IDENTIFICACIN PRELIMINAR DE

FACTORES LIMITANTES EN LA
BIORREMEDIACION DE UN SUELO
ARCILLOSO CONTAMINADO CON
PETRLEO CRUDO
Andra C. L. Rizzo *; Claudia D. da
Cunha; Ronaldo L. C.
SantosI;Renata M. SantosI; Hugo M.
Magalhes; Selma G. F.
LeiteII; Adriana U. SorianoIII
Centro
de
Tecnologa
Mineral
(CETEM/MCT), Av. Pedro Calmon, 900,
Cidade universitaria, Ro de Janeiro
21941-908-RJ,
Brasil
II
Bioqumica
Departamento
de
Engenharia (EQ), Universidade Federal
Rio de Janeiro, Cidade universitaria,
21949-900 Rio de Janeiro-RJ, Brasil
III
Petrobras/CENPES,
Av.
Horcio
Macedo, 950, Cidade universitaria, Ro
de Janeiro 21941-598-RJ, Brasil
Me

RESUMEN

Biorremediacin es una alternativa

atractiva para el tratamiento de suelos
contaminados con hidrocarburos de
petrleo. Sin embargo, la efectividad del
proceso de biodegradacin puede ser
limitada por las caractersticas del
contaminante y su biodisponibilidad en el
suelo. Este trabajo tiene como objetivo
establecer un procedimiento preliminar
para identificar el factor principal
(obstinacin de hidrocarburos o su
biodisponibilidad) que deteriora la
biodegradacin, posiblemente resultando
en
eficiencias
de
recuperacin
bajo. Ensayos en microcosmos de suelo
se realizaron aplicando tcnicas de
bioestimulacin y bioaumentation. Se
realizaron experimentos similares con
medio lquido que contiene el petrleo
crudo y los microorganismos, ambos

extrados de una muestra de suelo

contaminado resistida, nutrientes y el
inculo
microbiano
de dializado
Rhodoturula y Nocardia nova. Despus
de 30 das, ms altos niveles de
biodegradacin de microcosmos (98.8%)
se obtuvieron con bioaumentacion en
medio lquido, sealando que el principal
problema
de
la
utilizacin
de
hidrocarburos
del
petrleo
por
microorganismos se asoci a su
disponibilidad y no slo a la obstinacion
intrnseca
de
los
contaminantes
restantes.
Palabras
clave: biorremediacin,
biodisponibilidad, suelo contaminado de
petrleo

Introduccin
Recientes ocurrencias de derrames de
aceite en arcilla teniendo suelos
tropicales brasileos estn motivando
estudios
con
proceso
de
biorremediacin. Esta tecnologa acelera
la
biodegradacin
natural
bajo
condiciones optimizadas a travs de
suministro de oxgeno adecuado y la
mezcla, ajuste de temperatura, pH y
agua contenido, realizar modificacin de
nutrientes (bioestimulacin) o aadiendo
una poblacin microbiana adecuada
(bioaumentation). Esta alternativa es muy
atractiva debido a su rentabilidad y la
posibilidad
de
mineralizacin
de
contaminantes a CO2 y H2O por la va
metablica aerbica. 1
Se conoce que el tratamiento biolgico
de un suelo contaminado con aceite
puede ser afectado por la estructura de
hidrocarburos y por los procesos de
meteorizacin, que disminuyen la
biodisponibilidad de los contaminantes a
microorganismos. Erosin se refiere al
resultado de los procesos biolgicos,

