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UNIDAD 5

SESION 1

VALIDACIN DE METODOS ANALITICOS:


DEFINICIN: La validacin de un mtodo analtico es el proceso por el cual se
establece, mediante estudios de laboratorio, que las caractersticas de desempeo
del mtodo cumplen con los requisitos para las aplicaciones analticas previstas.

Objetivo: Asegurar que el mtodo analtico evala correctamente la identidad,


potencia y/o calidad de un frmaco a granel, un excipiente o un producto
farmacutico terminado.

Fundamentos legales:
Avalada y estandarizada por organismos internacionales como: como
federaciones farmacuticas y de salud de Europa, Japn y Estados Unidos
(International Conference of Harmonitation, 1990, 1997)

Proceso de validacin:
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Contar con estndares y mtodos de calibracin certificados.


Calificacin de los instrumentos analticos. (instalacin y operacin)
Contar con un mtodo analtico normalizado.
Contar con personal entrenado para su operacin.
Validar el mtodo.
Emitir un reporte de validacin.

1. Los estndares, permiten toma un punto de referencia, una concentracin o


pureza real. Los reactivos deben tener una calidad homognea y deben
estar certificados por su proveedor y por la empresa que los use.
2. Los equipos requieren de: descripcin de la marca y modelo, sus
modificaciones, un manual de operacin en espaol, sistemas de
calibracin y mantenimiento, bitcoras de calibracin y uso, instalaciones
adecuadas para su operacin (conexiones elctricas, espacio, soporte,
ambiente). El equipo debe estar calificado, es decir, debe haberse evaluado

la linealidad de su respuesta, el lmite de cuantificacin, el limite de


deteccin y la relacin entre seal y ruido.
3. El mtodo es un documento escrito que debe incluir: el propsito y el
alcance, las responsabilidades y competencias del equipo de trabajo, la
serie de pasos a seguir, el tamao de la muestra, su manipulacin, el
manejo de los reactivos, la disposicin de los desechos, las herramientas
matemticas para convertir los resultados en valores numricos, los
criterios de aceptacin.
Los ensayos analticos tienen 4 clases:
Clase A: Para establecer identidad.
Clase B: Para detectar y cuantificar impurezas.
Clase C: Para determinar cuantitativamente la concentracin.
Clase D: Para evaluar las caractersticas de un producto, disolucin y uniformidad
de contenido.
Parmetros requeridos para la Validacin OMS
CARACTERISTICA
Exactitud
Precisin
Robustez
Linealidad
Especificidad
Lmite de deteccin
Lmite de
cuantificacin

A
X
X
X

CLASE DE ENSAYO
B
C
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X

D
X
X
X
X
X

CUANDO SE APLICA LA VALIDACIN:


A. Cuando el mtodo analtico es nuevo.
B. Los mtodos Farmacopicos no requieren validacin.
C. Cuando al mtodo Farmacopico se le hacen modificaciones menores
como:
a. Cambio de equipo analtico.
b. Cambio en la formulacin del medicamento.
c. Cambio de proveedores de reactivos crticos.
Caractersticas de la validacin:

1. ESPECIFICIDAD Y SELECTIVIDAD:
ICH Q2A y USP 31 (United States Pharmacopeia):
La capacidad de evaluar en forma inequvoca al analito en presencia de los
componentes cuya presencia cabra esperar, tales como impurezas, productos de
degradacin y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un
procedimiento analtico individual puede compensarse mediante otros
procedimientos analticos de apoyo.
En un procedimiento analtico para impurezas, la especificidad se puede
establecer:
Se agregan cantidades conocidas (del frmaco o producto farmacutico) con
niveles adecuados de impurezas y/o excipientes
Comparacin con muestras sin agregado de cantidades conocidas
El resultado de la valoracin no se ve afectado por la presencia de estos
materiales: un resultado exacto que permite la declaracin exacta del contenido o
la potencia del analito en una muestra
(Mtodo compendial 1225 USP 31)
Si no se dispone de impurezas o de los productos de degradacin puede
demostrarse la especificidad:
Comparando los resultados de las pruebas de muestras que contengan impurezas
o productos de degradacin con los de un segundo procedimiento bien
caracterizado.
1
(Mtodo compendial 1225 USP 31)
Degradaciones forzadas relevantes
calor
luz
humedad (85%)
Hidrlisis cida y alcalina
Oxidacin
En algunos casos, pueden ser vlidas otras condiciones
El tiempo de exposicin, la temperatura y la concentracin pueden ajustarse para
obtener una degradacin adecuada de la muestra.
Mtodo compendial 1225 USP 31
LINEALIDAD

