada plato

Las dos fases en cada plato estn en equilibrio

El valor del coeficiente de distribucin es constante e independiente de la

Difusin axial o longitudinal del soluto en la fase mvil (B)

La resistencia a la transferencia de masa entre la fase mvil y la estacionaria ( C ) La

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Inyector : el inyector es el dispositivo con el cual se introduce la muestra en la columna.

Las muestras (lquidas) son

Cromatografa con temperatura programada.

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS

Ventajas de la cromatografia capilar

Separaciones con alta resolucin

Detector de fotometra de llama: mide la intensidad de emisin molecular de la