qumicos o fsicos que pueden afectar el

tipo de hidrocarburos que permanecen
en el suelo, mejorar la absorcin de
contaminantes orgnicos hidrofbicos
(HOCs) sobre la matriz del suelo y, por lo
tanto, disminuye la velocidad y extensin
de la biodegradacin. 2, 3 Como regla
general, slo la fraccin de los HOCs
disuelto en la fase acuosa est
disponible
para
degradacin
microbiolgica, mientras que la fraccin
sorbed
tiene
una
baja
biodisponibilidad. 4 por otra parte, un
suelo contaminado con aceite degradado
normalmente
contiene
fraccin
recalcitrante de compuestos compuesto,
bsicamente, por el alto peso molecular
Hidrocarburos
(superiores
a
C25
compuestos), que no pueden ser
fcilmente
degradados
por
microorganismos
indgenas. Por
el
contrario, un suelo recientemente
contaminado de aceite contiene una
mayor
cantidad
de
compuestos
saturados y alifticos, que son los ms
susceptibles
a
la
degradacin
microbiana.
Preocupaciones sobre la posibilidad de
contaminacin del suelo debido a
actividades
de
industria
petrolera
motivaron una alianza entre dos
investigaciones brasileo, que tena
como principal objetivo, la propuesta de
una
nueva
tecnologa
de
biorremediacin ex situ a arcilla brasilea
teniendo suelos contaminados. Durante
el curso del proyecto de un gran nmero
de experimentos de biorremediacin
fueron conducta, la mayora de ellos en
microcosmos de suelo, con el fin de
establecer las mejores estrategias y
condiciones operativas a aplicarse en
esta tierra contaminada. Esto incluye, por
ejemplo, uso de bioaumentantion o
tcnicas de bioestimulacin, evaluacin
del contenido de humedad ptima y de
pH que estimula la actividad microbiana
de y as sucesivamente. 5-7 sin embargo,
los resultados obtenidos en cuanto a
eliminacin de contaminantes orgnicos

(expresado como eliminacin - TPH de

hidrocarburos totales de petrleo) y la
eficiencia de biodegradacin (basado en
la generacin de dixido de carbono
como
resultado
de
metabolismo
aerbico) eran considerados bajos, que
van desde 5 a 50% y de 5 a 14%,
respectivamente.
Teniendo en cuenta estos resultados y
los reportados en la literatura, la reducida
eficacia
de
los
procesos
de
biorremediacin, en microcosmos de
suelo, podra estar relacionado con dos
factores posibles: la estructura qumica
de los contaminantes o su baja
biodisponibilidad en el suelo. Pero,
cmo identificar que factor, en este
caso,
perjudica
el
proceso
de
biorremediacin? Con este fin, se emple
una
metodologa
simple,
basada
solamente en la cuantificacin de dixido
de carbono (CO2), para evaluar la
degradacin de contaminantes orgnicos
en el lquido y las fases slidas. Las
pruebas tiene como objetivo identificar el
grado de biodegradacin en ambos
casos e indicar el principal factor que
interfiere en el proceso.
El presente trabajo tiene como objetivo
establecer un procedimiento preliminar
para identificar el factor principal
(obstinacin de hidrocarburos o su
biodisponibilidad) que deteriora la
biodegradacin de un petrleo crudo
degradado presente en un suelo
contaminado brasileo (representante de
una situacin real; petrleo pesado y
cinco aos de contaminacin), lo que
resulta en eficiencias de recuperacin
bajo. Estudios de degradacin de un
microcosmos se llevaron a cabo
aplicando tcnicas de bioestimulacin y
bioaumentation. Adems, se realizaron
experimentos similares con medio lquido
que contiene el petrleo crudo y los
microorganismos, ambos extrados de
muestra de suelo contaminado, adicin
de nutrientes y el inculo microbiano

de dializado
nova.

Rhodoturula y Nocardia

En este trabajo que se emple el suelo

contaminado como un microorganismos
y orgnica extraccin de fuente.

Experimental
Extracto del aceite
Suelo
El suelo investigado era una arcilla
brasilea con suelo contaminado con
petrleo
crudo
pesado,
aproximadamente hace cinco aos, del
estado de So Paulo, Brasil. Los autores
obtuvieron algunas caractersticas fsicoqumicas de suelos contaminados
previamente y los antecedentes se
resumen en la tabla 1. 5

El extracto orgnico empleado en

pruebas de medio lquidas (como se
describe) se obtuvo extraccin de
cincuenta gramos de suelo contaminado
con n-hexano (grado analtico) despus
de
la
sonicacin
(Cole-Parmer
Instruments, modelo 8891, Estados
Unidos) para 5 minutos despus, el
extracto
orgnico,
compuesto
bsicamente por el crudo residual y
solvente, en primer lugar se concentr en
un rotavapor (Yamato, modelo RE50,
Japn) hasta 10 mL y que en un
concentrador caliente con flujo de
nitrgeno (Tecnal modelo TE019, Brasil)
a 2 mL. El extracto final se aadi al
medio inorgnico (NaCl 5 g L-1, K2HPO4 1
g L-1, NH4H2PO4 1 g L-1, (NH4)2SO4 1 g L-1,
MgSO4.7H2O 0.2 g L-1, KNO3 3 g L-1) para
ser empleado como la fuente principal de
carbono
orgnico
por
los
microorganismos durante las pruebas de
medio lquidos. 8
Produccin de inculo