La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad para obtener resultados de


prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una
transformacin matemtica bien definida, a la concentracin de analito en
muestras en un intervalo dado.
USP 31
Debe utilizarse un mnimo de 5 puntos de datos para una evaluacin
adecuada
Inspeccin visual del grfico y mtodo estadstico (lnea de regresin,
mnimos cuadrados)
Los criterios de aceptacin deben equilibrar el rigor cientfico con las
limitaciones prcticas
Linealidad: Valor r2 mnimo: 0,99 hasta 0,9999
Interseccin-y: estadsticamente no significativa, dentro del n % de la
respuesta de la solucin estndar
Apto para la valoracin mediante un estndar de un solo punto
Intervalo: necesario para resultados exactos y precisos
Estadstica de la regresin:

Todo anlisis estadstico considera los posibles errores al analizar los datos.
En la tabla 1 se muestran los tipos de errores.

TABLA 1: Tipos de errores


FACTOR 1
VERDADERO
VERDADERO

FALSO

VV

VF

VF

FF

FACTOR 2

FALSO

VF = Probabilidad de considerar un valor verdadero como falso ().


FV = Probabilidad de considerar un valor falso como verdadero ().

Hiptesis de la regresin:

y b0 b1 x

H 0 : b1 1.0
Hiptesis de la pendiente (b1):

H a : b1 1.0

H 0 : b0 0
Hiptesis del intercepto (b0):

H a : b0 0

H 0 : r 0.9
Hiptesis de la correlacin ( r ):

H a : r 0.9

Clculos previos:

SPxx x
2
i

x
n

SPyy y

x y

b
Pendiente:

2
i

SPxy xy

SPxy
SPxx

a y bx
Intercepto:

SPxy

SPxx Spyy

Coeficiente de correlacin:

Coeficiente de determinacin:

r 2 r

LINEALIDAD DEL MTODO


Evala la capacidad del mtodo analtico para dar respuestas coherentes a
diferentes concentraciones de una sustancia a analizar en un medicamento.

Procedimiento:

1. Preparar un placebo (todos los componentes de la formulacin a excepcin


del principio activo).
2. Tomar 5 muestras del placebo. Marcarlas A, B, C, D y E. Adicionar y
disolver 80 %, 90 %, 100 %, 110 % y 120 % del frmaco puro en cada
muestra respectivamente.
3. A cada muestra realizar el mtodo analtico completo.
4. Calcular la concentracin real de cada muestra.
5. Graficar los mg adicionados VS los mg recuperados (calculados).
6. El mtodo se considera lineal si el coeficiente de correlacin r es cercano
a 1.0 y el intercepto de la ordenada al origen a es cercano a 0. O se
puede aplicar los criterios de la tabla 2.
TABLA 2: Criterios de linealidad
SISTEMA
MTODO
a=0
b=(

a=0
)

b=1

r 9.0

r 0.85

Puntos (n) 5

n5

Repeticiones 3

Repeticiones 5

DETERMINACION DE LA SIGNIFICANCIA DE LA REGRESION:


Hiptesis:
H0: = 0 (la regresin no es significativa, es decir no hay relacin lineal entre x y
y) (x no explica la variabilidad de y)
Ha: 0 (x explica la variabilidad de y

TABLA DE ANALISIS DE VARIANZA (ANADEVA)


FUENTE DE
VARIACION

SUMA DE
CUADRADOS

GRADOS DE
LIBERTAD

CUADRADO
MEDIO

Regresin

( SP XY )

SC REG
gl REG
SC ERR
gl ERR

SP XX
Error

SCTOT - SCREG

n-2

Total

SPyy

n-1

CM REG
CM ERR

CONCLUSION:
Rechazo H0: La regresin es significativa.
No rechazo H0: no hay evidencia de que la regresin sea significativa.

