RADIOINMUNOENSAYO RADIOINMUNOANLISIS (RIA)

El RIA es una tcnica que se inici a partir de la dcada de los sesentas, en

Nueva York, cuando los doctores Salomn A. Berson y Rosalin S. Yalow, premios
Novel de Medicina en 1977, iniciaron el desarrollo de las tcnicas de unin
competitiva, entre las cuales se encuentra el RIA. Estas tcnicas introdujeron el uso de
radionclidos para la cuantificacin de reacciones antgeno (Ag)-anticuerpo (Ac).
Permite la cuantificacin exacta de compuestos biolgicos presentes en el
organismo en concentraciones tan bajas como ng/ml (nanogramo=10-9 g) o incluso de
pg/ml (picogramo=10-12 g), incluso hacerlo en mezclas con enormes cantidades y
diversidad de materiales extraos, por lo que no es necesario purificar previamente la
muestra.
Fundamento:
El radioinmunoanlisis se basa en una reaccin antgeno-anticuerpo.
Los anticuerpos deben ser especficos contra la substancia que queremos
determinar, y tener una gran afinidad. La cantidad de anticuerpo aadida al anlisis es
limitada, e inferior a la cantidad de antgeno total. Por lo que va a quedar saturado con
l. El antgeno es la hormona (de la muestra) que queremos determinar, (antgeno
fro).
Adems del antgeno (hormona) presente en la muestra problema, se va a
aadir una cantidad constante y conocida de antgeno pero marcado (antgeno
caliente). Los antgenos marcados se forman sustituyendo algunos de los tomos
normales del antgeno por los correspondientes istopos radiactivos (H3=tritio, P 32), o
introduciendo radioistopos extraos en la molcula (yodo=I125 unido a un resto de
TYR).
Los dos tipos de antgenos, fro y caliente, van a competir, en igualdad de
condiciones, por unirse con el anticuerpo disponible. Las concentraciones del antgeno
marcado y del anticuerpo son constantes, la nica variable del sistema es la
concentracin de antgeno no marcado (muestra problema).
Cuanto mayor sea la cantidad de antgeno fro en la muestra problema, este
desplazar al antgeno caliente y por tanto se fijarn al anticuerpo cantidades menores
de antgeno marcado.
As pues, la formacin de complejos radiactivos (Ag*-Ac) vara en funcin de la
concentracin del antgeno no marcado: a mayor concentracin de antgeno no
marcado, mayor formacin de complejos antgeno-anticuerpo no marcados, y menor
formacin de complejos radiactivos, y viceversa.
Separacin de las fases ligada y no ligada
Tras la reaccin antgeno-anticuerpo, en el tubo de reaccin encontraremos:
- Las fracciones libres, constituidas por antgeno fro y antgeno marcado.
- Las fracciones ligadas formadas por complejos antgeno-anticuerpo y
antgeno marcado-anticuerpo.