Un equipo especializado fue encargado

de muestreo del suelo para garantizar
una
coleccin
representativa
de
muestras que se almacenaron a
5 C. Antes de su uso, el suelo
contaminado
fue
mecnicamente
homogeneizado
para
disminuir
la
aparicin localizada de niveles elevados
de contaminantes.

En los experimentos que implican la

aplicacin de la tcnica bioaumentation,
se emplearon dos tipos de inculo. El
primero de ellos, llamado suelo extraer
microorganismos (SEM), se obtuvo
extraccin microorganismos autctonos
de cincuenta gramos de muestra de
suelo contaminado con medio inorgnico
184 mL en agitacin (150 rpm) en una
centrifuga (Nova tica, mod 430/RD,
Brasil) de 2 h.8 que la suspensin se
mantuvo a 2 h y 46 mL de sobrenadante
fue utilizado para cada frasco como
inculo. Este inculo se aplic slo en

pruebas de medio lquidas, con el fin de

reproducir la misma cantidad de
microorganismos presentes en muestras
de suelo utilizadas en pruebas del
microcosmos de suelo.
Previamente registrados por los autores,
el suelo contaminado utilizado en este
trabajo tena un microorganismos
hetertrofos y degradadoras de petrleo
microroganismos de aproximadamente
105 CFU g suelo-1 y 10 g MPN4 suelo-1,
respectivamente. 6, 7
Un segundo tipo de inculo, llamado
Consorcio
de
probiticos
de
hidrocarburos (HDC), fue utilizado en
ambos testculos como microcosmos de
suelo y el medio lquido. Estos inculo
fue constituida por dos microorganismos
que degradan petrleo crudo (Nocardia
nova y Rhodotorula
dializado
var.
dairenesis), previamente aislado del
suelo crudo contaminado. 6 las clulas
fueron cultivadas en medio que contiene
crudo aceite mineral (4% v/v) como la
nica fuente de carbono, centrifug y
lav dos veces con solucin salina estril
(0,7%), segn lo descrito por Trindade et
al. 7 inculo fue agregado a las muestras
de suelo para obtener la concentracin
de 108UFC (unidad formadora de
Colonia) g de suelo-1. 6, 7
Experimentos de biodegradacin
Pruebas de medio lquidas
Pruebas de medio lquidas se llevaron a
cabo
tratando
de
maximizar
la
biodisponibilidad del aceite, mediante la
mejora de la transferencia de masa.
Se realizaron experimentos en 250 mL
hermticamente
tapn
matraz
de
filtracin de Pyrex, que contiene un
volumen final de 50 mL, incluyendo el
medio inorgnico, extracto del aceite e
inculo microbiano.

Condiciones especficas de prueba se

describen como 8 () condicin 1: medio
inorgnico (48 mL) y aceite de extracto
(mL 2, 4% v/v); (ii) condicin 2: medio
inorgnico
con
suelo
extraer
microorganismos (SEM) (48 mL) y
extracto de aceite (mL 2, 4% v/v); (iii)
condicin 3: el medio inorgnico con
SEM (46 mL), aceite de extracto (mL 2,
4% v/v) y el inculo de HDC (2 mL) y (iv)
condicin 4: medio inorgnico (46 mL),
aceite de extracto (mL 2, 4% v/v) y el
inculo de hidrocarburos probiticos
consorcio (HDC) (2 mL).
Todas las condiciones se realizaron por
duplicado y matraces se incubaron a 30
c durante 30 das. Para mantener la
concentracin de oxgeno suficiente,
renovaciones peridicas (en intervalos de
48 h) de headspaces frascos hicieron
abrir y airear durante 2 minutos. Durante
estos
experimentos,
la
actividad
microbiana fue supervisada por la
produccin de dixido de carbono.