EJEMPLO 1:
Se realiz la determinacin de la respuesta de linealidad para el equipo A de
donde se obtuvieron las siguientes respuestas. Determinar si el mtodo es lineal y
la regresin es significativa.
X
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Y
4.3
5.7
7.2
4.8
7.0
8.8
8.0
8.8
10.8
7.6

X2
1
4
9
16
25
36
49
64
81
100

Y2
18.49
32.49
51.84
23.04
49.00
77.44
64.00
77.44
116.64
57.76

XY
4.3
11.4
21.6
19.2
35.0
52.8
56.0
70.4
97.2
76.0

55.00
x =

73.00
y = 7.3

385

568.14

443.90

5.5
552
SP xx =385
=82.5
10
732
SP yy=568.14
=35.24
10
SP xy=443.9

b=

( 55 ) ( 73 )
=42.4
10

SP xy 42.4
=
=0.5139
SP xx 82.5

a= y b x =7.3( 0.5139 ) ( 5.5 )=4.47

r=

SP xy

( SP

xx

) ( SP yy )

42.4
=0.7863
( 82.5 )( 35.24 )

r 2=0.7863 2=0.6183
0.6183 significa que el 61.83 % de la variacin de y es explicada por x.

ANDEVA
F. V.
Regresin
Error
Total

S. C.
21.791
13.449
35.24

g. l.
1
8
9

C. M.
21.791
1.681

F
12.96

Buscar en tablas de F para p 0.05, 1/8 (columna horizontal 1, columna vertical 8)


F = 5.32

El valor de 12.96 cae en la parte de rechazo de H 0, es decir se acepta Ha, la


regresin es significativa.

Ejercicio 2
Se determin la intensidad de fluorescencia de riboflavina y se obtuvieron los
siguientes resultados. Determinar si el mtodo es lineal y si la regresin es
significativa.
Riboflavina
(mcg/mL)
0.0
0.10
0.20
0.40
0.80

Fluorescencia (unidades
arbitrarias)
0.00
5.80
12.20
22.30
43.30

CONCENTRA
CION
X

0.40

0.00 0.00
0.10 5.80
0.20 12.20
0.40 22.30
0.80 43.30
1.50 83.60

PROMEDI
O

SPxx=
xi2 (xi)2 /n

LECTUR

X2

y2

xy

0.00
0.00
0.01
33.64
0.04
148.84
0.16
497.29
0.64 1874.89
0.85 2,554.66

0.00
0.58
2.44
8.92
34.64
46.58

0.3 16.72

SPyy= SPxy=x
b=SPxy/S
yi2 y - [(x)
Pxx
(yi)2 /n ((y)] /n
1156.87

21.50

Tabla de Analisis de Varianza

53.75

a=ybx
0.60

r=SPxy/
RAIZ(SPxx)
(SPyy)
1.00

r2
1.00

Fuente de
variacion

SC

g
CM
l

1155.6 1.0
3
0
3.0
1.24
0
1156.8 4.0
7
0

Regresion
Error
Total

1155.63

F
2789.12

F1/
3
10.13

0.41

ROBUSTEZ

La USP 31 la define como una medida de la capacidad del mtodo analtico, y


demuestra que no resulta afectado por pequeas pero deliberadas variaciones en
los parmetros del mtodo y proporciona una indicacin de su confiabilidad
durante su uso normal.
En la prctica de manera sencilla consiste en repetir por duplicado el anlisis de la
muestra, por dos analistas diferentes, en dos das diferentes.
2 repeticiones X 2 analistas X 2 das = 8 anlisis
Estos se agrupan en una tabla de contingencia de la siguiente manera:

DA (D)