Sin embargo, la radiactividad total en el tubo permanece constante antes y

despus de la reaccin, por lo que hay que separar la fase ligada de la no ligada y
contar la radiactividad en una de ellas, sin interferencia de la otra.
Hay diferentes mtodos de separacin estn basados en las distintas
propiedades del antgeno libre y del complejo antgeno-anticuerpo:
Adsorcin: Con carbn activo, dextrano o resinas. Adsorben (se unen)
especficamente la fase libre (antgenos fro y caliente) pero no se unen a los
complejos antgeno-anticuerpo que quedaran en solucin. Tras centrifugacin, el
carbn sedimenta en el fondo del tubo con la fase no ligada mientras que la fase
ligada queda en el sobrenadante, que se aspira o decanta. Este mtodo se utiliza cada
vez menos.
Precipitacin qumica: Hay substancias como el etanol, el propilenglicol o el
sulfato amnico que alteran la solubilidad de las protenas provocando su
precipitacin. Precipitan los complejos ligados. Tras centrifugacin, quedan los
complejos ligados en el sedimento y la fraccin libre en el sobrenadante, que se
elimina por aspiracin o decantacin.
Precipitacin inmunolgica: Se utiliza un segundo anticuerpo contra el
anticuerpo del sistema. La unin del segundo anticuerpo al complejo
antgenoanticuerpo da lugar a un complejo de gran tamao, en general insoluble y
fcilmente precipitable. Tras incubacin y centrifugacin, la fase libre queda en el
sobrenadante y se separa por aspiracin o decantacin. Este mtodo es muy utilizado
en RIA.
Fase slida: Consiste en inmovilizar al anticuerpo a un soporte slido, que
puede ser la propia pared del tubo, bolitas de vidrio, partculas de Sephadex
(polmero). La separacin se consigue simplemente aspirando el medio de incubacin.
Este mtodo tiende cada vez ms a utilizarse por ser sencillo, prctico, ms corto y
requiere menos manipulacin, e incluso permite su automatizacin.
Una vez separadas las fases, normalmente, se lee la radiactividad de la fase
ligada utilizando un contador gamma (g), si el istopo utilizado para el marcaje es
I125 , o un contador beta (b) en el caso de haber marcado con tritio ( 3H). Un contador
de centelleo no detecta directamente la presencia de un radioistopo sino que la
muestra radiactiva se halla dispersa en el centelleador. El centelleador es un lquido
(lquido de centelleo) con propiedades fluorescentes. Como consecuencia de las
desintegraciones radiactivas se excitan las molculas del lquido de centelleo y emiten
fluorescencia que es detectada en el contador.
CONSTRUCCIN DE LA CURVA PATRN:
Para poder relacionar los valores de radiactividad obtenidos con la
concentracin de hormonas, hay con construir una curva patrn que relacione estos
parmetros. La curva patrn se prepara al mismo tiempo que el anlisis de las
muestras problema, aplicando la tcnica a una serie de tubos que contienen
cantidades conocidas de la hormona a determinar (antgeno no marcado patrn) y las
mismas cantidades de antgeno marcado y de anticuerpo que se usan en el anlisis:
En el primer tubo no hay antgeno no marcado, por lo que todos los centros de unin
del anticuerpo sern ocupados por el antgeno marcado. A este punto de mxima
unin del antgeno marcado se llama B0 o Bmx, que representa la radiactividad

mxima que se puede unir. Los siguientes tubos tienen concentraciones conocidas
cada vez mayores de hormona, a mayor concentracin de antgeno no marcado menor
formacin de complejos antgeno marcado-anticuerpo, ya que ambos antgenos
compiten por unirse al anticuerpo. Los resultados obtenidos nos permiten construir una
curva patrn representando grficamente la radioactividad obtenida ( el % sobre Bo)
en estos tubos (eje de ordenadas, eje Y).frente a las concentraciones conocidas de
antgeno no marcado contenida en cada uno de los tubos (eje de abscisas, eje X).

La concentracin de hormona en las muestras problema se calcula

interpolando en esta curva patrn la medida de radiactividad obtenida para cada tubo
problema. La curva patrn se puede representar grficamente como una recta
utilizando un papel semilogartmico, lo que facilita la lectura de los resultados.
Como en cualquier mtodo analtico, hay una variabilidad experimental debida
a numerosos factores (reactivos, aparatos, operador, etc.) por lo que es frecuente que
todas las determinaciones se hagan por duplicado. Si los resultados obtenidos son
similares, el resultado final se calcular como la media aritmtica de los dos valores.
Tanto los contadores beta como gamma, en la actualidad, disponen de programas
informticos para cada una de las determinaciones hormonales, por lo que son
capaces de hacer todos los clculos de forma automtica, representar la curva patrn,
y leer en ella los problemas, mostrando directamente los resultados finales del anlisis.

BIBLIOGRAFA:
Universidad de Jan. Mtodos para el estudio de hormonas. UJAEN. Espaa.
Fecha
de
acceso:
20/06/16.
Disponible
en:
http://www4.ujaen.es/~esiles/ENDOCRTema6.pdf.