Pruebas del microcosmos de suelo

Las
mejores
estrategias
para
bioestimulacin,
humedad
y
bioaumentation ajuste aplicado en el
tratamiento biolgico de los suelos
contaminados brasilea investigada en
este trabajo se establecieron en trabajos
7
anteriores. 5,
Algunas
de
esas
estrategias fueron empleadas en suelo
microcosmos pruebas descritas abajo.
Experimentos de biodegradacin en el
suelo un microcosmos se llevaron a cabo
en 250 mL para hermticamente tapn
matraz de filtracin de Pyrex, que
contiene 50 g de suelo y otros aditivos
tales como nutrientes y el inculo. PH y
humedad del suelo fueron ajustados al
50% de retencin de agua (WHC) de
capacidad y 7.0, respectivamente.

Condiciones especficas que se utilizan

para cada muestra se describen como ()
condicin 1: contaminacin de suelo,
K2HPO4 (c relacin 100: 1), inculo de
HDC
(2
mL); (ii)
condicin
2:
contaminacin de suelo, K2HPO4 (c
relacin 100: 1).
Todas las condiciones se realizaron por
duplicado y matraces se incubaron a 30
c durante 30 das. De manera similar al
procedimiento adoptado en la prueba de
medio lquida, suministro de oxgeno
estaba garantizada por renovaciones
peridicas (en intervalos de 48) de los
espacios.
Tambin
en
estos
experimentos, la actividad microbiana fue
supervisada por la produccin de dixido
de carbono, como hizo en pruebas de
medio lquidas.
Determinacin cuantitativa de CO2
En el presente estudio que el examen del
proceso de biodegradacin fue logrado
slo por perdidas del petrleo crudo
calculadas a partir de la medicin de
cromatografa
de
gas
de
CO2 evolucionaron, puesto que se
considera por diversos autores como una
prueba directa de la mineralizacin
completa del contaminante orgnico. 912
como se inform por Heitzer y Sayler,
mientras que los contaminantes y
productos intermedios son parmetros
importantes de controles qumicos,
solamente la formacin de productos
finales tales como CO2proporciona la
prueba directa de la destruccin
completa y la mineralizacin de un
contaminante. 13
Un
Hewlett-Packard
5890A
II
cromatgrafo se utiliz para analizar los
espacios de cabezas del matraz cerrado
hermticamente con el tapn Pyrex de
filtro que contiene muestras de suelo y
lquido frasco. El gas portador fue helio
ultra alta pureza. Un detector de
conductividad trmica (TCD) se fij en

220 c y se utiliza una columna de

CHROMOSORB 102. Se muestre el
gas confinado en Pyrex matraces de
filtracin, utilizando una jeringa de
prueba de gas, volumen de 500 l a
travs de la succin de la atmsfera
interna de los espacios vacos de frascos
antes del proceso de aireadoras.
Se podra suponer, como consecuencia
de
los
metabolismos
aerbicos
heterotrficos de los microorganismos, si
se consumen dos moles de carbono
orgnico (del aceite degradado o de la
materia orgnica natural del suelo), un
mol de carbono se emplea en la
generacin de CO2 y la segunda mol de
carbono se incorpora a la biomasa. Por
lo tanto, el CO2 cuantificada por
cromatografa de gases representa slo
el 50% de la materia orgnica total que
era biodegradable. Basado en este
concepto y utilizando el valor acumulado
de CO2 generadas durante 30 das de los
experimentos, la eficiencia de la
biodegradacin (BE) se calcul como: BE
% = (carbn totalmente biodegradado) x
100 / Total carbono orgnico en el
suelo; Totalmente biodegradable carbono
= 2 carbn de CO 2 generadas durante
30 das. 7
Tambin con frecuencia se asume que el
carbono orgnico total corresponde a 80
a 90% de contenido de hidrocarburos
totales del petrleo en el suelo
contaminado
con
petrleo
crudo. Teniendo esto en cuenta, es
posible confirmar en la tabla 1 que el
valor obtenido para el carbono orgnico
(Corgnico) corresponde al 89% del Total
petrleo hidrocarburos (TPH) presentes
en el suelo contaminado resistido. Por lo
tanto, en este trabajo, se consider que:
total de carbono orgnico en el suelo =
85% del suelo concentracin de TPH al
principio del experimento. 7
Resultados y discusin

La
cuantificacin
cromatografa
CO2 logradas durante los experimentos
de biodegradacin en medio lquido
permitida la evaluacin del perfil del
generacin de CO2 para cada condicin
(figura 1).