1
2
yi

ANALISTA (A)
1
2
y111
y211
y112
y212
y121
y221
y122
y222
yi1
yi2

yj
yj1
yj2
y

Posteriormente realizar un anlisis de varianza, para lo cual se calculan las sumas


de cuadrados:
a= analista
d= da
r= repeticin

y
i 1

y
d

i 1

ar

y 2

dr

SCANALISTA:

SCDA:

adr

y 2
adr

yi1 2 yi2 2
2 2

y y
2

j1

j2

2 2

y 2
2 2 2

y 2
2 2 2

SCANALISTAXDA:

y y
a

i 1

i 1

ij

i 1

adr

yi1 yi 2 y j1 y j 2 y

2 2 2

SCERROR: SCTOT SCA SCD - SCAXD

y
y
a

ijr

SCTOTAL:

i 1 i 1 i 1

adr

Clculo de los grados de libertad:


Para Analista:
a-1 i-1
Para Da:
d-1 j-1
Para AXD: (a-1)(d-1) (i-1)(j-1)
Para error: ad(r-1) ad(k-1)
Para total: adr-1 ijk-1
Realizar un anlisis de varianza:
TABLA DE ANADEVA
F.V.
ANALISTA
DA
ANALISITA
X DA
ERROR
TOTAL

S.C.
A
D
AXD
E
TOTAL

gl
(a-1)
(d-1)
(a-1)(d1)
ad(r-1)
adr-1

C. M.
SCA/glA
SCD/glD
SCAD/glad
SCERROR/glERROR

F calculada
CMA/CMERROR
CMD/CMERROR
CMAD/CMERROR

F tablas

F.V. = Factor de variacin


S.C. = Suma de cuadrados (varianza)
C.M. = Cuadrado medio
F = Cuadrado medio esperado (valor para una distribucin F)
HIPTESIS
ANALISTAS:

H0: a1 = a2
Ha: a1 a2

DIAS:

H0: d1 = d2
Ha: d1 d2

ANALISTA POR DIA:

INTERPRETACION:

H0: d1 = d2
Ha: d1 d2

Encontrar el valor de a en las tablas correspondientes considerando los grados de


libertad de analista/gl error, gl dia/gl error; gl analistaXda/gl error.

Aceptar y rechazar las hiptesis.


Concluir.

EXACTITUD Y PRECISION
Exactitud: Capacidad de un mtodo analtico para dar la misma respuesta del mismo
medicamento con la misma cantidad de frmaco y estas respuestas son comparables a las de
un estndar o referencia.
Precisin: Capacidad de un mtodo analtico para dar la misma respuesta del mismo
medicamento con la misma cantidad de frmaco.

Procedimiento:
1. Realizar de 3 a 5 anlisis de placebo cargado.
2. aplicar una prueb de t de student.
H 0 : 100%
a. Hiptesis:
H 0 : 100%
b. Establecer el nivel de riesgo: = 0 0.05
c. Calcular los grados de libertad : datos - parmetros
d. Calcular el estadstico:
t

y
s2
n

EJEMPLO:
Agregado (mg)
10
12
14
18
20
y
98.40
Sy = 2.10

Recuperado (mg)
9.8
11.6
13.4
18.2
20.1

% Recuperado
(9.8/10)X100 = 98.00
(11.6/12)X100 = 96.67
(13.4/14)X100 = 95.71
(18.2/18)X100 = 101.11
(20.1/20)X100 = 100.50

Grados de libertad (gl):


gl = 5 datos 1 parmetro (%recuperacin) = 5 1 = 4
Clculos:
t

98.40 100

2.10 2

s2
n

1 .6
0.882

1.6
0.939

5
=

t = -1.70
Se busca el valor de t en tablas para un valor de = 0.05 y 4 grados de libertad:
t(0.005,4) = 2.776
Se compara con la grfica de distribucin de t para un intervalo entre 2.776 y
+2.776

Conclusin: No se rechaza la hiptesis nula H0


El mtodo es exacto

PRECISIN Y EXACTITUD:
El mtodo debe ser:
Repetible.
Reproducible