Se pudo observar que durante los

primeros 15 das, que el comportamiento
de las curvas de las condiciones 2, 3 y 4
fueron similares, lo que indica un periodo
de adaptacin para ambos tipo de
inculo
aadido:
suelo
extrado
hidrocarburos
probiticos
consorcio
(HDC) y microorganismos (SEM).
La evolucin de CO2 despus el da 15
fue mayor en las condiciones 2 y 3 que
en la condicin 4, posiblemente debido al
perodo de aclimatacin previo que la
microbiota extrada durante ms de 4
aos de contaminacin y a la interaccin
fuerte entre las distintas especies
microbianas nativas.
Este comportamiento podra confirmarse
en la tabla 2 , donde la eficiencia de la
biodegradacin (% BE) obtenida despus
de 30 das se presentan.

Es posible observar en la tabla 2 que

inculo proporcionado por SEM fue
capaz de degradar, en medio lquido, el
45% de los contaminantes (condicin 2),
mientras que el inculo HDC solo
(condicin 4) presenta un ser de slo el
23%. Cuando se present el consorcio
microbiano
de
probiticos
de
hidrocarburos
en
medio
lquido
conjuntamente con el suelo extrado
microorganismos
(microorganismos
indgenas, condicin 3) se obtuvo un ser
del 98%. Este resultado indica que el
efecto sinrgico obtenido por la adicin
del inculo de probiticos fue muy
importante
hacia
el
objetivo
de
biodegradacin del aceite.
El CO2 Perfil de generacin utilizando
microcosmos de suelo para las dos
condiciones de prueba se presentan en
la figura
2. La
eficiencia
de
la
biodegradacin (BE) para el sistema de
bioestimulantes,
que
contiene
microorganismos indgenas (condicin
2), y el bioaumentado uno (condicin 1),
que contienen inculo HDC (Rhodotorula
dializado y Nocardia nova) fueron 8 y el
13%, respectivamente. Comparando los

resultados obtenidos para condiciones

equivalentes en medio lquido y en
microcosmos de suelo (condicin 2 en
prueba de medio lquido con la condicin
2 en microcosmos de suelo y condicin 3
en la prueba de medio lquido con la
condicin 1 en microcosmos de suelo),
es posible comprobar la mejora
significativa en ser como resultado de la
biodisponibilidad de aceite. En lquido
medio es verificado un aumento de seis
veces en ser especficamente cuando
slo la poblacin microbiana autctona
fue utilizado (8% en el suelo y 45% en
medio lquido). De la misma manera, en
el caso donde la poblacin microbiana
autctona se complement con inculo
HDC, los tenan un aumento de 7.5 (16%
en el suelo al 98% en medio lquido).

de biodegradacin son generalmente

mayores en suelos arenosos que en
suelos arcillosos. Adems la disminucin
de la biodisponibilidad puede resultar de
la incorporacin del contaminante a la
materia orgnica del suelo debido a las
reacciones de oxidacin qumica, as de
lenta difusin en los poros muy
pequeos, ambos absorcin en materia
orgnica y formacin de pelculas
semirrgidas alrededor de lquidos de
fase no acuosa, causando as una alta
resistencia a la transferencia de
masa. 7 las estimaciones de la fraccin
de biodisponibilidad en estudios de
factibilidad realizados antes de un
proyecto de biorremediacin pueden
representar una estimacin til del nivel
mximo de biodegradacin alcanzables.

Estos resultados indican que los bajos

valores obtenidos para ser en el suelo
podran estar relacionados con la fuerte
interaccin entre contaminantes y el
suelo, reduciendo la biodisponibilidad de
aceite, y no es una consecuencia directa
de la obstinacin de aceite.

Loehr et al. 2 demostr que un suelo que

contiene crudo envejecido no pudo ser
remediado mediante el proceso de
biorremediacin de fase slida. Aunque
las concentraciones sustanciales de
hidrocarburos permanecieron en este
suelo, se demostr que los hidrocarburos
eran altamente resistido y no puede ser
lanzado desde el suelo. Por lo tanto, la
fraccin de los qumicos quedan en el
suelo despus de biodegradacin
(incluso si esa fraccin es cercana al
100%) puede representar un extremo
ambientalmente aceptable (EAE). 14 tal
extremo ocurre cuando los productos
qumicos que permanece en el suelo no
tienen un impacto adverso en la salud
humana y el medio ambiente, y
productos qumicos que podran liberarse
lentamente se degradar principalmente
por natural capacidad asimilativa del
suelo. 7 segn
Trindade et
al.,7 el
concepto EAE reconocer que altas
concentraciones de qumicos en el suelo
no pueden ser asociadas con efectos
adversos. En un sitio con suelo
contaminado, riesgo para la salud
humana y el medio ambiente es
directamente
relacionado
con
la
liberacin y disponibilidad de un producto
qumico y el conocimiento de lo que se

Histricamente, contaminar muestras

envejecidas donde tiempos de contacto
pueden variar de meses a aos o incluso
dcadas,
generalmente
concentran
algunos
contaminantes
son
biodegradados lentamente. Adems, el
proceso
de
envejecimiento
(o
atmosfricos) contribuye a la absorcin
de esta materia orgnica, reduciendo su
biodisponibilidad y, en consecuencia, su
biodegradacin. El grado de reduccin
de la biodisponibilidad durante el
envejecimiento
depende
de
la
concentracin del contaminante, las
condiciones
de
envejecimiento
y
caractersticas de la muestra: secuestro
es ms extenso en las concentraciones
de contaminantes baja;ocurrencia de
mojar y ciclos de secado aumentar la
medida de secuestro; y el ritmo y la
medida de secuestro pueden variar
considerablemente
entre
diferentes
muestras de suelo y sedimento. 14 tasas

libera y la tasa de liberacin es tan

importante como el tipo y concentracin
de contaminantes.
Conclusiones
Los
valores
de
eficiencia
(BE)
biodegradacin
obtenidos
en
los
experimentos medio lquidos utilizando
ambos microorganismos autctonos e
inculo de hidrocarburos probiticos
consorcio
(HDC)
demostr
que,
probablemente,
el
principal
factor
perjudicial a la biodegradacin del aceite
presente en la arcilla estudiada teniendo
suelo brasileo podra atribuirse a la
interaccin fuerte entre el contaminante y
la matriz del suelo, como consecuencia
del proceso de envejecimiento.
Otros experimentos de bioaumentacion
en microcosmos de suelo deben
realizarse con una mayor densidad de
inculo de microorganismos autoctonos
y microorganismos probiticos de
hidrocarburos pues verific un efecto
sinrgico positivo en medio lquido.
Sin embargo, se deben observar
limitaciones al considerar la fraccin
resistida
de
contaminante
que
permanece en el suelo como un final
aceptable ambiental (EAE).
Diferentes tecnologas o estrategias para
aumentar la biodisponibilidad de aceite
en los suelos pueden aplicarse, incluso
por la fsica (por molienda o mezcla) o
medios (tensoactivos, solventes Co o
adicin de agentes quelantes). En ambos
casos, el objetivo principal es aumentar
la transferencia de masa desde la fase
sorbed, aumentando as la solubilidad del
aceite residual. 15
Es importante tener en cuenta que,
aunque
empleando
Ciencias
toxicolgicas y agrcolas, el concepto de
biodisponibilidad
ha
recientemente
llamado la atencin de los sectores

industriales y ambientales como un factor

importante para decidir cmo tratarla
(biolgica o qumicamente) y cmo
solucionar la limpieza extrema. En este
ltimo caso, la razn es que si
contaminantes en el suelo no son
biodisponibles, ms masa contaminada
puede dejarse en su lugar o sea sin tratar
sin crear riesgos adicionales. Por lo
tanto, es posible lograr ahorros de tiempo
y
costo
con
un
estudio
de
15
biodisponibilidad.
En este sentido, el presente trabajo dio
una contribucin inicial mientras que
estableci un procedimiento preliminar
para identificar el factor principal
(obstinacin de hidrocarburos o su
biodisponibilidad)
que
limita
la
biodegradacin de un petrleo crudo
degradado presente en una arcilla
brasilea teniendo suelo.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por el centro
de Tecnologa Mineral (CETEM) en
colaboracin
con
el
CENPES
PETROBRAS.
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Recibido: 22 de enero de 2007
Publicado en la web: 30 de enero de
2008